Academic literature on the topic 'Analyses à l'échelle de la cellule unique'

Le miel est traditionnellement consommé dans les îles de l’océan Indien et utilisé également pour ses propriétés cosmétiques et thérapeutiques. Ce produit, issu du nectar de fleurs ou de miellat d’insectes, est collecté et transformé par les abeilles produisant ainsi un miel unique caractéristique de la flore de chaque île. A l’issue de la récolte, l’apiculteur doit nor­malement veiller à ce que le miel soit conforme et respecte des caractéristiques physico-chimiques spécifiques selon les recom­mandations du Codex alimentarius. De plus, il doit indiquer des informations, comme l’origine botanique et géographique, sur chaque pot de miel vendu. En pratique il est toutefois très diffi­cile de vérifier l’exactitude de ces informations, d’autant qu’elles sont mises en avant comme argument de vente.La spectrométrie dans le proche infrarouge (SPIR), basée sur les propriétés physiques d’absorption de la lumière par les com­posés organiques, peut être un outil de contrôle et de traçabi­lité des miels mis sur le marché (1, 3). L’objectif principal de cette étude a été d’évaluer la faisabilité d’un contrôle qualité (authentification de l’origine botanique et/ou géographique et détection d’adultération) des miels commerciaux produits dans l’océan Indien. Les perspectives de cette méthode de laboratoire sont importantes dans le cadre du développement des filières apicoles, notamment lorsqu’elles sont orientées vers les marchés d’exportation et vers la promotion de leur qualité auprès de consommateurs désireux de profiter de produits d’excellence et fortement attachés à des territoires insulaires uniques.Au total, 625 miels des pays de l’océan Indien (tableau I) ayant diverses origines botaniques (tableau II) ont été mesurés sans ajustement à 30 °C et après ajustement à 70 °Brix avec de l’eau distillée (3). La mesure a été réalisée en réflexion diffuse à l’aide d’une cellule ronde avec un fond réflecteur doré (trajet optique 0,1 mm) sur un spectromètre FOSS NIRSystem 5000 (1 100–2 500 nm, 2 nm). En parallèle, les mesures du degré Brix, de l’humidité et de la conductivité des miels bruts ont été réalisées au laboratoire. Après l’analyse en composantes prin­cipales (ACP) de la base spectrale des 625 miels et le calcul des distances H de Mahalanobis, 83 miels ont été identifiés comme spectralement atypiques et retirés du jeu de données (tableau I). Sur la base des distances spectrales (H, Mahalanobis), 64 miels représentatifs des 542 miels retenus ont été sélectionnés, ajustés à 70 °Brix, puis adultérés avec du sirop de sucre de canne du commerce (Mascarin®) à 25 et à 10 p. 100 par pesée.Les modèles prédictifs des teneurs en humidité, Brix et conducti­vité ont été établis en utilisant la régression modified partial least square (M-PLS) du logiciel WinISI 3 (Infrasoft, Port Mathilda, PA, Etats-Unis). Les modèles PLS ont été réalisés sur la base des dérivées premières des spectres normalisés (SNV) et corri­gés pour la ligne de base (Detrend). Pour expliquer les critères géographiques et botaniques, nous avons utilisé une méthode non supervisée de discrimination (Cluster Analysis, Unscrumbler 10.3, CAMO, Oslo, Norvège), qui constitue des groupements naturels, sur la base des distances spectrales. Les spectres des miels non adultérés ont servi de base pour définir un espace multidimensionnel (ACP centrée, non réduite sur dérivée seconde des spectres bruts). La projection des spectres (dérivée seconde des spectres bruts) des miels adultérés sur cet espace a permis d’identifier un plan factoriel (CP1–CP7) expliquant 65 p. 100 de la variance totale, sur lequel les miels adultérés étaient nettement séparés des miels non adultérés. Les modèles d’étalonnage obtenus par régression PLS pour le degré Brix, l’humidité et la conductivité ont été performants avec des R² de l’ordre de 0,92 et des erreurs de validation croisée acceptables (tableau III) (figure 1).Les essais de groupement des individus sur la base de leur spectre (recherche de clusters), de même que l’utilisation d’autres méthodes mathématiques, comme l’analyse discrimi­nante linéaire (LDA) et la classification support vecteur machine (SVM) à partir des origines géographiques et botaniques n’ont pas donné de résultats satisfaisants (tableau IV). Cette impossi­bilité de discriminer les miels de l’océan Indien serait peut-être due à une identification botanique imprécise des miels. Sans analyses polliniques des échantillons de miels, les origines bota­niques ne peuvent être certifiées, en particulier les miels dits monofloraux. