Dissertations / Theses on the topic 'Angiogeneza'

Ribonucleases (RNases) are proteins involved into many biological processes and hydrolysis of ribonucleic acid. The topic of this study has been the structural and functional characterization of three bovine proteins, namely RNase-A, Angiogenin-1 (bANG) and Lactogenin. The enzymatic, pro-angiogenic and cytotoxic activity has been evaluated. RNase-A is the best known protein showing a strong ribonucleolytic activity and a low cytotoxic action. bANG is a single-chain polypeptide stimulating angiogenesis; it has a weak ribonucleolytic activity necessary, but not sufficient, to induce the neoformation of blood vessels. Lactogenin, also named RNase BL-4, has been relatively poorly studied. In this study the relationship between molecular structure and biological activity of the three RNases has been evaluated by spectroscopy, ribonucleolytic activity analysis and, finally, by their effects on the viability of human endothelial or cancerous cellular cultures. High homology level of primary structure is resulted for all three under study proteins. Moreover, disulfide architecture is preserved except the missing of one bridge in bANG and the presence of a pyroglutamic residue at the N-terminus of Lactogenin. It is known that RNase-A is far more active in cleaving dinucleotide substrates as CpG and UpG in comparison with Lactogenin and bANG. On the other hand, Lactogenin presents a higher specificity for UpG instead of CpG than bANG. Angiogenin has been treated with immobilized trypsin in order to obtain its tryptic peptides and identify which part of protein is more involved into biological activity. The research study has shown that bANG stimulates the proliferation and capillary-like structures formation of Huvec endothelial cells in Matrigel in vitro angiogenic assay. The fragment 1-6 (N-terminal, termed P1) and the fragment 56-61 have stimulated a cellular proliferation response comparable to the native protein's one while the C-terminal fragment 103-124 has exhibited an inhibition effect. Moreover, in the presence of all the fragments P1, 56-61 and C-terminal the cells have demonstrated branch points formation, after seeding on Matrigel. The activity of Lactogenin has been comparable to the one of bANG, even if less strong, while RNase-A have not stimulated HUVEC cells' proliferation or differentation on Matrigel. Angiogenin and Lactogenin have been shown to promote the migration of cultured endothelial cells and the neovascularization in the chicken chorioallantoic membrane. The attachment and growth of HUVEC cells on synthetic materials such as polycaprolactone scaffolds seem to be improved by the addition of Angiogenin and its N-terminal fragment to the culture medium. The cytotoxic properties of RNase-A, bANG and Lactogenin have been valuated by using some tumor cell lines. bANG has expressed a stronger cytotoxic potential, inducing cell death by an apoptotic mechanism. In comparison with RNase A, the major cytotoxicity of bANG could be explained as a minor interaction with the RNAse inhibitor (RI). This hypothesis has been verified modelling bANG structure on the complex human Angiogenin-hRI, as the protein conformation is not so different in the complex from the free form. Many different contacts with hRI have been observed in hANG and bANG. One of the principal anchorage sites of hRI to hANG is resulted the Pro 88 residue, which lies within a hydrophobic pocket defined by three tryptophan residues of hRI. In bANG, the replacing of Pro88, with Ser89 causes a steric and electrostatic strain in the inhibitor enzymatic complex, decreasing the susceptibility of bANG to the inactivation by RI. Further studies will clarify the binding of bANG to hRI by calculating the inhibition constant.

In dieser Studie wurde der Einfluss von anabol-androgenen Steroiden (AAS) wie Testosteron auf die Angiogenese im peripubertären Hengsthoden untersucht. Sieben von 14 Junghengsten erhielten Durateston® und wurden vier [n=3; Versuchsgruppe 1 (VG1)] bzw. zwölf [n=4; Versuchsgruppe 2 (VG2)] Wochen nach der letzten Applikation kastriert, während die übrigen sieben Tiere ohne eine Behandlung in dem gleichen Zeitraum kastriert wurden. Im Rahmen der morphometrischen Untersuchung konnte ein Anstieg der Volumendichte und der Numerischen Dichte bezüglich der Blutgefäße in der Versuchsgruppe festgestellt werden, während die Fläche der Blutgefäßanschnitte in den Kapillaren der Versuchsgruppe kleiner ist als bei den Tieren in der Kontrollgruppe. Die erhöhte Angiopietin2- und transforming growth factor alpha-Expression in der VG1 könnte möglicherweise für diese morphometrischen Be-funde verantwortlich sein. Die Blutgefäße der Versuchsgruppen zeigen, möglicherweise stimuliert durch Testoste-ron, eine höhere vascular endothelial growth factor-receptor2-Expression als die der Kontrollgruppe. Aufgrund der signifikanten Abnahme der morphometrischen Parameter von der VG1 zu der VG2 handelt es sich vermutlich um einen temporären Effekt.

