Dissertations / Theses: 'ADN polymerase I'

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Saulier-Le, Dréan Bénédicte. "Isolement et caracterisation d'un adn complementaire de la poly(adp-ribose) polymerase chez l'amphibien xenopus laevis." Rennes 1, 1993. http://www.theses.fr/1993REN1S011.

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Abstract:

Chez l'amphibien xenopus laevis, l'activite de la poly(adp-ribose) polymerase (parp) a ete mise en evidence dans les ovocytes, les ufs et les embryons precoces. Elle est presente sous forme d'un polypeptide unique de 100 kda. Elle est activable par l'adn et presente une bonne immunoreactivite croisee avec des anticorps diriges contre les parp humaine et bovine. Un dosage de l'activite parp dans les ovocytes a montre que cette enzyme etait synthetisee au cours de l'ovogenese. D'autre part, un alignement des sequences proteiques des parp deja connues (humaine, murine, bovine et aviaire) a revele certaines zones de la proteine conservees a 100% entre ces 4 especes. Des oligonucleotides degeneres, derives a partir de ces zones conservees nous ont permis d'amplifier par pcr un fragment d'adnc de 750 pb codant pour la parp de xenope. Grace a cette sonde homologue, nous avons crible une banque d'adnc d'ufe de xenope, et isoles plusieurs clones. L'adnc reconstitue a partir de ces clones representait un total de 3,6 kb, soit environ 650 pb de region 3 non traduite et une phase de lecture ouverte, incomplete en 5, codant pour 998 acides amines de la parp de xenope. Cette proteine presente 71 et 78% d'identite avec les parp de mammiferes et de poulet. La sequence des 13 premiers acides amines de la proteine n'a pas pu etre isolee jusqu'a present. La parp de xenope a ensuite ete exprimee dans e. Coli, et caracterisee par western blot

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Feugeas, Olivier. "Pcr (polymerase chain reaction) et vih." Lille 2, 1990. http://www.theses.fr/1990LIL2M264.

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Gielly, Ludovic. "ADN chloroplastique et phylogénies intragénériques." Université Joseph Fourier (Grenoble), 1994. http://www.theses.fr/1994GRE10051.

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Abstract:

L'analyse comparee des variations des sequences de l'adn chloroplastique (adncp) est une methode de plus en plus utilisee pour estimer les relations phylogenetiques chez les vegetaux. L'analyse de certaines regions non-codantes, caracterisees par des taux de mutations plus eleves que les regions codantes, permet d'etendre le domaine d'utilisation de l'adncp a des niveaux taxonomiques hierarchiquement bas. Trois couples d'amorces universelles pour l'amplification de trois de ces regions, deux espaceurs intergeniques (intergene trnt (ugu)-trnl (uaa) et intergene trnl (uaa)-trnf (gaa)) et l'intron du trnl (uaa) ont ete definis et utilises pour tester l'utilite phylogenetique de telles zones. Les travaux presentes etayent l'utilisation des zones non-codantes de l'adncp pour construire des phylogenies entre especes proches chez les vegetaux. En accord avec des resultats precedemment etablis, il ressort que ces regions de la molecule evoluent en moyenne plus de trois fois plus vite que le gene rbcl. Les donnees de sequences accumulees ici mettent en evidence une heterogeneite des taux de variation suivant les lignees et meme a l'interieur du genre et rejoignent ainsi les resultats de travaux contemporains effectues par d'autres equipes. Aucune correlation n'a pu etre etablie entre le temps de generation et les vitesses d'evolution de l'adncp. Les variations des sequences de l'intron du trnl (uaa) ont ete suffisantes pour construire une premiere phylogenie du genre gentiana l. Neanmoins certains branchements dans la phylogenie demeurent ambigus et necessitent de ce fait d'analyser des sequences supplementaires (chloroplastiques et nucleaires, codantes et non-codantes)

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Ferrigno, Olivier. "Les elements transposables sine b2 fournissent un promoteur arn polymerase ii mobile." Nice, 1999. http://www.theses.fr/1999NICE5357.

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Abstract:

Les sine (short interspaced elements) sont des composants tres abondants des genomes de mammiferes qui se propagent par retrotransposition. Parmi les sine, la famille des elements b2 constitue approximativement 0,7% de l'adn genomique total de rongeur. Les b2, comme la plupart des sine ont evolue a partir d'un arn de transfert, mais possedent aussi une region unique, d'origine inconnue, de 70 pb a leur extremite 3. Nous avons localise un de ces membres dans un intron du gene lama3 qui code pour les isoformes de la chaine 3 de la laminine-5 murine. Nous avons identifie un nouveau transcrit 3 dont le site d'initiation est situe dans cette sequence b2 au niveau de la region unique et est derive du brin antisens au transcrit ressemblant aux arnt synthetises par la pol iii. Nos etudes ont montre tout d'abord que la nouvelle transcription in vivo par la pol ii du gene lama3 est conduite par un petit fragment de 70 pb appartenant exclusivement a la sequence b2 et est dirigee par un element initiateur et une boite tata en amont. Cette sequence initiatrice est reconnue par le facteur de transcription usf et l'expression ectopique de ce facteur peut stimuler fortement la transcription par la pol ii de l'element b2 in vivo. Ces resultats mettent en evidence pour la premiere fois la presence d'un promoteur pol ii dans un element sine. Nous avons ensuite elargi nos etudes en montrant que la grande majorite des elements b2 possedent un promoteur pol ii, et que ce promoteur possede des similitudes de sequences avec plusieurs promoteurs de genes codant pour des proteines. Ces donnees indiquent que les elements sine b2 ont le potentiel de distribuer un promoteur pol ii fonctionnel et regulable a travers le genome. Ceci a pu, au cours de l'evolution, resulter en la creation de nouveaux arnm qui fournissent le materiel de base pour la selection naturelle.

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Kandan-Kulangara, Febitha. "Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) and RNA interference (RNAI) during cell death." Doctoral thesis, Université Laval, 2013. http://hdl.handle.net/20.500.11794/25972.

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Abstract:

L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.

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Casefont-Ducancelle, Alexandra. "ADN polymérase du cytomégalovirus humain : activité enzymatique et sensibilité aux entiviraux." Paris 5, 2005. http://www.theses.fr/2005PA05N15S.

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Abstract:

Le foscarnet, utilisé pour traiter les infections sévères à cytomégalovirus, est un inhibiteur de l'ADN polymérase, codé par le gène UL54. Le but du travail était d'étudier le retentissement de mutations introduites dans UL54 sur l'activité de l'enzyme et la résistance au foscarnet. Une méthode originale, reposant sur la mesure de l'incorporation de nucléotides trisphosphates marqués à la digoxigénénine dans le brin d'ADN en formation, a été mise au point pour mesurer l'activité d'ADN polymérases sauvages et mutées, et leur comportement en présence de foscarnet. L 'implication de l'extrémité N-terminale du domaine conservé delta-C dans le mode d'action du foscarnet a été démontrée pour la première fois. Le rôle d'association de mutations a été confirmé. L'étude des phénotypes de polymérases portant des mutations dans le domaine IV a permis de préciser leur rôle dans la fonction exonucléasique de l'enzyme virale
Anti-cytomegalovirus drug foscarnet, is an inhibitor of viral DNA polymerase pUL54. We aimed to analyse the impact of UL54 mutations on polymerase activity and foscarnet resistance. Mutations were introduced by mutagenesis into gene UL54 and wild-type and mutated DNA polymerases were expressed in vitro. We developed a colorimetric assay to measure DNA polymerase activity in the absence and presence of foscarnet. We demonstrated the usefulness of this DNA polymerase phenotypic assay for the characterization of mutation suspected to confer foscarnet resistance. Change N495K and combination of S291P and combination and K415R were shown to induce foscarnet resistance for the first time, confirming the wide distribution of foscarnet-resistance mutations through gene UL54. The role of N495K was confirmed by rescue marker. We assessed the major role of serine 771 on polymerase catalytic function and of amino-acids 412 and 413 on 3'5' exonuclease activity

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Le, Cam Eric. "Conformation de l'ADN et interactions ADN-protéines en microscopie électronique." Paris 11, 1995. http://www.theses.fr/1995PA11T007.

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Causse, Xavier. "Interet de l'adn polymerase du virus de l'hepatite b dans l'evaluation therapeutique des hepatites chroniques a vhb seul." Lyon 1, 1988. http://www.theses.fr/1988LYO1M125.

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Ralec, Céline. "ADN polymérases et acides nucléiques endommagés chez les Archaea : maintenance génonique et Biotechnologies." Thesis, Brest, 2013. http://www.theses.fr/2013BRES0057/document.

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Abstract:

Les Archaea hyperthermophiles sont des micro-organismes particulièrement adaptés à la vie à très haute température. Les températures élevées sont responsables de la création de diverses lésions à l’ADN. Pourtant, le taux de mutations spontanées chez l’Archaea Sulfolobus solfataricus est proche de celui mesuré chez des organismes mésophiles. Ceci laisse suggérer que les Archaea doivent être équipées de mécanismes spécialisés efficaces dans la reconnaissance et réparation des dommages à l’ADN. La réplication de l’ADN est un mécanisme fonctionnellement conservé dans les trois domaines du Vivant assuré par des enzymes clefs, les ADN polymérases. A ce jour, chez Pyrococcus abyssi (Pab), Euryarchaea hyperthermophile, deux familles de pol ont été identifiées, une pol réplicative de la famille B, présente dans les trois règnes du Vivant et une pol réplicative la famille D, spécifique de l’embranchement des Euryarchaea. Tous les membres de la famille B des pols archéennes possèdent une signature structurale unique impliquée dans la reconnaissance spécifique des bases endommagées (uracile et hypoxanthine). Ce doctorat a permis de démontrer que cette poche pouvait également accommoder les bases canoniques (A, T, C, G) contribuant ainsi à la haute fidélité de ces enzymes. Des structures cristallographiques à très haute résolution de l’ADN polymérase B (PabPolB) ont permis d’identifier la présence d’un ion métallique divalent situé à proximité de cette poche de reconnaissance. Il a été suggéré que cet ion modulerait la reconnaissance des bases désaminées et le glissement de l’ADN polymérase au cours de la synthèse d’ADN. De plus, nous avons montré que les ions catalytiques divalents ont un rôle central dans la modulation des propriétés intrinsèques de PabPolB. L’ion calcium est utilisé par PabPolB pour mener à bien la synthèse d’ADN mais engendre des caractéristiques cinétiques différentes de celles conférées par l’ion magnésium universel. D’autre part, nous avons déterminé pour la première fois chez un organisme archéen la concentration intracellulaire de dNTPs et NTPs. Leurs concentrations sont relativement plus élevées que celles mesurées par exemple chez l’eucaryote Saccharomyces cerevisiae, suggérant un mécanisme constitutif de réaction de protection à des agressions de l’ADN. L’ensemble de ces résultats participe à la compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent la maintenance de l’intégrité du génome et, donc, de la vie des organismes hyperthermophiles
Hyperthermophilic Archaea that thrive under harsh environments (elevated temperature, pH shifts, andionizing radiations) are supposed to be exposed to massive DNA damages. However, the mutations frequencies in hyperthermophilic Archaea are comparable with those of other microorganisms (1) indicating they are equipped with unique and efficient molecular mechanisms to ensure their genome integrity. DNA replication is an essential and conserved process among the three domains of life. DNA polymerases are central enzymes involved in the joining of deoxyribonucleoside 5′-triphosphates (dNTPs) to form the growing DNA chain. In Pyrococcus abyssi (Pab), two familiesDNA polymerases have been described as replicases, one family B (PabPol B) with structural diversity and common mechanisms among all organisms in the three domains of life, and one family D found exclusively in Euryarchaea. All members of archaeal family B DNA polymerases possess a unique structural feature involved in the recognition of deaminated bases (uracil and hypoxanthine) called uracil-pocket. During my PhD, it has been shown that not only deaminated but also canonical bases (A, T, C, G) could enter this pocket in PabPolB. We therefore renamed it as the base-checking pocket and proposed a role in the high fidelity of PabPolB. High-resolution crystal structures of PabPolBhig hlighted the presence of divalent metal ion to the proximity of the base-checking pocket. It has been suggested that thismetal ion may modulate the recognition of deaminated bases and the translocation of PabPolB on DNA during DNAsynthesis. Moreover, the crucial role of metal ion on DNA synthesis and exonuclease activity by PabPolB has beenevaluated. DNA polymerisation in the presence of calcium was as effective as the universal magnesium ion while showing different time-course kinetics. For the first time, intracellular concentrations of nucleotides (dNTPs and NTPs) have been determined in an archaeal microorganism. dNTPs and NTPs concentrations seem rather elevated for Pab than in the eukaryotic Saccharomyces cerevisiae cells, suggesting a constitutive mechanism for protecting the genome from DNAdamage. Overall, these results contributed to unravel specific molecular mechanisms involved in the maintenance of the genome integrity with a particular emphasis on molecules (DNA polymerases, dNTPs and NTPs) crucial for cellular life

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Pion, Emmanuelle. "Etude du mécanisme d'interaction du domaine de liaison à l'ADN de la poly(ADP-ribose)polymerase (PARP-1) avec des cibles nucléiques." Strasbourg 1, 2004. http://www.theses.fr/2004STR13030.