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer l’impos­sibilité de discriminer les miels de l’océan Indien en fonction de leur origine géographique et/ou botanique. Parmi elles, les différences chimiques caractéristiques de l’origine géographique et/ou botanique correspondent à des classes de composés (aro­matiques par exemple) qui n’impactent pas suffisamment les empreintes spectrales, ne permettant pas de trouver des fac­teurs discriminants. La projection des miels adultérés à 25 p. 100 (figure 2), sur la base de miels non adultérés montre une sépara­tion nette des populations. En revanche, pour un niveau d’adul­tération à 10 p. 100, la séparation n’est pas évidente (figure 3).Les résultats obtenus montrent que la spectrométrie dans le proche infrarouge peut être utilisée pour prédire certains para­mètres physico-chimiques des miels. Ces premiers résultats montrent que la constitution d’une base spectrale de miels adultérés à différents niveaux au laboratoire, associée à des méthodes de régression ou de discrimination devrait permettre l’identification de miels non-conformes, comme montré précé­demment par Rios-Corripio et coll. (2).Ces résultats ne permettent pas, dans l’état actuel, de différencier l’origine géographique et botanique des miels collectés dans le commerce. La limite de détection des miels adultérés par du sucre de canne devra être déterminée. Elle se trouve entre 10 et 25 p. 100. Les fraudeurs adultérant fréquemment les miels avec du glucose, il serait important de poursuivre les essais avec ce produit. Il est donc possible de détecter, par la technique SPIR, des altérations importantes du miel par ajout de sucre de canne.

Les quantités et flux infinitésimaux de biomolécules électroactives émises par une cellule unique isolée en boite de Pétri peuvent être mesurés en temps réel par une ultramicroélectrode placée au contact de la cellule sécrétrice. Le travail présenté dans ce manuscrit a pour but d'étendre cette méthodologie analytique d'utilisation des microélectrodes de carbone platiné à l'étude du lien entre stress oxydant et l'effet de substances anti-cancéreuses (FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM) sur des cellules tumorales du sein. Le signal ampérométrique est collecté par une microélectrode de carbone platiné positionnée à une centaine de nanomètres au-dessus d'une cellule tumorale du sein et incubée en présence d'espèces anticancéreuses de type ferrocifènes. La libération in situ des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'azote (RNS), i.e., H2O2, ONOO-, NO et NO2-, par ces cellules (MCF7 et MDA-MB-231) est analysée. Les études morphologiques montrent que les produits FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM présentent un effet anti-prolifératif significatif. Le traitement avec Fc-diOH et surtout DP1 augmente significativement la production de ROS. Par contre, Fc (témoin) et Fc-OH-TAM n'ont pas ou très peu d'effet. Cela est assez surprenant pour Fc-OH-TAM, qui a l'effet anti-prolifératif le plus fort parmi les ferrocifènes testés. Fc-diOH et DP1, quant à eux, semblent induire une surproduction de NO° et/ou de NO2-, ainsi que du peroxyde d'hydrogène. Cette comparaison inédite entre études morphologiques et électrochimiques tend à montrer que les ferrocifènes agissent par deux voies qui sont complémentaires, soit via la formation de quinone méthide (Fc-OH-TAM), soit par réaction directe (DP1, Fc-diOH).

