Dissertations / Theses on the topic 'ADNmt'

Las enfermedades mitocondriales son un grupo de trastornos hereditarios de metabolismo caracterizados por la alteración de la función mitocondrial, que en la mayor parte de los casos derivan en una disfunción en el sistema de fosforilación oxidativa. Este grupo de enfermedades es muy heterogéneo tanto clínica como genéticamente, debido a su implicación multiorgánica y a su origen genético dual. Debido a que por lo general no hay correlación entre fenotipo y genotipo en los pacientes con sospecha de enfermedad mitocondrial, en la mayor parte de los casos es difícil realizar un diagnóstico molecular definitivo. La integración de las técnicas de secuenciación masiva en este diagnóstico permite mejorar su eficacia, así como asociar nuevos fenotipos a genes ya descritos como implicados en estas enfermedades o incluso asociar nuevos genes a fenotipos clínicos. Durante el desarrollo de este trabajo, se ha integrado la secuenciación masiva en el diagnóstico de pacientes con fenotipo clínico de enfermedad mitocondrial. En primer lugar, se ha puesto a punto la secuenciación del ADNmt completo, así como se ha diseñado y validado un panel de genes a la carta incluyendo aquellos genes implicados en el mantenimiento del ADNmt, para su posterior uso en el diagnóstico; además, junto a dos aproximaciones, se ha aplicado el exoma clínico y el exoma completo a este diagnóstico. Finalmente, se han caracterizado variantes potencialmente patogénicas no descritas anteriormente, y se han estudiado posibles variables modificadoras del fenotipo en pacientes con sordera neurosensorial no sindrómica portadores de la variante homoplasmica m.1555A>G. Se ha obtenido un alto rendimiento diagnostico incluyendo diferentes técnicas de secuenciación masiva en la rutina diagnóstica de pacientes con enfermedad mitocondrial, sobretodo en pacientes bien caracterizados clínicamente. La secuenciación del ADNmt ha permitido la detección de variantes patogénicas en muy bajo porcentaje de heteroplasmia, así como el diagnóstico de pacientes con variantes no asociadas comúnmente a sus fenotipos. La aplicación del panel de genes a la carta ha permitido realizar el diagnóstico genético de pacientes con deleciones múltiples en el ADNmt. Con la aplicación del exoma clínico y el exoma completo, hemos identificado variantes potencialmente patogénicas asociadas a pacientes con síndrome de Leigh y defectos en la actividad enzimática de los complejos OXPHOS; además, una de las variantes se ha encontrado en un gen donde no se han asociado mutaciones previamente a un fenotipo clínico, abriendo nuevas líneas de investigación. Además, se ha podido caracterizar la patogenicidad de las variantes patogénicas estudiadas, asociándolas a los fenotipos clínicos de los pacientes.
The mitochondrial disorders (MD) are a group of inherited metabolic diseases characterized by an alteration in the correct function of the mitochondria, mainly due to deficiencies of the oxidative phosphorylation system. These diseases are genetically and clinical heterogenic, due to their dual genetic origin (they can be caused due to mutations in the nuclear and in the mitochondrial genome) and their great phenotypic variability (the disease can affect only one organ or it can be multisystemic). Many times this group of disorders lacks of a genotype-phenotype correlation, since the same mutation can generate different phenotypes, and one specific phenotype can be caused by mutations in different genes, and this fact hampers the genetic diagnose of these disorders. The hypothesis of this thesis proposes that the use of the next generation sequencing (NGS) technologies in the genetic diagnostic of the MD will improve its performance. The use of the NGS in the diagnostic of these diseases will allow the detection of new point mutations in genes already described. Furthermore, the diagnostic through NGS also will allow to associate genes related with a specific MD to new phenotypes, or even to discover new genes causing MD, thus expanding the genetic and phenotypic spectrum of MD and improving the performance of the genetic diagnostic. In the present work we have integrated massive sequencing analysis of mitochondrial and nuclear genes to the diagnostic of patients with MD. We have set up and validated the complete mitochondrial DNA (mtDNA) sequencing that has enabled us to detect low levels of mtDNA heteroplasmy. Furthermore, the covering homogeneity of the complete mtDNA molecule has been optimized. This methodology has allowed us to precisely determine the concrete deleted sequences in single mtDNA deletions. Additionally, we have designed à la carte and validated a panel of genes directly related to mtDNA maintenance for diagnostic purposes. In patients with MD the clinic (n=8) and complete (n=9) exomes have been studied and analyzed. In this regard, new potentially mutagenic variants in both nuclear and mitochondrial DNA genes have been completely characterized, as well as potential phenotypic modulator variants in Non-Syndromic Sensoryneural Hearing Loss patients carrying the homoplasmic m.1555A>G mutation in the MTRNR1 gene. The application of the massive sequencing analysis technique in the diagnosis of these MD has represented an increase in the diagnosis efficiency, specially in those patients that had been well characterized clinically. MtDNA sequencing has allowed the detection in peripheric blood samples of pathogenic variants with a very low degree of heteroplasmy that were not previously detected by the classic Sanger sequencing, reducing the necessity of performing a muscle biopsy. In the complete mtDNA sequencing study, we have detected pathogenic variants that had not been previously associated to the phenotype of the patients. Additionally, the application of the genes panel related with mtDNA maintenance has proven to be very efficient, specially in those patients with multiple mtDNA deletions, being the POLG and TK2 the most representative in those patients. The clinic exome study in patients with Leigh syndrome has allowed us to genetically diagnose 2 out of 6 patients studied. Finally, in two patients with multi-enzymatic deficit of the oxidative phosphorylation system, we have found new potentially pathogenic variants, one in a gene previously associated with the YARS2 clinical phenotype, while the other in a mitochondrial gene previously not associated to any MD.

L’ADN cellulaire qu’il soit nucléaire ou mitochondrial est constamment soumis à l’action de stress d’origine exogène ou même endogène à la base d’altérations plus ou moins profondes de sa structure. Ces modifications chimiques sont très variées et peuvent aller de l’oxydation d’une base aux cassures double-brins de la molécule d’ADN. Ces dernières sont considérées comme les dommages les plus agressifs pour la cellule car peuvent conduire à la perte d’information et donc à la mort cellulaire. Parmi les systèmes de surveillance de la stabilité du génome figure la Poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation). Cette modification post-traductionnelle est assurée essentiellement par les protéines PARP et PARG et est caractérisée par l’incorporation des polymères d’ADP ribose (pADPr) sur des protéines cibles. La PARylation constitue un élément clé dans plusieurs voies de maintien de l’intégrité génomique (BER, NHEJ, HR). La PARylation est aussi décrite au niveau de la mitochondrie mais son rôle dans la gestion des DSBs de l’ADNmt n’est pas connu. Le travail, objet de cette thèse, consiste à étudier le rôle de la PARylation dans le cas des DSB au niveau général chez la drosophile et ensuite de comprendre les mécanismes de gestion des DSB mitochondriales et évaluer l’implication de la PARylation dans ce processus. Nos résultats montrent que : (1) le comportement de la PARylation ne varie pas au cours du processus de cassures et de réparation de l’ADN nucléaire, alors que l’expression des ARNm de PARP-I et PARP-II augmente durant la phase de réparation ; (2) les cassures de l’ADN mitochondrial, induites par la bléomycine, entraînent une augmentation du nombre de copies de l’ADNmt. Cette augmentation transitoire de la quantité de l’ADNmt est observée durant la phase des dommages et retourne à la valeur initiale durant la phase de la réparation. Ce comportement semble être régulé par PARP. L’ensemble de ces résultats suggère que la réparation des DSBs est indépendante de la PARylation au niveau nucléaire mais que la présence de PARP est importante. De plus, PARP semble avoir un rôle dans la régulation de la réplication de l’ADNmt en réponse à un stress génotoxique
Both nuclear and mitochondrial DNA alterationsarise following exposure to environmental and endogenous stresses. These genomic alterations are various, ranging from base oxidation to DNA strand breaks, single- and double-strand breaks. These damages are highly detrimental to the cell because they can lead to loss of genetic information and thus to cell death. However, cells have developed various mechanisms to counteract this biological issue and to lead up to a complex DNA damage response (DDR). The Poly (ADP- ribosyl) ation (PARylation) is among these DDR systems. This post-translational modification is mainly carried out by PARP and PARG proteins and is characterized by the incorporation of polymers of ADP-ribose on target proteins. The majority of the PARylationfunctions are related to cellular stress response, particulary in response to genomic damages where it is implicated in many DNA integrity pathways such as Base Excision Repair, Non Homologous End Joining and Homologous Recombination. In contrast to the nucleus, PARylation is also described in the mitochondria but its role in mtDNA integrityis still a heavily debate issue, particularly in case of mtDNA DSBs.To understand it, we used Drosophila model wherePARP-B isoform (human PARP-1 ortholog) is the only enzymatically active form in Drosophila PARP family. The aim of this thesis is to study the role of PARylation in response to DSBs induction in nucleus and mitochondrial DNAand then to understand the mechanisms involved in mtDNA integrity and to evaluate the role of PARylation in this process. Our results show that PARylation level remains stable during DSBs induction and also during repair process,contrary to what is shown in Human cells.However, PARP-I and PARP-II mRNA expression increase during repair period. In mitochondria compartment,our data show an increase of mtDNA copy number in presence of mtDNA DSBs. This increased level returns to normal during repair period and seems to be dependent on PARP. All these results suggest that DSBs repair is PARylation independent at the nuclear level but that the presence of PARP is important. In addition, PARP appears to have a role in the regulation of mtDNA replication in response to genotoxic stress