Formation of blood vessels is required for development, growth and healing. Although quiescent, endothelial cells (ECs) store a potent proliferative and invasive potential that, upon the appropriate stimuli, is unleashed and gives rise to neovascularization phenomena. Disease progression of cancer and neovascular age-related macular degeneration (nAMD) strongly depends on angiogenesis. In cancer, tumor cells are able to stimulate ECs to become angiogenic and form new blood vessels that allow them to fulfill their tendency to grow and escape the site of the primary tumor. In nAMD, instead, inflammation and drusen deposition induce a strong damage to the retinal pigment epithelium (RPE), which in response to the damage triggers abnormal vessel formation that directly causes disease progression and consequent vision loss. In light of the role that angiogenesis plays in these diseases, targeting blood vessels with anti-angiogenic drugs has always been an appealing concept. However, due to the partial failure of anti-angiogenic therapies in the treatment of such diseases, it has become crucial to find alternative strategies that rely on targeting new molecules in a way to show great efficacy with minimal toxic effects. CD93 is a transmembrane glycoprotein that has been shown to have a prevalent role in controlling EC function, such as cell adhesion and migration. In this work, we investigated the molecular pathways behind the function of CD93 as regulator of EC adhesion and migration, showing that CD93 regulates actin dynamics via the small GTPases Rac1, Cdc42 and RhoA in a signaling axis triggered by its phosphorylation and interaction with Cbl phosphorylated on tyrosine 774. We also gained insights on the functional transport of CD93 during adhesion and migration, demonstrating that it is regulated by both its cytoplasmic domain and the Rab5C-

In der vorliegenden Arbeit wurden einige Aspekte der Angiogenese unter besonderer Berücksichtigung des Wachstumsfaktors Angiogenin untersucht. In der Sektion I der Arbeit wird ein standardisiertes Tiermodell in der Ratte vorgestellt, das die Wirkung angiogenetischer Faktoren zur Stimulierung der Angiogenese in ischämischen Geweben quantitativ erfaßt. Damit wurde ein in vivo Modell geschaffen, das die quantitative Beurteilung der therapeutischen Effekte von lokal applizierten Wachstumsfaktoren zur indirekten Revaskularisation ischämischer Gewebe erlaubt. Bereits 1,9 ng des Wachstumsfaktors Angiogenin, lokal appliziert, stimulierten 07 Tage nach Ischämieinduktion die Angiogenese signifikant. Gesamtgefäßanzahl und Kapillaren pro mm 2 waren nach Angiogeningabe signifikant höher. Langzeitbeobachtungen bis 70 Tage nach Ischämieinduktion zeigten, daß die Regulation der Angiogenese einer gedämpften sinusförmigen Schwingung entspricht, deren Amplitude und Frequenz durch Angiogeninapplikation im Vergleich zu den Kontrollen deutlich gesteigert wurde. Dieser Trend ließ sich abgeschwächt auch bei alleiniger lokaler Applikation von Collagen I ohne Gabe eines Wachstumsfaktors nachweisen. Bei dem Vergleich der Dosis-Wirkungsbeziehung von Angiogenin und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) erwies sich Angiogenin zur Stimulation der indirekten Revaskularisation 2,5-mal potenter. 10 ng Angiogenin stimulierten signifikant die Angiogenese 07 Tage nach Applikation. 