Les systèmes d'analyse miniaturisés sont particulièrement adaptés pour les analyses de cellules en faible nombre ou de cellules isolées. Une telle diminution du volume d'analyse permet une augmentation de la concentration locale et par conséquent une augmentation de la sensibilité des mesures effectuées. Les travaux présentés dans cette thèse se positionnent dans ce cadre en proposant un outil analytique novateur, couplant le contrôle dynamique des micro-environnements de la cellule par la microfluidique et l'analyse instantanée et locale des espèces en solution par l'électrochimie.
Grâce au développement d'outils modulables de culture cellulaire et de manipulation de cellules vivantes dans des dispositifs microfluidiques, nous avons mis en place le contrôle dynamique stable de stimulations chimiques sur une population de cellules souches mésenchymateuses (CSM) en culture et poursuivons cette étude dans le but d'induire la réactivité cellulaire des CSM vers la voie de différenciation neuronale.
Le développement d'un microsystème intégré de détection électrochimique du stress oxydant sur cellules uniques est mis en oeuvre à travers la réalisation d'un dispositif microfluidique intégré consistant en un réseau de chambres de mesures, contenant des microélectrodes fonctionnelles, et permettant d'isoler des macrophages uniques et de les maintenir en survie pendant plusieurs dizaines de minutes, durée suffisante pour réaliser nos mesures électrochimiques. En faisant varier les conditions de mesure, comme le nombre de cellules sondées dans le même micro-environnement, la nature du stimulus ou la présence ou non de communication cellulaire avec une population voisine, nous posons les bases d'une analyse originale jamais réalisée jusqu'à présent.

Cette thèse concerne le développement d’outils microfluidique pour l’ingénierie d’enzymes d’intérêt thérapeutique. La microfluidique à base de gouttelettes présente un énorme potentiel dans le domaine de la biologie quantitative. Nous développons des outils microfluidiques pour l’évolution dirigée de l’enzyme L-asparaginase, enzyme utilisée comme traitement de laleucémie lymphoblastique aiguë. Ce traitement est basée sur une enzyme d’origine bactérienne,ce qui conduit à déclencher des réactions immunitaires qui se traduit par l’interruption du traitement, souvent fatale pour le patient. Cependant, une version humaine de l’enzyme L-asparaginase, qui est moins immunogénique, n’est à l’heure actuelle pas suffisamment active pour être utilisée. L’objectif principal de cette thèse est d’alors d’analyser et de cribler des banques de mutants d’enzymes en utilisant des méthodes classiques de mutagenèse et d’analyser chaque mutant individuellement par le biais de la microfluidique. Pour cela, plusieurs systèmes microfluidiques ont été développés et optimisés afin de répondre à différents critères de sélection pour l’analyse et la sélection de l’enzyme L-asparaginase. La version bactérienne a servi de contrôle positif pour l’optimisation des systèmes microfluidiques afin de pouvoir analyser et de cribler des banques de mutants de la version humaine de l’enzyme L-asparaginase
This thesis deals with the development of microfluidic tools for the engineering ofenzymes of therapeutic interest. Droplet microfluidics has enormous potential in the field ofquantitative biology. We are developing microfluidic tools based on the directed evolutionof the enzyme L-asparaginase, an enzyme used to treat acute lymphoblastic leukemia. Thistreatment is based on an enzyme of bacterial origin, which leads to immune reactions thatresult in the interruption of treatment, often fatal for the patient. However, a human version ofthe enzyme L-asparaginase, which is less immunogenic, is currently not sufficiently active to beused. The main objective of this thesis is to analyze and screen enzyme mutant libraries usingstandard mutagenesis methods and to analyze each mutant individually through microfluidics.For this, several microfluidic systems have been developed and optimized for different selectioncriteria for the analysis and selection of the enzyme L-asparaginase. The bacterial versionserving as a positive control for the optimization of microfluidic workflows to analyze andscreen mutant libraries of the human version of the enzyme L-asparaginase

Bien que largement étudiés, les mécanismes fondamentaux de prise de décision dans les processus de différenciation cellulaire restent mal compris. Les théories déterministes, souvent basées sur des études populationnelles, atteignent rapidement leur limite lorsqu’il s’agit d’expliquer les différences de choix individuels de cellules, pourtant exposées au même environnement. L’objectif de ma thèse est donc d’étudier les premières étapes de la différenciation des cellules hématopoïétiques à l’échelle de la cellule unique, par des analyses transcriptomiques, protéomiques et morphologiques. Ce travail a été effectué sur deux modèles de différenciation : les lymphocytes T régulateurs et les cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon. Nous avons observé le comportement de ces cellules uniques après stimulation. Grâce à la combinaison de la microscopie en time lapse et des analyses moléculaires réalisées à l’échelle de la cellule individuelle, nous avons pu démontrer que le choix du devenir cellulaire n’était pas unique, programmé. La cellule passe d’abord par un état dit « multi-primed », métastable où elle exprime des gènes de plusieurs lignées différentes, puis elle passe par une phase dite « incertaine », instable où elle hésite entre deux phénotypes avant de se stabiliser dans un état fixe. Nos observations sont cohérentes avec une explication stochastique de la prise de décision. La différenciation serait donc un processus spontané, dynamique, fluctuant et non un processus prédéterminé. Les décisions du destin cellulaire sont prises séparément par les cellules individuelles
