Academic literature on the topic 'Ammine biogene'

The aim of this thesis was the qualitative and quantitative determination of biogenic amines (BA) and amino acids (AA), in particular the essential AA, in different food matrices typical of Sardinia (Italy). The study was focused on wines and table olives, which are potential source of biogenic amines due to their fermentation processes involved in their production. The decision to follow this research field is based on the importance of having updated information to assess the actual risk from ingesting BA, produced by decarboxylation of AA by microorganisms. These molecules, in fact, have direct or indirect effects on the human vascular and nervous system, especially in people who are sensitive to these substances or in people with specific diseases and/or subjected to particular therapies that affect the normal metabolism. From the legal standpoint, the legislation is developing and it is necessary to collect data in order to improve the control measures for food safety. First step of the doctorate project was to set up an analytical method of high sensitivity simultaneous detection and quantification of BA and AA in food. The method was developed using selective derivatisation with dansyl chloride and HPLC with fluorescence detection and chromatographic separation of 36 compounds, 13 BA and 22 AA, ammonium ion was successfully achieved. BA and AA were dosed using calibration curves built with the internal standard method (norvaline). This method was validated according to ICH Topic Q 2 (R1) 1995 guidelines with the determination of a linearity range, r2, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), intra and inter-day repeatability, and recovery. In cooperation with several local vineries, a survey on BA and AA amount in Cannonau, Vermentino, Carignano e Vernaccia wines, the four most typical “Controlled Designation of Origin” wines from Sardinia was performed. Sixty-one samples were analyzed, and 33 compounds (between BA and amino acids AA) were identified and quantified in the wines analyzed. Carignano wine is particularly rich in BA compounds, while Vermentino wine has a concentration of BA lower than other wine analyzed. Putrescine, histamine and tyramine are the BA found in higher concentration, but usually their amount is lower than 10 mg/L. -Aminobutyric acid is very concentrate in Vermentino wine, with an average value of 130.3±44.8 mg/L. About AA compounds, the highest total concentration is in Vermentino wine, and proline is always the most representative AA. Subsequently, a trial has been set in order to investigate the production of biogenic amines during the winemaking fermentation processes. The experiment was carried out in collaboration with the Agris (Sardinian Regional Agency for Agricultural Research) on three types of characteristic wines of Sardinia: Cannonau, Vermentino and Moscato. The musts of Cannonau, Vermentino and Moscato were treated with different strains of yeast and bacteria starter, and the evolution of the concentration of BA and AA (especially the essential AA) was monitored. Comparing the data obtained, it was observed that the three types of wine at the end of fermentation have interesting differences. It can be noted that the wine Cannonau is particularly rich in nitrogen compounds compared to the two white wines, probably because of the malo-lactic fermentation that does not take place in the other two wines. The Vermentino and Moscato are more similar to each other. In general, it was observed that the choice of starter turns out to be of significant impact in the formation of BA, though not all of the starter can make a difference. Furthermore, neither worrying values of histamine nor of tyramine were observed. Finally, an experimentation regarding the table olives, a fermented product very popular in all Mediterranean area, was developed. Sampling was carried out on a typical Sardinian olive cultivar, the ‘Nera di Gonnos’, and transformation followed the traditional natural fermentation. The HPLC-FLD method used for the wines was modified and validated for the olives. The analyses were conducted during the different steps of fermentation and after one year. Fifteen compounds, between AA and AB, were identified. The obtained data revealed that during the production process there is an increase of formation of nitrogen compounds in general, but the presence in table olives of histamine and tyramine is significantly below the values considered dangerous. In conclusion, a useful, reliable and easily applied HPLC-FLD method to monitor and safeguard the quality and safety of food products was developed. The traditional products from Sardinia showed a general good quality. It would be interesting also to extend the research by selecting and testing other microbial strains in order to obtain products with a lower content of BA and higher essential AA or other useful AA, such as Arg, that have important beneficial effects, yielding products with high quality