250 ng bFGF und 100 ng Angiogenin stimulierten jeweils hoch signifikant die Gefäßneubildung. Der initiale angiogenetische Effekt von bFGF und Angiogenin beruht auf der Neubildung haupt-sächlich von Kapillaren. In der Sektion II wird eine Methode zur Beschichtung kleinkalibriger Gefäßprothesen mit Wachstumsfaktoren beschrieben und ein Tiermodell in White New Zealand Kaninchen zur Testung der Offenheitsrate der Gefäßprothesen in vivo vorgestellt. Die "patency rate" der im-plantierten 5 cm langen und im Durchmesser 2 mm messenden PTFE-Prothesen war auch mit angiogenetischer Beschichtung für klinische Zwecke nicht ausreichend. Offenheitsraten von 24 Stunden wurden mit der kombinierten angiogenetischen Beschichtung der Prothesen mit 1 µg bFGF und 285 µg Angiogenin erreicht. Alle anderen Beschichtungen zeigten eine wesentlich kürzere Offenheitsrate. Prothesen mit alleiniger Angiogeninbeschichtung (285 µg) blieben 8 Stunden offen. Prothesen mit alleiniger Beschichtung mit bFGF (1 µg) waren bereits nach 6 Stunden verschlossen. Die schlechteste Offenheitsrate mit nur 2 Stunden bzw. nur 1 Stunde wiesen die nur mit Heparin (100 E) bzw. nur mit Gelatine beschichteten Prothesen auf. Die Verwendung des Matrixfaktors Gelatine als Träger der Angiogenesefaktoren zur Beschichtung der Prothesen war aufgrund seiner hohen Thrombogenität hauptsächlich für die schlechte Offenheitsrate verantwortlich. In der Sektion III wird eine Methode zur Herstellung modifizierten Angiogenins vorgestellt. Durch Phosphorylierung der Aminosäure Serin im Angiogeninmolekül durch Proteinkinase C, ließ sich ein weniger kationisches Angiogenin in vitro herstellen, daß im alkalischen Milieu (bei pH 8) instabil war. Mit der Phosphorylierung durch Proteinkinase C ließen sich Phosphorylie-rungsraten für Angiogenin von bis zu 49 % erzielen. Höhere Phosphorylierungs-raten wurden mit der Proteinkinase C bei der Phosphorylierung von Histon V S mit über 50 % und von bFGF mit 84 % erzielt. Die spezifische Aktivität der Proteinkinase C betrug 2,7 µmol/min/mg bei Histon V S als Substrat. Die Michaelis-Konstanten wurden für Angiogenin mit km = 50 µM, für bFGF mit km = 3,3 µM und für Histon V S mit km = 10,0 µM be-stimmt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit lag dabei für die Phosphorylierung von Angiogenin bei vmax = 120 pmol/min/mg, von bFGF bei vmax = 100 pmol/min/mg und von Histon V S bei vmax = 66,7 nmol/min/mg. Die im Abschnitt 3 formulierten Fragen 1 12 lassen sich zusammenfassend wie folgt beantworten: 1. Ist die Wirkung angiogenetischer Faktoren in einem standardisierten Tiermodell quantifizierbar? Ja. Das an männlichen Lewis Inzuchtratten standardisierte Tiermodell erlaubt die quantitative Untersuchung der angiogenetischen Potenz von Wachstumsfaktoren zur indirekten Revaskularisierung ischämischer Gewebe in vivo. 2. Welche Langzeitwirkung hat Angiogenin in vivo bei der Revaskularisierung ischämischer Gewebe im standardisierten Tiermodell? Die initiale Stimulation der Angiogenese 07 14 Tage nach Applikation von Angiogenin besteht in der Neubildung von Kapillaren. Im weiteren Verlauf tritt die Zunahme der Prä-kapillaren in den Vordergrund. 3. Über welchen Zeitraum lassen sich im standardisierten Tiermodell in vivo angiogenetische Effekte von lokal appliziertem Angiogenin nachweisen? 1,9 ng Angiogenin stimulierten die Angiogenese 07 Tage nach Applikation signifikant (p £ 0,05). Bis 70 Tage nach der Gabe von Angiogenin war im Vergleich zu den Kontrollen eine Stimulation der Angiogenese erkennbar. 4. Gibt es für die angiogenetische Wirkung von Angiogenin und bFGF in vivo eine Dosis-Wirkungsbeziehung? Ja. Im vorliegenden Tiermodell betrug die optimale Dosis zur Stimulation der Angiogenese für bFGF 250 ng. Für Angiogenin lag die optimale Dosis zwischen 10 und 100 ng. 5. Sind Angiogenin und bFGF in ihrer angiogenetischen Potenz gleich? Wenn nicht, worin unterscheiden sie sich? Angiogenin erwies sich als 2,5-mal stärker gefäßneubildend als bFGF im vorliegenden Tiermodell. Beide Wachstumsfaktoren stimulierten in optimaler Dosis die Angiogenese 07 Tage nach Ischämieinduktion hoch signifikant (P < 0,002). Der initiale Effekt beider Wachstumsfaktoren bestand in einer Stimulierung der Neubildung von Kapillaren. 