Despite intensively studies, the fundamental mechanisms of cell fate decision during cellular differentiation still remain unclear. The deterministic mechanisms, often based on studies of large cell populations, cannot explain the difference between individual cell fates choices placed in the same environment. The aim of my thesis work is to study the first steps of hematopoietic cell differentiation at the single cell level thanks to transcriptomic, proteomic and morphological analyses. Two differentiation models have been used: T regulatory lymphocytes and human cord blood-derived CD34+ cells. The behavior of individual cells following stimulation has been analyzed. Using time-lapse microscopy coupled to single cell molecular analyses, we could demonstrate that the cell fate choice is not a unique, programmed event. First, the cell reaches a metastable “multi-primed” state, which is characterized by a mixed lineage gene expression pattern. After transition through an “uncertain”, unstable state, characterized by fluctuations between two phenotypes, the cell reaches a stable state. Our observations are coherent with a stochastic model of cell fate decision. The differentiation is likely to be a spontaneous, dynamic, fluctuating and not a deterministic process. The cell fate decisions are taken by individual cells

De par leur excellente résolution spatiale et leurs propriétés particulières, les ultramicroélectrodes (UME) constituent des outils de choix pour l'étude de mécanismes biologiques de sécrétion à l'échelle de la cellule unique. En configuration " synapse semi-artificielle ", du fait de la faible distance qui sépare la cellule émettrice de l'UME, les molécules sont libérées dans un faible volume, induisant alors des concentrations suffisamment élevées pour être détectables par électrochimie. Ainsi, les UME offrent la possibiIité de mesurer des flux, même infimes, de molécules électroactives en temps réel. Cette technique analytique a été utilisée, complétée ou adaptée afin d'étudier deux phénomènes biologiques : l'exocytose vésiculaire et le stress oxydant cellulaire. L'analyse ampérométrique de l'exocytose, mécanisme impliqué dans la communication cellulaire, permet l'étude quantitative de la cinétique de libération des molécules intravésiculaires libérées dans le milieu extracellulaire. L'UME, placée dans le milieu extérieur, n'apporte pas d'information quant au statut des vésicules avant la fusion. Pour compléter ces informations, nous avons développé, par des techniques de microfabrication, un microsystème constitué d'électrodes conductrices et transparentes d'ITO permettant un couplage des détections ampérométrique et optique (microscopie TIRF) pour l'étude de la sécrétion des cellules BON BC21. L'ampérométrie à quatre potentiels constants, utilisée au laboratoire pour la détection des ROS/RNS libérées par les macrophages, cellules du système immunitaire, nécessite un grand nombre d'expériences pour s'affranchir de la variabilité cellulaire et des différences de sensibilité des UME. Afin de réduire considérablement le temps d'expérience, nous avons développé un microsystème constitué de quatre chambres de mesure, chacune contenant un jeu de trois électrodes. Ces quatre chambres permettront, à terme, le suivi et la détection simultanée en temps réel des variations de production de H2O2, ONOO-, NO* et NO2- libérées par une cellule.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu du domaine biomédical. Les études en molécule unique permettent d'observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d'ensemble, tels la traduction de protéines.Cette thèse présente les premiers résultats en molécule unique sur la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère). Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s'hybrider sur les séquences d'ARN traduites. L'observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en onde évanescente (TIRF), les ARN étant fixés sur une lamelle de microscope. En lisant l'ARN, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départs donnent des informations sur le passage du ribosome à différentes positions sur l'ARN. Cette méthode permet d'obtenir des données cinétiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être interpolées par des lois de probabilité. Nous obtenons par cette méthode des mesures de la cinétique in vitro de l'élongation eucaryote et nous observons un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous complexons le ribosome sur l'ARN grâce à une structure de type IRES. Dans nos conditions d'expérience, l'incorporation d'un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Ces résultats ouvrent des perspectives d'étude cinétique dans des cas plus complexes tels le franchissement de structures secondaires de l'ARN.