Le amine biogene (AB) sono sostanze azotate prodotte da diversi microrganismi attraverso la decarbossilazione di specifici aminoacidi. La tiramina, prodotta in grandi quantità da molti ceppi di Enterococcus faecium, è considerata una della più pericolose amine biogene. Ad oggi, per ostacolare lo sviluppo di questi microrganismi indesiderati, è aumentato l’interesse verso strategie basate sull’utilizzo di composti antimicrobici di origine naturale. In questa tesi, parte di un progetto più ampio, sono state prese in considerazione le matrici vegetali di foglie di mora (Rubus fruticosus) e aghi di ginepro (Juniperus oxycedrus), dalle quali sono stati ottenuti i rispettivi oli essenziali (OE) ed estratti fenolici. Questi composti naturali antimicrobici sono stati testati in vitro per poter inibire la crescita di un ceppo di E. faecium, noto produttore di tiramina. In particolare, sono state studiate le cinetiche di crescita del ceppo in presenza di queste sostante a concentrazioni sub-letali e le risposte fisiologiche a questo tipo di stress. È stato poi valutato anche l’effettivo accumulo di AB tramite tecnica HPLC e attraverso un’analisi gascromatografica sono state caratterizzate le composizioni dei due OE. I risultati hanno mostrato una maggiore efficacia da parte degli oli essenziali (in particolare di mora), rispetto agli estratti fenolici, nel rallentare la crescita microbica e di conseguenza l’accumulo di AB. Questo aspetto è stato confermato anche dalle analisi citofluorimetriche. Questo indica che i danni cellulari indotti dalla presenza dell’OE sono per lo più sub-letali e temporanei. Per questo motivo gli sviluppi futuri e i trial in sistemi reali prevederanno l’utilizzo di strategie combinate (aggiunta di più composti naturali di diversa origine o impiego di colture bioprotettive) al fine di massimizzare l’effetto di questi composti e sfruttare eventuali effetti sinergici.

Nella mia sperimentazione si è determinato le concentrazioni di ammine biogene ed etilcarbammato di vini autoctoni siciliani prodotti a partire da vitigni Catarratto, Grillo ed Insolia provenienti da 4 cantine siciliane e detrrminato il profilo in molecole volatili di questi vini mediante la tecnica GS/MS-SPME e il naso elettronico. Per quanto concerne le ammine biogene, l’ammina rilevata in maggiore quantità è stata la putrescina, mentre la 2-feniletilammina e le poliammine sono state rilevate a bassissime concentrazioni. L’istamina era al di sotto del limite di determinazione (0,1 ppm) nei vini della cantina D e nei vini Grillo e Catarratto della cantina C. La tiramina è stata rilevata solo in 7 dei vini analizzati a concentrazioni mai eccedenti 1,31ppm. I vini della cantina B, pur presentando in 2 campioni delle elevate concentrazioni di putrescina, erano privi di poliammine e tiramina. Per quanto riguarda l’etilcarbammato, esso è risultato sempre al di sotto dei 15ppb, indipendentemente dal vitigno e dalla cantina di produzione, con l’eccezione dei campioni di Catarratto della cantina D. Il vino Grillo proveniente dalla stessa cantina presentava i più bassi valori di etilcarbammato determinato tra i campioni analizzati.Per il profilo in molecole volatili rilevate mediante GC/MS-SPME sono state identificate circa 20 molecole appartenenti a classi chimiche differenti quali esteri, alcoli, acidi ed aldeidi.Al fine di evidenziare meglio le differenze tra i diversi campioni di vino, è stata effettuata un’analisi PCA. La proiezione dei diversi campioni sul piano cartesiano definito dalle componenti 1 e 2 era in grado di spiegare, rispettivamente, il 46,44% e il 17,52% della varianza. I diversi campioni sono stati raggruppati principalmente per cantina e non in rapporto al vitigno. Infatti, sono stati individuati 4 cluster corrispondenti alle 4 cantine di produzione. Dal momento che il profilo sensoriale di un vino è la risultante, oltre che di un complesso equilibrio quali-quantitativo di numerose molecole, anche delle interazioni che si vengono a creare tra le molecole volatili e non in un sistema complesso come il vino, è stata effettuata un’analisi mediante naso elettronico. Come precedentemente, i risultati ottenuti sono stati analizzati mediante l’analisi della componente principale che è stata in grado di spiegare più del 80% della varianza totale. Anche in questo caso, i campioni tendevano a raggrupparsi per cantina e non per vitigno. Dall’analisi critica dei dati si evince come il processo produttivo adottato abbia influito in maniera più significativa rispetto al vitigno sulla differenziazione dei profili in molecole volatili determinati sia mediante gascromatografia che naso elettronico. In conclusione, i risultati della mia sperimentazione hanno evidenziato: marcate differenze in termini di profili in molecole volatili tra i vini analizzati solo in rapporto al processo produttivo adottato dalle cantine, sebbene la zona di produzione della materia prima sia piuttosto ristretta; ottima qualità dei prodotti considerati in termini di molecole potenzialmente tossiche per la salute del consumatore.