6. Lassen sich die angiogenetische Wirkung von bFGF und Angiogenin zur indirekten Vaskularisierung nutzen? Die Anwendung von rekombinantem humanem Angiogenin und bFGF wies für beide Wachstumsfaktoren eine ausgeprägte Stimulation der indirekten Revaskularisation im verwendeten Tiermodell nach. Eine gleichartige, jedoch möglicherweise nicht gleich starke Reaktion ist bei der Anwendung dieser humanen Wachstumsfaktoren am Menschen zu er-warten. Ein Ausnutzen der angiogenetischen Potenz dieser Faktoren zur gezielten therapeutischen Stimulation der indirekten Revaskularisation beim Menschen, z. B. bei Durchblutungsstörungen des Herzens oder anderer Körperregionen erscheint sinnvoll und vielversprechend. 7. Sind angiogenetische Faktoren, insbesondere Angiogenin und bFGF allein oder in Kombination zur Verbesserung der Biokompatibilität schmallumiger synthetischer, nicht biologischer Gefäßprothesen geeignet? Bei insgesamt für klinische Zwecke noch unbefriedigender Offenheitsrate der angiogenetisch beschichteten PTFE-Prothesen mit einem Durchmesser von 2 mm war eindeutig zu erkennen, daß die Kombination von Angiogenin und bFGF der alleinigen Beschichtung mit nur einem Wachstumsfaktor oder nur mit Heparin überlegen ist. 8. Ist mit angiogenetisch beschichteten Gefäßprothesen eine Endothelialisierung der Prothese in vivo und in situ möglich? Die erzielten Resultate mit angiogenetisch beschichteten Gefäßprothesen ließen keine in vivo/in situ Endothelialisierung an den implantierten Prothesen aufgrund der schlechten Offenheitsrate von maximal 24 Stunden nachweisen. Weitere Untersuchungen mit weniger thrombogenen Matrixfaktoren in der Kombination auch mit anderen Wachstumsfaktoren werden sicher neue Erkenntnisse bringen. 9. Ist die Modifizierung des Angiogeninmoleküls durch Phosphorylierung mit Proteinkinase C in vitro möglich? Ja. Proteinkinase C war in einem optimierten Phosphorylierungsansatz unter Verwendung ihrer Stimulatoren Ca 2+ , Phosphatidylserin und Diolein in der Lage Angiogenin mit einer Effektivität von bis zu 50 % in vitro zu phosphorylieren. 10. Mit welchen Methoden läßt sich phosphoryliertes Angiogenin nachweisen? Mit der SDS-PAGE ist bei Verwendung von (g-32 P)ATP als Phosphatdonator der Phos-phorylierungsreaktion phosphoryliertes Angiogenin als 32 P-Angiogenin qualitativ und quantitativ nachweisbar. 11. Welche Methoden sind geeignet phosphoryliertes Angiogenin zu isolieren und zu reinigen? Zur Separation von niedermolekularen Verunreinigungen und von überschüssigem Phosphor sind für präparative Zwecke die SEPHADEX G25 Molekularsiebsäulenzentrifugation und die CENTRICON 10 Membranfilterzentrifugation geeignet. Mit der sauren Proteinfällung ließ sich am einfachsten die quantitative Bestimmung phosphorylierten Angiogenins durchführen. 12. Stellt die Phosphorylierung von Angiogenin durch PKC möglicherweise eine physiologische Reaktion in der Wirkungskette von Angiogenin dar? Zur Beantwortung dieser Frage sind weitere Versuche in vivo und in vitro erforderlich. Bisherige Hinweise auf die zentrale Funktion der Proteinkinase C in vielen intra/extra-zellulären Informationsübertragungsprozessen ("second messenger" Reaktionen und "signalling" Prozesse) führen aufgrund der guten Phosphorylierbarkeit von Angiogenin durch PKC zu der Vermutung, daß die Phosphorylierung von Angiogenin durch PKC auch in vivo eine Rolle spielt. Möglicherweise stellt die Phosphorylierung von Angiogenin im molekularen Wirkungsmechanismus von Angiogenin auf der