Academic literature on the topic 'Alcool déshydrogénase'

Notre travail a consiste a mettre au point deux dosages conductimetriques, celui de l'ethanal avec application a son dosage dans le vin, et celui de l'ethanol applique a son dosage dans le vin, le serum et le sang. Apres quelques rappels bibliographiques et une description des materiels et des methodes utilises, nous avons expose nos resultats en trois parties. Dans un premier chapitre, nous avons etudie la faisabilite de la methode en calculant les variations theoriques de conductivite pour l'oxydation d'une mole de substrat (ethanal ou ethanol). Dans une seconde partie, nous avons cherche les conditions physico-chimiques optimales: choix du tampon, du ph, de la concentration du substrat permettant une meilleure sensibilite experimentale de mesure de l'oxydation de l'ethanal. Nous avons ensuite expose nos resultats concernant la mise au point de dosage de l'ethanol ainsi que l'application dans le vin, le serum et le sang total. Dans ce dernier cas, la reproductibilite du dosage, pour des prises d'essai de quelques microlitres de sang, a donne un coefficient de variation inferieur a 5%. Il existe ainsi une bonne correlation avec la methode spectrophotometrique (n=25; r=1,00 avec le serum) ce qui a valide notre travail

La lignine, un polymère de composés phénoliques, occupe des fonctions essentielles au sein de la plante, notamment pour le maintien d'un port dressé mais aussi au niveau du système vasculaire en imperméabilisant la paroi des vaisseaux, ce qui facilite le transport des solutés. Chez les angiospermes, les lignines sont constituées principalement d'unités guaïacyles (G) et syringyles (S) et de traces d'unités hydroxyphényles (H) qui dérivent respectivement de l'incorporation des alcools coniférylique, sinapylique et p-coumarylique. Ces monolignols proviennent de la réduction des aldéhydes hydroxycinnamyliques correspondants par une activité alcool cinnamylique déshydrogénase (CAD). Au laboratoire, deux formes de CAD ne présentant aucune homologie de séquence entre elles (CAD1 et CAD2) avaient été initialement purifiées à partir de xylème d'Eucalyptus gunnii. La CAD2 réduit efficacement les trois aldéhydes hydroxycinnamyliques, alors que la CAD1 utilise uniquement les aldéhydes coniférylique et p-coumarylique avec une plus faible affinité. De nombreux travaux ont donc été consacrés à la CAD2 et ont démontré sa participation au processus de lignification. En revanche, la fonction de la CAD1 demeurait non élucidée bien que l'hypothèse de son implication dans la synthèse de deux des trois monolignols ou de dérivés d'alcool benzylique puisse être émise. Nous avons donc entrepris l'étude fonctionnelle de cette enzyme chez le tabac (Nicotiana tabacum L. ). A la suite du clonage au laboratoire de deux gènes codant pour la CAD1 chez le tabac, leurs profils d'expression ainsi que les propriétés catalytiques des enzymes recombinantes correspondantes ont été déterminées. Des plantes ayant une expression des gènes NtCAD1 réduite ont ensuite été produites par une stratégie RNAi et caractérisées. Aucun phénotype morphologique n'a pu être observé chez ces plantes CAD1- en comparaison avec les plantes témoins. Néanmoins une analyse biochimique détaillée des plantes CAD1- a permis de révéler le rôle de cette enzyme. Ainsi, la réduction de l'expression des gènes NtCAD1 affecte la composition monomérique des lignines à travers principalement une diminution de la quantité d'unités G en comparaison avec les plantes témoins. Différentes méthodes d'analyse ont par ailleurs été employées pour appréhender le métabolisme des phénylpropanoïdes dans sa globalité : HPLC, LC-MS et GC-MS. Les profils en composés phénoliques solubles issus de xylème de tiges sont modifiés suite à la réduction de l'activité CAD1. La quantité de cinq oligolignols (oligomères de monolignols) identifiés par LC-MS, tous contenant au minimum une sous-unité G, est diminuée d'un facteur 1,6 à 4,2 dans les plantes CAD1-. Une accumulation d'acide néochlorogénique a aussi été détectée par GC-MS en quantité 2 fois supérieure dans les plantes CAD1- en comparaison avec les plantes témoins. . .