Les maladies mitochondriales regroupent un ensemble de pathologies liées à un déficit de la chaînerespiratoire mitochondriale. Au laboratoire, nous focalisons notre intérêt sur les mitochondriopathies liées à undéfaut de stabilité de l’ADN mitochondrial (ADNmt), qui se traduit par des délétions multiples et/ou unedéplétion (diminution du nombre de copies). Ces pathologies sont caractérisées par une importantehétérogénéité clinique et génétique et sont secondaires à des mutations dans des gènes nucléaires codantpour des protéines impliquées dans le maintien de l’ADNmt. De nos jours, la recherche des gènesresponsables d’instabilité de l’ADNmt s’avère négative chez plus de 70% des malades, d’où un grand intérêtpour améliorer les techniques d’identification des mutations et la recherche de nouveaux gènes impliquésdans ces pathologies
Non communiqué

La dynamique mitochondriale est un processus qui correspond à un équilibre dynamique entre des forces de fusion et de fission qui s'exercent sur les membranes des mitochondries. Quand les forces de fission prédominent les mitochondries apparaissent fragmentées, à l'inverse quand les forces de fusion sont prépondérantes les mitochondries forment un réseau filamenteux et interconnecté. Les principaux acteurs qui contrôlent la dynamique mitochondriale sont de grandes GTPases conservées de la levure à l'homme. Dnm1p (DRP1) est impliquée dans la fission de la membrane externe. Fzo1p (MFN1-2) et Mgm1p/Msp1p (OPA1) sont impliquées dans la fusion respectivement de la membrane externe et interne. L'objet d'étude principal de mon équipe est la protéine Msp1p/OPA1. Mon équipe a montré que la perte de Msp1p chez la levure à fission S. pombe induit la fragmentation des mitochondries, la perte du génome mitochondrial (ADNmt) et conduit à la mort de cette levure petite négative qui ne peut tolérer l'absence d'ADNmt. Afin de mieux comprendre les différents rôles de Msp1p et leurs relations, j'ai recherché des suppresseurs génétiques et pharmacologiques de la létalité induite par la perte de Msp1p. Nous avons identifié des suppresseurs génétiques en supprimant le gène msp1+ par recombinaison homologue dans des levures de fonds génétiques différents. Dans toutes les souches utilisées, des mutations spontanées localisées dans un des 3 gènes codant des protéines de fission (dnm1+, fis1+, caf4+), ont été retrouvées. Ces mutations suppriment à la fois la fragmentation des mitochondries et la perte de l'ADNmt, suggérant que le rôle de Msp1p dans la stabilité de l'ADNmt est une conséquence de sa fonction fusogène. Grâce au criblage de chimiothèques, nous avons identifié 5 composés pharmacologiques capables de supprimer la létalité d'un mutant thermosensible de Msp1p. J'ai entrepris la caractérisation de deux d'entre eux. Le premier supprime à la fois la fragmentation et la perte d'ADNmt induites par l'inactivation de Msp1p et semble cibler la fission mitochondriale. Le second ne supprime que la perte de l'ADNmt, suggérant que la seule fonction essentielle de Msp1p est son rôle dans le maintien de l'ADNmt. Au cours de ces travaux je me suis également intéressé aux mécanismes moléculaires pouvant expliquer la petite négativité de S. pombe. En absence d'ADNmt, les levures petites positives sont viables car capables, contrairement aux levures petites négatives, de maintenir un potentiel de membrane mitochondrial. 6 allèles, nommés ptp et rzl, qui permettent à la levure S. pombe de vivre sans ADNmt ont été décrits il y a plus de 20 ans. Nous les avons identifiées par des approches gène candidat ou séquençage haut débit. Ces allèles correspondent à des versions mutées de gènes codant soit des sous-unités de l'ATP synthase soit des sous-unités du protéasome. Dans le premier cas, ceci nous permet d'impliquer un fonctionnement reverse de l'ATP synthase et du transporteur ADP/ATP dans la restauration du potentiel de membrane mitochondrial et donc dans l'acquisition de la petite positivité chez S. pombe. Dans le second cas, différents mécanismes potentiellement impliqués ont été proposés. L'identification des gènes ptp et rzl devrait permettre une meilleure compréhension du processus de petite positivité/négativité qui reste à ce jour assez obscur. Les suppresseurs génétiques et pharmacologiques capables de supprimer la perte d'ADNmt en supprimant ou non la fragmentation des mitochondries constituent d'excellents outils pour comprendre les mécanismes qui relient la dynamique mitochondriale à la perte de l'ADNmt. La mise en évidence de la conservation des effets des drogues identifiées chez la levure chez les mammifères pourrait avoir un intérêt thérapeutique. En effet, des mutations d'OPA1, l'homologue de Msp1p chez les mammifères, sont responsables d'une neuropathie optique
Mitochondrial dynamics corresponds to a dynamic balance between two antagonistic forces of fusion and fission, which act on mitochondrial membranes. When fission prevails mitochondria appear fragmented, conversely when fusion predominates mitochondria form a filamentous and interconnected network. The main actors that control mitochondrial dynamics are large GTPases conserved from yeast to human. Dnm1p (DRP1) is involved in the fission of the outer membrane. Fzo1p (MFN1-2) and Mgm1p/Msp1p (OPA1) are involved in the fusion of the outer and inner membrane respectively. My team is interested in the protein Msp1p/OPA1 and showed a few years ago that loss of Msp1p in the fission yeast S. pombe induces mitochondrial fragmentation, mitochondrial genome (mtDNA) depletion and cell death. As a " petite negative ", S. pombe cannot tolerate the absence of mtDNA. To better understand the various role of Msp1p and their relationship, we searched for genetic and pharmacological suppressors of the lethality induced by Msp1p inactivation. We identified genetic suppressors by deleting the msp1+ gene by homologous recombination in various genetic backgrounds. In all strains, we found spontaneous mutations located in one of the 3 genes encoding mitochondrial fission proteins (dnm1+, fis1+, caf4+). These mutations suppress not only mitochondrial fragmentation but also mtDNA loss, suggesting that the role of Msp1p in mtDNA maintenance is a consequence of its fusogenic function. Thanks to chemical libraries screening, we identified 5 pharmacological compounds able to suppress the lethality induced by a Msp1p temperature-sensitive mutant, and characterized two of them. The first one suppresses both mitochondrial fragmentation and mtDNA loss and appears to target mitochondrial fission. The second one suppresses only mtDNA loss, suggesting that mtDNA maintenance is the only essential function of Msp1p. During this work I was also interested in the molecular mechanisms that could explain why S. pombe is " petite negative ". In the absence of mtDNA, the " petite positive " yeasts can survive because, unlike the " petite negative " yeasts, they are able to maintain mitochondrial membrane potential. Six alleles, named ptp and rzl, which allow S. pombe to live without mtDNA were previously described 20 years ago. We identified them by candidate gene and high-throughput sequencing approaches. These alleles correspond to mutated versions of genes encoding either subunits of ATP synthase or subunits of the proteasome. In the first case, this allows us to involve the reverse functioning of the ATP synthase and the ADP/ATP carrier in the restoration of the membrane potential thus converting S. pombe into a " petite positive " yeast. In the second case, various potentially involved mechanisms are proposed. The identification of ptp and rzl genes should allow a better understanding of the " petite positive/negative " properties that remain today rather unclear. Genetic and pharmacological suppressors able to suppress mtDNA loss with or without mitochondrial morphology recovery, represent interesting tools to understand the mechanisms that link mitochondrial dynamics to mtDNA loss. Furthermore, showing that the effects of the compound that we identified in yeast are conserved in mammals may have a therapeutic value. Indeed, mutations in OPA1, the Msp1p homologous in mammals, are responsible for an optic neuropathy