zellulären Ebene z. B. bei der extra/intrazellulären Informationsübertragung, oder bei der Modifizierung der biologischen Aktivität, evtl. auch bei der Inaktivierung von Angiogenin eine zentrale Schlüsselreaktion dar. Die präsentierten Ergebnisse zeigen, daß Angiogenin ein potenter Stimulator der indirekten Revaskularisierung in vivo ist und die Wirkung im standardisierten Tiermodell an der Ratte quantitativ untersucht werden kann. Die Offenheitsrate kleinkalibriger (Æ 2 mm) PTFE-Gefäßprothesen läßt sich im entwickelten Tiermodell an White New Zealand Kaninchen in vivo testen. Die angiogenetische Beschichtung der Prothesen mit dem Matrixfaktor Gelatine als Trägersubstanz der Angiogenesefaktoren und mit Heparin, Angiogenin und bFGF als Mitogenen zeigte keine für klinische Fragestellungen akzeptable Offenheitsrate. Mit der Phosphorylierung von Angiogenin durch Proteinkinase C in vitro unter Verwendung ihrer Stimulatoren Ca 2+ , Phospholipid und Diolein konnten Phosphorylierungsraten von bis zu 50 % erzielt werden. Mit phosphoryliertem Angiogenin steht nun ein weiterer molekular veränderter Wachstumsfaktor für Untersuchungen seiner biologischen Eigenschaften und der angiogenetischen Potenz in vivo und in vitro zur Verfügung.<br>The growth of new vessels is called angiogenesis. Special growth factors e.g. basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) are potent stimulators of angiogenesis in vivo and in vitro. Angiogenin another angiogenic protein was isolated first by Fett et al. 1985 from human carcinoma cells. Part I: The effect of angiogenin to stimulate angiogenesis in ischemic hind legs of inbred male Lewis rats is described. In this new animal model ischemia was induced by the ligature of the femoral artery. To stimulate angiogenesis angiogenic proteins (bFGF, angiogenin) were locally applied and compared to untreated ischemic animals. Already 1.9 ng locally applied angiogenin significantly stimulated the growth of collaterals in ischemic rat hind legs which could be demonstrated already 7 days after the application of angiogenin. The best stimulation of angiogenesis was achieved by the local application of 100 ng angiogenin which was 2.5-fold more angiogenic than 250 ng bFGF in the ischemic rat legs. The angiogenic effect of angiogenin as well as of bFGF was dependent on the applied dose reaching an optimum concerning angiogenin between 10 and 100 ng and for bFGF at 250 ng. Part II: The patency of PTFE vascular grafts with different angiogenic luminal coatings was tested in an animal model. In White New Zealand rabbits the abdominal aorta was replaced by a 5 cm long PTFE vascular graft 2 mm in diameter. Angiogenin and bFGF luminal coated PTFE grafts were 24 hours patent. Angiogenin coated grafts were after 8 hours occluded by a small distal thrombus. bFGF coated grafts were occluded after 6 hours. Heparine coated grafts were totally occluded by a thrombus after only 2 hours and gelatine coated grafts were already occluded after 1 hour. Part III: Protein Kinase C (PKC) isolated from rat brain was able to phosphorylat angiogenin with an effiency reaching 49% using Ca2+, Phospholipids and Dioleins as stimulators of the reaction. Histone V S was phosphorylated to 50% and bFGF to 84% by the same PKC. The determined Michaelis-Menten- Factor was concerning angiogenin km = 50 µM, bFGF km = 3.3 µM and Histone V S km = 10 µM. The separation of phosphorylated angiogenin was possible with the method of Sephadex G25 molecular sieve centrifugation as well as with the Centricon 10 membran centrifugation. The presented results demonstrate that angiogenin is a potent angiogenic protein stimulating the formation of new collaterals which