Academic literature on the topic 'Aminoacyl-ARNt'

La GlnRS de Deinococcus radiodurans se distingue des autres GlnRS par la présence d'un appendice additionnel en C-terminal (C-ter). Celui-ci adopterait le même repliement que la famille de protéines YqeY de fonction inconnue et une région de la sous-unité GatB de l'AdT. Son architecture atypique, trouvée dans 4 organismes, corresponds à la fusion de protéine de la voie directe et indirecte d'aminoacylation des ARNt. La structure cristallographique de la GlnRS-Dr n'a pas permis de résoudre la région C-ter, la maille étant suffisamment large pour l'accommoder. Des analyses en RMN du C-ter isolé ont confirmé la présence d'une région majoritairement structurée. D'autres structures ont été résolues en présence de petits substrats (glutamine, analogues d'adénylate) ainsi que la forme tronquée en C-ter. Dans 2 cas, une conformation verrouillée unique du site actif a été mise en évidence. Des analyses structurales et fonctionnelles et les propriétés de l'empilement cristallin sont exposées.

Le travail de cette thèse s'inscrit dans le cadre de l'étude des règles qui régissent la spécificité d'aminoacylation des ARN de transfert (ARNt) par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). La précision de cette réaction est cruciale puisqu'elle détermine la fidélité de la traduction de l'information génétique et la synthèse de protéines fonctionnelles. J'ai tiré profit des stratégies de biologie moléculaire, basées sur la transcription in vitro des ARNt, la production d'enzymes clonées, et la mutagénèse, afin d'explorer les relations structure/fonction des systèmes d'aminoacylation de levure et de la mitochondrie humaine.<br />Les aspects fonctionnels et structuraux ont été davantage explorés par des essais de cristallisation et des approches in vivo.<br />Jusqu'à présent, il était admis que les règles de reconnaissance et d'aminoacylation d'ARNt isoaccepteurs pour un système donné devaient être identiques. L'analyse d'une famille d'ARNt isoaccepteurs de l'arginine de levure et de sa relation particulière avec l'ARNtAsp nous ont permis d'établir que : (i) les isoaccepteurs sont arginylés avec des efficacités différentes (un facteur 20 les sépare) et sont protégés de la misaminoacylation par des antidéterminants idiosyncrasiques, (ii) l'isoaccepteur ARNt4<br />Arg possède des propriétés d'aspartylation, vestiges de son histoire évolutive, puisque seulement deux mutations sont<br />suffisantes pour convertir sa spécificité – c'est un exemple de génération de la diversité moléculaire par duplication de gènes. Les systèmes d'aminoacylation mt de mammifères restent peu étudiés, et ce malgré la « bizarrerie » structurale et l'implication dans des<br />pathologies sévères de leurs ARNt, codés par le génome mt. Nos efforts ont permis l'assignement des 10 gènes nucléaires manquants codant pour les aaRS mt humaines. Ceux-ci<br />sont portés par un jeu de gènes différents de celui codant pour les sysnthétases cytoplasmiques. L'analyse détaillée du système d'aspartylation, choisi comme système modèle a révélé (i) une identité de l'ARNt mt moins stringente que celle des ARNt classiques, (ii) une adaptation subtile et ciblée de l'aaRS mt, codée par le génome nucléaire et de type bactérien. Ceci illustre un processus de co-évolution entre les génomes mt et nucléaire<br />humain. De plus, j'ai déterminé les signaux qui protègent l'ARNtAsp mt d'être un substrat des aaRS non mt. De manière surprenante, ce n'est pas la dégénérescence structurale globale de<br />l'ARNt qui empêche le plus cette aminoacylation croisée mais une simple paire de bases du bras D.