La síndrome de depleció i delecions múltiples de l’ ADN mitocondrial (ADNmt) (SDDM) engloba un grup de malalties minoritàries d’ herència autosòmica, recessiva o dominant, degudes a alteracions en el manteniment de l’ ADNmt. Aquestes alteracions es manifesten com una pèrdua de molècules d’ ADNmt (depleció), acumulació de delecions múltiples o de mutacions puntuals a l’ ADNmt. L’ espectre clínic de la SDDM és molt ampli i heterogeni. Pot manifestar-se en un rang molt ampli de gravetat, des d’ afectacions simples i relativament lleus, fins a afectacions de progressió ràpida i\/o multiorgàniques que condueixen a la mort del pacient durant els primers anys de vida. Genèticament, la SDDM és també heterogènia i s’ associa a mutacions en gens nuclears els productes dels quals participen en processos relacionats d’ alguna forma amb el manteniment de l’ ADNmt. Un d’ aquests processos és l’ homeòstasi de dNTPs que resulta imprescindible per garantir una correcta replicació de l’ ADNmt. El present treball de tesi doctoral consta d’ estudis preclínics in vitro i in vivo per a l’ aplicació de l’ administració de desoxirribonucleòsids (dNs) com a precursors de la síntesi de dNTPs al tractament de dues formes de SDDM, la deficiència en timidina quinasa 2 (TK2) i en la subunitat catalítica de la polimerasa mitocondrial (POLG). La TK2 és la quinasa responsable de la primera i limitant fosforilació de desoxitimidina (dThd) i desoxicitidina (dCtd) al mitocondri, essencial per l’ obtenció de dTTP i dCTP. La deficiència en TK2 es presenta típicament com una miopatia greu i està associada a una marcada depleció de l’ ADNmt al múscul. Hem assajat l’ administració de dThd i dCtd a un model murí knock-out per la Tk2 (Tk2KO). Aquests ratolins desenvolupen una encefalomiopatia fatal que progressa ràpidament i condueix a la mort als 16 dies d’ edat. Amb el tractament, la supervivència dels ratolins Tk2KO augmenta a 34 dies, i els nivells d’ ADNmt a múscul es normalitzen. Tot i això, el tractament perd eficàcia amb l’ edat. Descrivim canvis importants al metabolisme de dNTPs que tenen lloc al llarg del desenvolupament normal del ratolí i contribueixen a reduir l’ eficàcia del tractament amb l’ edat. D’ altra banda, hem utilitzat fibroblasts derivats de pacients amb mutacions a la subunitat catalítica de la polimerasa-gamma (POLG), proteïna que s’ encarrega de la síntesi de l’ ADNmt. Mutacions en aquest enzim causen SDDM amb un ampli espectre clínic associat a depleció i delecions múltiples de l’ ADNmt. El tractament basat en dNs indueix un augment al contingut dels quatre dNTPs mitocondrials, i això és suficient per restituir la capacitat replicativa de l’ ADNmt sense alterar la seva fidelitat, a cèl·lules amb mutacions en diferents dominis funcionals de POLG. Els resultats obtinguts en aquest treball suggereixen que l’ estimulació de la síntesi de dNTPs a través de la suplementació amb dNs podria ser una estratègia terapèutica vàlida per SDDM diferents a la deficiència en TK2 o POLG, així como per altres malalties en les que un increment a la síntesi de l’ ADNmt pogués resultar beneficiós.
El síndrome de depleción y deleciones múltiples del ADN mitocondrial (ADNmt) (SDDM) engloba un grupo de enfermedades minoritarias de herencia autosómica, recesiva o dominante, debidas a alteraciones en el mantenimiento del ADNmt. Estas alteraciones se manifiestan como una pérdida de moléculas de ADNmt (depleción), acumulación de deleciones múltiples o de mutaciones puntuales en el ADNmt. El espectro clínico del SDDM es muy amplio y heterogéneo. Puede manifestarse en un rango de gravedad muy distinto, desde afectaciones simples y relativamente leves, hasta afectaciones de progresión rápida y\/o multiorgánicas que conducen a la muerte del paciente durante sus primeros años de vida. Genéticamente el SDDM es también muy heterogéneo y se asocia a mutaciones en genes nucleares cuyos productos intervienen en procesos relacionados de algún modo con el mantenimiento del mtDNA. Uno de estos procesos es la homeostasis de dNTPs que resulta imprescindible para garantizar una correcta replicación del ADNmt. El presente trabajo de tesis doctoral consta de estudios preclínicos in vitro e in vivo para la aplicación de la administración de desoxirribonucleósidos (dNs) como precursores de la síntesis de dNTPs en el tratamiento de dos formas de SDDM, la deficiencia en timidina quinasa 2 (TK2) y en la subunidad catalítica de la polimerasa mitocondrial (POLG). La TK2 es la quinasa responsable de la primera y limitante fosforilación de desoxitimidina (dThd) y desoxicitidina (dCtd) en mitocondria, esencial en la obtención de dTTP y dCTP. La deficiencia en TK2 se presenta típicamente como una miopatía grave que está asociada a una marcada depleción del ADNmt en músculo. Hemos ensayado la administración de dThd y dCtd en un modelo murino knock-out para Tk2 (Tk2KO). Estos ratones desarrollan una encefalomiopatía fatal que progresa rápidamente y conduce a la muerte a los 16 días de edad. Con el tratamiento la supervivencia de los ratones Tk2KO asciende a 34 días, y los niveles de ADNmt en músculo se normalizan. A pesar de ello, el tratamiento pierde efecto con la edad. Describimos cambios importantes en el metabolismo de dNTPs que tienen lugar durante el desarrollo normal del ratón y contribuyen a reducir la eficacia del tratamiento con la edad. Por otro lado, hemos trabajado con fibroblastos derivados de pacientes con mutaciones en la subunidad catalítica de la polimerasa-gamma (POLG), proteína que se encarga de la síntesis del ADNmt. Mutaciones en esta enzima causan SDDM con un amplio espectro clínico asociado a depleción y deleciones múltiples del ADNmt. El tratamiento basado en dNs induce un aumento en el contenido de los cuatro dNTPs mitocondriales, y esto es suficiente para restituir la capacidad replicativa del ADNmt sin alterar su fidelidad, en células con mutaciones en diferentes dominios funcionales de POLG. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la estimulación de la síntesis de dNTPs a través de la suplementación con dNs podría ser una estrategia terapéutica válida para SDDM distintos a la deficiencia en TK2 o POLG, así como para otras enfermedades en las que un incremento en la síntesis del ADNmt pueda resultar beneficioso.
The mitochondrial DNA depletion and multiple deletions syndrome (mtDNA) (MDDS) comprises a group of rare diseases of autosomal recessive or dominant inheritance, due to alterations in the maintenance of mtDNA. These alterations manifest as a loss of mtDNA molecules (depletion), accumulation of multiple deletions or point mutations in the mtDNA. The clinical spectrum of MDDS is very broad and heterogeneous. It can manifest in a wide range of phenotypes with different severity, from simple and relatively mild affectations to rapidly progressing and\/or multiorgan diseases that lead to early death of the patient during his first years of life. Genetically, the MDDS is also very heterogeneous, being associated with mutations in nuclear genes whose products are somehow involved in processes related with mtDNA maintenance. One of these processes is dNTP homeostasis, which is essential to sustain a correct replication of mtDNA. This doctoral thesis work consists of in vitro and in vivo preclinical studies on the administration of deoxyribonucleosides (dNs), precursors for the synthesis of dNTPs, as a therapy for treating two forms of MDDS, the deficiencies in thymidine kinase 2 (TK2) and in the catalytic subunit of mitochondrial polymerase (POLG). TK2 is the kinase responsible for the first and limiting phosphorylation of deoxythymidine (dThd) and deoxycytidine (dCtd) in mitochondria, which is essential to obtain dTTP and dCTP. TK2 deficiency usually presents as a severe myopathy associated with a marked depletion of mtDNA in muscle. We have tested the administration of dThd and dCtd in a murine knock-out model for Tk2 (Tk2KO). These mice develop a fatal encephalomyopathy that progresses rapidly leading to death at 16 days of age. With the treatment, survival of Tk2KO mice is extended to 34 days, and the levels of mtDNA in muscle are normalized. However, the therapeutic effect is lost with aging. Here, we describe important changes in dNTP metabolism occurring during normal mouse development and reducing the effectiveness of the treatment with aging. On the other hand, we have worked with fibroblasts derived from patients with mutations in the catalytic subunit of polymerase-gamma (POLG), a protein responsible for mtDNA synthesis. Mutations in this enzyme cause SDDM with a broad clinical spectrum associated with depletion and multiple deletions of mtDNA. The dNs-based treatment induces an increase in the content of the four mitochondrial dNTPs, and this is sufficient to restore the mtDNA replicative capacity while preserving its fidelity, in cells with mutations affecting the different functional domains of POLG. The results obtained in this work suggest that stimulating the dNTP synthesis through dNs supplementation could be a valid therapeutic strategy for MDDS other than TK2 or POLG deficiency, as well as for other diseases in which an increase in mtDNA replication may result beneficial.