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Abstract:

L'activation de la poly(ADP-ribose)polymerase (hPARP-1) intervient en réponse aux cassures dans l'ADN. Dans le cadre de la recherche de traitements anti-cancéreux, la protéine PARP-1 constitue une cible de choix de par son implication dans les mécanismes de réparation de l'ADN. Etant donné la conservation du site catalytique au sein de la superfamille PARPs, l'élucidation au niveau moléculaire du processus de liaison à l'ADN de PARP-1 apparaît essentielle pour la compréhension de son rôle biologique et pour le développement d'inhibiteurs spécifiques dirigés contre la fonction de liaison. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au mécanisme de liaison entre le domaine de liaison (DBD) de la hPARP-1 et des cibles nucléiques. Après avoir caractérisé les propriétés de fluorescence du DBD de PARP-1 nous avons déterminé les paramètres de liaison du DBD. Cette étude a mis en évidence une spécificité de reconnaissance au niveau de la jonction entre un double et un simple brin d'ADN avec une extrémité 5' rentrante. Le rôle des résidus tryptophanes apparaît essentiel dans la reconnaissance de la structure nucléique via des interactions de type empilement. Ces résultats nous ont permis de modéliser la liaison et de démontrer une dimérisation de la PARP-1 sur l'extrémité 5' rentrante. La position asymétrique de la PARP-1 sur l'ADN observée par empreinte à la DNase I semble corrélée avec la formation d'un dimère catalytique. Les mesures de l'activité de poly(ADP-ribosyl)ation combinées aux études par spectroscopie de fluorescence nous ont permis de corréler la stoechiométrie de liaison avec le niveau d'activité. Ainsi, une forte activité est mesurée lors de la formation d'un dimère protéique sur la cible nucléique. Enfin, la génération par mutagenèse dirigée d'un mutant du résidu Trp 51 du doigt à zinc FI, a permis de préciser le rôle de ce résidu dans le maintien conformationnel du DBD et son importance dans la conservation des propriétés de liaison du DBD
Activation of Poly(ADP-ribose)polymerase (hPARP-1) is an immediate response to DNA damage. For the research of antitumor agents in addition of actual chemotherapies and radiotherapies, the protein PARP-1 is a good target since it is implicated in facilitating DNA repair. Due to the highly conserved catalytic domain into the whole PARPs family, the elucidation of the molecular binding mechanism appears essential not only for a better knowledge of its biological function but also for developing specific inhibitors. In this context, we have analyzed the binding mechanism of PARP-1 in the presence of nucleic acid targets in order to better understand the protein's function. After the characterization of the fluorescence properties of the PARP-1 DBD, we have determined, the binding parameters of the PARP-1 DBD. This study showed that the recognition of a DNA junction between a double strand and a single strand bearing a 5' recessed end by DBD is highly specific. Trp residues seem to be directly implicated in the nucleic acids binding by stacking interactions. We also modelized the binding and demonstrated a protein PARP-1 dimerization. The asymmetric protection of DBD to DNA seems to be correlated with the formation of a catalytic dimer. Poly(ADP-ribose)activity measurements associated with fluorescence spectroscopy revealed that the activity levels of PARP-1 is strongly correlated with the binding stochioemetry. Even, a tightly relation was established between the binding stochiometry and the nucleic acids structures. Indeed, a great activity is measured when a DBD dimer is formed. Finally, by generating a mutant of DBD PARP-1 in position Trp51 in the zinc finger FI, we have detailed the implication of this Trp residue in the DBD structures maintain. By this work, the Trp51 seems to be relevant for keeping the binding properties of the DBD PARP-1

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Monlun, Eric. "Diagnostic virologique des infections a papillomavirus de type 16 et 18 : mise au point d'une technique d'amplification genomique (pcr : [polymerase chain reaction])." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1990. http://www.theses.fr/1990STR1M093.

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Bourguet, Pierre. "Etude des voies de silencing transciptionnel indépendantes de la méthylation ADN chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Université Clermont Auvergne‎ (2017-2020), 2018. http://www.theses.fr/2018CLFAC091/document.

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Abstract:

Le silencing transcriptionnel limite la transcription des gènes et des éléments transposables dont l’expression pourrait être délétère à la cellule. Il dépend d’une diversité de modifications de la chromatine comme la méthylation ADN ou les marques répressives des histones. De façon à mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine du silencing transcriptionnel, nous avons mené une approche de génétique directe à l’aide d’un transgène soumis au silencing dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Cette stratégie nous a permis d'isoler à la fois des mutants déficients pour le maintien du silencing transcriptionnel et des mutations qui empêchent la réactivation transcriptionnelle des éléments transposables en réponse à un stress thermique. Nous avons caractérisé les défauts provoqués par ces mutations en combinant des approches de biologie moléculaire, de cytologie et de génomique.Nous montrons ainsi que MED14, la sous-unité centrale du complexe Mediator, et UVH6, composant du complexe TFIIH, sont requis pour la transcription de l'hétérochromatine en stress thermique. MED14 stimule aussi la transcription de l'hétérochromatine en l'absence de stress, mais ne semble fonctionner qu'en présence de la méthylation ADN. En plus de cette fonction originale, nous identifions un nouveau rôle de MED14 dans le maintien de la méthylation ADN, possiblement via la voie de méthylation ADN dirigée par les petits ARN.Par ailleurs, nos résultats nous ont permis d’identifier le rôle des protéines MAIN et MAIL1, qui définissent une voie de silencing transcriptionnelle indépendante des voies connues jusqu'alors. De façon intéressante, MAIN et MAIL1 possèdent un domaine protéique partagé avec les éléments transposables, qui aurait successivement été capturé par les éléments transposables et leur hôte au cours de l’histoire évolutive des plantes à fleurs.Enfin, en isolant une nouvelle mutation du gène POL2A, nous confirmons le rôle de l’ADN polymérase epsilon dans le silencing transcriptionnel et caractérisons les propriétés chromatiniennes qui dépendent de POL2A. Nous montrons que les défauts de silencing des mutants pol2a corrèlent avec une désorganisation importante de l’hétérochromatine sans diminution drastique des marques qui y sont associées. Au contraire, nous détectons une hyperméthylation ADN prononcée dans le mutant, et explorons différentes hypothèses pour expliquer ce phénotype particulier. Nos données suggèrent que plusieurs mécanismes moléculaires sont à l’origine des défauts des mutants pol2a. Elles confirment le rôle prépondérant de la chromométhylase CMT3 dans la régulation de la méthylation ADN, et suggèrent qu’un stress réplicatif pourrait causer une hyperméthylation de l’ADN.Dans l’ensemble, ces travaux de thèse proposent des pistes de travail dont l’exploration pourrait permettre d’expliquer les effets des déficiences réplicatives dans le maintien du silencing transcriptionnel et de l’homéostasie de la méthylation ADN. Ils suggèrent en outre que MED14 a une fonction dédiée à la transcription de l’hétérochromatine qui pourrait stimuler le maintien de la méthylation ADN
Transcriptional gene silencing hinders deleterious transcription of some genes and transposable elements. Silencing is maintained by numerous chromatin modifications such as DNA methylation and repressive histone marks. To better understand the molecular mechanisms of silencing, we conducted a forward genetic screen using a transgene reporter system targeted by transcriptional gene silencing in the model plant Arabidopsis thaliana. We isolated a first type of mutants with diminished maintenance of silencing and a second category that displayed deficient release of transgene silencing upon heat stress. We then combined molecular, cytological and genomic methods to characterize the defects associated with these mutations.First, we show that the Mediator subunit MED14 and the TFIIH complex subunit UVH6 are required for heat-stress-induced release of silencing. We further show that MED14, but not UVH6, promotes transcriptional activation of transposable elements in mutant contexts where silencing is defective. Importantly, MED14 is only required when DNA methylation is not affected, suggesting that MED14 has a specialized function to promote transcription of heterochromatin. Furthermore, we show that MED14 promote DNA methylation at targets regulated by RNA-directed DNA methylation.Characterizing mutants from the first category, we unveil the contribution of the MAIN and MAIL1 proteins into transcriptional gene silencing, and show that they likely act through a pathway independent of known silencing factors. Interestingly, MAIN and MAIL1 bear a protein domain that is shared with transposable elements, and that has been captured by transposable elements and genes throughout the evolutionary history of flower plants.Additionally, we confirm the involvement of the DNA polymerase epsilon in transcriptional gene silencing by isolating a new mutation of the POL2A gene among mutants of the first category. We characterize the effects of the pol2a mutation on several heterochromatin properties, and show that the pol2a mutant retains high levels of heterochromatin marks despite having highly disorganized heterochromatin. We actually detect a strong elevation of DNA methylation in the pol2a mutant and explore different hypothesis to explain this unusual phenotype. We show that increased expression of the CMT3 chromomethylase is a likely cause, but that additional molecular mechanisms are probably involved. Further exploration suggests that constitutive replicative stress occurring in pol2a mutants could be an additional cause of DNA hypermethylation.To summarize, this work provide putative causes for DNA hypermethylation and silencing defects in a situation of replicative deficiency. Further investigation will be required to identify the molecular components involved in the mechanism. Our data further suggest that MED14 has a function dedicated to heterochromatin transcription that could promote DNA methylation maintenance

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Harismendy, Olivier. "Etude de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae : approches par puces à ADN." Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077094.

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Incan, Michel d'. "L'infection par le virus htlv-1 est-elle une etiologie des lymphomes cutanes a cellules t en france ? revue generale sur le virus htlv-1 en pathologie humaine, et etude personnelle de 42 cas de lymphomes cutanes au moyen de la technique d'amplification genique invi-vitro." Clermont-Ferrand 1, 1990. http://www.theses.fr/1990CLF13816.

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Velours, Christophe. "Réplication de l'ADN mitochondrial : identification d’une seconde activité ADN polymérase dans la mitochondrie de S.cerevisiae et Contribution à l’étude du réplisome mitochondrial." Thesis, Bordeaux 2, 2009. http://www.theses.fr/2009BOR21689/document.

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Abstract:

Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa
During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

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Quintin, Justine. "Organisation de la chromatine et signalisation par les oestrogènes." Thesis, Rennes 1, 2013. http://www.theses.fr/2013REN1S074/document.

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Abstract:

En réponse à son environnement composé de signaux endogènes et exogènes, une cellule doit pouvoir adapter son transcriptome, et cela à travers une modulation fine de l'expression de ses gènes. Les mécanismes permettant une telle adaptation reposent sur de multiples paramètres, entre autre l'organisation du génome, que ce soit au niveau de sa séquence primaire ou de son organisation au sein de la chromatine qui est un support pour l'intégration de nombreuses informations (structurelles et épigénétiques). De plus, l'organisation tridimensionnelle du noyau cellulaire apporte des contraintes physiques et fonctionnelles qui contribuent également à ces régulations. Afin de comprendre comment toutes ces informations peuvent être intégrées lorsqu'un signal régule la transcription d'un ensemble de gènes colinéaires («cluster» de gènes), nos études se sont focalisées sur la description et dissection des mécanismes impliqués dans la régulation coordonnées de gènes œstrogéno-dépendant par le récepteur aux œstrogènes (ER) et ses facteurs pionniers (FOXA1, FOXA2 et GATAs) dans des cellules cancéreuses d'origine mammaire. Dans ce cadre, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au cluster TFF, situé sur le bras long du chromosome 21, incluant le gène modèle TFF1, en utilisant des techniques d'analyse à grande échelle (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C et analyses transcriptomiques)
A given cell has to be able to adapt its fate and homeostasis in response to endogenous and exogenous signals. This adaptation occurs through finely tuned regulations of genes' expressions leading to the variation of their transcriptomes. Multiple parameters have to be integrated in order to provide such mechanisms of regulation. First, the primary sequence of the genome and its organization into chromatin are major regulatory components that harbor genetic, structural and epigenetic information. Second, the three-dimensional organization of the genome into the nucleus brings both physical and functional constraints that also contribute towards these regulatory processes. Here, we engaged a work aiming to understand and dissect how these several levels of information are integrated during the transcriptional regulation of colinear genes (cluster of genes) by the same signal. We took as a model the coordinated regulation of the estrogen-sensitive TFF cluster driven by the estrogen receptor (ER) and its pioneering factors (FOXA1, FOXA2 and GATAs) in mammary cancer cells. This cluster is located within the long arm of the chromosome 21, and contains the gene model termed TFF1. We used large-scale methods (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C and microarray transcriptomic analyses) to decipher these dynamic mechanisms

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Luque, Alejandro E. "La réplication de l'ADN nucléaire dans la cellule de blé : étude des facteurs réplicatifs et mise en place d'un système viral de réplication végétale." Bordeaux 2, 1999. http://www.theses.fr/1999BOR28637.

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Daher, Rana. "Recombinase polymerase amplification technology : Assessment for nucleic acid-based acid-based point-of-care diagnostics." Doctoral thesis, Université Laval, 2015. http://hdl.handle.net/20.500.11794/26269.