Chez les eucaryotes superieurs, 9 aminoacyl-arnt synthetases forment un complexe multienzymatique qui est compose de 11 polypeptides dont les poids moleculaires s'echelonnent entre 18 a 150 kd. Nous avons clone l'adn complementaire qui code pour le polypeptide de plus haut poids moleculaire du complexe chez drosophila melanogaster. Nous avons montre que la proteine correspondante est une aminoacyl-arnt synthetase multifonctionnelle (la glupro rs). Cette enzyme porte a la fois deux activites synthetasiques specifiques pour l'acide glutamique et la proline. Ces deux activites sont portees par des domaines fonctionnellement independants. De plus, cette enzyme possede un troisieme domaine, central, qui est constitue de six motifs repetes long de 46 acides amines et qui ne semble pas necessaire a l'expression des activites catalytiques. Parallelement, nous avons montre que le complexe multisynthetasique chez drosophila melanogaster a une composition identique a celui des mammiferes chez les procaryotes les deux activites synthetasiques sont codees par des genes distincts, suggerant que la multifonctionnalite de cette enzyme pourrait provenir d'une fusion de genes. Cette organisation multifonctionnelle pourrait etre reliee a l'emergence d'un complexe multienzymatique. Nous avons entrepris une etude fonctionnelle in vivo de cette enzyme en etablissant des lignees transgeniques de drosophile pour differents domaines de cette enzyme. Nous avons trouve que les lignees transgeniques exprimant la molecule entiere ou les motifs repetes montrent une reduction de la fecondite dans certaines conditions suggerant que les motifs repetes pourraient jouer un role dans une compartimentalisation du complexe. La region genomique a ete isolee et s'etend sur 19 kb. Nous avons egalement localise la position de quelques introns dont un est retrouve a la meme position dans l'enzyme humaine correspondante

Les aminoacyl-arnt synthetases (aars) sont des proteines presentes dans tous les organismes vivants. Elles aminoacylent les arn de transfert, et participent ainsi a la traduction de l'information genetique. Les plantes ont trois compartiments cellulaires hebergeant un appareil de traduction : le cytosol, les mitochondries et les plastes. Ces deux derniers derivent d'une endosymbiose de la cellule eucaryote hote, respectivement avec une proteobacterie et une cyanobacterie. Chacune des 20 specificites d'aminoacylation est necessaire dans les trois compartiments, or tous les genes codant les aars sont dans le noyau. Dans ce travail, nous montrons l'adressage vers les organites pour 13 des 19 aars d'arabidopsis connues, presentant une presequence d'adressage putative. La strategie experimentale utilisee consiste a fusionner une presequence n-terminale putative a la gfp ( green fluorescent protein ) et de faire exprimer cette construction dans des protoplastes de tabac. La fluorescence de la gfp rend compte de la localisation sub-cellulaire conferee par la presequence. Les resultats indiquent qu'un certain nombre d'aars sont presentes a la fois dans les mitochondries et dans un des deux autres compartiments (cytosol et plastes). Un parallele peut etre fait avec les origines variables des arnt dans les mitochondries. Une facon preliminaire de considerer l'adressage des proteines, est de les soumettre a des logiciels de prediction. Comme aucun programme existant ne permet de predire a la fois l'adressage mitochondrial et plastidique, nous avons developpe un outil de prediction appele predotar. En combinant predotar et le dispositif experimental utilisant la gfp, nous avons pu decrire de nouvelles proteines adressees aux organites d'arabidopsis.