El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena de 16,5 kb. En su secuencia existe información para 13 polipéptidos de diferentes subunidades de los complejos de la cadena de transporte electrónico (CTE), para 22 ARNt y para 2 ARNr. Una mutación en cualquiera de estos genes puede provocar que la CTE no funcione correctamente, dando lugar a una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa. Todo ello puede provocar por un lado un déficit de energía en las células o tejidos, o por otro lado un incremento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Según la demanda energética de cada tejido este déficit de producción de energía será más o menos importante, pudiendo incluso provocar graves trastornos fisiopatológicos.
El incremento de la producción de ROS por parte de la cadena de transporte electrónico puede ser eliminado con ayuda de las defensas antioxidantes celulares. Si la producción de ROS es más importante que la acción de estas defensas, ello puede llegar a provocar lesiones en diferentes componentes celulares tales como lípidos, proteínas o al propio ADNmt. Para profundizar en este campo, en este trabajo en primer lugar se han diagnosticado a cuatro pacientes con enfermedad mitocondrial, portadores de una mutación en su genoma mitocondrial. A partir de plaquetas de estos pacientes se han generado cíbridos transmitocondriales, que se han utilizado como modelo de estudio. Se han estudiado las siguientes mutaciones en genes mitocondriales: T14487C en la subunidad ND6 del complejo I, A3243G en el ARN de transferencia Leu (UUR), A8344G en el ARN de transferencia Lys y G6930A en la subunidad COXI del complejo IV. Analizando la producción de peróxido de hidrógeno como medida de la producción de ROS en estas cuatro líneas, hemos observado que las líneas portadoras de una mutación que afectase al funcionamiento del complejo I y III (descritos ampliamente en la literatura como principales productores de ROS en la mitocondria) es decir A3243G, A8344G y T144874C, sí provocan un incremento de la producción, mientras que la mutación que no afectaba a estos complejos (G6930A) no provocaba incremento. Posteriormente se ha estudiado si este incremento producía daño oxidativo a diferentes componentes celulares, tales como lípidos, proteínas y el propio ADNmt. Previamente, debido a que en la literatura no existía un consenso claro sobre el mejor método de análisis de la peroxidación lipídica, se realizó un pequeño estudio sobre cuál era el mejor inhibidor de la peroxidación lipídica a utilizar y en que concentración, obteniendo que el mejor a utilizar era el BHT a una concentración de 3mM.
En cuanto los resultados de daño oxidativo se observó que en los lípidos solo se observaba daño oxidativo en la línea portadora de la mutación T144874C, mientras que las otras no lo presentaban. En la oxidación de proteínas no se observó daño en ninguna de las cuatro líneas portadoras de la mutación y en cuanto a la oxidación del ADNmt, se observó daño oxidativo en las líneas portadoras de las mutaciones A8344G y T14487C. Con estos resultados se observa que en algunas mutaciones en el genoma mitocondrial la producción de ROS generada es superior a la capacidad detoxificadora de la célula, provocando daño oxidativo, mientras que en otras la producción de ROS no supera la acción de las enzimas antioxidantes.
Mitochondrial encephalomyopathies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are a heterogeneous group of disorders characterized by primary dysfunction of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) with a decrease in ATP production. Clinical and biochemical heterogeneity of mitochondrial disorders is due to the ubiquitous nature of mitochondria and the dual genetic (mitochondrial and nuclear DNA) control of OXPHOS. Some unique features of mitochondrial genetics, such as heteroplasmy and tissue segregation, contribute to this phenomenon. However, the precise mechanisms leading to this heterogeneity are still largely unclear.
Mitochondria are the major source of reactive oxygen species (ROS), which are generated as toxic by-products of redox-coupled reactions in the electron transport chain (ETC). Inhibition of the ETC in vitro using some respiratory complex inhibitors results in a significant increase in the mitochondrial production of ROS. This increase suggests that when dysfunction of the respiratory chain complexes occurs, electrons can be transferred directly to the molecular oxygen. However, cells are well protected by antioxidant enzymes: the manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and copper-Zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) to eliminate superoxide anion (O2.-) and the glutahione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) to eliminate hydrogen peroxide.
Oxidative stress results when the balance of prooxidants and antioxidants is altered in favour of the prooxidants. In turn, an excess of ROS may contribute to OXPHOS damage. Thus, to define the relationship between mtDNA mutations and production of ROS, several transmitochondrial cell lines (cybrids) carrying different mutations in their mtDNA were obtained from different mitochondrial patients. These included two common and well characterized mtDNA mutations in tRNA genes, the A3243G transition in the tRNALeu(UUR) derived from a patient with MELAS syndrome (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes), and the A8344G mutation in the tRNALys, derived from a patient with the MERRF syndrome (myoclonus epilepsy with ragged-red fibers). In addition, another two cybrids cell lines were studied, harbouring the G6930A mutation in the gene encoding the subunit I (COI) of the cytochrome c oxidase (COX). This mutation changes the amino acid glycine into a premature termination codon, resulting in the loss of the last 170 amino acids (33%) of the polypeptide, thus causing a complete disruption in the COX assembly. The last cybrid cell line studied carried the mutation T144874C in the subunit 6 of the complex I of the ETC.
Hydrogen peroxide production was increased in cybrids harbouring tRNA and complex I mutations, but no changes were observed in cybrids harbouring the mutation in complex IV. No oxidative damage to lipids, proteins or mtDNA was detected in cybrids harbouring A3243G and G6930A mutations. In the cybrid cell line harbouring A8344G mutation, only oxidative damage to mtDNA was observed and in the cybrids harbouring the mutation in complex I, mtDNA and lipid oxidative damage were detected.
These results suggest that some mutations in mtDNA may increase the production of hydrogen peroxide (i.e., those mutations which affect complex I or III of the ETC) meanwhile other mutations do not. Furthermore this increase can sometimes override the antioxidant defences of the cells and produce oxidative damage to key cellular components.

L'île de La Réunion est située dans l'Ouest de l'Océan Indien. Sa population forme une société multiculturelle composée de six groupes ethniques principaux. Les évènements impliqués dans le peuplement de l'île et la sociologie de sa population sont bien documentés. La Réunion est donc un terrain d'un grand intérêt pour l'anthropologie moléculaire, offrant la possibilité de confronter des données génétiques à d'autres types de sources. Suivant cette démarche, notre travail a permis : (i) de préciser l'impact d'un effet fondateur connu ; (ii) de restituer la dynamique temporelle de certaines composantes du pool mitochondrial réunionnais ; (iii) de qualifier les contributions respectives des populations parentales dans une mise en place des groupes ethniques ; (iv) d'évaluer le contributions des sous-unités géographiques de l'Afrique sub-saharienne et de l'Inde ; (v) et de mettre en évidence les facteurs à l'origine du patron des maladies récessives autosomiques à la Réunion.

Un des rôles de la mitochondrie, qui possède son propre ADN (ADNmt), est la production de l'énergie nécessaire à la cellule, qu'elle synthétise sous forme d'ATP grâce aux oxydations phosphorylantes (OXPHOS). Ainsi, une altération du métabolisme énergétique mitochondrial peut provoquer l'apparition de pathologies mitochondriales dont, généralement, la sévérité est inversement proportionnelle à l'âge de début. De nombreuses études s'intéressent aux mécanismes d'apparition et de développement de ces maladies afin de mieux les comprendre et de pouvoir proposer des thérapies. Cependant, à ce jour, il est encore difficile de transformer l'ADNmt de façon ciblée (remaniement ou mutation). De plus, il existe encore peu de modèles animaux de pathologies mitochondriales qui permettraient de réaliser des études intégratives et d'essayer d'éventuelles molécules thérapeutiques. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié deux types de modèles impliquant la modification du métabolisme mitochondrial. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la réalisation d'un modèle murin exprimant un grand nombre de caractéristiques du syndrome de Leigh, une maladie neurologique progressive. Pour cela nous avons utilisé une neurotoxine (MPTP) qui est connue pour sa toxicité envers les neurones dopaminergiques et aussi comme inhibiteur de la chaine respiratoire. Nous avons analysé l'activité de chaque complexe OXPHOS de différents tissus cérébraux et de tissus périphériques (cœur, foie, muscle et rein), prélevés sur des souris traitées et non-traitées. Nous avons retrouvé une inhibition des complexes III et/ou IV de la chaîne respiratoire dans le foie, le cortex, le striatum et le cervelet. Ces résultats, ajoutés à une neuro- dégénérescence accrue retrouvée dans une étude précédente, sont tous caractéristiques du syndrome de Leigh. Ces souris traitées par le MPTP semblent donc être un bon modèle pour l'étude de cette pathologie mitochondriale. Dans un second projet, nous nous sommes intéressés à l'effet des haplogroupes de l'ADNmt sur le métabolisme mitochondrial. En effet, bien qu'ils soient définis par des mutations neutres de l'ADNmt (polymorphismes), plusieurs études ont démontré des associations entre les haplogroupes et les pathologies, suggérant que les haplogroupes sont capables d'avoir un effet protecteur ou aggravant dans l'apparition d'une pathologie. Récemment, notre laboratoire a montré que certains haplogroupes avaient la capacité d'influencer le fonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Mon projet de recherche a donc consisté à mettre en place un modèle afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ce phénomène. Pour cela, nous avons recherché des haplogroupes d'intérêt dans la population française afin d'élaborer une collection de " cybrides " où chaque lignée de cellules possède un haplogroupe particulier mais un fonds génétique nucléaire commun à toutes les lignées. Nous avons caractérisé ces cybrides de manière biochimique (analyse de l'activité et des paramètres cinétiques de chaque complexe) et phénotypique (courbes de croissance). L'ensemble de ces résultats a été intégré dans un modèle informatique spécifiquement développé dans notre laboratoire pour modéliser la physiologie de la mitochondrie. Ce projet nous a permis de mettre en évidence l'influence des haplogroupes de l'ADNmt sur le métabolisme mitochondrial et de proposer une vision modulée des pathologies mitochondriales tant pour leur étude que pour leur diagnostic, en faisant ressortir la notion de médecine personnalisée. A l'avenir, il sera nécessaire de tenir compte du contexte génétique de l'ADNmt pour trouver de nouvelles stratégies ou de nouvelles cibles pour les thérapies des maladies mitochondriales
The mitochondrion is an intracellular organelle responsible for the cellular energy production, by synthesizing ATP through the oxidative phosphorylation (OXPHOS). One of the characteristics of this organelle is that it has its own DNA (mtDNA) encoding for subunits of OXPHOS complexes. Any alterations of mitochondrial energy metabolism cause mitochondrial pathologies whose severity is generally inversely proportional to the age of onset. Some scientific studies are looking at the mechanisms of occurrence and development of these diseases in order to better understand them and to be able to offer therapies. However, there is no tool that can transform mtDNA in a targeted way by mutation or DNA rearrangement. Moreover, there are still few animal models of mitochondrial pathology that would allow integrative studies on the one hand, and on the other hand, to try out possible therapeutic molecules. In this thesis, we studied two types of models involving the modification of mitochondrial metabolism either by chemical treatment or by the use of mutations found in individuals. In a first part, we were interested in the realization of mouse model with a large number of characteristics of the Leigh syndrome, a progressive neurological disease characterized by neuropathological lesions associating a damage of the brain stem and the basal ganglia. For this study, we have used the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP) neurotoxin, known for its toxicity to dopamine neurons and also as an inhibitor of mitochondrial respiratory chain. We analyzed the activity of the OXPHOS complexes I to IV on brain tissues (cerebelum, cortex, striatum and substancia nigra) and peripheral tissues (heart, liver, muscle and kidney) from treated and untreated mice. Inhibition of complexes III and/or IV in the liver, cortex, striatum and cerebellum was found. These results, combined with an increased neurodegeneration found in a previous study, are all characteristics of Leigh Syndrome. Mice treated with MPTP seem to be a good model for this mitochondrial pathology. In the second project, we looked at the effect of mtDNA haplogroups (haplotypes grouping) on mitochondrial metabolism. Although, haplogroups are defined by neutral mutations of mtDNA (polymorphism), several studies have shown associations between haplogroups and some pathologies suggesting that haplogroups are able to have a protective effect or being a risk factor in the pathology development. Recently, our laboratory has confirmed that some haplogroups may not be neutral and have the ability to influence the mitochondrial energy metabolism functioning. Therefore, my research project consisted of setting up a model to study these cellular and molecular mechanisms. We looked for haplogroups of interest in the population in order to elaborate a cellular collection where each cell line has a particular haplogroup but with a common nuclear genetic background in all the cell lines. This collection was obtained by cybride constructions. We characterized these cybrides biochemically by analyzing the activity of each complex, determining kinetic parameters (KM and Vmax) and titration specific respiratory chain inhibitors. Concomitantly, we defined cell parameters via growth curves. All these results were integrated into a computer model specifically developed in our laboratory to model mitochondrial processes. This project gives us some evidence of the mtDNA haplogroups' influence on mitochondrial metabolism and to propose a modulated vision of mitochondrial pathologies for their study and their diagnosis, highlighting the notion of personalized medicine. As each haplogroup modulates in the different way the mitochondrial metabolism, each individual could have a personal response to the same mutation or pathology. In future, the mtDNA genetics background should be taken into account to find new strategies or new targets for the therapies of mitochondrial diseases