Questo elaborato nasce dallo studio di un difetto organolettico osservato in una produzione industriale di Ventricina, un salame prodotto tramite colture starter e muffe (presenti all’esterno del budello). Nel caso specifico affrontato, l’azienda aveva prodotto due diversi lotti: in uno era presente una muffa commerciale (Penicillium nalgiovense), mentre l’altro era ammuffito spontaneamente nelle celle di maturazione presentando, al termine della produzione, odore acre e incrostazioni nella zona esterna del prodotto. Per dare una risposta a questa problematica, sono stati valutati gli andamenti della popolazione microbica, dell’aw, del pH, degli acidi organici, delle ammine biogene e la composizione del profilo aromatico dei prodotti a fine maturazione. È stata studiata la popolazione microbica anche al momento dell’insacco, per valutare il livello di inoculo degli starter e la qualità della materia prima. Dai risultati ottenuti si può dedurre un uso errato degli starter, insufficienti per gestire il processo fermentativo, sia per la bassa quantità di cellule aggiunte, sia per la scarsa qualità della carne impiegata. Questo ha permesso uno sviluppo anomalo della microflora autoctona e un ingente accumulo di ammine biogene. Dall’analisi degli aromi è stato possibile attribuire all’acido isovalerico, avente odore acre, accumulato nei campioni non inoculati con Penicillium, la principale causa del difetto riscontrato. Questo composto può derivare dal metabolismo dell’amminoacido leucina, a seconda delle vie metaboliche adottate dal microbiota presente. Tra i possibili responsabili del suo accumulo vi possono essere svariati gruppi microbici, come le muffe presenti nello stabilimento, stafilococchi selvaggi e ceppi di Carnobacterium. Questi risultati hanno messo in evidenza la necessità di una maggiore comprensione dei fattori che regolano la successione delle popolazioni microbiche durante i processi produttivi e l’ottimizzazione dell’impiego degli starter.

L’impiego di colture starter nell’industria delle carni fermentate è un fattore chiave per garantire la sicurezza dei prodotti, ma l’uso di pochi ceppi selezionati può comportare una perdita d’identità delle produzioni e un appiattimento delle loro peculiarità organolettiche. La ricerca di nuovi starter autoctoni è considerata fondamentale per proteggere questo aspetto, dunque un importante serbatoio di biodiversità è costituito da ceppi isolati da prodotti fermentati spontaneamente. Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare alcuni ceppi di batteri lattici isolati da 3 salami fermentati spontaneamente (senza l’uso di starter) di diversa provenienza (Brescia, Basilicata e Romagna). I ceppi isolati sono stati identificati prevalentemente (75%) come Lactobacillus sakei, mentre i restanti appartenevano a L. curvatus. Solo 2 isolati erano riconducibili a Leuconostoc mesenteroides, batteri lattici eterofermentati. Gli isolati sono stati testati per la loro capacità di produrre amine biogene e per il loro profilo aromatico. Tutti i L. sakei hanno confermato la loro incapacità a produrre amine biogene e solo un L. curvatus produceva putrescina, ottenuta dalla decarbossilazione dell’ornitina, prodotto finale della via dell’arginina deiminasi, importante una volta consumati tutti gli zuccheri disponibili in substrati carnei. Con l’analisi della produzione d’aromi, come messo in evidenza dalla PCA, è stato osservato come la fonte di isolamento ha dato luogo ad isolati con caratteristiche diverse, permettendo una loro netta separazione sulla base della provenienza ed evidenziando un’elevata diversità fenotipica di queste specie. Questo screening è indirizzato dunque alla ricerca di nuovi potenziali starter per l’industria dei salami, per meglio combattere la standardizzazione del prodotto determinata dall’uso di relativamente poche colture starter, favorendo la difesa della tipicità e della riconoscibilità di piccole produzioni tradizionali.