L'aminoacylation spécifique des ARN de transfert (ARNt) par l'acide aminé homologue est catalysée par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). L'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS) de Saccharomyces cerevisiae reconnaît spécifiquement, non seulement l'ARNtAsp, mais également son propre ARN messager (ARNmAspRS). Le complexe formé entre l'AspRS et son ARNmAspRS est l'étape initiale du mécanisme de rétro-régulation de l'expression de l'AspRS. Celle-ci est caractérisée par trois originalités, (i) L'AspRS est présente dans le noyau, (ii) c'est une régulation transcriptionnelle médiée par l'interaction de l'AspRS avec son propre ARNm et (iii) elle implique une coordination de l'expression de l'AspRS avec la concentration cellulaire en ARNt. L'interaction AspRS/ARNmAspRS a été caractérisée au niveau structural par cartographie en solution. Les régions d'ARNm reconnues par l'AspRS ont été identifiées au moyen d'expériences d'empreinte et de mutagenèse dirigée. La structure secondaire est originale à plusieurs égards : (i) elle s'organise en deux domaines indépendants ; (ii) chacun est reconnu par un monomère de l'enzyme ; (iii) un des domaines mime la branche anticodon de l'ARNtAsp avec un triplet anticodon GUC. Les conséquences physiologiques induites par une augmentation de la concentration en AspRS ont été également abordées. In vitro, l'aspartylation de l'ensemble des ARNt de levure en présence de concentrations croissantes en enzyme a montré que l'AspRS aspartyle de façon incorrecte l'ARNtGlu et l'ARNtAsn. In vivo, la construction d'un gène rapporteur conférant à la levure une résistance à la généticine n'a pas permis de détecter cette aspartylation incorrecte, en revanche, le suivi du protéome de la levure lorsque l'AspRS est surexprimée a établi les conditions d'accumulation de l'AspRS dans la cellule suggérant l'existence d'un verrou supplémentaire pour contenir l'aspartylation et assurer la survie de la cellule<br>Accurate translation of genetic information necessitates the tuned expression of a large group of genes. Amongst them, controlled expression of the enzymes catalyzing the aminoacylation of tRNAs, the aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS), is essential to insure translational fidelity. Here, it is shown that expression of AspRS is regulated in Saccharomyces cerevisiae by a feedback mechanism, that necessitates the binding of AspRS to its messenger RNA. The correlation between AspRS expression and mRNAAspRS and tRNAAsp concentrations, as well as the presence of AspRS in the nucleus, suggest an original regulation mechanism. It is proposed that the surplus of AspRS, not sequestered by tRNAAsp, is imported in the nucleus where it binds to mRNAAspRS and thus inhibits its accumulation. We have established the folding of the 300-nucleotides long 5' end of mRNAApRS and identified the structural signals involved in the regulation process. We propose that the mRNAAspRS fragment folds in two independent and symmetrically structured domains spaced by two single-stranded connectors. Domain I displays a tRNAAsp anticodon-like stem-loop structure that is restricted in domain II to a short double-stranded helix. The overall mRNA structure, based on enzymatic and chemical probing, support a model where each monomer of yeast AspRS binds one individual domain and recognizes the mRNA structure like it recognizes its cognate tRNAAsp. Finally, the consequences of an increased concentration of AspRS in the cell have been tested. In vitro, high AspRS concentrations lead to mis-aspartylation of tRNAAsn and tRNAGlu. In vivo, the design of a reporter gene conferring an antibiotic resistance, dependent on mischarged tRNAs, did not allow to detect any cross aminoacylation. However, the proteomic analysis of yeasts overexpressing AspRS pointed out the conditions of AspRS accumulation in the cell by detecting the presence of an additional control mechanism at the post-translational level

Cette thèse traite des aminoacyl-tARN synthétases mammifères. L'ubiquité et l'unicité d'un complexe multienzymatique composé des enzymes spécifiques pour les acides aminés arginine, acide aspartique, acide glutamique, glutamine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine et praline ont été établies. La caractérisation structurale et fonctionnelle des onze composantes polypeptidiques a été effectuée. L'état associatif de ces enzymes n'est pas une condition sine qua non pour l'expression de leurs activités catalytiques. L'assemblage de ces différentes composantes s'effectue par l'intermédiaire de domaines hydrophobes, distincts de domaines catalytiques dont la structure primaire, établie pour l'aspartyl-tARN synthétase par le biais de la séquence nucléotidique d'un clone d'ADNe, est très homologue à celle déterminée chez la levure. La raison d'être de ces complexes est discutée en relation avec leur aptitude à s'associer à des structures cellulaires. Des études réalisées in vivo ont montré le caractère sélectivement inductible de la méthionyl-tARN synthétase, soulevant le problème de la régulation de la biosynthèse, et donc de l'assemblage, des différents constituants de ce complexe.