L'Indonésie a été l'objet de la dispersion Austronésienne qui a débuté il y a environ 5000 ans depuis Taiwan, se propager à travers les Philippines et l'Indonésie, puis toucher l'Océanie à l'est, et à Madagascar à l'ouest. Malgré de nombreuses recherches en génétique sur la dispersion Austronésienne vers l'est, il y a très peu de données sur la dispersion vers l'ouest, laissant sans réponse de nombreuses questions, liées notamment au peuplement de Madagascar. Reposant sur l'analyse des données culturelles et biologiques, les populations d'Indonésie semblent avoir joué un rôle majeur dans la colonisation de Madagascar, le premier millénaire de notre ère. Cependant, le peu de populations Indonésiennes étudiées à ce jour n'a pas permis jusqu'à présent d'identifier la population indonésienne source. Dans ce présent travail, j'ai réalisé des études en génétique des populations de 12 populations Indonésiennes, qui à priori devraient éclairer l'histoire des migrations austronésiennes dans l'Océan Indien. Parmi elles sont inclus le Ma'anyan du sud-est de Bornéo qui sont les plus proches linguistiquement des Malgaches. En utilisant différents marqueurs génétiques, ma recherche a amélioré nos connaissances de la diversité génétique Indonésienne, et du lien génétique entre l'Indonésie et Madagascar. Résultats L'analyse des marqueurs uniparentaux (chr-Y et ADNmt) suggère que les Malgaches proviennent de plusieurs régions d'Indonésie, avec un lien privilégié avec le sud-est de Bornéo, le sud de Sulawesi et les îles de la Sonde. Etonnamment, les Ma'anyan partagent un nombre limité de lignées paternelles et maternelles avec les Malgaches, malgré leur proximité linguistique. Par ailleurs, en combinant l'analyse de fréquences des SNPs et l'analyse haplotypique à partir des données autosomales, il a été confirmé que la diversité génétique des Ma'anyan ne correspond pas à l'ancestralité asiatique des Malgaches. Cependant, en centrant l'analyse sur les populations du sud-est de Bornéo, l'origine de l'ancestralité asiatique des Malgaches est ancrée dans la population Banjar, un mélange de population Ma'anyan et Malaise, résultat des activités commerciales de l'empire Malais dans le sud-est de Bornéo, qui se sont poursuivies à travers l'océan Indien. Par ailleurs nos résultats ont aussi permis d'accroitre notre compréhension de la diversité génétique de l'Indonésie en identifiant (1) une nouvelle composante génétique austronésienne présente chez les Ma'anyan, et retrouvée à faible fréquence à travers l'Asie du Sud-Est, suggérant une plus grande complexité du modèle d'expansion austronésien dans la région et (2) le rôle joué par les nomades de la mer dans la structuration de la diversité génétique et les échanges entre populations dans l'Indonésie, soulignant l'histoire génétique complexe de populations suivant un mode de vie nomade
Indonesia hosts a wide range of linguistic, ethnic and genetic diversity, comprising ~600 ethnic groups and 700 living languages. Indonesia has facilitated the last substantial wave of human migration was the Austronesian dispersal ~5,000 years ago, which is thought to have originated in Taiwan. Its influence spread through Philippines and Indonesia, ultimately impacting a wide geographical area, from Remote Oceania in the east and to Madagascar in the west. Despite considerable genetic research on the eastward Austronesian expansion, there is little equivalent research on the western edge, leaving major issues unresolved regarding the settlement of Madagascar. Based on cultural and biological studies, it has been suggested that Indonesian peoples played a major role in the colonization of Madagascar from around the mid-first millennium CE (Current Era). However, poor geographical coverage of Indonesian populations has prevented the Indonesian source populations from being identified. Here, I performed human population genetic studies on 12 new Indonesian populations, which were a priori expected to shed light on the westward migration of Austronesians across the Indian Ocean. This includes the Ma'anyan ethnic group from Southeast Borneo, who are the closest linguistic siblings to modern Malagasy. Using different genetic markers (Y-chromosome SNPs, mitochondrial DNA and genome-wide SNPs), my research has improved the description of Indonesian genetic diversity, and investigated the genetic links between Indonesia and Madagascar. Results Uniparental markers (Y-chromosome and mtDNA) analyses suggest that Malagasy derive from multiple regional sources in Indonesia, with a focus on southeastern Borneo, southern Sulawesi and the Lesser Sunda islands. Interestingly, the Ma'anyan share limited paternal and maternal lineages with the Malagasy, despite their linguistic connection. Furthermore, combining SNP frequency and haplotype-based analyses from autosomal genome-wide data, it was confirmed that the genetic diversity of the Ma'anyan does not match the Asian ancestry of the Malagasy. However, by focusing on Southeast Borneo populations, strong support was found for an origin of the Asian ancestry of Malagasy among the people of Banjar, an admixed population of Ma'anyan and Malay, likely resulting from trading activities by the Malay Empire in Southeast Borneo, and later continuing across the Indian Ocean arena. These results increase our understanding of genetic diversity across Indonesia by 1) identifying the unique and undiscovered Austronesian genetic component carried by the Ma'anyan, which occurs at low levels across Island Southeast Asia and suggests a more complex model for the Austronesian expansion in this region, and 2) describing the role played by sea-nomads in structuring genetic diversity and exchanges in central Indonesia, thus revealing the complex genetic history of populations living this rare nomadic lifestyle

