Rodrigues, Paula Cristina Azevedo. "Mycobiota and aflatoxigenic profile of Portuguese almonds and chestnuts from production to commercialisation." Doctoral thesis, 2011. http://hdl.handle.net/1822/12385.
Abstract:
Tese de doutoramento em Engenharia Química e Biológica<br>Aflatoxin (AF) contamination of nuts is an increasing concern to the consumer’s health. Portugal is
a big producer of almonds and chestnuts, but there is no scientific knowledge on the safety of those
nuts. AFs B1, B2, G1 and G2 are produced mainly by some species of Aspergillus belonging to
section Flavi, which is composed of a large number of very closely related species. While these
species are difficult to differentiate morphologically and even genetically, they differ in a
characteristic that is of paramount importance for food safety, as only some are responsible for the
production of the highly toxigenic AFs. Taxonomy and species identification are therefore subject
of great interest, and the establishment of schemes for species and for aflatoxigenic strains
identification that are simultaneously accurate, sensitive, robust and expedite is mandatory.
This work had three major goals: the first was to provide knowledge on the general mycobiota,
aflatoxigenic fungi and AF contamination of Portuguese almonds and chestnuts, and its evolution
throughout the various stages of production (field, storage and processing). For this matter, 45
chestnut samples were collected from orchards from Trás-os-Montes. Forty-seven almond samples
were collected in Trás-os-Montes at different stages of production: field, storage and processing.
All fungi belonging to genus Aspergillus were isolated and identified to the section level, and all
isolates belonging to section Flavi were further tested for their aflatoxigenic ability. Fungi
representative of other genera were identified to the genus level. Almond samples were tested for
AF contamination.
The mycobiota of almonds and chestnut was found to vary in terms of both matrix and stage of
production. Chestnuts were mainly contaminated with the genera Fusarium, Cladosporium,
Alternaria and Penicillium, and the genus Aspergillus was only rarely found, whereas almonds
were more contaminated with Aspergillus. No Aspergillus section Flavi were isolated from
chestnuts. In almonds, Fusarium, Cladosporium, Alternaria and Penicillium decreased from field
to the end of processing, whereas Aspergillus increased significantly, including those from section
Flavi. In total, 352 fungi belonging to section Flavi were isolated from Portuguese almonds, of
which 231 isolates (66%) were aflatoxigenic. Even so, only one sample from storage was found to
be contaminated with AFs (4.97 μg/kg) at a level below the maximum levels recently imposed by
the Commission Regulation (EU) No 165/2010.
The second goal of this work was to characterise and identify the isolates of Aspergillus section
Flavi by applying a polyphasic approach including classic phenotypic and molecular methods as
well as the innovative technology protein spectral analysis Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionisation-Time of Flight Intact-Cell Mass Spectrometry (MALDI-TOF ICMS), and to
devise accurate and sensitive schemes for species identification. For the morphological analysis,
fungi were cultured on different media and were characterised for several macro and micro
morphological features. Morphological analysis was complemented with biochemical analyses,
which consisted of determining the extrolite profiles relative to AFs and cyclopiazonic acid. A
group of selected isolates was identified molecularly based on the sequencing of the ITS region and
partial calmodulin gene. Spectral analysis was made by MALDI-TOF ICMS to obtain spectra of
protein masses. Dendrograms of relatedness were obtained for each set of data and used to compare
sensitivity and accurateness of the different approaches.
From the preliminary morphological analysis, three morphotypes were identified: as “A. flavus
morphotype” (36.4% of the isolates), “A. parasiticus morphotype” (55.4%), and “A. tamarii
morphotype” (8.2%). The 3 morphotypes were then divided into 9 phenotypes based on their
extrolite profile. Genotypic and spectral analyses clustered the selected isolates into the same 3
groups created by morphological analysis. Furthermore, all sets of data, including the
morphological complemented with extrolite profile, were able to further resolve the isolates into more restrictive clusters. They all positioned two of the 9 phenotypes in two unidentified terminal
clades closely related to A. parasiticus.