was quantitatively evaluated in a new standardized rat animal model. The stimulation of indirect revascularization by angiogenin may be of therapeutical value in the treatment of ischemic cardio-vascular diseases. The patency of PTFE vascular prostheses 2 mm in diameter can successfully be tested in an animal model in White New Zealand rabbits by replacing the abdominal aorta by a 5 cm long PTFE vascular graft. Testing variant angiogenic luminal coatings of these PTFE grafts showed that a combination of bFGF/angiogenin had the best patency. Phosphorylation of angiogenin with PKC in vitro was possible reaching an effiency of 49% by using the stimulators Ca2+, Phospholipids and Dioleins for the reaction. Phosphorylated angiogenin may be a valuable modified angiogenic protein to study its biological and angiogenic activity in vivo and in vitro and could be helpful in the evaluation of its cellular pathways and receptors. © Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

Hintergrund: Connexine (Cx) spielen eine wichtige Rolle bei Wachstum und Differenzierung. Die Angiogenese ist an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Jedoch ist noch unklar, ob Connexine einen Einfluss auf die Angiogenese haben. Fragestellung; In dieser Arbeit sollte die Rolle endothelialer Connexine an der Angiogenese untersucht werden. Methoden: Venöse Zellen der menschlichen Nabelschnur (HUVEC) wurden kultiviert bis sie subkonfluent waren. Vor der 3D Kultur im Matrigel wurden die Zellen entweder mit Nicotin, dem Gap Junction Inhibitor Palmitoleinsäure (PA), einem siRNA-Knockdown von entweder Cx37, Cx40 oder Cx43 oder mit Isoprenalin behandelt. Die Zellen wurden dann auf ein in vitro Angiogenese-Assay (3D-Kultur, Matrigel) gegeben und nach 18h wurden unterschiedliche Angiogeneseparameter erhoben, um die Komplexität der Angiogenese zu beurteilen. Änderungen der Expression der Cx mRNA- und Proteinexpression sowie der Kommunikation über Gap Junctions wurden mittels PCR, Immunfluoreszenzmikroskopie, Western Blot und Lucifer Yellow Dye Transfer untersucht. Bei Gewebeproben der A. mammaria von Rauchern und Nichtrauchern wurden mittels Immunofluoreszenzmikroskopie die Expression der Cx beurteilt. Ergebnisse: Die Behandlung mit spezifischer siRNA führte zu einer signifikanten Abnahme der Expression des jeweiligen Connexins in den HUVECs. Sowohl der Knockdown als auch die Behandlung mit PA verringerte die Kommunikation über Gap Junctions signifikant und reduzierte die Anzahl der Abzweigungen im Angiogenese-Assay. Der Knockdown des Cx43 und Cx40 sowie die Behandlung mit PA reduzierten ebenfalls die Komplexität des Musters im Matrigel-Assay. Nicotin führte zu einer Reduktion der Cx43- und Cx37-Proteinexpression, wohingegen Cx40 durch transskriptionelle Gegenregulation konstant gehalten wurde, sowie zu einer Abnahme der Länge der Kapillar-ähnlichen-Strukturen, der Anzahl der Abzweigungen und des Musters im Matrigelassay, während die Anzahl der Zellen zunahm. Die mRNA-Expression der Connexine war hingegen erhöht. In Gewebeproben von Rauchern konnte analog eine verminderte Expression von Cx43 und Cx37, aber nicht von Cx40, in der Intima gezeigt werden. Isoprenalin erhöhte die Proteinexpression der endothelialen Connexine und verbesserte sowohl die interzelluläre Kommunikation als auch das Muster im Matrigel-Assay. Ebenso waren die Kapillar-ähnlichen Strukturen im Vergleich zur Kontrolle länger. Schlussfolgerung: Aus den erhobenen Ergebnissen lässt sich der Schluss ziehen, dass Connexine bei der Angiogenese involviert sind, vor allem beim Vorgang der Verzweigung. Dies kann teilweise die Veränderung erklären, die eine Nicotinbehandlung auf die Angiogenese hat.