Les mitochondries sont des structures uniques dans la cellule mammifère. Ces organites portent leur propre génome (ADN mitochondrial, ADNmt) qui se compose d'une petite molécule qui codifie pour 13 polypeptides de la chaîne de transport d'électrons (ETC), 22 ARNt et 2 gènes d'ARNr pour sa propre synthèse protéique. Le MTDNA est proposé pour être plus susceptible au stress oxydatif que le génome nucléaire (ADNn) parce que non seulement il manque d'histones protectrices, mais aussi en raison de sa proximité avec les complexes ETC qui sont les principaux producteurs de ROS dans les cellules de mammifères. Parmi tous les types de dommages à l'ADNmt, les dommages oxydatifs sont les plus répandus et, de loin, les mieux étudiés. La voie de réparation de l'excision de base (BER) est un mécanisme de réparation d'ADN conservé de façon évolutive qui répare les dommages de base d'ADN non volumineux. Puisque la guanine a le potentiel redox le plus bas de toute autre base dans l'ADN, elle est facilement oxydée à la 8-oxoguanine (8-oxoG) qui est l’altération la plus fréquente induite par les ROS sur les deux, l'ADNc et l'ADNmt. Si la fourche de réplication contourne le 8-oxoG avant son élimination, un A est souvent inséré sur le brin d'ADN opposé et les réplications subséquentes corrigent la transversion de G à T. Lorsqu'il est associé à la cytosine, le 8-oxoG est éliminé de l'ADN par l'ADN glycosylase de 8-oxoguanine (OGG1) qui, de cette manière, initie le procédé BER. OGG1 est une glycosylase de ménage bi fonctionnelle qui, conjointement avec d'autres enzymes BER différentes, est présente dans les compartiments nucléaires et mitochondriaux, soulignant l'importance de maintenir l'intégrité de l'ADNmt pour le fonctionnement cellulaire normal. Il a été démontré que la surexpression d'une version recombinante d'OGG1, spécifiquement destinée aux mitochondries par un signal de ciblage mitochondrial supplémentaire (MTS) (OGG1-MTS), protège les cellules d'un stress oxydatif, probablement en raison d'une efficacité accrue dans la réparation De 8-oxoG dans l'ADNmt. L'objectif principal de notre projet est d'élucider si la perte spécifique de l'activité de réparation 8-oxoG dans les mitochondries (mais pas dans le compartiment nucléaire) a un impact sur les fonctions organelles et / ou sur la viabilité cellulaire et aussi pour dévoiler le mécanisme / s Derrière les effets protecteurs d'OGG1 sur la physiologie mitochondriale et la maintenance d'ADNmt
Mitochondria are unique structures within the mammalian cell. These organelles carry their own genome (mitochondrial DNA, mtDNA) which consists of a small molecule that codifies for 13 polypeptides of the electron transport chain (ETC), 22 tRNA and 2 rRNA genes for its own protein synthesis. MtDNA is proposed to be more susceptible to oxidative stress than the nuclear genome (nDNA) because not only it lacks protective histones but also because of its proximity to ETC complexes which are the main ROS producers in mammalian cells. Among all the types of mtDNA damage, oxidative damage is the most prevalent and, by far, the best studied. Base excision repair (BER) pathway is an evolutionarily conserved DNA repair mechanism that repairs non-bulky DNA base damages. Since guanine has the lowest redox potential of any other bases in DNA, it is readily oxidized to 8-oxoguanine (8-oxoG) that is the most frequent alteration induced by ROS on both, nDNA and mtDNA. If the replication fork bypasses the 8-oxoG before its removal, an A is often inserted on the opposite DNA strand and subsequent replications fix the G to T transversion. When paired with cytosine, 8-oxoG is removed from DNA by the 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) that in such a way initiates the BER process. OGG1 is a bifunctional housekeeping glycosylase that, together with other various BER enzymes is present in both nuclear and mitochondrial compartments, highlighting the importance of maintaining mtDNA integrity for normal cellular functioning. It has been demonstrated that the overexpression of a recombinant version of OGG1, specifically targeted to mitochondria by an additional Mitochondrial Targeting Signal (MTS) (OGG1-MTS), protects the cells from an oxidative stress, likely due to an increased efficiency in the repair of 8-oxoG in mtDNA. The main goal of our project is to elucidate if the specific loss of 8-oxoG repair activity in mitochondria (but not in nuclear compartment) has an impact on the organelles’ functions and/or on cell viability and also to unveil the mechanism/s behind the protective effects of OGG1 on mitochondrial physiology and mtDNA maintenance

Les mitochondries, organelles intracellulaires des eucaryotes, fournissent par les oxydations phosphorylantes l'essentiel de l'énergie nécessaire aux différents travaux cellulaires sous la forme d'ATP grâce à un couplage entre la chaîne respiratoire et l’ATPsynthase. Ces réactions du métabolisme énergétique sont assurées par des complexes enzymatiques constitués de sous-unités codées à la fois par l'ADN nucléaire et par l'ADN mitochondrial. Il a été montré que des défauts dans l'activité de ces complexes pouvaient être responsables de l’apparition de pathologies regroupées sous le nom de cytopathies d’origine mitochondriale. Un des problèmes fondamentaux qui se pose lors de l’étude des mécanismes conduisant aux pathologies mitochondriales est de comprendre l’influence de l’ADN mitochondrial sur le métabolisme de la mitochondrie. En effet, la mitochondrie possède son propre ADN, et les mutations de cet ADN sont classées selon leur impact sur le métabolisme mitochondrial : des mutations pathogènes, qui ont des répercussions négatives sur ce métabolisme, et des polymorphismes, qui sont considérés comme étant neutres.Pour étudier l’influence de l’ADNmt sur le métabolisme énergétique, j’ai utilisé deux modèles d’étude : des cybrids portant des mutations de l’ADNmt retrouvées chez des patients atteints de surdité non-syndromique, et des cybrids portant des polymorphismes caractéristiques de l’haplogroupe J.Les résultats obtenus nous indiquent clairement que la différence entre des mutations pathogènes et des polymorphismes n’est pas aussi importante que ce qui était jusqu’à alors supposé. En effet, elle dépend d’un ensemble de facteurs tels que (i) le fonds génétique nucléaire et mitochondrial, (ii) de facteurs environnementaux. Car sous l’influence de ces différents facteurs une mutation considérée comme pathogène peut devenir neutre, et un polymorphisme considéré comme neutre peut devenir pathogène
Mitochondria, intracellular organelles of eukaryotic organisms, provide most of the necessary energy for cellular activity through oxidative phosphorylation, synthesizing ATP (energy source for the cell) by a coupling between the respiratory chain and the ATPsynthase. These energy metabolism reactions are carried out by enzymatic complexes constituted by sub-units coded by both nuclear and mitochondrial DNA. It has been shown that activity defects in these complexes could be responsible for a group of pathologies under the name of mitochondrial cytopathies.One of the fundamental issues of the study of the mechanisms that lead to mitochondrial cytopathies is the understanding of the influence that mitochondrial DNA has over mitochondrial metabolism. Indeed, mitochondria have their own DNA, and mutations in this DNA are classified according to their impact on mitochondrial metabolism: pathological mutations, which have negative consequences on mitochondrial metabolism, and polymorphisms, which are considered to be neutral.In order to study the influence of mtDNA on energy metabolism, I used two different models: cybrid cells carrying mtDNA mutations found in non-syndromic hearing loss patients, and cybrid cells carrying polymorphisms defining haplogroup J.The results gathered in these studies show that the difference between pathological mutations and polymorphisms is not as big as previously believed. Indeed, it depends on several factors, such as the nuclear and mitochondrial genetic backgrounds, as well as the environmental factors, because under the influence of these factors a mutation considered as pathological may become neutral, and a polymorphism considered neutral may become pathological

Les défauts de génome mitochondrial provoquent des maladies neuromusculaires, pour lequel aucun traitement efficace n'a été mis au point. La plupart des mutations mitochondriales sont hétéroplasmique, ce qui signifie que l'ADN mitochondrial (ADNmt) de type sauvage et muté coexistent dans la même cellule, et le changement de proportion entre deux types d'ADNmt pourrait rétablir les fonctions mitochondriales. Le but du projet était le développement du système pour cibler l'ARN thérapeutique dans les cellules humaines vivantes. Au cours de ma thèse j'ai synthétisé une série de nouveaux ARN anti-réplicatifs contenant modifications chimiques pour augmenter leur stabilité dans la cellule, et mis au point la nouvelle méthode de synthèse chimique des molécules d'ARN contenant cholestérol fixé par l'intermédiaire d'un pont biodégradable. Ces ARN étaient capable de pénétrer dans les cellules humains, d'être adressées dans les mitochondries et de diminuer la proportion d' ADNmt muté
Defects in mitochondrial genome cause neuromuscular diseases, for which no efficient therapy has been developed. Since most mitochondrial mutations are heteroplasmic, wild type and mutated mitochondrial DNA (mtDNA) coexist in the same cell, and the shift in proportion between two mtDNA types could restore mitochondrial functions. The aim of the project was development of carrier-free system for targeting the therapeutic mitochondrially importable RNA into living human cells. During my PhD study, I have synthesized a set of new anti-replicative RNAs containing various chemical modifications, aiming to increase their stability in the cell, and developed a new method for the chemical synthesis of RNA molecules containing cholesterol attached through a biodegradable bridge. Cholesterol containing antireplicative RNAs were characterised by efficient cellular uptake, partial colocalisation with mitochondria and ability to decrease the proportion of mutant mtDNA

La mitochondrie et le chloroplaste possèdent un génome dont l’expression et la maintenance dépendent de facteurs codés par le génome nucléaire. L’ADN mitochondrial des plantes (ADNmt) est caractérisé par d’importantes activités de recombinaison qui modulent sa structure et contribuent à son évolution. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé l’hélicase RADA qui est impliquée dans les étapes tardives de la recombinaison homologue organellaire. RADA possède des fonctions similaires à son homologue bactérien (RadA), mais semble jouer un rôle plus important dans les organelles de plantes. L’expression du génome chloroplastique (ADNcp) repose sur deux types d’ARN polymérases : la NEP, codés par le génome nucléaire et la PEP, codés par l’ADNcp. Durant ma thèse, j’ai également étudié le rôle de TRCF, homologue du facteur Mfd et adressé aux chloroplastes. Chez les bactéries, Mfd est impliqué dans le dégagement des ARN polymérases bloquées par des lésions et le recrutement de facteurs de réparation. Chez Arabidopsis, TRCF n’est plus impliqué dans la réparation, mais semble jouer un rôle dans la régulation de l’expression des gènes chloroplastiques
The mitochondria and chloroplasts have their own genomes whose expression and maintenance depend on factors encoded by the nuclear genome. The plant mitochondrial DNA (mtDNA) is characterized by important recombination activities that modulate its structure and contribute to its evolution. During my thesis, I characterized the RADA helicase that is involved in the late stages of organelle homologous recombination. RADA has similar functions to its bacterial homolog (RadA), but seems to play a more important role in plant organelles. The expression of the chloroplast genome (cpDNA) relies on two types of RNA polymerases: NEP encoded by the nuclear genome and PEP encoded by the cpDNA. During my thesis, I also studied the role of TRCF, an homolog of the Mfd factor which is addressed to chloroplasts. In bacteria, Mfd is involved in the release of stalled RNA polymerases by lesions and the recruitment of repair factors. In Arabidopsis, TRCF is no longer involved in repair but appears to play a role in the regulation of chloroplast gene expression