The third goal was to test a molecular method based on multiplex PCR and RT-PCR for the ability
to differentiate aflatoxigenic and non-aflatoxigenic isolates. Two genes of the AF biosynthetic
pathway, aflD (= nor1) and aflQ (= ord1= ordA), were tested for presence and expression (by PCR
and RT-PCR, respectively). The presence of both genes did not correlate with aflatoxigenicity. In
terms of gene expression, aflD was not considered a good marker for differentiating aflatoxigenic
from non-aflatoxigenic isolates, but aflQ showed a good correlation between expression and AFproduction
ability.
In conclusion, Portuguese almonds and chestnuts seem to be generally safe in terms of AF
contamination. Nevertheless, the majority of the isolates of Aspergillus section Flavi obtained from
Portuguese almonds was found to be aflatoxigenic, which may constitute a problem in terms of
food safety if storage and processing conditions are not effectively controlled. At present, these
conditions seem to be guaranteed, since only one almond sample was found to be contaminated. At
the species identification level, good agreement was obtained between the 3 methods of analysis
since they all generated similar dendrograms with concordant strain clustering. Morphological
analysis has shown sensitive and reliable as a preliminary method for species identification only
when complemented with the extrolite profile. The calmodulin gene showed to be more robust and
reliable as genomic marker for this group of fungi than the ITS region, providing good DNA
barcoding potential. MALDI-TOF ICMS results confirmed that this technique is highly reliable for
fungal identification, and is faster and less expensive in terms of labour and consumables when
compared with other biological techniques, which is essential whenever there is a paucity of
characters for defining many fungal species and when high numbers of isolates are involved.
Expression analysis of the aflQ gene seems to be a good method for the differentiation of
aflatoxigenic and non-aflatoxigenic isolates<br>A contaminação com aflatoxinas (AFs) dos frutos de casca rija é um problema com interesse
crescente no que respeita à saúde do consumidor. A castanha e a amêndoa são produtos agrícolas
de elevado interesse económico para Portugal, no entanto não existe conhecimento científico
quanto à sua segurança em termos de AFs. As AFs B1, B2, G1 e G2 são micotoxinas de elevado grau
toxigénico, e são produzidas por algumas espécies de Aspergillus secção Flavi. Esta secção integra
um elevado número de espécies muito próximas, tanto ao nível morfológico como molecular, mas
que diferem numa característica de elevado interesse para a segurança alimentar - a sua capacidade
para produzir AFs. Por esta razão, a taxonomia e identificação de espécies desta secção revestem-se
de grande interesse, pelo que o estabelecimento de esquemas de identificação simultaneamente
precisos, sensíveis, robustos e expeditos é imperioso.
O presente trabalho teve três objectivos principais. O primeiro objectivo foi obter informação sobre
a incidência de fungos filamentosos, com particular incidência sobre os fungos produtores de AFs,
e sobre a contaminação com AFs das amêndoas e castanhas portuguesas, e sua evolução ao longo
das várias fases de produção. Neste sentido, foram analisadas 45 amostras de castanha colhidas em
soutos de Trás-os-Montes e 47 amostras de amêndoa de Trás-os-Montes e Algarve colhidas em
diferentes fases de produção (campo, armazenamento e processamento). Todos os fungos do
género Aspergillus foram isolados e identificados até à secção, e todos os fungos pertencentes à
secção Flavi foram identificados até à espécie e caracterizados quanto à sua capacidade
aflatoxigénica. Fungos representativos de outros géneros foram identificados apenas até ao género.
As amostras de amêndoa foram ainda analisadas quanto à contaminação com AFs. A micobiota das
amêndoas e castanhas variou em termos de matriz e de fase de produção. As castanhas mostraram
contaminação dominada pelos géneros Fusarium, Cladosporium, Alternaria e Penicillium, sendo o
género Aspergillus encontrado com pouca frequência, enquanto nas amêndoas o género Aspergillus
foi detectado com elevada incidência. Não foi isolado qualquer fungo da secção Flavi de castanhas.