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Abstract:

Cette thèse de doctorat porte dans l’ensemble une étude approfondie sur une technologie émergente pour l’amplification isotherme des acides nucléiques appelée recombinase polymerase amplification (RPA). L’introduction porte une description détaillée sur la RPA. Cette revue de littérature documente et discute les diverses applications de la RPA en soulignant les connaissances actuelles concernant les applications diagnostiques. Malgré la composition complexe de la RPA (6 à 7 protéines dans le même mélange réactionnel), cette dernière s’avère une technologie rapide (générant des résultats < 20 min), spécifique et sensible (détection de l’ordre de quelques copies de génome), et largement appliquée dans différentes disciplines. Ces avantages nous permettent de croire que la RPA possède la flexibilité nécessaire pour être utilisée comme outil de diagnostic rapide des maladies infectieuses en réduisant le temps d’obtention des résultats à moins d’une heure au lieu de 2 à 3 jours avec les tests de cultures standards. En conséquence, il sera possible d’intégrer la RPA dans des plateformes microfluidiques ou laboratoire sur puce qui permettent la préparation d’échantillons, l’amplification et la détection des acides nucléiques des microbes causant des infections. En premier lieu, les travaux de cette thèse ont généré des lignes directrices additionnelles pour la conception des amorces/sondes RPA. En second lieu, nos travaux ont permis de développer un essai diagnostic RPA pour la détection des streptocoques du groupe B, responsables de la septicémie et la méningite chez les nouveau-nés. Cet essai fut le premier à évaluer la performance de la RPA avec des échantillons cliniques humains. Ce test diagnostic RPA a été comparé à une méthode de référence, la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cette démonstration sur des échantillons cliniques nous à inciter à pousser notre étude pour réaliser le dernier objectif de ce projet qui consistait à automatiser la RPA par intégration dans un système microfluidique miniaturisé centripète. Une collaboration avec des experts en génies et en matériaux a permis de générer un dispositif microfluidique appelé blade ainsi de l’instrument impliqué dans l’opération des différentes tâches mécanistiques. Ces résultats préliminaires suggèrent qu’il sera important d’offrir un système automatisé complet applicable au chevet du patient. Par conséquence, il sera possible d’exécuter une analyse complète des agents infectieux en moins d’une heure sans le besoin des procédures complexes de préparation et de transport des échantillons cliniques ni le recours à du personnel qualifié.
This dissertation consists of an exhaustive study on an emerging technology for isothermal amplification of nucleic acids called recombinase polymerase amplification (RPA). The introduction of this thesis is a detailed description of the RPA. This review documents and discusses the various applications of this technology by pointing to the current knowledge about RPA for diagnostic applications. Despite the complex composition of RPA (6 to 7 proteins in the same reaction mixture), the latter was shown to be rapid (generating results in < 20 min), specific and sensitive (detecting few target genome copies), and applied widely in different fields. Based on these advantages, we assume that RPA has a flexibility allowing it to be used for the rapid diagnosis of infectious diseases thus reducing time-to-result to less than an hour. Consequently, it will be possible to integrate RPA in microfluidic platforms providing a lab-on chip system. The first part of this doctoral project generated additional guidelines for RPA primers/probes design to develop specific RPA diagnostic assays. Second, we developed an RPA diagnostic test for the detection of group B streptococci, responsible for sepsis and meningitis in newborns. This assay was the first to evaluate RPA with human clinical samples. This diagnostic test was compared to a reference method, the polymerase chain reaction (PCR). This demonstration with clinical samples served to carry out the final objective of this project that was to automate RPA in a miniaturized microfluidic centripetal system. Collaboration with engineers and experts in materials has generated the microfluidic device called "blade" and the instrument involved in the operation of various mechanistic tasks. These preliminary results suggested that it will be important to provide an automated system applicable at bedside. Consequently, it will be possible to perform a complete analysis of infectious agents in less than an hour without the need for complex procedures for the preparation and transport of clinical specimens or the assistance of qualified personnel.

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Daniel, Laurianne. "Human Ribosomal DNA and RNA Polymerase I Fate during UV-induced DNA Repair." Thesis, Lyon, 2017. http://www.theses.fr/2017LYSE1093/document.

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Abstract:

La réparation par excision de nucléotides (NER) garantit l'intégrité du génome lors de l'exposition aux rayons UV. Après irradiation aux UV, un des premiers problèmes rencontrés par la cellule est l'arrêt général de la transcription dû au blocage de l'ARN polymérase II (ARNP2) au niveau des lésions UV. Pour régler ce problème, le NER possède une voie de réparation spécifiquement couplée à la transcription (TCR). Les connaissances concernant le NER ont été obtenu via des études sur la transcription par l'ARNP2. Cependant, dans les cellules à fort métabolisme, plus de 60% de la transcription correspond à la transcription, dans le nucléole, de l'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (ARNP1). De nombreuses protéines sont absence du nucléole, c'est pourquoi certains processus nucléaires ne peuvent avoir lieu dans cette structure. Afin d ‘être répliqué et réparé, l'ADNr se déplace à la périphérie du nucléole. Malgré l'importance de la transcription par l'ARNP1, la réparation de l'ADNr a été peu étudiée chez l'homme. De plus, à notre connaissance, aucune étude ne s'est penchée sur le mécanisme moléculaire du déplacement de l'ADNr à la périphérie du nucléole. Notre étude démontre l'implication de la TCR dans la réparation de l'ADNr après lésions UV induites. De plus, nos recherches ont démontré que l'ARNP1 reste accrochée à l'ADNr et sont tous les deux délocalisés à la périphérie du nucléole après irradiation aux UV. Enfin, nous avons identifié l'actin et la moysine I nucléaires comme facteurs protéiques nécessaire à cette délocalisation
Nucleotide excision repair (NER) guarantees genome integrity and proper cellular functions against UV-induced DNA damage. After UV irradiation, one of the first burden cells have to cope with is a general transcriptional block caused by the stalling of RNA polymerase II (RNAP2) onto distorting UV lesions. To insure UV lesions repair specifically on transcribed genes, NER is coupled with transcription in an extremely organized pathway known as Transcription-Coupled Repair (TCR). Most of the knowledge about TCR has been gathered from RNAP2 transcription. However, in highly metabolic cells, more than 60% of total cellular transcription results from ribosomal DNA (rDNA) transcription, by the RNA polymerase I (RNAP1), which takes place in the nucleolus. Many nuclear proteins are excluded from the nucleolus and because of this some nucleolar processes cannot occur inside this structure. In order to be replicated and repaired rDNAs need to be displaced at the nucleolar periphery. Despite the importance of RNAP1 transcription, repair of the mammalian transcribed rDNA has been scarcely studied. Moreover, to the best of our knowledge no molecular mechanism has been proposed for rDNA displacement. Our study clearly demonstrated that the full TCR machinery is needed to repair UV-damaged rDNA and restart RNAP1 transcription. Our results show that UV lesions block RNAP1 transcription and that RNAP1 is firmly stalled onto rDNAs without being degraded. Our study also describes the displacement of the RNAP1/rDNA complex to the nucleolar periphery after UV irradiation and identifies both nuclear ß-actin and nuclear myosin I as factors required for this displacement

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Lucas, Patrick. "Purification et caractérisation de deux ADN polymérases et d'une transcriptase inverse mitochondriales de la levure Saccharomyces Cerevisiae." Bordeaux 2, 1999. http://www.theses.fr/1999BOR28654.

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Iraqi, Ech-Chaoui Rafika. "Contribution a l'etude des adn polymerases d'embryon de ble : variation de leur taux d'activite au cours de la germination." Bordeaux 2, 1994. http://www.theses.fr/1994BOR28295.

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Abstract:

Cette thèse est une contribution à l'étude dans les embryons de blé, de trois ADN polymérases (pol A, Pol B et Pol C) d'une activité ADN primase ainsi que d'un facteur protéique associé : le PCNA (Antigène nucléaire de prolifération cellulaire). Ces cinq entités exercent un rôle essentiel lors de la réplication de l'ADN in vivo. La première partie de ce travail concerne la purification et la caractérisation de trois ADN polymérases appelées Pol A, Pol B et Pol C. Cette caractérisation a été faite par l'analyse de leurs propriétés physicochimiques et particulièrement par leur sensibilité vis à vis de certains inhibiteurs de la réplication ainsi que leur comportement vis à vis de certaines matrices naturelles ou synthétiques. La deuxième partie traite de la variation de l'activité de ces trois ADN polymérases purifiées d'embryon de blé au cours de la germination, cette dernière représentant un modèle de réplication in vivo. Cette étude est complétée par le suivi du taux de variation de l'ADN primase et d'une protéine auxiliaire (le PCNA) lors de la germination. L'étude au cours de la germination de ces cinq entités permet de proposer avec moins d'ambiguité que dans la littérature scientifique que : 1- l'ADN polymérase A serait l'équivalent de l'ADN polymérase et animale. 2- l'ADN polymérase B serait l'équivalent de l'ADN polymérase et animale. 3- l'ADN polymérase C assurerait un rôle de protection des ADN polymérases dans la graine mature avant germination
Five factors implicated during DNA replication of wheat embryo were analysed. The factors are DNA polymerases (A, B and C), DNA primase and an auxillary protein called PCNA (Proliferating Cell Nuclear Protein). At first, DNA polymerase A, B and C were purified and characterized respectively by chromatographic steps and physicochemical properties including sensitivity with inhibitors of DNA replication and properties with natural and synthetic templates. The second part deals with variation of activity of the DNA polymerases A, B and C previously purified and characterized during wheat embryo germination. We propose a similarity between wheat embryo DNA polymerases and animal DNA polymerases. DNA polymerase A could be similar to an alpha DNA polymerase. DNA polymerase B could be a DNA polymerase delta like. DNA polymerase C could be a storage protein in seed before germination

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Diénot, Magali. "Intérêt diagnostique de la polymérase chain reaction (PCR) leucocytaire et plasmatique au cours de l'infection à cytomégalovirus." Paris 5, 1993. http://www.theses.fr/1993PA05P087.

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Maillard, Patrick. "Sensibilite et permissivite des cellules lymphoides humaines vis-a-vis du virus de l'hepatite b : approches experimentales." Paris 11, 1997. http://www.theses.fr/1997PA114807.

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Zeng, Yué. "Caractérisation d'une protéine de 135 kDa nécessaire à la réplication du virus d'Epstein-Barr." Lyon 1, 1999. http://www.theses.fr/1999LYO1T098.

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Taniga, Velan. "Développement d’un module d’amplification par PCR avec suivi électrochimique pour la détection de bactérie." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066189.

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Abstract:

Nous avons développé un module de detection de bactérie base sur le suivi électrochimique d’une PCR. Le système a été realisé en Copolymère d’Oléfin Cyclique (COC). Il s’agit ici de présenter une nouvelle approche pour concevoir des systèmes de despistage d’infection nosocomiale en quelques heures. INTRODUCTION Avec le développement des flux migratoires de population et l’apparition de résistance aux antibiotiques, les infections nosocomiales sont devenues un enjeu de santé majeur. Les besoins en systèmes de diagnostique accessibles financièrement augmentent considérablement. L’approche qui consiste à intégrer entièrement une chaîne d’analyse commence à avoir les faveurs des systèmes de santé et en particulier de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Une compagnie nord américaine Cepheid a par ailleurs déjà développé un système automatisé de détection de germes basé sur l’identification de l’ADN par PCR. Cependant le coût élevé des technologies ralentit sa démocratisation malgré un apport considérable pour les tests cliniques de routine. Ici nous nous proposons une stratégie d’analyse qui permet de maîtriser les drastiquement les coûts de consommable. Tout d’abord tout le système est réalisé en COC, un thermoplastique qui peut être façonné à très grande échelle pour quelques dizines de centimes l’unité. [1]. Ensuite le système de détection, implique un suivi électrochimique qui remplace avantageusement les plateformes optiques traditionnellement coûteuses. Si la première cible de ce système est le dépistage de maladie nosocomiale, il apparaît aussi qu’il est transposable à d’autres domaines où la détection basée sur une PCR peut apporter des solutions. THEORIE L’échantillon, un écouvillon nasal est prélevé sur le patient. Ensuite les bactéries sont lysées grâce à l’utilisation de détergent. Une fois les parois bactériennes détruites, l’ADN est extrait sur phase solide par l’intermédiaire de billes magnétiques de type « charge switch » assemblées en colonnes [2]. Après lavage l’ADN est élué, puis amplifié par PCR en temps réel. Durant cette phase l’amplification de l’ADN est suivie grâce à l’utilisation d’un intercalant redox. Ce principe de détection fait l’objet d’un brevet [3] et nous présentons ici sa première implémentation dans un système de type laboratoire sur puce. Le complexe redox qui sert d’intercalant est détecté par voltammétrie à onde carrée (en anglais : Square Wave Voltammetry SQWV). Ce complexe interagit avec l’ADN double brin par intercalation pendant la phase d’élongation, ainsi il n’est plus disponible pour l’échange d’électrons avec les électrodes de détection. En conséquence, on observe une chute du niveau de courant mesuré pendant la SQWV qui correspond à l’augmentation de la quantité d’ADN. PRATIQUE De noveaux protocoles de fabrication de systèmes en thermoplastique ont été développés permettant de réaliser des système en COC robustes et étanches. L’intégration des électrodes sérigraphiées a été réalisée avec succès. Le desgin de la puce a été choisi afin de permettre la parallélisation d’expérience en vue des tests de sensibilité de détection. Afin de réaliser les cycles de chauffage nécessaire à l’amplification par PCR un système dédié, comprenant un bloc thermique, un système de régulation et une partie logicielle à été développé. La preuve de concept de l’efficacité du système a été démontré sur de l’ADN modèle : le Litmus. Il est possible de distinguer différentes concentration en ADN de départ
With the development of human mobility and antibiotics resistance, nosocomial infections have become a major health problem. The need for fast and efficient diagnosis systems, ,while affordable by the health care systems, is increasing. The “sample to result” integration allowed by microfludics is a strong asset in such developments. Cepheid developed an integrated system for germ genotyping based on real-time PCR, but due to expensive laser-induced fluorescence detection its cost still reduces its range of applications in routine clinics. Here, we propose a new strategy allowing further cost reduction. First, the whole analysis streamline is integrated in a single chip made of Cyclo Olefin Copolymer (COC) [1]. This material can be mass-processed by CD technology, to yield chips at a few cents a piece. Second, the detection involves an electrochemical method that alleviates need for optics. Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) was chosen as the initial primary target for validation. The technologies developed will further be applied to other strains of Bacteria or other fields such as agriculture, food testing, GMOs or security. The sample, a nasal swab, undergoes a chemical lysis, and DNA is extracted by selective capture on magnetic beads self-assembled into dense microcolumns arrays, as presented at MicroTAS 2009 [2]. DNA is then eluted, amplified by PCR in real time in the chip, while detected in situ by a high sensitivity electrochemical detection catalyzed by an intercalating redox compound. This proprietary technology [3] is being implemented here for the first time in a lab on chip. New protocols were developed to make a robust and leakage-free COC microfluidic chip with integrated electrodes. COC is a biocompatible and solvent resistant thermoplastic material. The COC microfluidic chip consists of a substrate with a hot-embossed microchannel and screen printed carbon and silver electrodes. The chip is sealed by solvent bonding [4]. This provides simple and cost effective fabrication, directly upscalable to mass production PCR Thermal control is done externally with a customized thermocycler. A redox compound is introduced together with DNA sample enabling electrochemical detection through Square Wave Voltammetry (SQWV). This compound intercalates in double-stranded DNA during the extension step, reducing its mobility and redox activity, so the peak current decreases during amplification of the target DNA. A sensitivity below 1ng/µL suitable for MRSA detection was achieved. The data were obtained by SQWV measurements. There is a clear correlation between the increase of DNA concentration and the decrease of the peak current for the redox compound: PCR amplification was also performed inside the chip, demonstrating the compatibility of this platform with thermal cycling and biomolecular reactions. Real-time electrochemical measurement during cycling was not possible yet due to experimental setup geometrical constraints, but work is in progress and results will be presented at the conference. Future experiments will focus on the integration of the bacteria lysis and DNA extraction steps on the same chip

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Balaguer, Patrick. "Détection non isotopique de sondes nucléiques : application à la réaction d'hybridation et d'amplification (PCR) : [Polymerase Catalysed Reaction]." Montpellier 2, 1989. http://www.theses.fr/1989MON20050.