Submitted by Josimara Dias Brumatti (bcgdigital@ndc.uff.br) on 2017-02-20T17:17:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Completa FINALIMPRESSAO.pdf: 2564795 bytes, checksum: c89d19b4bb37328ea1e5b184c0c08d37 (MD5)
Made available in DSpace on 2017-02-20T17:17:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Completa FINALIMPRESSAO.pdf: 2564795 bytes, checksum: c89d19b4bb37328ea1e5b184c0c08d37 (MD5)
A presente pesquisa, que se filia a pressupostos teóricos adotados pela Linguística Textual, objetiva analisar processos de referenciação, a partir de um corpus constituído de peças humorísticas compostas por paródias e pastiches de autoria de Marcelo Adnet e veiculadas por videoclipes, nas perspectivas sociocognitivista de Mondada e Dubois (2003) e semiolinguística de Patrick Charaudeau (1999). De acordo com a perspectiva sociocognitivista, a significação de um ato de linguagem não é algo preexistente, mas sim algo que depende de uma interpretação; segundo a teoria semiolinguística, a significação de um ato de linguagem também depende dos protagonistas no interior da prática discursiva, sendo por eles construída. A hipótese norteadora das análises foi a de que os textos que compõem o corpus deste trabalho, pertencentes ao gênero letra de música e encarados pelo senso comum apenas como paródias, constituem-se como críticas irônicas: ora a discursos que adotam uma postura de rejeição em relação aos gêneros musicais nos quais se ancoram, ora à estética adotada pelo gênero musical que adotam; ora à postura e a discursos, cujos combates estão na base ideológica do gênero musical a que se ligam. Dessa forma, pretendemos comprovar o viés satírico que esses textos assumem. A análise permitiu verificar que os processos de referenciação colaboram no reforço de um projeto de dizer crítico e irônico do sujeito comunicante ou social, além de ajudar tanto na identificação da identidade social desse sujeito, quanto na construção da identidade discursiva do sujeito enunciador ou individual.
This research, under the scope of Text Linguistic’s theorical presuppositions, aims to analyze reference process, based on a corpus constituted by humoristic pieces composed by parodies and pastiches by comedian Marcelo Adnet and supported by videoclips, with the theoretical contribution of sociocognitive perspective proposed by Mondada and Dubois (2003) and semiolinguistics theory proposed by Patrick Charaudeau (1999). According to sociocognitive perspective, the meaning of a language act does not pre-exist, but depends on interpretation; according to semiolinguistics theory, the meaning of a language act also depends on the protagonist inside of discursive practice. Our analyses were guided by the hypothesis that this research’s corpus, that belong to music letter genre and is known by commom sense as parodies, are actually ironic critics, sometimes to discourses that reject an specific music genre; sometimes to the aesthetic’s music genre adopted; sometimes to stance and the discourses, which opponents are on the the ideological basis of the musical genre adopted. In that way, we intended to prove the satirical approach of theses texts. The analysis allowed to verify that reference process enfacizes a critic and satiric communicator-subject’s or social-subject “projet de parole”, and also helps to identify communicator-subject’s social identity and to construct enunciator-subject or individual-subject discursive identity.

De l’ADN libre circulant (ADNc) dérivant de la tumeur peut être isolé dans le plasma des patients présentant un cancer. Cet ADNc tumoral (ADNct) permet un accès indirect à la tumeur puisqu’il porte les même caractéristiques génétiques et épigénétiques et représente une biopsie liquide. Nous avons évalué l’intérêt du séquençage ciblé de l’ADNct comme biomarqueur de réponse à des thérapies ciblées développées en phase précoce en oncologie. Dans la première partie de ce travail, nous avons évalué les mutations identifiables par séquençage de l’ADNct d’une cohorte de 39 patients recevant un traitement anti-cancéreux dans le cadre d’un essai thérapeutique de phase I. Un total de 157 échantillons de plasma a été séquencé avec une couverture moyenne de 1685x. A l’initiation du traitement, 23 des 39 patients (59%) avaient au moins une mutation identifiable dans l’ADNct. Parmi les 44 mutations identifiées, TP53, PIK3CA et KRAS étaient les gènes les plus fréquemment mutés avec des fréquences de 41%, 20% et 18% respectivement. Dans un second temps, l’ADNc des patients ayant des mutations identifiées a été collecté et séquencés tous les mois au cours du traitement jusqu’à progression. Parmi les 23 patients, 13 ont reçu une thérapie ciblant directement l’anomalie moléculaire identifiée. Le suivi longitudinal des mutations identifiées dans l’ADNct et la dynamique des fréquences alléliques pendant le traitement a mis en évidence des variations associées à la réponse thérapeutique. Par ailleurs, pour les patients présentant plusieurs mutations identifiées dans un même échantillon d’ADNct, le suivi de ces mutations a mis en évidence la présence de clones évoluant de manière discordante au cours du traitement. Les variations quantitatives des fréquences alléliques des mutations dans l’ADNct étaient associées au temps jusqu’à progression sous traitement. L’ADNct est un biomarqueur d’intérêt pour le développement des thérapies ciblées en oncologie fait l’objet de nombreux développement en oncologie qui seront discutés dans ce travail
Circulating cell free DNA (ccDNA) deriving from tumor can be isolated in plasma of cancer patients. This circulating tumor DNA (ctDNA) shared the same genetics and epigenetics characteristics with the tumor and represents virtually a liquid biopsy. We evaluated whether targeted next-generation sequencing (NGS) of circulating tumor DNA (ctDNA) could be used for patient selection and as a tumor clone response biomarker in 39 patients with advanced cancers participating in early-phase clinical trials of targeted drugs. Overall, 159 plasma samples were sequenced with a mean sequencing coverage achieved of 1,685X across experiments. At trial initiation (C1D1), 23 of 39 (59%) patients had at least one mutation identified in cfDNA. Out of the 44 mutations identified at C1D1, TP53, PIK3CA and KRAS were the top three mutated genes identified, with 18 (41%), nine (20%), eight (18%) different mutations, respectively. In the second part of this work, we performed sequential NGS of ctDNA for the 23 patients with cfDNA mutation identified at C1D1. The monitoring of mutation allele frequency (AF) in consecutive plasma samples during treatment with targeted drugs demonstrated potential treatment associated clonal responses. Longitudinal monitoring of cfDNA samples with multiple mutations indicated the presence of separate clones behaving discordantly. Molecular changes at cfDNA mutation level were associated with time to disease progression. Targeted NGS of ctDNA has potential clinical utility to monitor the delivery of targeted therapies and future directions are discussed

Em Portugal, até ao momento, são poucos os estudos publicados relativamente à epidemiologia de problemas durante e após a viagem. Neste estudo, pretendeu-se caraterizar os problemas de saúde, durante e até três meses após a viagem, em viajantes que recorreram a consulta pré-viagem e permaneceram no destino até 90 dias, através de um formulário pré-viagem e de um questionário pós-viagem aplicado telefonicamente. Num total de 90 viajantes, 23 viajantes (25,6%) referiram a ocorrência de um ou mais problemas de saúde, durante ou após o regresso da viagem: 17,8% diarreia do viajante, 8,9% febre, 2,2% problemas de pele e 2,2% acidente ou traumatismo. Após o regresso da viagem, apenas foram referidos dois casos (2,2%) de problemas de saúde, nomeadamente febre. Os viajantes que tiveram problemas de saúde são proporcionalmente mais jovens, com escolaridade de ensino secundário completo e permaneceram no destino por um período superior a 30 dias. Os viajantes que se deslocaram à África Subsariana e ao Sudeste Asiático relataram, proporcionalmente, mais problemas de saúde. Cerca de um quinto dos viajantes interromperam ou não aderiram à quimioprofilaxia da malária. Considerando que, de acordo com a estatística da malária importada em Portugal, esta se encontra em sentido crescente, seria importante acompanhar especialmente estes viajantes no sentido de despistar precocemente casos de malária. Neste sentido, é importante a melhoria contínua da qualidade do aconselhamento ao viajante, nomeadamente na prevenção de problemas em viagem, no esclarecimento sobre o risco da viagem, na adesão à quimioprofilaxia da malária, na prevenção e na correta utilização de antibióticos, no tratamento de diarreia do viajante, no incentivo à procura de ajuda médica durante e após a viagem e no acompanhamento, diagnóstico e tratamento após o regresso da viagem.
In Portugal, the publications for epidemiological problems during and after travel are very few. In this investigation, we want to characterise the health problems, during and after travel, in individuals attending a pre-travel consultation and that remained in the destination for up to 90 days, through a pre-travel form and a three-month post-travel questionnaire, this last applied by phone. A total of 90 travellers were included, from whom 23 (25.6%) reported an occurrence of one or more health problems, during or after returning home: 17.8% traveller's diarrhoea, 8.9% fever, 2.2% skin problems and 2.2% suffered from an accident or trauma. After returning home, only two travellers (2.2%) reported to have had health problems, specifically fever. Ill travellers were younger; with high school level completed and have remained in the destination for more than 30 day. Travellers who visited Sub-Saharan Africa and Southeast Asia reported more health problems than those who went to other destinations. About one-fifth of the travellers discontinued or did not take any malaria chemoprophylaxis. In Portugal, according to the statistics, imported malaria is increasing. Considering that, it would be important to follow these travellers, especially the mentioned above group in order to find malaria cases earlier. Therefore, it is important to continuously improve the quality of traveller's advice, mainly in the prevention of health problems, focusing travel’s risk, adherence to malaria chemoprophylaxis, prevention and correct use of antibiotics in traveller's diarrhoea, encouraging demand of medical care during and after travel and follow-up, diagnosis and treatment after returning home.