Le ammine biogene sono il prodotto della decarbossilazione degli amminoacidi da parte di enzimi microbici. Tra essi vi è la tirosina decarbossilasi, caratterizzata dalla possibilità di utilizzare, in assenza di tirosina, la fenilalanina, ottenendo la 2-feniletilamina. In particolare, la tiramina è responsabile della comparsa di importanti sintomi tossicologici, raggruppati con il termine “cheese reaction”. In questa sperimentazione sono stati presi in considerazione 2 ceppi di Enterococcus mundtii (C46 e C53) coltivati in BHI in presenza o assenza di tirosina per caratterizzarne l’attività decarbossilasica. Sono state monitorate la crescita microbica, mediante densità ottica e la produzione di tiramina e 2-feniletilamina mediante tecnica HPLC. Dai risultati ottenuti è emerso che entrambi i ceppi producono tiramina sia in presenza che in assenza del precursore. La concentrazione massima rilevata per il ceppo C46 è stata di 797 mg/l e 767 mg/l per C53. È inoltre emerso che essi possono decarbossilare la fenilalanina, ma solo dopo 8 e 24 ore di incubazione per il ceppo C46 e C53. Per quanto concerne la crescita, entrambi i ceppi hanno raggiunto il massimo valore di densità ottica dopo 6-8 ore a 37°C, con una durata della fase lag ridotta, seguita da un rapido aumento della densità ottica. Non sono state riscontrate differenze significative in termini di massima densità ottica raggiunta (A) e durata della fase lag (λ) tra i due ceppi, mentre C53 ha presentato valori inferiori per quanto riguarda la velocità incremento della densità ottica in fase esponenziale (µmax). Dagli studi genici è emerso che l’organizzazione dell’operone dei ceppi considerati corrisponde con quella filogeneticamente riconosciuta per il genere Enterococcus, ma nonostante la similarità, l’operone manca del gene codificante per l’antiporto Na+/H+. È stata inoltre evidenziata nel genoma dei ceppi considerati un’altra regione che contiene geni codificanti per un ulteriore sistema decarbossilasico.

I salami ottenuti per fermentazione spontanea in Italia costituiscono oramai una parte marginale della produzione poiché l’impiego delle colture starter è sempre più diffusa. Questo da un lato ha portato netti miglioramenti sulle caratteristiche igienico-sanitarie ma può comportare un appiattimento delle caratteristiche qualitative dei prodotti ottenuti. E’ quindi sempre più necessaria la ricerca di nuove colture starter in grado di connotare e differenziare le proposte e ceppi isolati in prodotti tradizionali soggetti a fermentazione spontanea costituiscono un importante serbatoio di biodiversità. In questo elaborato abbiamo valutato le caratteristiche microbiologiche di un salame ottenuto da una fermentazione domestica in Romagna, ottenuta senza l’impiego di starter. Il prodotto finale è stato studiato per le sue caratteristiche chimico-fisiche, microbiologiche, il contenuto in ammine biogene e il profilo aromatico. Dal prodotto sono stati poi isolati ed identificati ceppi di batteri lattici che sono risultati per lo più appartenere alla specie Lactobacillus sakei, comunemente ritrovata in prodotti simili, ma sono stati riscontrati anche alcuni ceppi di Lactobacillus curvatus. Su questi isolati è stata condotta una prima caratterizzazione tecnologica al fine di individuare i più interessanti candidati ad un possibile utilizzo come starter e al fine di escludere le loro capacità amminobiogeniche. I dati riportati in questo elaborato indicano una grande variabilità nell’ambito della specie Lactobacillus sakei per quanto riguarda, in particolare, il metabolismo degli amminoacidi e la conseguente produzione in molecole d’aroma. Questi studi possono aprire alla possibilità di usare miscele di ceppi “taylor made” con diverse attitudini in funzione dello stadio di fermentazione, per portare a termine il processo necessario per l’ottenimento di salami sicuri, con caratteristiche organolettiche appropriate ed in grado di differenziale le diverse produzioni.