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Abstract:

Les reactions de bioluminescence peuvent etre utilisees pour detecter des sequences specifiques d'adn apres hybridation avec une sonde nucleique. Differents marqueurs comme la cytosine sulfone, la fluoresceine et la biotine peuvent etre incorpores dans l'adn ou dans des oligonucleotides et etre detectes par des anti-corps ou de l'avidine lies a des enzymes. La detection par bioluminescence sur filtre de nitrocellulose offre une sensibilite comparable aux meilleures methodes non radioactives mais apporte surtout une mesure rapide, quantitative et facilement realisable par des films polaroid ou une camera video. La detection n'altere pas le filtre et permet la reutilisation de celui-ci. La luminescence peut etre utilisee pour detecter des reactions d'hybridations effectuees en solution mais la sensibilite est inferieure a celle obtenue sur filtre. L'amplification enzymatique permet de produire en grande quantite du materiel a detecter. L'incorporation de biotine-utp ou l'utilisation d'oligonucleotides amorces biotinylees dans la reaction d'amplification produit des molecules d'adn marquees qui peuvent etre detectees directement sans aucune etape de separation. Ce dosage est semi-quantitatif et rapide (1 heure)

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Taberlet, Pierre. "ADN mitochondrial et phylogéographie intraspécifique : [thèse soutenue sur un ensemble de travaux]." Grenoble 1, 1992. http://www.theses.fr/1992GRE10017.

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Abstract:

La mise en relation de phylogenies intraspecifiques (obtenues par l'analyse de sequences d'adn mitochondrial) avec des donnees biogeographiques permet de mieux comprendre l'histoire evolutive recente des especes animales. Les resultats obtenus concernent trois especes differentes. L'analyse des sequences de l'adn mitochondrial de la mesange bleue (parus caeruleus) dans la region grenobloise a mis en evidence deux lignees maternelles bien differenciees. Le morcellement de l'aire de repartition durant une partie du quaternaire puis le melange recent de deux populations anterieurement isolees pourrait permettre d'interpreter ce resultat. Les musaraignes du groupe sorex araneus presentent une evolution chromosomique spectaculaire. Nos resultats indiquent que l'evolution de l'adn mitochondrial et l'evolution du caryotype sont deux processus presque independants. Alors que les haplotypes mitochondriaux se trouvent tres lies a l'histoire biogeographique, les mutations chromosomiques (fusions robertsoniennes) peuvent aisement etre transmises d'une population a l'autre. L'ensemble des donnees disponibles suggerent que l'impressionnant polymorphisme chromosomique de ce groupe est un phenomene tres recent. A partir des cellules presentes a la base d'un seul poil preleve sur un ours brun des pyrenees (ursus arctos) captif, nous avons extrait l'adn total, amplifie et sequence une partie du gene du cytochrome b. La comparaison avec trois sequences homologues a permis de construire un arbre phylogenetique faisant apparaitre que l'ours brun des pyrenees se serait individualise nettement avant la divergence recente de l'ours brun d'alaska (u. Arctos) et de l'ours blanc (u. Maritimus)

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Rozenberg, Flore. "Analyse de determinants de virulence du virus herpes simplex (hsv) dans l'encephalite herpetique humaine ; contribution a l'etude du pouvoir neuropathogene de hsv chez l'homme." Paris 11, 1997. http://www.theses.fr/1997PA114857.

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Reguillon, Isabelle. "Les mécanismes de la transcription chez les eucaryotes." Bordeaux 2, 1994. http://www.theses.fr/1994BOR2P049.

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Pedroza-Garcia, José Antonio. "Functional characterization of the DNA Polymerase epsilon and its involvement in the maintenance of genome integrity in Arabidopsis." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS248.

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Abstract:

Contrairement aux animaux, les plantes ont un développement largement post-embryonnaire et forment continuellement de nouveaux organes et tissus grâce à l’activité de leurs méristèmes. Ces massifs de cellules indifférenciées conservent la capacité à se diviser tout au long de la vie de la plante, et c’est également à partir du méristème caulinaire que se forment les gamètes. Chaque cycle de division peut être la source de mutations, suite par exemple à des erreurs de réplication. De plus, les méristèmes sont relativement exposés aux stress environnementaux qui peuvent également endommager l’ADN des cellules. Les mécanismes impliqués dans la détection des lésions de l’ADN ou des défauts de réplication et l’arrêt de la prolifération cellulaire en réponse à ces dommages jouent donc un rôle fondamental dans le maintien de la stabilité du génome, aussi bien au cours du développement végétatif que lors de la reproduction sexuée. Chez tous les eucaryotes, l’ADN Polymérase ε est un acteur central de ces mécanismes parce qu’elle assure non seulement la réplication fidèle de l’ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire, mais est également directement impliquée dans la réparation de l’ADN, et dans la perception du stress réplicatif. L’étude détaillée de sa fonction est cependant rendue difficile chez beaucoup d’organismes par le fait que son inactivation est létale. Dans ce travail, nous avons utilisé des approches de génétique pour étudier le rôle de l’ADN Pol ε d’Arabidopsis au cours de la progression du cycle cellulaire et dans la réponse au stress réplicatif et aux lésions de l’ADN. Nous avons ainsi pu montrer que la sous-unité catalytique du complexe Pol ε ainsi que sa principale sous-unité accessoire DPB2 sont essentielles à la détection des défauts de réplication, et fonctionnent en amont de la kinase ATR pour induire l’arrêt du cycle cellulaire et activer les voies de réparation au cours du développement végétatif. En outre, nous avons découvert un nouveau point de contrôle activé lors de la phase de réplication pré-méiotique qui permet l’activation d’une mort cellulaire programmée en réponse à des défauts survenus pendant cette phase, grâce au facteur de transcription SOG1.Tous les stress biotiques ou abiotiques auxquels la plante est soumise pouvant conduire à la formation de lésions au niveau de l’ADN, nos résultats ouvrent des perspectives de recherche pour comprendre la réponse des plantes aux stress environnementaux. En outre, la disponibilité de mutants viables pour différents facteurs impliqués dans la réplication ou la réponse aux lésions de l’ADN nous a permis d’explorer chez un eucaryote pluricellulaire des mécanismes qui sont pour l’instant essentiellement décrits chez la levure, et ainsi d’acquérir des connaissances qui pourront être transférées aux systèmes animaux et notamment à l’Homme
Plant development is a largely post-embryonic process that depends on the activity of meristems. These pools of undifferentiated cells retain the ability to proliferate throughout the lifespan of the plant, and are at the origin of gamete formation relatively late in its life cycle. Mutations can arise at each round of cell division, for example due to replication errors. In addition, meristems are relatively exposed to all kinds of environmental stresses that can also induce DNA damage. Detection of DNA lesions or replication defects and subsequent cell cycle arrest are thus instrumental to the maintenance of genome integrity, both during vegetative and reproductive growth. In all eukaryotes, DNA Pol ε is a key player of these mechanisms because it is not only responsible for the faithful reproduction of the genetic information during S-phase, but also directly involved in DNA repair and replicative stress perception. Detailed analysis of its function has however been complicated by the lethality of its inactivation in most organisms. In this work, we have used genetic approaches to investigate its role during cell cycle progression and replicative stress response. We have shown that both its catalytic sub-unit and its main accessory sub-unit DPB2 are involved in replicative stress sensing and that they function upstream of the ATR kinase to induce cell cycle arrest and DNA repair during vegetative growth. In addition, we have found that a specific checkpoint exists during pre-meiotic DNA replication that activates a cell death program via the SOG1 transcription factor upon replicative stress. Because all types of biotic and abiotic stresses can generate DNA damage, our work opens new research prospects to understand how plants cope with adverse conditions. Furthermore, the viability of Arabidopsis mutants deficient for various factors involved in DNA replication or DNA Damage Response allowed us to analyse into details in a multicellular eukaryote crucial cellular mechanisms that had until now been mainly investigated in yeast. This work thus allowed us to generate data that can be transferred to animal systems and notably to Human

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Thomen, Philippe. "Transcription par une ARN Polymerase : mesures de forces à l'échelle de la molécule unique." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2002. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011391.

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Abstract:

Nous avons réalisé une expérience à l'échelle de la molécule unique pour étudier l'influence d'une force mécanique sur la transcription par l'ARN polymérase du phage T7. Cette enzyme, prototype de moteur moléculaire, est très processive et partage des homologies avec les membres de la famille Pol I incluant la transcriptase inverse du VIH 1. Une extrémité de l'ADN à transcrire est tenue par une polymérase fixée sur une surface, l'autre extrémité est attachée à une bille microscopique capturée à l'aide d'un piège optique interférométrique qui permet de mesurer la force développée durant la transcription. Des mesures de vitesse de transcription ont été réalisées dans la gamme 5-20 pN, à différentes concentrations en nucléotides (NTP). On observe que la diminution de la concentration en NTP, qui rend l'étape de liaison du nucléotide dans le site actif limitante, fait apparaître une dépendance marquée de la vitesse à la force, alors que les hautes concentrations en NTP rendent la polymérase insensible à la force. On en déduit que le mouvement d'avancée de l'enzyme le long de l'ADN est couplé à la fixation du nucléotide dans le site actif. Ainsi l'énergie d'hydrolyse n'est pas directement convertie en énergie mécanique. Les homologies entre polymérases suggèrent que ce mécanisme est également partagé, ce qui permet de proposer que pour les polymérases en général, l'étape de fixation du nucléotide dans le site actif est couplé au mouvement sur l'ADN.

Nous avons également mené un autre type d'expérience en mesurant la force lors de l'ouverture mécanique de la double hélice d'ADN, qui a permis de déterminer la friction exercée sur l'ADN en rotation.

La configuration d'ouverture de l'ADN a été également utilisée pour étudier l'interaction d'une protéine, EcoR V avec l'ADN. L'analyse des résultats a mis en évidence une grande variabilité dans l'énergie de dissociation, liée à des différences d'affinités entre les sites de reconnaissance spécifiques de l'enzyme.

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Bednarska, Aleksandra. "Artificial systems for in vitro gene expression." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLN016/document.

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Abstract:

L’ARN polymérase dépendante d’ADN (RNAP) est une enzyme responsable de la polymérisation de ribonucleotides dans une séquence d'ARN complémentaire de l'ADN de matrice. La famille de RNAP a plusieurs membres, comme de protéines sous-unité unique (par exemple du bactériophage T7) ou multiple sous-unité (bactériennes et eucaryotes). Transcription de l'ARN - un événement crucial dans l'expression des gènes - varie en fonction de l'origine de RNAP. Bien que le processus de transcription est relativement bien caractérisée, de nombreux éléments restent mal compris, surtout par rapport à la dynamique de la reconnaissance de promoteur, d'évasion et de l'allongement dans une contexte de cellule où la densité moléculaire, les concentrations et les effets plus proches environs sont importants. L'objectif de cette thèse était la développement d’une méthode qui permettrait suivre la réaction RNAP in vitro en temps réel dans des conditions très contrôlées. Un axe majeur a été mis pour développer un biocapteur basé surface qui permettrait à la caractérisation des principales étapes de la réaction de transcription. Par conséquent, les interactions entre des molécules d'ADN immobilisés sur une surface du capteur et RNAP libre délivré par un système microfluidique de la surface ont été examinées. Changements de l'indice de réfraction, corrélés avec les changements de masse sur la surface ont été suivis en utilisant l'imagerie par résonance de plasmon de surface (SPRi). SPRi est une technique sensible dédiée à l'analyse des interactions entre deux ligands en temps réel. Les bases du mécanisme sont la détection de légères différences dans la réflexion de la lumière polarisée à un angle fixe qui est associé avec une variation de masse à l'interface. Les données obtenues à partir SPRi sont utilisées pour déterminer la cinétique des interactions. Géométrie d’ADN puces permet de suivre plusieurs échantillons simultanément, qui raccourcit considérablement le temps que de manipulation et améliore la qualité et la reproductibilité des résultats obtenus. Autres biocapteurs optofluidique: résonateur de microring et microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont été développés en parallèle. Nous avons biofunctionalisé et caractérisé des surfaces de capteur (de verre couvert de polymère pour un résonateur de microring et la microscopie TIRF et 50 nm couche mince d’or sur des prismes de SPRi) afin d'immobiliser ADN d'une manière contrôlée, par création d’une monocouche auto-assemblée (SAM). Fonctionnalisation de polymères SU-8 concernées deux méthodes: covalent immobilisation de (bio) molécules et la conjugaison non covalente sur la base de couplage hydrophobe. Pour la fonctionnalisation de surface d’or, quatre stratégies différentes d'immobilisation des molécules ont été comparés: formation de la liaison de thiol - or, la formation des liaisons amide, interactions extrAvidin - biotine et le couplage hydrophobe. Les études de la conjugaison de l'ADN à la surface d'or fonctionnalisé ont été effectuées en ce qui concerne la spécificité et la densité d'ADN immobilisées de longueurs différentes: 50, 500 et 1000 pb. Enfin, les surfaces biofunctionalized ont été utilisées pour suivre en temps réel des réactions de transcription de deux RNAP: bactériophage T7 RNAP monomère et l'holoenzyme d'Escherichia coli RNAP. Les analyses cinétiques de la formation d’un complexe nucléoprotéine et la transcription d'ARN ont été fait par report de la densité et la longueur de l'ADN immobilisé, la position de la séquence du promoteur spécifique. Transcription de l'ARN dans l'appareil SPRi a été confirmée par la collection, la détection et l'analyse des produits ARN.L'objectif final comprends une synthèse de l'ARN contrôlée qui serait une étape intermédiaire d'enquêter en temps réel la production de protéines in vitro
DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) is an enzyme responsible for the polymerization of ribonucleotides into an RNA sequence complementary to the template DNA. RNAP family has several members being single subunit (e.g. T7 bacteriophage) or multi subunit (bacterial and eukaryote) proteins. RNA transcription – a crucial event in gene expression – differs depending on the RNAP origin. Although the transcription process is relatively well characterized, many elements remain poorly understood, especially with respect to the dynamics of promoter recognition, escape and elongation in a cell like context where molecular density, concentrations and nearest neighbour effects are prevalent.The goal of this thesis was to develop a robust method that would allow real time monitoring of RNAP reaction in vitro in thoroughly controlled conditions. A major axis was to develop a surface-based biosensor that would allow the characterization of the main steps of the transcription reaction. Consequently, interactions between DNA molecules immobilized on a sensor surface and free RNAP delivered through a microfluidic flow system to the surface were examined. Changes in refractive index, correlated with changes in mass at a surface were followed using surface plasmon resonance imaging (SPRi). SPRi is a sensitive technique dedicated to analysis of interactions between two ligands in real time. The mechanism bases on the detection of slight differences in the reflectivity of polarized light at a fixed angle that are associated with a mass variation at the interface. Data obtained from SPRi are used to determine the kinetics of the interactions. Microarray geometry of SPRi allows monitoring several samples simultaneously that significantly shortens manipulation time and improves a quality and reproducibility of obtained results. Other label-free optofluidic biosensors: microring resonator and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy were developed in parallel.We firstly biofunctionalized and characterized sensor surfaces (polymer coated glass for microring resonator and TIRF microscopy and 50-nm thin layer gold coatings on glass prisms for SPRi) in order to immobilize DNA strands in a controlled manner, using a self-assembled monolayer (SAM). Functionalization of photoresist polymer SU-8 concerned two methods: covalent (bio)molecule grafting and non-covalent conjugation based on hydrophobic coupling. Regarding gold surface functionalization, four different strategies of antifouling (bio)molecule immobilization were compared: thiol – gold bond formation, amide bond formation, extrAvidin – biotin interactions and hydrophobic coupling. Studies of DNA conjugation to the functionalized gold surface were performed with respect to specificity and density of immobilized DNA molecules of different lengths: 50, 500 and 1000 bp.Finally, biofunctionalized surfaces were used for real time monitoring of transcription reactions using two RNAPs: monomeric bacteriophage T7 RNAP and the holoenzyme of Escherichia coli RNAP. Kinetic analyses of nucleoprotein complex formation and RNA transcription were performed as a function of immobilized DNA density, the length of the immobilized DNA, the position of the specific promoter sequence with respect to the point of immobilization and the direction of subsequent transcription. RNA transcription in the SPRi apparatus was confirmed by collection, detection and analysis of relevant products.The future development of biosensors dedicated to in vitro gene expression will include the adaptation of the methods presented above to other optofluidic systems and further development of the technique. The final goal comprises a controlled RNA synthesis that would be an intermediate step to investigate real time in vitro protein production

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Arnaud-Barbe, Nadège. "Définition d'un système d'expression et de purification d'ARN polymérases recombinantes du bactériophage T7 : étude de la transcription de matrices ADN et ARN par ces polymérases." Lyon 1, 1998. http://www.theses.fr/1998LYO1T071.

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Raia, Pierre. "Détermination de la structure de l’ADN polymérase D par cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS338.

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Abstract:

Dans toutes les formes de vie, les ADN polymérases jouent un rôle central dans la réplication du génome, sa maintenance et sa réparation. Toutes les ADN polymérases ont été classées en sept familles distinctes en se basant sur leur homologie de séquence : PolA, PolB, PolC, PolD, PolX, PolY et les reverse transcriptases. La dernière famille d’ADN polymérase pour laquelle la structure et le mécanisme moléculaire demeurent inconnus est la PolD. La PolD est l’une des ADN polymérases réplicatives des Archées. C’est une polymérase hétérodimérique composée d’une sous-unité DP1, qui catalyse l’activité de relecture exonucléase 3’-5’, et d’une sous-unité DP2, qui catalyse l’activité de polymérisation 5’-3’. Afin de résoudre l’incertitude concernant les origines évolutives de la PolD, j’ai déterminé la structure cristallographique des domaines catalytiques des sous-unités DP1 et DP2 de Pyrococcus abyssi et la structure du complexe DP1-DP2 lié à l’ADN, par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Ces structures révèlent que la PolD est une ADN polymérase atypique qui diffère de celle des autres ADN polymérases caractérisées à ce jour. De plus, DP2 partage une homologie structurale inattendue avec les ARN polymérases à ‘deux-tonneaux-β’. Ces travaux clarifient les relations évolutives entre toutes les ADN polymérases et mettent en lumière le mécanisme d'acquisition et d'échange de domaines qui s'est produit au cours de l'évolution du réplisome eucaryote
In all forms of life, DNA polymerases play central roles in genome replication, maintenance and repair. All DNA polymerases have been grouped in different families, using sequence alignments: PolA, PolB, PolC, PolD, PolX, PolY and reverse transcriptases. The only class of DNA polymerases left whose structure and molecular mechanism are unknown is PolD. PolD is an archaeal replicative DNA polymerase made of a proofreading exonuclease subunit (DP1) and a larger polymerase catalytic subunit (DP2). To help resolve the uncertainty concerning the evolutionary origins of PolD, I determined the crystal structures of two large fragments of both DP1 and DP2 subunits of the Pyrococcus abyssi PolD. Crystal structures of both DP1 and DP2 subunits revealed that PolD is an atypical DNA polymerase. We also determined the cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the DP1-DP2 complex bound with DNA. Structures of both polymerase and proofreading active sites differ from other structurally characterized DNA polymerases. In addition, PolD shares an unexpected structural homology with the ‘two-barrel’ family of RNA polymerases. By many aspects, this work provides new insights on the evolutionary history of DNA and RNA polymerases

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Diab, Rim. "Etudes sur la transcriptase inverse de HIV-1 : interactions de la polymérase avec son amorce spécifique et recherche des inhibiteurs de type leurre." Bordeaux 2, 1996. http://www.theses.fr/1996BOR28415.

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Hodeib, Samar. "Real-time unfolding of DNA G-quadruplexes by helicases and polymerases." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017PSLEE027/document.

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Abstract:

Les structures G-quadruplexes (G4) sont considérées comme des obstacles qui s’opposent à la progression du réplisome. Les séquences capables de former des G4 dans le génome humain se trouvent dans les régions d’ADN double brin au niveau des oncogènes et des proto-oncongènes et sur l’extrémité simple brin des télomères. La plupart des études biochimiques et biophysiques ont caractérisé les propriétés thermodynamiques des G4 en utilisant par exemple la température de fusion Tm pour déduire la thermodynamique de la formation/résolution du G4. Cependant, les expériences en solution donnent seulement une information indirecte concernant la dynamique du G4. Dans ce travail de thèse en molécule unique utilisant la technique des pinces magnétiques, nous avons pu caractériser la cinétique de la formation et résolution des G4s ainsi que la stabilité d’une structure G4 insérée dans une région d’ADN double brin : une situation qui ressemble aux G4 dans les promoteurs de gènes, où la séquence complémentaire est en compétition avec la formation de la structure de G4. Nous avons trouvé que le G4 télomérique a une très courte durée de vie (~20 s) et donc ce G4 se résout sans qu’une hélicase soit nécessaire. Au contraire, ce n’est pas le cas pour le G4 du c-MYC qui est très stable (~2h). Nous avons observé en temps réel la collision entre les hélicases et les polymérases et le G4 du c-MYC. Nous avons trouvé que l’hélicase Pif1 ouvre l’ADN puis résout le G4 après avoir effectué une pause et reprend l’ouverture de l’ADN, alors que l’hélicase RecQ et l’hélicase réplicative du bactériophage T4 ne peuvent pas le résoudre, mais peuvent le sauter. Nous avons aussi trouvé que la RPA ne peut pas résoudre le G4 du c-MYC. D’autre part, nous avons observé que la polyémrase du virus T4, la gp43, ainsi que la polymérase de T7, et la polymérase ε de la levure peuvent répliquer le G4 du c-MYC qui de façon étonnante ne constitue pas une barrière infranchissable
G-quadruplex (G4) structures are considered as the major impediments for the replisome progression. The putative G4 forming sequences in the human genome are mostly located in the double-stranded DNA regions of oncogenes and proto-oncogenes and on the single-stranded overhangs of telomeres. Most of the biochemical and biophysical studies have characterized the G4 thermodynamics properties using melting temperature Tm as a proxy to infer thermodynamics of G4 folding/unfolding energetic. However, these thermodynamics properties give only indirect information about G4 dynamics. In this work, using single molecule magnetic tweezers technique, we first characterize the kinetics of folding and unfolding and thus the stability of a single G4 inserted in a dsDNA: a situation that mimics the G4s in promoters, where the complementary sequence competes with the G-rich structure. We find that the lifetime of telomeric G4 is short (~20 s) and thus that this G4 unfolds without the need of a helicase. This is not the case for the very stable c-MYC G4 (~2 hr). We observe in real time how helicases or polymerases behave as they collide with the c-MYC G4 on their track. We find that the Pif1 helicase unwinds dsDNA, resolves this G4 after pausing and resume unwinding, while RecQ helicase and the bacteriophage T4 replicative helicase do not resolve the G4 but may jump it. We also find that RPA does not unfold the c-MYC G4. Besides, we find that T4 bacteriophage gp43 polymerase, T7 polymerase and Yeast Pol ε can replicate the G4 which surprisingly does not appear as a major roadblock for them

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Jagoueix, Sandrine. "Liberobacter africanum et liberobacter asiaticum, les bactéries associées à la maladie du greening des agrumes : caractérisation, phylogénie et détection par l'étude de l'ADN ribosomique 16S." Bordeaux 2, 1995. http://www.theses.fr/1995BOR28363.

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Hazan, Corinne. "Recherche d'inhibiteurs de haute affinité de l'ADN polymérase bêta par criblage virtuel et RMN." Toulouse 3, 2008. http://thesesups.ups-tlse.fr/279/.

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Abstract:

L'ADN polymérase Beta est une cible pharmacologique de la progression tumorale et de la résistance aux traitements anti-tumoraux et de certaines maladies neuro-dégénératives. Plusieurs inhibiteurs de pol Beta ont déjà été identifiés, mais leur affinité est insuffisante pour un développement pharmacologique. L'approche par fragment permet de concevoir des molécules de haute affinité, en liant de façon covalente deux fragments d'affinité moyenne pour pol Beta, se fixant dans deux sites disjoints mais proches. Le premier fragment, l'acide pamoique, est issu de la littérature (Kd 13 µM). La caractérisation structurale de son interaction avec pol Beta a permis de déterminer deux sites adjacents au site de fixation de l'acide pamoique. Un criblage virtuel de 28714 fragments, combiné à un criblage par RMN pour vérifier la distance entre l'acide pamoique et les fragments testés, a permis de sélectionner 4 fragments. Ces fragments ont été utilisés pour créer 4 molécules hybrides acide amoique-linker-fragment. Des tests de réplication in vitro d'ADN par pol Beta ont montré que deux des molécules synthétisées avaient une activité inhibitrice significativement meilleure que l'acide pamoique
DNA polymerase Beta is a pharmacological target involved in tumor progression, cisplatin resistance and neuro-degenerative diseases. Even if molecules leading to pol Beta inhibition have already been discovered, there is a great interest in identifying inhibitors with higher affinity. SAR (Structure Activity Relationship) by NMR is a strategy that allows the design of high affinity molecules, by tethering together two micromolar affinity small molecules for pol Beta that bind to proximal subsites of the target. The first fragment, pamoic acid, was already known. The structural characterization of the complex pol Beta - pamoic acid was helpful in identifying two adjacent sites to pamoic acid binding site. A virtual screening of 28714 fragments, combined to NMR screening, led to selecting 4 fragments, whose binding site was close enough to pamoic acid binding site. Four hybrid molecules, of the form pamoic acid-linker-fragment, have been synthesized and tested for their ability to inhibit in vitro replication by pol Beta. Two of them showed increased inhibition compared to pamoic acid

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Essalhi, Kadija. "Interaction entre yOgg1, une ADN glycosylase de la voie BER, et l’ADN polymérase réplicative Polε chez Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Orléans, 2013. http://www.theses.fr/2013ORLE2077/document.