Die Präeklampsie als schwangerschaftsspezifische Erkrankung zählt unverändert weltweit zu den Hauptursachen fetaler und maternaler Morbidität und Mortalität. Ungeachtet vieler Forschungsbestrebungen fehlt bisher vor allem eine effiziente Früherkennung sowie daraus ableitbare kausale Therapieoptionen. Obgleich Ätiologie und Pathogenese nach wie vor als ungeklärt gelten, existieren zunehmend überzeugende Hinweise, welche einer Dysbalance von angiogenen Faktoren, wie VEGF und PlGF, und antiangiogenen Faktoren, wie sFlt1 und sEng, eine zentrale Rolle in der Entstehung der Erkrankung zuschreiben. Mehrere Studiengruppen konnten in diesem Zusammenhang veränderte Plasmakonzentrationen antiangiogener Proteine noch vor der eigentlichen Manifestation der Erkrankung nachweisen. Ziel dieser Studie war es zu klären, ob eine pathologisch uterine Perfusion im 2. Trimenon mit erhöhten sFlt1-Werten assoziiert ist und in einem prospektiven Ansatz die prädiktive Wertigkeit der antiangiogenen Faktoren sFlt1 und sEng, in einem durch Dopplersonografie vorselektierten Risikokollektiv zu bestimmen. Dazu wurden im retrospektiven Teil von 39 und im prospektiven Teil von 77 Einlingsschwangerschaften im 2. Trimester in venös entnommenen Blutproben mit Hilfe des ELISA - Tests die maternalen sFlt1- und sEng- Konzentrationen gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass in einem durch Dopplersonografie vorselektierten Patientenkollektiv die maternale sFlt1-Konzentration bei Patientinnen mit späteren Schwangerschaftskomplikationen signifikant erhöht ist. Zusätzlich konnte belegt werden, dass die sEng - Konzentration in einem dopplersonografisch vorselektierten Risikokollektiv ebenfalls als unabhängiger prädiktiver Marker zur Vorhersage einer späteren Präeklampsie genutzt werden kann. Vielmehr ist es sogar möglich, Hochrisikopatientinnen mit Manifestation der Erkrankung vor der 34. SSW durch ausgesprochen hohe Sensitivität und Spezifität zu identifizieren.

In this thesis we have investigated different approaches to block intraplaque angiogenesis in atherosclerosis. Intraplaque angiogenesis is a physiological response to the increased oxygen demand in the plaque but also has adverse effects by facilitating intraplaque hemorrhage and influx of inflammatory mediators, resulting in plaque instability and consequent rupture. To study this phenomenon we used in vitro assays as well as the accelerated atherosclerosis vein graft model in ApoE3*Leiden mice, a unique model in which the formed plaque shows characteristics that highly resemble human atherosclerotic lesions, including intraplaque angiogenesis and hemorrhage and a high inflammatory cell content. We focused on different approaches to restore plaque stability via improving intraplaque oxygen levels as well as via blocking different growth factors signaling. Moreover we studied the effects of our treatments on the interaction between angiogenesis and inflammation both in vitro and in vivo.

Die Studien der vorliegenden Habilitationsschrift hatten die Untersuchung der Abhängigkeit diffuser und tumorförmiger Hypervaskularisationen der Plazenta von angiogenen Wachstumsfaktoren zum Ziel. Kernaussagen sind, daß in Chorangiomen eine höhere Expression der Angiopoietine - 1 und - 2 vorliegt, bei morphologisch gleicher Rezeptorausstattung. Keine Differenzen zeigte die Expression von PDGF sowie seinem Rezeptor PDGF-ß. Bei Differenzierung solitärer und multipler Chorangiome (Chorangiomatosen) hinsichtlich klinischer Parameter sowie der Expression der angiogenen Wachstumsfaktoren Angiopoietin-1 und bFGF sowie hinsichtlich der Proliferationsrate konnten Unterschiede zwischen den plazentaren Läsionen deutlich werden. Die Expression der Wachstumsfaktoren war jeweils in Chorangiomatosen kräftiger als in solitären Veränderungen. Das Auftreten von Chorangiomatosen steht offensichtlich in Zusammenhang mit einer verstärkten Expression dieser Wachstumsfaktoren, die damit noch die ohnehin in Chorangiomen - gegenüber ortholog gereiftem Plazentaparenchym - gesteigerte Expression übertrifft. So