La pression au même titre que la température, le pH, les solvants organiques, l'activité de l'eau, peut modifier la structure des biocatalyseurs ainsi que leur activité catalytique. Longtemps délaissée à cause des problèmes techniques inhérents à la pression, l'étude de ce paramètre thermodynamique connaît depuis une vingtaine d'années un nouvel essor. Le réacteur haute pression haute température (maxima de 250 MPa et 150°C) mis au point pour cette étude, permet de suivre in vitro l'influence de la pression sur les réactions enzymatiques catalysées par une alcool déshydrogénase (ADH) tétramérique thermostable (extraite de Thermoanaerobium brockii : TBADH). La détermination des paramètres cinétiques de ces deux enzymes a montré, dans le cas de YADH, que la pression inhibait l'activité de l'enzyme sans affecter son affinité pour l'éthanol. Par contre, la pression améliore le turn-over et l'affinité deTBADH pour ses substrats alcooliques, ceci pour des pressions allant jusqu'à 175 MPa avec un optimum correspondant à 100 MPa. Les variations de volume d'activation rendant compte des effets de la pression sur les réactions biochimiques ont été déterminées pour les deux enzymes. Ainsi, il a été montré que les variations de volume observées au cours des cinétiques catalysées par YADH sont principalement dues à des événements se produisant lors de la phase catalytique, alors que dans le cas de TBADH, il semble que ce soit lors de la fixation du substrat que les plus grands changements ont lieu. Les études structurales effectuées par la méthode des dérivés seconde en chromatographie liquide haute performance ont montré que les modifications d'activités n'étaient pas dues comme dans la plupart des cas, à une dissociation des enzymes oligomériques mais à une modification de la structure tridimensionnelle de l'enzyme.

La pression, de même que la température, est un paramètre susceptible de modifier la conformation et l'activité catalytique des biocatalyseurs. La connaissance exacte de son mode d’action passe par l'étude d'un grand nombre d'enzymes en milieu hyperbare. Notre recherche traite des comportements cinétiques et structuraux des alcool déshydrogénases sous pression. Nous avons étudié l'enzyme du foie de cheval (HLADH), celles de la levure (YADH) et de Thermoanaerobium brockii (TBADH). Dans une première partie, l'étude cinétique de HLADH a été menée sous pression, à deux températures. Les influences de la température et des substrats alcooliques ont été observées. Les analyses des paramètres cinétiques et volumétriques des différentes réactions ont mis en évidence l'effet protecteur de la température vis-à-vis de la pression. Elles ont aussi montré qu'à 29ʿC, la pression peut améliorer l'activité catalytique de l'enzyme, bien que son affinité apparente pour ses différents substrats soit largement affectée. Une attention particulière a enfin été portée à l'inhibition par excès d'alcool primaire, ainsi qu'à son évolution en fonction de la pression et de l'alcool considéré. Dans une seconde partie, une étude structurale a été effectuée enspectroscopie de fluorescence et en spectroscopie InfraRouge à Transformée de Fourier (FTIR). Elle a concerné HLADH, YADH et TBADH, dont les comportements cinétiques sous pression sont connus. Ces enzymes oligomériques subissent des modifications structurales sous pression, mais contrairement à ce qui est généralement admis, elles ne semblent pas se dissocier. Lors de la dénaturation hyperbare de HLADH, l'existence d'un ou plusieurs état(s) intermédiaire(s) de type molten globule a de plus été mise en évidence. Les dénaturations hyperbares et thermiques de ces enzymes ont enfin été comparées : les états dénaturés obtenus par l'une ou l'autre des méthodes sont différents.

La synthese de phenolamides definis comme inhibiteurs potentiels de la cinnamyl alcool deshydrogenase cadh (ec1. 1. 1. 2) ainsi que celle des analogues structuraux de ces phenolamides a ete entreprise afin de determiner l'influence des differents parametres structuraux intervenant dans la reconnaissance par l'enzyme. Les phenol'amides et leurs analogues hydrocinnamides ont ete obtenus par action des amidures de lithium des amines considerees avec les acides parahydroxycinnamiques actives et proteges. A titre de comparaison des alcools et cetones ethyleniques correspondants ont ete synthetises. Pour modeliser les interactions entre le substrat et le site catalytique, la complexation des aldehydes cinnamiques et les phenolamides a ete etudiee par spectroscopie uv en presence de sels de zinc en milieu aprotique. Les resultats sont en accord avec un processus de complexation faisant intervenir les formes ml et m#2l dans le cas des aldehydes substrats et des hydrocinnamides. Les sites de complexation sont le carbonyle (ou la fonction amide) et les substituants phenoliques par effet de type "catechol". Pour les cinnamides le modele faisant intervenir les formes ml et ml#2 est propose. La mise en evidence d'effets bathochromes importants est en faveur de la participation de complexes delocalises de structure quinonique. Ces resultats sont a rapprocher des tests biologiques effectues "in vitro" sur la cadh