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Abstract:

Les dommages oxydatifs de l’ADN sont impliqués dans les processus pathologiques que sont le cancer, les maladies neurodégénératives ou le vieillissement. Ces dommages résultent en partie de l’action des espèces réactives de l’oxygène (ERO), qui proviennent du métabolisme cellulaire ou d’agents exogènes (physiques ou chimiques), et qui conduisent à différents types de lésions parmi lesquelles l’oxydation des bases de l’ADN (8-oxoguanine, 8-oxoG) ou la formation de sites abasiques AP (apurique/apyrimidique). Ces lésions, qui si elles ne sont pas éliminées conduisent à des processus de mutagenèse ou de mort cellulaire, sont prises en charge spécifiquement par le système de réparation de l’ADN par excision de base ou BER. Le BER est initié par l’action d’une ADN glycosylase, telles que la 8-oxoG-ADN glycosylase (Ogg1) chargée d’éliminer la 8-oxoG, une lésion très abondante. Une étude par « double-hybride » initiatrice de ce projet a révélé l’existence d’une interaction in vivo chez S. cerevisiae entre la protéine yOgg1 et la sous-unité catalytique de l’ADN polymérase réplicative Polε (yPol2), également impliquée dans la voie BER chez la levure. Nos travaux démontrent que yOgg1 et yPol2 interagissent bien physiquement entre elles et de façon spécifique. Une étude par troncations et mutagenèse dirigée nous a permis d’identifier le domaine 3’→5’ exonucléase de yPol2 comme faisant partie de la forme tronquée minimale de yPol2 capable d’interagir avec yOgg1. La poche du site actif de yOgg1 et/ou son voisinage immédiat pourrait contenir pour partie le site d’interaction pour yPol2. Nous observons d’ailleurs une corrélation nette entre l’activité de yOgg1 et sa capacité à interagir avec yPol2 dans la levure. De même, l’activité 3’→5’ exonucléase de yPol2 pourrait être liée à son interaction avec yOgg1. D’un point de vue fonctionnel, yPol2 stimulerait l’activité AP lyase de yOgg1 et le couplage entre l’activité ADN glycosylase et AP lyase de l’enzyme, permettant ainsi une meilleure coordination de l’étape d’excision du nucléoside endommagé et l’étape de resynthèse de l’ADN dans la voie BER
Oxidative DNA damages are involved in pathological processes such as cancer, neurodegenerative diseases and aging. Part of these damages results from the action of reactive oxygen species (ROS), which are produced by cellular metabolism or (physical or chemical) exogenous agents. They lead to different types of DNA lesions including DNA base oxidation (8-oxoguanine, 8-oxoG) and abasic site formation (AP, apuric/apyrimidic). If not removed, these lesions lead to mutagenesis or cell death. Most of base lesions are dealt specifically by the base excision repair (BER) pathway. BER is initiated by a DNA glycosylase, such as 8-oxoG-DNA glycosylase (Ogg1) which is responsible for the removal of 8-oxoG. In previous unpublished work, a yeast two-hybrid study revealed the existence in S. cerevisiae of an interaction between yOgg1 and the catalytic subunit of the replicative DNA polymerase Polε (yPol2), also involved in the BER pathway in eukaryotes. Our work shows that yOgg1 and yPol2 physically and specifically interact with each other. Truncation and site-directed mutagenesis studies allowed us to identify the 3 ' → 5' exonuclease activity domain of yPol2 as part of the minimal form of yPol2 still able to interact with yOgg1. The active site of yOgg1 and/or its immediate vicinity may contain part of its interaction domain with yPol2. Besides, we observe a clear correlation between yOgg1 catalytic activity and its ability to interact with yPol2 in vivo. Similarly, the 3'→5' exonuclease activity of yPol2 could be useful to its interaction with yOgg1. From a functional point of view, yPol2 stimulates in vitro the AP lyase activity of yOgg1 and the coupling of both DNA glycosylase and AP lyase enzyme activity. The interaction yOgg1/yPol2 could allow a better coordination of damaged nucleoside excision and DNA re-synthesis steps in BER

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Goullet, de Rugy Théo. "Etude de l'effondrement rapide des fourches de réplication lors d'un stress réplicatif." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30238.

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Abstract:

Le Stress Réplicatif est caractérisé par une accumulation de fourches bloquées et est connu pour être une source majeure d'instabilité génétique dans les cellules humaines. Le Stress Réplicatif et l'instabilité génétique sont des marqueurs précoces de la tumorigenèse. Il est connu que les fourches de réplication bloquées peuvent dégénérer en cassures double brin. En effet, après un stress réplicatif prolongé (24h) induit par l'hydroxyurée (HU), l'endonucléase MUS81-EME1 peut promouvoir l'effondrement des fourches de réplication. Cette endonucléase prévient l'accumulation de régions sous-répliquées en G2 et des défauts de ségrégation chromosomique en mitose. Dans cette étude, en suivant l'apparition de cassures double brin (CDB) par les techniques sensibles d'essai comète neutre et de QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry), nous avons pu mettre en évidence que l'effondrement des fourches est un événement qui peut être visualisé rapidement suite au stress réplicatif (dès 2h après HU). Nous avons pu caractériser cet effondrement rapide comme étant un mécanisme indépendant de MUS81, sous unité catalytique du complexe MUS81-EME1. De plus, en réalisant des extinctions de l'expression de gènes par siARN, nous avons identifié deux nucléases, Artémis et XPF, comme étant impliquées dans ce mécanisme d'effondrement rapide des fourches de réplication. Nos résultats suggèrent un rôle de ce mécanisme d'effondrement rapide dans la prévention d'intermédiaires mitotiques et de la transmission de lésions aux cellules filles. Nous avons également identifié l'ADN polymérase alternative, Pol theta comme étant un facteur impliqué dans la prévention de la mort cellulaire induite par ce mécanisme. L'exploration de données de qPCR sur des prélèvements de tissus cancéreux nous a permis d'identifier la surexpression de Pol theta comme étant corrélée à des gènes de la HR. Ceci suggère un potentiel mécanisme d'adaptation pour prévenir de l'accumulation de fourches effondrées dans les cellules cancéreuses. L'ensemble de ces données révèle que les cellules humaines ont acquis au cours de l'évolution la capacité de cliver rapidement des fourches bloquées qui pourrait s'avérer importante pour la stabilité du génome, notamment en contexte de stress réplicatif
Replicative stress is characterized by an accumulation of stalled replication forks and is known to be a major source of genetic instability in human cells. Replicative stress and genetic instability are early markers of tumorigenesis. It is known that stalled replication forks can degenerate into double strand breaks (DSB), a process called replication fork collapse. Indeed, after an extended replicative stress (24h) induced by hydroxyurea (HU), the endonuclease MUS81-EME1 can promote the collapse of replication forks. This endonuclease prevents accumulation of under replicated regions in G2 and mitotic segregation defects. Here, by monitoring DSB with sensitive neutral comet assay and QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry) approaches, we found that replication forks can also collapse rapidly after replicative stress (as early as 2 hours after HU). We characterised this rapid replication fork collapse as a MUS81-independent mechanism. Moreover, by performing siRNA based knock down, we identified two nucleases, Artemis and XPF, involved in rapid replication fork collapse mechanism. Our results point toward a role of this rapid collapse mechanism in preventing mitotic intermediates and lesion transmission to daughter cells. Also, we identified the role of an alternative DNA polymerase Pol theta as a molecular factor involved in preventing this mechanism to induce cell death. Data mining of expression data from tumour samples allowed us to identify Pol theta verexpression as correlated with HR genes, underpinning a potential adaptation mechanism to prevent collapsed fork accumulation in cancer cells. Collectively, these data reveal that human cells have evolved a quick cleavage response to stalled forks that might be important for genome stability notably in cells undergoing replicative stress

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Tedim, Ferreira Maria. "Proteomics of Poly(ADP-ribose) Polymerases during DNA Replication and Repair." Doctoral thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/37991.

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Abstract:

En 2017, Statistique Canada a rapporté qu'un Canadien sur quatre mourra d’un cancer. Chaque jour, nous sommes confrontés à des facteurs environnementaux qui imposent à notre ADN un stress génotoxique. Ce stress peut avoir de graves conséquences au point de menacer notre intégrité génomique, comme les cassures d'ADN double-brin (DSBs). Heureusement, nos cellules ont deux voies principales pour combattre ce type de lésions : la recombinaison homologue (HR) et la Classical Non-Homologous End-Joining (CNHEJ). La voie HR, un type de réparation sans erreur utilisé dans la phase-S du cycle cellulaire, assure une réparation fidèle de la zone endommagée et conserve l'intégrité de l'information génétique. Les individus porteurs de mutations dans les protéines de cette voie, telles que BRCA1 et BCRA2, sont plus susceptibles de développer des cancers du sein et de l'ovaire. Récemment, la clinique a connu une percée majeure dans le traitement du cancer de l'ovaire. Une nouvelle classe de médicaments a été autorisée par la US Food and Drug Administration (FDA) pour traiter les cancers de l'ovaire récurrents qui présentent une HR défective. Ces médicaments inhibent un des acteurs les plus précoces dans la réponse aux dommages à l'ADN (DDR): la PARP-1 (Poly(ADP-ribose) polymerase-1). Lors de l'induction de dommages à l'ADN, la PARP-1 devient fortement activée, conduisant à la production massive de polymères de poly(ADP-ribose) (PAR) générés à partir de l'hydrolyse du nicotinamide adénine dinucléotide. Ce polymère agira comme une plateforme pour recruter des facteurs de réparation de l'ADN au site de réparation. L'application clinique réussie des inhibiteurs de la PARP (PARPi) vient des observations où les mutations ou l'extinction de BRCA1/2 entraînent une diminution de l'activité HR. L'inhibition de la PARP-1 combinée à cette déficience en HR favorise la mort cellulaire, un phénomène appelé létalité synthétique. Trois PARPi sont actuellement autorisés par la FDA et sont utilisés pour le traitement du cancer gynécologique. Malgré l'efficacité thérapeutique de ces inhibiteurs, les mécanismes induisant une régression tumorale ne sont pas complètement compris. Ainsi, il devient extrêmement important de déchiffrer davantage ces mécanismes pour atteindre le plein potentiel des PARPi. Pour ce faire, une recherche fondamentale sur les fonctions des PARPs, et de leurs partenaires dans la DDR, est essentielle et constitue l'objectif général de cette thèse. Durant mon doctorat, nous avons étudié l'influence de la PARP-1 dans la voie HR au moment de l'étape initiale de la résection, qui est essentielle pour l'élimination de l'ADN endommagé. Certaines études ont montré l'implication de la PARP-1 dans le recrutement de la protéine de résection MRE11. Ici, nous démontrons que la PARP-1 a une nouvelle fonction dans la résection des DSBs et nous proposons un nouveau modèle pour expliquer la létalité synthétique observée dans les tumeurs avec une HR défective. Pour compléter l'objectif de ce doctorat, nous avons étudié les rôles régulateurs de la PARP-1 au cours du processus HR, mais plus tard dans la résolution des lésions, c'est-à-dire au maximum de la formation des foyers RAD51, une étape cruciale pour la réparation efficace des DSBs via la HR. Nous avons observé que le PAR-interactome (PARylome) est, à ce moment, fortement enrichi en protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN. Plusieurs des protéines les plus abondantes étaient constituées d’hélicases d’ADN et d’ARN, et de facteurs de transcription. Puisque certains de ces gènes sont mutés dans les tumeurs, ils pourraient théoriquement être des cibles prioritaires pour une utilisation conjointe avec des PARPi. Nous avons également étendu notre étude de la PARylation à la chromatine, au niveau des histones. Nous avons constaté que les queues d'histones ne sont pas les seules cibles de la PARP-1 et que les domaines globulaires centraux sont également PARylés. Finalement, le grand intérêt clinique de la PARP-1 méritait une analyse approfondie de son expression systémique. Ainsi, j'ai terminé mes études en décrivant la distribution et l'abondance tissulaire de la PARP-1 dans les organes simiens, avec l'objectif principal de fournir des informations précieuses quant à l'efficacité potentielle des PARPi ou sa résistance, dans un tissu donné et maladies apparentées. En résumé, cette thèse fournit de nouvelles informations importantes sur les mécanismes orchestrés par la PARP-1 lors de la réponse aux DSBs, y compris les réseaux protéiques complexes engagés dans le remodelage des fonctions cellulaires nécessaire au maintien de l'intégrité génomique.
In 2017, Statistics Canada reported that one out of four Canadians will die of cancer. Every day, we face environmental factors that burden our DNA with genotoxic stress. This stress can lead to severe types of DNA damage that can threaten our genomic integrity, namely double-strand breaks (DSBs). Fortunately, our cells have evolved with different repair mechanisms to deal with such lesions. There are two primary types of repair against DSBs: Homologous Recombination (HR) and Classical Non-Homologous End-Joining (CNHEJ). The HR pathway is an error-free repair mechanism used in the S-phase of the cell cycle to ensure faithful repair of the damaged area and thus preserve our genetic information. Individuals that bear mutations in proteins involved in this pathway, such as BRCA1 and BCRA2, have been associated with the development of breast and ovarian cancers. Almost 4 years ago, the field went through a major breakthrough in ovarian cancer care. A new class of drugs was accepted by the US Food and Drug Administration (FDA) to manage recurrent ovarian cancers that display HR-deficiencies. These drugs consist of inhibitor molecules against one of the earliest sensors of DNA damage in the cell: PARP-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1). Upon DNA damage induction, PARP-1 becomes highly activated, leading to the massive production of poly(ADP-ribose) (PAR) polymers, from the hydrolysis of nicotinamide adenine dinucleotide, which in turn modify several proteins posttranslationally and act as a scaffold to recruit DNA repair factors to the repair site. The successful application of PARP inhibitors (PARPi) arose from the observations that mutations or silencing of BRCA1/2, resulted in diminished HR activity. In the context of HR deficiency, the concomitant inhibition of PARP resulted in cell-death, an effect called synthetic lethality. Three PARPi are currently accepted by the FDA and are being clinically used for the treatment of gynaecological cancers. Notwithstanding the great promise of these inhibitors for other types of cancers, the mechanism by which these are inducing cancer lethality is not fully understood. Thus, it becomes of extreme importance to further decipher its mechanistic ways, to achieve full potential of PARPi in the clinic. To achieve this, fundamental research on the functions of PARPs and their protein partners in the DNA damage response is indispensable and constitutes the general aim of this thesis. During my doctoral work, we investigated the influence of PARP-1 during the HR pathway, primarily during the initial step of resection, which is essential for the removal of damaged DNA. Early reports of PARP-1 involvement in resection described the recruitment of the resection protein MRE11 to sites of damage in a PARP-1 dependent manner. Here, we demonstrate that PARP-1 has a novel function in DSB resection and we propose a new model for the synthetic lethality observed in HR-deficient tumors. To further complement the general aim of this doctorate, we investigated the regulatory roles of PARP-1 during the HR pathway, however in a later stage of HR resolution, at the peak formation of RAD51 foci, which is a crucial step for the efficient repair of DSBs through HR. We observed that the PAR-interactome (PARylome) at this stage was abundantly enriched with RNA-processing factors. Several of the most abundant proteins consisted of DNA and RNA helicases, as well as transcription factors, some of which were found to be mutated in tumors, and thus can be seen as potentially druggable targets to be used in combination with PARPi. We also extended our PARylome study to the chromatin proteome and investigated the histone PARylome upon DNA damage. Interestingly, we found that histone tails are not the only targets of PARP-1 and that globular domains are also targets of PARylation. Lastly, the high clinical interest of PARP-1 warrants studies addressing PARP-1 organ distribution. Thus, I finalized my studies by extensively describing and reporting PARP-1 tissular and cellular distribution and abundance in monkey organs, with the main objective of providing valuable information to any study assessing PARP inhibition efficacy and resistance in any given tissue and related diseases. In summary, this thesis provides important new information on the mechanisms PARP-1 is regulating during the response to DSBs, including the networks PARP-1 is orchestrating to potentially help reshape the cell environment, to efficiently repair the most lethal lesion our genome faces.