Nas amêndoas, os géneros Fusarium, Cladosporium, Alternaria e Penicillium diminuiram
progressivamente desde o campo até ao final do processamento, enquanto a incidência de
Aspergillus, incluindo a secção Flavi, aumentou. No total das amostras de amêndoa foram isolados
352 fungos pertencentes à secção Flavi, dos quais 66% eram aflatoxigénicos. No entanto, apenas
foi identificada uma amostra contaminada com níveis detectáveis de AFs (4,97 μg/kg), mas
inferiores aos níveis máximos impostos pelo Regulamento (CE) Nº 165/2010 da Comissão
Europeia.
O segundo objectivo do presente trabalho foi caracterizar e identificar os isolamentos de
Aspergillus secção Flavi através de uma abordagem polifásica incluindo a caracterização fenotípica
clássica e molecular, assim como a inovadora tecnologia de análise espectral de proteínas Matrix-
Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight Intact-Cell Mass Spectrometry (MALDI-TOF
ICMS), e delinear esquemas robustos e simultaneamente sensíveis de identificação de espécies. A
análise macro e micromorfológica em diferentes condições de cultura foi complementada com a
análise de extrólitos, nomeadamente AFs e ácido ciclopiazónico (CPA). Um grupo de 24 fungos foi
identificado molecularmente pela análise de sequências da região ITS e do gene da calmodulina. A
análise espectral por MALDI-TOF ICMS foi aplicada a 69 fungos. Foi construído um dendrograma
de similaridade para cada um dos grupos de dados e os resultados foram comparados em termos de
precisão, robustez e sensibilidade.
Na análise morfológica preliminar foram identificados três morfotipos distintos designados
“morfotipo A. flavus” (36,4% dos isolamentos), “morfotipo A. parasiticus” (55,4%), e “morfotipo
A. tamarii” (8,2%). Estes morfotipos foram posteriormente divididos em nove fenótipos, com base
no seu perfil de extrólitos. As análises genotípica e espectral criaram três grupos (clades) correspondentes aos obtidos na análise morfológica e posicionaram dois dos nove fenótipos em
clades terminais relativos a taxa não identificados.
O terceiro objectivo deste trabalho foi testar um método baseado em PCR multiplex e RT-PCR
para diferenciação de estirpes aflatoxigénicas e não-aflatoxigénicas. Para tal, foram seleccionados
dois genes da cadeia biossintética das AFs, aflD (= nor1) e aflQ (= ord1= ordA), para os quais a
presença e expressão foram testadas por PCR e RT-PCR, respectivamente. A presença de ambos os
genes não se correlacionou com a capacidade aflatoxigénica dos indivíduos testados. Em termos de
expressão, apenas o gene aflQ mostrou boa correlação com a produção de AFs, tendo sido
considerado um bom marcador molecular da capacidade aflatoxigénica.
Em conclusão, as castanhas e amêndoas com origem em Portugal parecem possuir boa qualidade
em termos de contaminação com AFs. No entanto, a maioria dos isolamentos de Aspergillus secção
Flavi provou ser aflatoxigénica, o que pode constituir um problema de segurança alimentar para as
amêndoas, caso as condições de armazenamento e processamento não sejam devidamente
controladas.
Em termos de identificação de espécies, foi obtido um nível de concordância elevado entre as
diferentes abordagens usadas. A análise morfológica mostrou-se um método fiável e sensível para
identificação preliminar dos isolamentos apenas se complementada com a análise de extrólitos. O
gene da calmodulina mostrou-se mais robusto e sensível do que a região ITS, demonstrando maior
potencial como marcador molecular. Os resultados obtidos por MALDI-TOF ICMS confirmaram
que esta técnica é altamente fiável na identificação de Aspergillus secção Flavi, tendo como
principal vantagem o facto de ser significativamente menos dispendioso, tanto em termos de tempo
como de consumíveis, quando comparado com as restantes metodologias. Esta técnica reveste-se
de elevada importância nos casos em que estão envolvidos numerosos espécimens com elevada
proximidade taxonómica.
Relativamente à diferenciação de isolamentos aflatoxigénicos e não-aflatoxigénicos, a análise da
expressão do gene aflQ sob condições indutoras da produção de AFs mostrou ser um método
fiável.