A mitocôndria é um organelo celular que possui o seu próprio genoma, o ADN mitocondrial (ADNmt). Apesar de bastante pequeno quando comparado com o ADN nuclear (ADNn), mutações ao nível do ADNmt são bastante frequentes devido à falta de mecanismos de proteção e de reparação, provocando disfunções no mecanismo de fosforilação oxidativa, o que afeta essencialmente órgãos e tecidos com grande demanda de energia, como é o caso dos músculos e do cérebro. Dado que os métodos convencionais de tratamento destas desordens mitocondriais se têm revelado ineficazes, torna-se crucial o desenvolvimento de protocolos terapêuticos inovadores e eficientes, dos quais se destaca a terapia génica mitocondrial (TGM). Com este projeto tentamos desenvolver um novo sistema capaz de entregar de forma eficaz o ADN plasmídico (ADNp) à mitocôndria para uma possível utilização em TGM. Assim, o presente trabalho pode ser dividido em duas partes principais: uma primeira parte que inclui a síntese e caracterização de nanosistemas à base de ADNp e do polímero polietilenimina (PEI), e incorporação de compostos mitocondriotrópicos capazes de direcionar os sistemas para a mitocôndria; e uma segunda parte que integra estudos in vitro para testar a capacidade de transfeção celular das nanopartículas e a sua afinidade de direcionamento para a mitocôndria. Os sistemas em estudo demonstraram ser biocompatíveis, com eficiências de encapsulação de ADNp elevadas, apresentam forma esférica ou oval com tamanhos inferiores a 300 nm e possuem potenciais zeta positivos, o que os torna adequados para uso em protocolos de TGM. Os sistemas foram internalizados nas células e direcionados para a mitocôndria com sucesso. Estes resultados demonstram que a síntese de novos vetores com afinidade mitocondrial pode constituir um grande avanço na correção de defeitos mitocondriais, oferecendo uma nova estratégia terapêutica no combate a diversas patologias como o cancro e doenças neuromusculares e neurodegenerativas.
Mitochondrion is a cellular organelle that has its own genome, mitochondrial DNA. Although quite small compared to nuclear DNA, mutations in mitochondrial DNA are quite frequent due to the lack of protection and repair mechanisms, causing dysfunctions in the mechanism of oxidative phosphorylation, which essentially affects organs and tissues with large energy demand, as is the case of muscles and brain. Since conventional methods of treatment of these mitochondrial disorders have proved to be ineffective, the development of innovative and efficient therapeutic protocols, of which mitochondrial gene therapy (TGM) stands out, is crucial. With this project we tried to develop a new system capable of efficiently deliver plasmid DNA to mitochondria for possible use in TGM. Thus, the present work can be divided into two main parts: a first part that includes the synthesis and characterization of nanosystems based on plasmid DNA and polyethyleneimine polymer, and incorporation of mitochondriotropic compounds capable of directing the systems to mitochondria; and a second part which integrates in vitro studies to test the cellular transfection capacity of the nanoparticles and their mitochondria targeting affinity. The systems under study have been shown to be biocompatible, with high encapsulation efficiencies of plasmid DNA, presenting spherical or oval shape with sizes smaller than 300 nm and positive zeta potentials, which make them suitable to be used in TGM protocols. The systems were cell internalized and targeted to the mitochondria with success. These results demonstrate that the synthesis of new vectors with mitochondrial affinity may constitute a major advance in the correction of mitochondrial defects, offering a new therapeutic strategy in the fight against several pathologies such as cancer and neuromuscular and neurodegenerative diseases.

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017
Os processos geográficos e demográficos deixam marcas nos padrões de variabilidade genética das espécies. Sendo a diversidade genética essencial para garantir capacidade de adaptação das populações a alterações ambientais, a baixa diversidade genética representa um risco mais elevado para os endemismos, que exibem geralmente diversidade mais empobrecidas. Candidula coudensis é uma das 12 espécies de Candidula, um género de gastrópodes terrestres, recentemente identificada em Portugal. A espécie constitui um endemismo do Vale da Couda, no distrito de Leiria, com distribuição geográfica extremamente reduzida (13,5 km2). Dada a potencial vulnerabilidade de um endemismo tão localizado, foram usadas sequências do ADN mitocondrial (COI: citocromo oxidase subunidade I) e nuclear (ITS1: espaçador interno transcrito subunidade 1), e produzidos modelos de nicho ecológico, para avaliar a diversidade genética e a demografia histórica dos indivíduos do Vale da Couda e, ainda, mapear a sua potencial distribuição geográfica. De forma a determinar se os indivíduos de Vale da Couda constituem um grupo monofilético, foi construída, a partir das sequências de ADN mitocondrial, uma filogenia com as espécies do género presentes em Portugal. A população do Vale da Couda apresentou elevados valores de diversidade genética, existindo um elevado número de haplótipos que se dividem em quatro grupos não monofiléticos. Não parece existir nenhum padrão filogeográfico com os haplogrupos distribuídos de forma não uniforme nos diferentes locais de amostragem. A história demográfica dos indivíduos do Vale da Couda indica sinais de expansão demográfica, sendo necessária uma taxa de mutação de 15%MY para que esta date do Último Máximo Glacial (UMG). O modelo de nicho ecológico determinou que as características ecológicas mais importantes na restrição da distribuição de C. coudensis são a litologia, a isotermalidade e a precipitação anual. Durante o Último Máximo Glaciar (UMG) a distribuição desta espécie localizar-se-ia mais a sul do que a distribuição atual, numa região onde provavelmente coexistiriam outras espécies de Candidula, como C. setubalensis e C. arrabidensis, que presentemente habitam aquela região. Com o final do UMG terá havido uma re-colonização para norte até ao local actualmente ocupado, onde as condições ambientais são apropriadas à sua persistência. Os padrões de elevada variabilidade genética e divergência entre haplogrupos no Vale da Couda podem ser tentativamente explicados por um cenário biogegráfico em que as condições do UMG tenham favorecido um isolamento de populações a um nível micro-geográfico, potenciando a diferenciação entre as mesmas e aumentando a variabilidade intraespecíficica. O Vale da Couda terá então sido colonizado pelas várias linhagens que se formaram durante o UMG, o que explica a existência dos vários haplogrupos existentes actualmente nessa região. O facto de a análise demográfica demonstrar que existiu uma expansão da população corrobora esta hipótese. Actualmente, a elevada variabilidade genética desta população é mantida devido à grande dimensão da mesma. Concluíndo, a população do Vale da Couda contraria a ideia de que populações com distribuição limitada apresentam diversidades genéticas diminuidas, acrescentando este exemplo à lista de excepções a esta regra. Uma vez que, a elevada diversidade genética está associada a uma elevada população efectiva, e com tempo de geração curto, não há sinais de que a população de Vale da Couda precise de especial protecção do ponto de vista da conservação.
Patterns of genetic variability are shaped by a combination of geographic, demographic and evolutionary processes. Genetic diversity is the raw material for adaptation. Populations and species with restricted geographic distributions usually display low levels of diversity, which represent an evolutionary risk. Candidula coudensis is an endemic species of land snails from Vale da Couda, Portugal, with an extremely restricted distribution (13.5 km2). Mitochondrial (cytochrome oxidase I) and nuclear (internal transcribed spacer 1) DNA sequences of species of the genus Candidula from Vale da Couda and other locations in Portugal were used to evaluate the monophyly of C. coudensis,patterns of genetic diversity and the species demographic history. Ecological niche models (ENM) for both present and Last Glacial Maximum (LGM) distributions of C. coudensis were constructed to assess possible shifts in the distribution that might have influenced the evolutionary history of this species. The population of Vale da Couda showed unexpected levels of genetic variability given its striking restricted geographic range. We found a high number of haplotypes which are part of four non-monophyletic haplogroups, unevenly distributed among sites. The putative past and contemporary models of geographic distribution of Vale da Couda lineages are compatible with a scenario of species co-existence in more southern locations during the last glacial maximum (LGM) followed by a post-LGM northern dispersal, tracking the species to optimal thermal, humidity and soil physical conditions. LGM conditions may have favoured population isolation at a micro-geographical level, promoting intra-specific diversification. This diversity is maintained presently due to a large effective population size. Mismatch analysis indicated a population expansion during the LGM, which corroborates our biogeographic scenario. The high divergence and non-monophyly between haplogroups prompts the need for future molecular taxonomy studies of the Candidula genus in Portugal to clarify the identity of species that seem to be non-monophyletic.