On etudie des processus sous-tendant le choix du milieu de vie chez la drosophile. Le choix de l'habitat aurait des implications importantes dans les mecanismes de l'evolution. Chez drosophila melanogaster, il existe un polymorphisme pour la capacite a degrader l'alcool et a l'utiliser comme metabolite. Son role dans l'evolution de cette espece est bien demontree. Comme des individus aptes a metaboliser l'ethanol choisissent des milieux alcoolises, a l'inverse de ceux qui sont incapables de le degrader, nous recherchons des processus impliques dans ce choix. Le travail porte sur des animaux issus d'une meme souche (ayant donc le meme contexte genetique) mais se differenciant par les alleles fast et slow du gene de l'adh (degradation de l'alcool rapide pour le premier et lente pour le second). On a tente d'inhiber pharmacologiquement l'activite de l'enzyme adh (alcool deshydrogenase) correspondant a ce gene. Apres avoir mis au point les conditions d'application de cet inhibiteur ainsi que les doses a utiliser chez la drosophile, on met en evidence le lien existant entre la metabolisation d'un substrat alcoolique et l'acquisition d'une preference pour un milieu alcoolise ou non. En bloquant le metabolisme de l'alcool on induit une aversion conditionnee chez des mouches de genotype fast/fast (degradation rapide de l'ethanol). La non-metabolisation de l'alcool produit un malaise revele par une etude du comportement locomoteur qui est alors perturbe. Ensuite, on montre que la preference pour un milieu alcoolise par les animaux des genotypes homozygotes (fast/fast et slow/slow) ne depend pas que des capacites genotypiques de ceux-ci a degrader ou non l'ethanol, mais aussi de l'experience benefique ou nefaste qu'ils peuvent retirer de l'ingestion de cette substance. Ce type de choix effectue par les individus resulte d'un apprentissage prealable s'exprimant differemment selon les capacites induites par le genotype

C. Butyricum est une bactérie sporulante, strictement anaérobie et capable d'assimiler le glycérol. Les gènes et les enzymes de la voie d'oxydation du glycérol, la glycérol déshydrogénase, codée par le gène dhaD1, et la DHA kinase codée par les trois gènes dhaK1, dhaK2 et dhaK3 ont été caractérisés. L'organisation génomique de la DHA kinase est différente de celle décrite chez les autres micro-organismes, ce qui met en évidence l'originalité de cette enzyme chez C. Butyricum. La voie de réduction du glycérol a mis en évidence une organisation génomique en opéron des gènes dhaB1 et dhaB2 codant respectivement pour une glycérol déshydratase atypique, sa protéine activatrice et dhaT codant pour une 1,3-propanediol déshydrogénase. Une régulation au niveau transcriptionnel par un système putatif de transduction du signal à deux composants (TCS) est également suggérée pour les deux voies métaboliques. La caractérisation moléculaire et biochimique des protéines DhaB1 et DhaB2 a permis de confirmer que la glycérol déshydratase de C. Butyricum est d'un type entièrement nouveau puisqu'elle est coenzyme B12-indépendante contrairement à toutes les glycérol déshydratases décrites à ce jour. Par ailleurs, les données biochimiques suggèrent un mécanisme radicalaire pour cette enzyme analogue à celui décrit pour les autres enzymes à radical SAM. L'analyse structurale de DhaB1 initiée lors de ce travail permettra de la comparer aux pyruvate formate lyases, enzymes à radical SAM les mieux caractérisées. Enfin, les divers outils moléculaires et biochimiques développés pour cette étude pourront ultérieurement être utilisés pour des expériences d'ingénierie protéique afin d'accroître nos connaissances sur le mécanisme d'action de cette enzyme
C. Butyricum is a strictly anaerobic spore forming bacteria able to metabolize glycerol. The genes and enzymes of the glycerol oxidative pathway, the glycerol dehydrogenase, encoded by the dhaD1 gene, and the DHA kinase, encoded by the three dhaK1, dhaK2 and dhaK3 genes were characterized. The genomic organization of the DHA kinase, is different from all the one previously characterized for other microorganisms, underlines the C. Butyricum enzyme originality. The glycerol reductive pathway, shows a genomic organisation in operon comprising the dhaB1 and dhaB2 genes encoding respectively a glycerol dehydratase and its activase, and the dhaT gene encoding a 1,3-propanediol dehydrogenase. A regulation at a transcriptional level by a two-component signal transduction system is suggested for the two pathways. The molecular and biochemical characterization of the DhaB1 and DhaB2 proteins allows to confirm that the C. Butyricum glycerol dehydratase is a novel type of glycerol dehydratase, coenzyme B12-independent, contrary to all glycerol dehydratases already described. The biochemical data suggest a radical mechanism for this enzyme similar to the one of the other SAM radical enzymes. The structural analysis of DhaB1 initiated in this work will allow a structural comparison with the pyruvate formate lyase, the best SAM radical enzyme characterized so far. Finally, the different molecular and biochemical tools developed in this study will be used later in protein engineering experiments to increase our knowledge on this enzyme mechanism