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Pierini, Laura. "Etude des mécanismes moléculaires impliquant l'ADN polymérase Kappa dans le checkpoint de phase S." Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30171/document.

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Abstract:

La réplication de l'ADN est un évènement majeur pour la cellule car elle permet la duplication fidèle du matériel génétique. Il s'agit d'une étape critique du cycle cellulaire, car les fourches de réplication rencontrent fréquemment des barrières naturelles ou des lésions d'origine endogènes (lésions oxydatives) ou exogènes (agents physiques ou chimiques), sources de cassures chromosomiques et donc d'instabilité génétique. Une des réponses à ces fourches bloquées est l'activation du point de contrôle (checkpoint) de la phase S du cycle cellulaire. Nous avons montré que l'ADN polymérase Kappa (pol Kappa), polymérase dite translesionnelle en raison de ses capacité à franchir des lésions sur l'ADN, s'avère être aussi un acteur du point de contrôle de phase S. En effet, la déplétion de pol Kappa par ARN interférence dans différentes lignées cellulaires ou par immunodépletion d'un extrait de Xénope, entraîne un défaut de phosphorylation de Chk1. Pol Kappa est impliquée dans la synthèse de brins naissant d'ADN au niveau des fourches bloquées, ce qui facilite le recrutement du complexe 9-1-1 composé des protéines Rad9, Rad1 et Hus1et permet alors, une activation correcte du checkpoint de phase S. Afin de décrypter le rôle de pol kappa, nous avons construits différents mutants et nous avons analysé leur capacité à former des foyers, à être recrutés à la chromatine et à interagir avec différents partenaires dans des conditions d'activation du point de contrôle de phase S. Nous avons pu constater que le mutant du domaine d'interaction à PCNA était incapable de former des foci foyers ?. Nous avons ensuite observé, qu'en condition de stress réplicatif, pol Kappa était recruté à la chromatine grâce à son domaine d'interaction à PCNA et par différentes approches biochimiques, nous avons pu voir que pol kappa interagissait avec Rad9 et Chk1. Nous avons également mis en évidence que le défaut d'activation de Chk1 en l'absence de pol kappa reflétait d'une diminution de son taux dans le noyau, suggérant une régulation commune entre Chk1 et pol Kappa. En effet, nous avons observé que pol Kappa, comme Chk1, était régulés par l'ubiquitine hydrolase USP7. En effet, l'interaction entre pol Kappa et USP7 est augmentée en condition de stress. Nous avons pu voir, qu'à l'instar de Chk1, l'absence de USP7 entrainait une baisse du niveau de pol kappa dans le noyau. Ainsi nous proposons qu'en réponse à un stress réplicatif, pol Kappa et Chk1 soient stabilisés via leur dé-ubiquitination par USP7, permettant leur recrutement à la chromatine et une activation correcte du checkpoint de phase S. Parallèlement à ces travaux, des publications récentes montrent une implication possible de pol Kappa au niveau des séquences répétées. Nous avons pu mettre en évidence une interaction entre pol Kappa et Cenpb, protéine centromérique reconnaissant une séquence de 17 paires de bases dans l'ADN a-satellite. Ces résultats préliminaires suggèrent que le rôle de pol Kappa dans le checkpoint de phase S s'adresse notamment aux régions d'hétérochromatine. L'ensemble des résultats obtenus montre l'importance de pol Kappa dans le maintien de la stabilité génomique, par son rôle dans le checkpoint de phase S, et par son implication dans la régulation de Chk1 en condition de stress réplicatif
DNA replication is a major event for cells which allow the faithful duplication of genetic material. It is a critical step of cell cycle, because replication forks encounters frequently naturals barriers (non B-DNA structures), exogenous barriers (chemicals agents), or endogenous barriers (oxydatives lesions). These different barriers can be at the origin of chromosomes breaks and lead to genetic instability. To overcome the stalled forks, cells have evolved two major mechanisms: the induction of ATR replication checkpoint pathway and the recruitment of specialized DNA polymerase to perform the translesion synthesis. This two pathways are essential to maintain genomic stability. Human DNA polymerase Kappa (pol Kappa), the most conserved specialized DNA polymerase, is best known to participate to translesion synthesis. Recently, we have shown that pol kappa has a crucial role in the S-phase checkpoint activation. Indeed, pol Kappa is implicated in the synthesis of short DNA intermediates at the stalled forks, facilitating the recruitment of 9-1-1 clamp, and is required for an optimal phosphorylation of Chk1, the main effector of the S-phase checkpoint. Durant my PhD thesis, I explored the molecular mechanisms underlying this newly identified role. We have constructed several pol kappa mutants, and we have observed that for the mutation in the PCNA binding domain impeded pol kappa to form foci in response to replication stress. We also showed the requirement of this domain for pol Kappa recruitment on chromatin. By different experimental approaches, we have described a complex in which pol Kappa interacts with Rad9 and Chk1, two proteins required for the S-phase checkpoint activation. The Chk1 phosphorylation defect observed in absence of Kappa could also be the consequence of the Chk1 protein level decreased in the nucleus, meaning a potential common regulation between pol Kappa and Chk1. Based on this observation, we have studied how pol Kappa is regulated upon a replication stress and like Chk1, pol Kappa seems to be regulated by ubiquitination. We focused our attention on USP7 an ubiquitin hydrolase known to regulate Chk1. We have demonstrated an interaction between pol Kappa and USP7, which is stimulated after replication stress. Moreover, USP7 depletion leads to a decrease of pol Kappa level in the nucleus, suggesting that de-ubiquination of pol Kappa could to be a prerequisite for its checkpoint function and its stability

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Ben, Yamin Rosen Barbara. "Fonction et régulation de l'ADN polymérase zêta au cours de la réplication de l'ADN : conséquences sur la stabilité du génome. DNA Polymerase Zeta Contributes to Heterochromatin Replication to Prevent Genome Instability." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASS031.

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Abstract:

La réplication de l’ADN est un processus cellulaire fondamental qui assure la duplication fidèle de l’information génétique. Différentes perturbations peuvent interférer avec la progression de la fourche de réplication menaçant ainsi l’intégrité du génome. Pour éviter le blocage du réplisome, les polymérases réplicatives peuvent être remplacées par des polymérases translésionnelles (TLS) mutagènes mais capables de franchir différents types de lésions. Parmi les polymérases TLS, Polζ est unique car son absence entraine une létalité embryonnaire chez la souris suggérant qu’elle a acquis une fonction essentielle au cours de l’évolution. Cependant, sa fonction et sa régulation dans les cellules mammifères restent méconnues. Dans ce travail, nous avons montré que la phase S est perturbée en absence de REV3L, avec une modification du programme temporel de la réplication au niveau de régions génomiques répliquées en milieu-fin de phase S. Ce défaut de réplication est associé à une augmentation de la mutagénèse et des modifications du paysage épigénétique. Nous avons de plus mis en évidence que REV3L interagit avec les composants de l’hétérochromatine et est localisé au niveau des régions péri-centromériques, ce qui suggère que Polζ participe à la réplication de l’hétérochromatine et limite ainsi l’instabilité génomique. Dans une seconde partie, nous avons découvert que la protéine REV3L est clivée de manière post-traductionnelle par l’endopeptidase TASP1 générant deux polypeptides capables de s’hétérodimériser pour former un complexe stable qui, en association avec Rev7, représente probablement le complexe actif de Polζ. Aussi, nous avons observé que REV3L est finement régulée de manière endogène ou après exposition à un stress génotoxique à de multiples niveaux : (1) au niveau transcriptionnel, (2) par le clivage par TASP1, (3) par des phosphorylations post-traductionnelles. Finalement, l’ensemble de ces découvertes met en lumière un mécanisme de régulation unique contrôlant la fonction d’une polymérase mutagène dans les cellules mammifères. Ces résultats sont particulièrement importants étant donné que Polζ est un facteur impliqué dans les mécanismes de résistance des tumeurs face aux chimiothérapies
DNA replication is a fundamental process that ensures accurate duplication of the genetic information. Various perturbations can impede replication fork progression, and thus threatening genome integrity. To prevent fork collapse, replicative DNA polymerases can be replaced by error-prone DNA polymerases called translesion (TLS) polymerases, able to bypass DNA damage at the cost of increased mutations. Among TLS polymerases, Polζ is unique because inactivation of its catalytic subunit, REV3L, leads to embryonic lethality in mice underscoring its biological importance. However, little is known about its function and regulation in mammalian cells. We showed that loss of REV3L impairs S phase progression with a disruption of replication timing at specific genomic loci that replicate in mid-late S-phase, and this is associated with increased mutagenic events and aberrant epigenetic landscape. We also revealed that REV3L interacts with heterochromatin components and localizes in pericentromeric regions, suggesting that Polζ contributes to replicate heterochromatin regions to limit genome instability. In a second part, we discovered that REV3L protein is proteolytically processed by the endopeptidase TASP1 to generate two polypeptides that heterodimerize to form a stable complex that associates with REV7, likely representing the active complex of Polζ. We also found that REV3L is finely regulated in physiological conditions and after genotoxic stress at multiple levels: (1) transcriptionally, (2) proteolytically by TASP1 and (3) post-translationally by phosphorylation. Altogether these findings highlight a unique mechanism to control the function of an error-prone polymerase in mammalian cells. These data are particularly important given that Polζ is an important factor for tumor resistance to chemotherapeutic agents

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Cerutti, Elena. "Nucleotide Excision Repair at the crossroad with transcription." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1057.

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Abstract:

L’intégrité de l’ADN est continuellement remise en question par divers agents endogènes et exogènes (p. ex., la lumière ultraviolette, la fumée de cigarette, la pollution de l’environnement, les dommages oxydatifs, etc.) qui causent des lésions de l’ADN qui interfèrent avec les fonctions cellulaires correctes. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) supprime les adduits d’ADN déformantes l’hélice tels que les lésions induites par les UV et il existe dans deux sous voies distinctes selon l’endroit où les lésions de l’ADN sont situées dans le génome. L’une de ces sous voies est directement liée à la transcription de l’ADN (TCR) par l’ARN Polymérase 2 (ARNP2). Dans la première partie de ce travail, nous avons démontré qu’un mécanisme NER entièrement compétent est également nécessaire pour la réparation de l’ADN ribosomique (ADNr), transcrite par ARN Polymérase 1 (ARNP1) et représentant 60 % de la transcription cellulaire totale. De plus, nous avons identifié et clarifié le mécanisme de deux protéines responsables du repositionnement nucléolaire dépendant des UV de l’ARNP1 et de l’ADNr observé pendant la réparation. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié la fonctionne moléculaire de la protéine XAB2 lors de la réparation NER et nous avons démontré son implication dans le processus TCR. De plus, nous avons également montré la présence de XAB2 dans un complexe d’épissage du pré-ARNm. Enfin, nous avons décrit l’impact de XAB2 sur la mobilité de l’ARNP2 lors des premières étapes de la réparation TCR, suggérant ainsi un rôle de XAB2 dans le processus de reconnaissance des lésions
The integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process

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HAMAL, ABDELLAH. "Etude des adn polymerases chez les archaebacteries." Paris 11, 1991. http://www.theses.fr/1991PA112195.