La libération des espèces réactives de l’oxygène de l’azote (ROS/RNS) par des macrophages immunostimulés a été suivie en temps réel avec des microélectrodes de carbone platiné. Les mesures à potentiels constants ont montré que des macrophages activés par IFN-γ/LPS et/ou PMA produisent principalement le ONOO−, NO•, NO2− et/ou H2O2. Sous activation par IFN-γ/LPS, la majorité de ces espèces semblait être dérivée d’une co-production de NO• et d’O2•− par la NOS inductible. Ce travail a fourni la première preuve directe de la libération d’ONOO− par les macrophages immunostimulés. De plus, des mesures chronoampérométriques à triple saut de potentiel ont montré des variations temporelles de la libération de chaque espèce. Une augmentation d’H2O2 en présence de [MnII(pyane)Cl2] a été observée, démontrant son rôle comme mimique de SOD. Cependant, des atténuations d’ONOO− et de NO• ont aussi été observées, accompagné par une augmentation de NO2−. Ceci démontre une activité NO• dismutase de ce complexe, aussi que sa réactivité envers l’ONOO−, ce que nous avons ensuite confirmé par des études électrochimiques in vitro.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est parmi les principales causes de mortalité dans le monde et les traitements disponibles sont insuffisants. Ceci est dû à la connaissance limitée de la complexité biologique et du microenvironnement hépatiques en situation normale et pathologique. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé un protocole de séquençage d’ARN sur cellule unique (scRNA-seq) à partir de tissus primaires de foie humain. Nous avons assemblé un atlas de cellules du foie humain et comparé le profil scRNA-seq du foie normal au profil du CHC. L’atlas a révélé l’hétérogénéité au sein des principales populations de cellules hépatiques, la zonation transcriptomique des cellules endothéliales et l'existence de progéniteurs épithéliaux dans le foie adulte capable de se différencier à la fois en cholangiocytes et en hépatocytes. L'analyse par scRNA-seq du CHC a dévoilé l'hétérogénéité marquée de cette tumeur, les modifications de son microenvironnement cellule par cellule et les interactions entre les cellules tumorales et le virus de l’hépatite B en découvrant des voies et des facteurs moteurs de la cancérogenèse hépatique jusque-là inconnus
Hepatocellular carcinoma (HCC) is a leading cause of death worldwide and the current treatments are unsatisfactory. One reason is the limited knowledge on the complexity and microenvironment of healthy and diseased liver. To address this gap, we have developed a single cell RNA sequencing (scRNA-seq) pipeline for primary human liver tissues. We have assembled an atlas of human liver cells and compared the scRNA-seq profile of normal liver and HCC. The atlas revealed an unknown heterogeneity within the main populations of liver cells, the transcriptomic zonation of endothelial cells and the existence of an epithelial progenitor in the adult liver capable of differentiating into both cholangiocytes and hepatocytes. ScRNA-seq analysis uncovered the marked cell heterogeneity of HCC, its microenvironment changes at single-cell level and the interactions between tumor cells and hepatitis B virus discovering previously unknown pathways and drivers of hepatocarcinogenesis

Les technologies d'analyse à l'échelle de la cellule unique ont vu le jour il y a quelques années et sont depuis en constante évolution. Ces technologies permettent de mieux comprendre le fonctionnement d'ensemble de cellules très hétérogènes. Elles permettent par exemple de découvrir et suivre des sous types cellulaires, avec des applications en cancérologie ou encore en neurobiologie. Nous avons développé une technologie pour étudier le profil d'expression de gènes d'intérêt au niveau d'une cellule unique, en utilisant la microfluidique en gouttes. En limitant le nombre de gènes étudiés comparé aux technologies commerciales de transcriptome entier, l’approche ciblée a plusieurs avantages potentiels : gagner en profondeur de séquençage, augmenter le nombre de cellules étudiées, optimiser la détection pour les bas niveaux d’expression, tout en réduisant la complexité des données et des coûts. Le ciblage est parfois indispensable, notamment lorsque les ARNs ne portent pas de séquence d’amorce générique, comme dans le cas des ARNs viraux. Deux applications sont présentées : l'analyse de l'inflammation des cellules immunitaires du cerveau aux premières étapes du développement, ainsi que l'étude de la recombinaison génétique chez le virus