Negli ultimi decenni è diventato sempre più comune l’utilizzo di colture starter nella produzione di carni fermentate. Questo determina aspetti positivi, come il controllo delle fermentazioni che porta all’ottenimento di prodotti di qualità e sicuri dal punto di vista igienico-sanitario, ma anche svantaggi, come la possibile perdita di tipicità dei prodotti locali. In questa tesi, parte di un progetto più ampio, sono stati caratterizzati a livello di sicurezza (antibiotico resistenza [AR], produzione di amine biogene [AB]) 148 ceppi di battei lattici isolati da diversi salami europei fermentati spontaneamente. I risultati evidenziano una AR legata all’origine degli isolati: ceppi isolati da prodotti spagnoli e croati mostravano una maggiore incidenza di AR, con anche resistenze multiple, mentre ceppi isolati da prodotti italiani e sloveni erano sensibili agli antibiotici testati. In generale vi era una diffusa la resistenza alla streptomicina, mentre per (gentamicina, kanamicina e tetraciclina i valori di MIC erano molto variabili, in relazione sia alla specie che al biotipo. Anche la produzione di AB era molto variabile: tra i ceppi spagnoli, alcuni Lat. curvatus erano in grado di produrre tiramina e/o putrescina e in un caso istamina, mentre il 30% dei Comp. alimentarius produceva sia tiramina che istamina. Inoltre, sono stati effettuati test per valutare l’attività antimicrobica con spiccati risultati per i ceppi croati. Molti ceppi erano caratterizzati da geni codificanti le batteriocine (sakacina e curvacina), evidenziando un possibile legame con la loro attività. Dai risultati ottenuti, è stato quindi possibile selezionare un gruppo di ceppi considerati sicuri che saranno studiati a livello tecnologico (potere acidificante, resistenza al sale, profilo termico, profilo in metaboliti volatili), al fine di selezionare i migliori candidati da utilizzare come colture starter e/o protettive nella produzione di salumi a livello industriale.

In questo lavoro, sono stati analizzati come caso di studio due tipi di salami fermentati italiani (tipo Felino e tipo Milano). Lo scopo è stato quello di valutare l’effetto di diverse condizioni ambientali nelle celle d’asciugamento e l’effetto di diverse colture starter sulle caratteristiche dei salami di produzione industriale. Alla fine della maturazione, i salami ottenuti sono stati analizzati per determinare i conteggi microbici, l’accumulo di ammine biogene (AB) e il profilo aromatico volatile, mediante l’utilizzo delle analisi SPME-GC. Questi profili sono stati confrontati con i risultati di un gruppo panel esperto. I salami tipo Felino, inoculati solo con Stafilococchi, sono stati caratterizzati da un lento abbassamento del pH e dalla presenza di alti contenuti di AB. Inoltre, sono state osservate le attività enzimatiche specifiche degli Stafilococchi, come il metabolismo della fenilalanina, che hanno modificato radicalmente i profili volatili del prodotto. Anche le diverse condizioni d’asciugamento applicate sono state in grado d’influenzare alcune caratteristiche sensoriali dei prodotti finali come la durezza e la masticabilità che mostrano diverse cinetiche di perdita d’acqua.

L’ocratossina e le ammine biogene sono due metaboliti biologici che possono essere ritrovati nei vini. Il primo di questi contaminanti è stato studiato recentemente per la sua elevata tossicità sebbene non sia rintracciabile frequentemente nei vini. Le ammine biogene sono presenti in ogni tipo di vino in differenti concentrazioni, oltretutto, alcune di loro, ad alte concentrazioni, possono causare reazioni allergiche. Gli obiettivi di questo PhD riguardano tre differenti aspetti. Indagare metodi biologici di per la decontaminazione di ocratossina A durante la vinificazione; in particolare lo studio si è focalizzato sull’uso di un ceppo Lactobacillus plantarum utilizzato come starter malolattico. Valutare la presenza di Lactobacillus spp., isolati da mosto e vino, in grado di produrre ammine biogene, usando tecniche molecolari come la reazione a catena della polimerasi (PCR) per rilevare i geni codificanti gli enzimi responsabili della sintesi di questi composti. Testare la capacità di un L. plantarum di effettuare la malolattica effettuando l’inoculo in differenti fasi della vinificazione e valutare il trend delle ammine biogene già presenti nel mosto.
Two of the major biological metabolites present in wine are the ochratoxin and the biogenic amines. The first of these contaminants was studied in recent decades because of its toxicity in humans, although its presence is not frequent in wines. The biogenic amines are present in every types of wine in different concentration, and some of them, in high concentrations, can cause allergenic reactions in humans. The objectives of this PhD regard three different aspects. Investigate the biological methods to reduce ochratoxin A in wine during winemaking; in particular the study is focused to use a Lactobacillus plantarum strain as malolactic starter. Investigate the presence of Lactobacillus spp., isolated from must and wine, able to produce the amines, using molecular techniques as polymerase chain reaction (PCR) to detect the genes that encode for the enzymes responsible of the synthesis of these compounds. Test the ability of a L. plantarum to perform MLF in relationship with inoculation time and assess the trend of biogenic amines already present in must.