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Abstract:

Une adn polymerase thermophile a ete purifiee a homogeneite chez l'archaebacterie thermoplasma acidophilum. L'analyse de l'adn polymerase purifiee sur gel de polyacrylamide en conditions denaturantes revele qu'elle correspond a polypeptide de 588 kda qui co-sedimente avec l'activite adn polymerase sur gradient de saccharose. La combinaison de la sedimentation et du gel filtration ont permis de conclure que l'adn polymerase purifiee est une enzyme monomerique constituee d'un unique polypeptide de 88 kda. Cette adn polymerase est resistante a l'aphidicoline, peu sensible au ddttp et inhibee par le nem lorsqu'elle est prealablement pre-incubee a haute temperature. L'adn polymerase purifiee chez t. Acidophilum possede une activite exonuclease 35 associee qui est stimulee en presence du manganese; les deux activites adn polymerase et exonuclease sont optimales a 65c mais l'activite exonuclease est beaucoup plus thermostable que l'activite adn polymerase. Par la suite, on a mis en evidence une activite exonuclease 35 manganese-dependante associee a l'adn polymerase purifiee chez s. Acidocaldarius. Ce resultat a ete confirme par la co-precipitation de l'activite exonuclease avec l'activite adn polymerase, et sa neutralisation par des anticorps anti-adn polymerase purifies. L'analyse des extraits bruts de differentes archaebacteries, par la technique d'immunotransfert, en presence d'anticorps prepares contre l'adn polymerase chez s. Acidocaldarius nous a permis de montrer qu'une adn polymerase apparentee a celle de s. Acidocaldarius existe chez d'autres archaebacteries. On a detecte d'autres activites adn polymerase dans differents extraits bruts d'archaebacteries; ces activites sont plus thermostables chez les hyperthermophiles que chez les sulfolobales. Enfin, dans l'extrait brut d'archaeglobus, l'activite adn polymerase est inhibee a 50% en presence de 100 m d'aphidicol

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ELIE, CHRISTIANE. "Adn polymerases d'archaebacteries : sensibilite des archaebacteries halophiles a l'aphidicoline : purification et caracterisation de deux adn polymerases chez deux archaebacteries thermoacidophiles." Paris 6, 1989. http://www.theses.fr/1989PA066172.

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Abstract:

Les archaebacteries constituent une troisieme lignee cellulaire intermediaire entre les eubacteries et les eucaryotes; nous nous sommes interesses aux adn polymerases de ces micro-organismes. Nous avons tout d'abord montre que la croissance et la synthese de l'adn in vivo chez des archaebacteries halophiles etaient inhibees par l'aphidicoline, un inhibiteur specifique de la replication chez les eucaryotes. Ce resultat suggere qu'une adn replicase, apparentee aux adn replicases eucaryotes pourrait exister chez ces archaebacteries. J'ai ensuite purifie et caracterise une adn polymerase monomerique, insensible a l'aphidicoline et thermophile chez l'archaebacterie thermoacidophile sulfolobus acidocaldarius. En collaboration avec s. Salhi et j. M. Rossignol, nous avons montre que cette enzyme pouvait repliquer a haute temperature un adn de phage uni-amorce et pouvait etre utilisee pour l'amplification genique par la methode de polymerisation en chaine. Enfin, avec a. Hamal, j'ai purifie et caracterise une autre adn polymerase monomerique, insensible a l'aphidicoline et thermophile chez une autre archaebacterie thermoacidophile phylogenetiquement eloignee de sulfolobus acidocaldarium: thermoplasma acidophilum. J'ai prepare des anticorps polyclonaux diriges contre l'adn polymerase de s. Acidocaldarius et j'ai montre que ces anticorps ne reconnaissaient pas l'adn polymerase de t. Acidophilum

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Guitton-Sert, Laure. "Identification de nouveaux mécanismes de régulation temporelle des origines de réplication dans les cellules humaines." Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30350/document.

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Abstract:

La duplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée à partir de l'activation de plusieurs dizaines de milliers d'origines de réplication. La mise en place des origines a lieu au cours de la phase G1 sous la forme de complexe de pré-réplication (pré-RC) et leur activation est orchestrée par un programme spatio-temporel. La régulation spatiale détermine les origines qui seront activées et la régulation temporelle, ou timing de réplication, détermine le moment de leur activation. En effet, toutes ces origines ne sont pas activées en même temps durant la phase S : certaines origines seront activées en début de phase S, d'autre en milieu, ou d'autre à la fin. Ce programme est établi en tout début de phase G1, au " point de décision du timing ". C'est un programme très robuste qui signe l'identité d'une cellule, son état de différenciation et le type cellulaire à laquelle elle appartient. Il a aussi été montré qu'il est altéré dans des situations pathologiques, en particulier le cancer, sans qu'on ne comprenne très bien les raisons mécanistiques. De manière générale, les mécanismes moléculaires qui régulent le timing de réplication sont méconnus. Le premier volet de ma thèse a permis l'identification d'un nouveau régulateur du timing de réplication : il s'agit de l'ADN polymérase spécialisée Thêta. Recrutée à la chromatine très tôt en phase G1, elle interagit avec des composants du pré-RC, et régule le recrutement des hélicases réplicatives à la chromatine. Enfin, sa déplétion ou sa surexpression entraîne une modification du timing de réplication à l'échelle du génome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai exploré les mécanismes qui régulent ce programme temporel d'activation des origines suite à un stress réplicatif. J'ai identifié un mécanisme de régulation transgénérationnel inédit : la modification du timing de réplication de domaines chromosomiques ayant subi un stress réplicatif au cycle cellulaire précédent. Des cellules-filles issues d'une cellule ayant subi des problèmes de réplication dans des domaines fragiles (riches en AT, et donc potentiellement structurés, et pauvres en origines) présentent un timing plus précoce de l'activation des origines au niveau de ces domaines. Ce nouveau processus biologique d'adaptation est particulièrement intéressant dans un contexte tumoral de haut stress réplicatif chronique car ce pourrait être un moyen pour la cellule tumorale de survivre à son propre stress réplicatif mais aussi aux thérapies antitumorales qui sont nombreuses à cibler la réplication de l'ADN
DNA duplication in S phase starts from thousands of initiation sites called DNA replication origins. These replication origins are set in G1 as pre-replication complexes (pre-RC) and fired in S phase following a spatio-temporal program of activation. This program determines which origins will be fired and when. Indeed, all the origins are not fired in the same time and we can distinguish early, middle and late replication origins. This temporal regulation is called "replication timing" and is determined at the "timing decision point" (TDP) in early G1. It's a robust program, which participates to the definition of cell identity, in term of differentiation state or cell type. However, the precise molecular mechanisms involved are poorly understood. Defective timing program has been evidenced in pathological contexts, in particular in cancers, but the mechanisms of this deregulation remain unclear. In the first part of my PhD, I contributed to the discovery of a new regulator of the origin timing program: the specialized DNA polymerase Theta (Pol Theta). Pol Theta is loaded onto chromatin in early G1, coimmunoprecipitates with pre-RC components and modulates the recruitment of Mcm helicases at TDP. Moreover, depletion or overexpression of Pol Theta modifies the timing of replication at a fraction of chromosomal domains. The second part of my work aimed at exploring the mechanisms that regulates replication timing after a replicative stress. I identified a totally new transgenerational adaptive mechanism of DNA replication timing regulation: the modification of the timing of origin activation at chromosomal domains that have suffered from a replicative stress during the previous cell cycle. Daughter cells from a cell that has experienced replication stress at particular domains (late replicating domains, AT rich so they can form structured DNA, and poor in origin density) shows advanced origin activation within these regions. This new biological process in response to replicative stress could be of particular interest in the context of cancer since, tumor cells are characterized by high level of intrinsic chronic replicative stress. This new mechanism may favor cancer cell survival despite replication stress, particularly upon treatments with anti-tumor agents that target DNA

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Moreel, Xavier. "Proteomique fonctionnelle des poly(ADP-Ribose) polymerases." Thesis, Université Laval, 2010. http://www.theses.ulaval.ca/2010/27251/27251.pdf.

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Domenichini, Séverine. "Caractérisation fonctionnelle des protéines CDT1 d'Arabidopsis : rôles dans la régulation de la prolifération cellulaire et dans le maintien de l'intégrité du génome." Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112052.

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Abstract:

Chez les plantes, les méristèmes ont la capacité de se diviser tout au long de la vie de la plante, qui peut dépasser 1000 ans pour certaines espèces. De plus, la lignée germinale n'est pas définie dès l'embryogenèse mais provient des cellules méristématiques et s’individualise relativement tard au cours du développement. Il est donc crucial que le cycle cellulaire soit finement régulé afin d'éviter une accumulation de mutations au cours de la croissance végétative et de la reproduction. Chez tous les eucaryotes, les protéines CDT1 sont impliquées dans l’initiation de la réplication de l'ADN en permettant la formation du complexe de pré-réplication et l'ouverture de la fourche de réplication avant le recrutement des ADN polymérases. Leur activité est strictement régulée afin que chaque partie du génome soit répliquée une fois et une seule au cours de la phase S. Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour deux protéines homologues du facteur d’initiation de la réplication CDT1 (CDC10 Target1) : AtCDT1a et AtCDT1b. La sur-expression de CDT1a stimule la réplication de l’ADN et, chez Arabidopsis, cette protéine aurait une double fonction dans la régulation du cycle cellulaire et dans la division des plastes. Nous avons étudié ici les fonctions respectives de AtCDT1a et AtCDT1b. En utilisant des approches génétiques, nous avons montré que ces deux protéines jouent des rôles partiellement redondants pour maintenir l’intégrité du génome et permettre le développement des gamétophytes. De plus, en réalisant une approche de TAP (Tandem Affinity Purification), nous avons montré qu’elles interagissent avec l’ADN polymérase ε, une ADN polymérase réplicative, ouvrant de nouvelles perspectives de recherche concernant le rôle des protéines CDT1de plantes lors de la réplication de l'ADN. En parallèle, nous avons essayé d'élucider les spécificités de CDT1a et plus précisément de son extension N-terminale qui est absente de CDT1b. Nous avons constaté que ce domaine de CDT1a est requis pour son interaction avec l'ADN pol ε, et que les mutants cdt1a complémentés par une version tronquée de la protéine présentent une croissance considérablement réduite, un arrêt prématuré du méristème racinaire, et un stress de l'ADN constitutif, ce qui suggère que l’interaction CDT1a/pol ε est indispensable à la progression normale de la phase S. L’ensemble de nos résultats ont révélé de nouvelles fonctions pour les homologues de CDT1 de plantes. Une question importante sera de déterminer si celles-ci sont caractéristiques du cycle cellulaire chez les plantes, ou si nous avons identifié de nouveaux mécanismes qui sont conservés chez tous les eucaryotes
In plants, meristems retain the ability to divide throughout the life cycle of plants, which can last for over 1000 years in some species. Furthermore, the germline is not laid down early during embryogenesis but originates from the meristematic cells relatively late during development. Thus, accurate cell cycle regulation is of utmost importance to avoid the accumulation of mutations during vegetative growth and reproduction. In all eukaryotes, CDT1 proteins are involved in the onset of DNA replication by allowing the formation of the pre-replication complex and subsequent opening of the replication fork. Their activity is strictly regulated to ensure faithful duplication of the genome during S-phase. The Arabidopsis thaliana genome encodes two homologs of the replication licensing factor CDT1 (CDC10 Target 1): AtCDT1a and AtCDT1b. Overexpression of CDT1a stimulates DNA replication, and this protein would have a function both in cell cycle regulation and plastid division.Here, we have investigated the respective roles of Arabidopsis CDT1a and CDT1b. Using genetic approaches, we have shown that the two proteins function partially redundantly to maintain genome integrity and allow gametophyte development. In addition, using Tandem Affinity Purification, we have shown that they interact with DNA pol ε, a replicative DNA polymerase, opening further research prospects regarding the role of plant CDT1 proteins during DNA replication. In parallel, we have tried to elucidate the specificities of CDT1a and more precisely of its N-terminal extension that is absent from CDT1b. We have found that this domain of CDT1a is required for its interaction with DNA pol ε, and that cdt1a mutants complemented with a truncated version of the protein show drastically reduced growth, premature meristem arrest, and constitutive DNA stress, suggesting that the CDT1a/pol ε interaction is indispensible to the normal progression of S-phase. Together, our results have unraveled new functions for plant CDT1 homologues, and one important aspect of future research will be to determine whether these are features of the plant cell cycle, or if we have identified new mechanisms that are conserved in all eukaryotes

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Rhinn, Hervé. "Approches transcriptionnelles appliquées à un modèle de traumatisme crânien chez la souris." Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066254.

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Abstract:

Ce travail vise à étudier les variations d'expression cérébrale d'ARNm à la suite d'un trauma crânien (TC) chez la souris. Une méthode d'analyse de données par PCR quantitative basée sur une modélisation de cette réaction ainsi qu'un protocole permettant de mesurer l'ADNc en présence d'ARN sont développés. Des facteurs de normalisation adaptés au modèle étudié sont identifiés. En utilisant ces résultats, les niveaux d'expression de gènes impliqués dans l'inflammation et l'apoptose par récepteurs de mort sont suivis par PCR quantitative pendant 48h après TC. L'utilisation de puces à ADN et la construction d'une banque soustractive permet par ailleurs d'identifier des gènes dont l'expression est induite dans le modèle étudié. L'effet thérapeutique de l’acide valproïque, la naltrexone et la minocycline, ainsi que leur influence sur le niveau d'expression de certains transcrits sont étudiés. Dans l'objectif d'une extinction spécifique de certains transcrits après TC, plusieurs formulations en lipoplexes ont été étudiées afin d'optimiser la transfection de siRNA in vitro. Des siRNA dirigés contre certains gènes des voies de l'apoptose et de l'inflammation (TNFR1, RIP, FADD et MMP9 ) ont été validés in vitro et testés in vivo après TC
This works aims at the study of mRNA epxression following a traumatic brain injury (TBI) in mouse. Methods are developed, for quantitative PCR (qPCR) analysis and for the quantification of cDNA mixed in solution with RNA. Normalization factors suitable for the study are validated. Based on these results, the mRNA levels of genes belonging to the inflammatory and death-receptor pathways are quantified after TBI using qPCR. DNA microarray and suppressive subtractive hybridization are used to identify new genes uprégulated after TBI. Three drugs (valproic acid, naltrexone and minocycline) are used after TBI, and their therapeutical benefits as well as their consequences on the expression levels of several gens are studied. In order to specifically silence the expression of some genes after TBI, the use of siRNA is planned. The formulation of siRNA in lipoplexes is studied in vitro in order to optimize their transfection efficiency, and siRNA targeting Fas, TNFR1, RIP, FADD and MMP9 are validated in vitro and tested in vivo after a TBI

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Dissertations / Theses on the topic 'ADN polymerase I'

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