Single cells technologies were introduced a few years ago and have been dramatically evolving ever since. These technologies have revolutionized biology, making it possible to better understand how heterogeneous cell systems works. For example, they permit to discover and follow cell subtypes, with applications in oncology or neurobiology. We have developed a technology to study the expression profile of genes of interest at the level of a single cell, using droplet-based microfluidics. By limiting the number of genes studied compared to commercial whole-transcriptome technologies, the targeted approach has several potential benefits: gaining deeper sequencing, increasing the number of cells studied, optimizing detection for low levels of expression, while reducing the complexity of data and costs. Targeting is sometimes essential, especially when the RNAs do not carry a generic primer sequence, as in the case of viral RNAs. Two applications are presented: the analysis of inflammation of the immune cells of the brain in the early stages of development, as well as the study of genetic recombination in the virus

Les progrès technologiques en séquençage haut débit et en manipulation cellulaire permettent d'analyser simultanément et indépendamment le contenu de nombreuses cellules (ARN, ADN,...). Cette révolution "omique" offre un nouveau cadre pour revisiter la "Théorie Cellulaire", essentiellement basée sur des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles. Les nombreuses modalités cellulaires désormais accessibles au niveau de la cellule unique, telles que leur transcriptome, leur localisation spatiale, leurs trajectoires développementales, enrichissent considérablement cette définition, et établissent un contexte totalement renouvelé pour réévaluer la définition de "types" ou d’"états" cellulaires ainsi que leurs interactions. \Mon travail de thèse a été de mettre en place des approches statistiques appropriées pour analyser ces données transcriptomiques sur cellule unique caractérisées par une forte variance, la présence d'un pourcentage élevé de valeurs nulles et un grand volume de données. Mon travail s’est focalisé sur le modèle expérimental central de mon laboratoire d’accueil, l'épithélium des voies respiratoires humaines. Les voies respiratoires humaines sont bordées d'un épithélium pseudo-stratifié composé principalement de cellules basales, sécrétrices, à gobelet et multiciliées. Les voies respiratoires constituent en outre un véritable écosystème cellulaire, dans lequel la couche épithéliale interagit étroitement avec les cellules immunitaires et mésenchymateuses. Cette coordination entre les cellules assure une bonne défense du système respiratoire et sa correcte régénération en cas d'agressions extérieures. Une meilleure compréhension des situations cellulaires normales et pathologiques peut améliorer les approches pour lutter contre des pathologies telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, l'asthme ou la mucoviscidose.J'ai d'abord pu caractériser au niveau de la cellule unique la séquence précise et spécifique des événements conduisant à la régénération fonctionnelle de l'épithélium, en utilisant un modèle 3D de cellules humaines. J'ai identifié des hiérarchies de lignées cellulaires et j'ai pu reconstruire les différentes trajectoires possibles de différentiation cellulaire. J'ai confirmé des trajectoires cellulaires décrites précédemment, mais j'ai aussi découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules à gobelet aux cellules multiciliées, identifiant de nouvelles populations cellulaires et de nouvelles interactions moléculaires impliquées dans le processus de régénération de l'épithélium sain des voies aériennes humaines. J'ai ensuite construit un atlas des différents types cellulaires qui tapissent les voies respiratoires humaines saines, du nez jusqu’à la 12ième génération de bronches. Le profilage de 10 volontaires sains a généré un ensemble de données de 77 969 cellules, provenant de 35 emplacements distincts, qui comprend plus de 26 types cellulaires épithéliaux, immunitaires et mésenchymateuses. Cet atlas illustre l'hétérogénéité cellulaire présente dans les voies respiratoires. Son analyse révèle une différence d'expression des gènes entre le nez et les voies respiratoires pulmonaires que j’ai caractérisé dans les cellules suprabasales, sécrétrices et multiciliées. Mes travaux ont également permis d'améliorer la caractérisation de certaines populations de cellules rares, comme les cellules "hillock", déjà décrites chez la souris. En conclusion, mon travail contribue à une meilleure compréhension des dynamiques de différenciation et d'hétérogénéité cellulaire dans les voies respiratoires humaines saines. La ressource ainsi constituée sera extrêmement utile dans tout projet futur visant à analyser avec précision les conditions spécifiques des maladies respiratoires
Improvements made in nucleic acid sequencing and cell handling technologies now offer the opportunity to analyze simultaneously the content of numerous single cells (RNA, DNA, ...) by global and unbiased approaches. This single-cell ‘omics’ revolution provides a new framework to revisit the “Cell Theory”, elaborated over several centuries, and essentially based on morphological and functional features. The many cell modalities now accessible at single- cell level, such as their transcriptome, spatial localization, developmental trajectories, enrich considerably this definition, and set a renewed context to precisely reassess the definition of ‘cell types’, ‘cell states’ as well as their different interactions and fates.My thesis work initially set up ad hoc approaches and statistical framework to analyze appropriately these single-cell data, which deeply differ from standard bulk RNA-seq. High variance, presence of a huge percentage of null values, large volume of data are among the specific characteristics of these datasets. My work was centered on the main experimental model of my host laboratory, e.g. the human airway epithelium. Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal, secretory, goblet and multiciliated cells. Airways also constitute a true cellular ecosystem, in which the epithelial layer interacts closely with immune and mesenchymal cells. This coordination between cells ensures proper defense of the respiratory system and its correct regeneration in case of external aggression and injuries. A better understanding of the operating sequences in normal and physiopathological situations is relevant in pathologies such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis.First, I characterized at a single cell level the precise and cell-specific sequence of events leading to functional regeneration of the epithelium, using a 3D model of human cells. I then built a single-cell atlas of the different cell types that are lining healthy human airways from the nose to the 12th generation of bronchi.By applying computational and statistical approaches, I have identified cell lineage hierarchies and was able to reconstruct a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. I not only confirmed previously described cell lineages, but I have also discovered a novel trajectory that links goblet cells to multiciliated cells, identifying novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. The profiling of 12 healthy volunteers then generated a dataset of 77,969 cells, derived from 35 distinct locations. The resulting atlas is composed of more than 26 epithelial, immune and stromal cell types demonstrating the cellular heterogeneity present in the airways. Its analysis has revealed a strong proximo-distal gradient of expression in suprabasal, secretory, or multiciliated cells between the nose and lung airways. My work has also improved the characterization of rare cells, including “hillock” cells that have been previously described in mice.In conclusion, this work probably represents one of the first single-cell investigations in human airways. It brings original contributions to our understanding of differentiation’s dynamics and cellular heterogeneity in healthy human airways. The resulting resource will be extremely useful for any future single-cell investigators and also for establishing a very useful joint between clinical and biological works. As such, it will constitute a reference in any future project aiming to precisely analyze specific disease conditions