deutet diese Studie nunmehr verstärkt auf eine Korrelation zwischen der Höhe der Wachstumsfaktorexpression und dem quantitativen Auftreten lokalisierter Angiopathien hin. Zudem ließen sich klinische Korrelationen aufzeigen. So lag das mütterliche Alter beim Auftreten lokalisierter hypervakularisierter Veränderungen deutlich über der bei unauffälligen Plazenten, ein Ergebnis, das vorherige Untersuchungen bestätigte. Geringe Differenzen das maternale Alter betreffend bestanden zwischen Chorangiomen und Chorangiomatosen. Hinsichtlich der Schwangerschaftskomplikationen fanden sich keine Unterschiede zwischen Chorangiomen und Chorangiomatosen. Begleitende Reifungsstörungen fanden sich auch in diesem Studienkollektiv, dahingehend, daß Chorangiome und häufiger noch Chorangiomatosen kombiniert mit diesen Auftreten. Untersuchungen zur Apoptose- und Proliferationsrate in Chorangiomen mit differierendem histologischen Subtyp erbrachten keinen Hinweis auf den Einfluß der Apoptose auf das Wachstum dieser tumorartigen Läsionen. In Chorangiomen zeigte sich im Vergleich zu regelhaft entwickeltem reifem Plazentagewebe eine leicht gesteigerte Proliferationsrate. Auffällig war einzig, daß Chorangiome endotheliomatösen Subtyps die höchste Proliferationsrate aufwiesen. Studien intrauteriner Todesfällen der frühen und mittleren Fetalperiode konnten zeigen, das diffuse Hypervaskularisationen offensichtlich reaktiver Natur sind. Untersuchungen zur Expression angiogener Wachstumsfaktoren zeigten, daß diese exprimiert werden und damit bereits an der Gefäßentwicklung der Plazenta in der Fetalperiode beteiligt sind. Unterschiede hinsichtlich der Expression der Wachstumsfaktoren in Plazenten mit Hypervaskularisationen und Kontrollproben fanden sich jedoch morphologisch nicht. Die gesteigerte Gefäßbildung in der frühen Fetalperiode ist offenbar eine reaktive Anpassung der Zotten auf die Hypoxie. Falldarstellungen zweier weiterer Plazentatumoren, eines inzidentellen Chorangiokarzinoms sowie eines Angiomyxoms der Nabelschnur erbrachten hinsichtlich der Gefäßkomponente in diesen Tumoren keine Abhängigkeit von den untersuchten Wachstumsfaktoren. Eine Studie von 136 Chorangiomen aus 22439 Plazenten ließen aussagefähigen Analysen der Häufigkeit, morphologischer Charakteristika und Korrelationen zwischen Chorangiomen und klinischen Befunden zu. So zeigten sich signifikante Abhängigkeiten zwischen dem Auftreten eines Chorangioms und dem mütterlichen Alter, der gestationsbedingten Hochdrucksymptomatik, der Parität, dem kindlichen Geschlecht und begleitender Reifungsstörungen der Plazenta. Insbesondere die Reifungsstörungen in Kombination zum Auftreten eines Chorangioms waren zuvor nie Gegenstand einer größeren wissenschaftlichen Studie. Einzelne Parameter fanden zwar sporadisch in einzelnen Publikationen mit wenigen Chorangiomen wissenschaftlich Beachtung, doch die dort publizierten Ergebnisse widersprachen sich vielfach. So ist die jetzt vorliegende Untersuchung in ihrer Größe und damit Aussagekraft sehr relevant.<br>The studies had the investigation of the dependence of vague and tumoric hypervascularisation of the placenta on angiogenic growth factors as a goal. Core statements are that in chorangiomas a higher expression of Angiopoietin-1 and - 2 is present, during morphologically same receptor equipment. The expression of PDGF as well as ist receptor did not show differences PDGF - beta. With differentiation of solitär and multiple chorangiomas (chorangiomatoses) regarding clinical parameters as well as the expression of the angiogenic growth factors Angiopoietin-1 and bFGF as well as regarding the proliferation rate could become clear differences between the placental lesions. The expression of the growth factors was in each case in chorangiomatoses stronger than in single changes. The occurrence of chorangiomatoses stands obviously in connection with a strengthened expression of these growth factors, which exceeds thereby still anyway the expression increased in chorangiomas - opposite ortholog matured placental tissue. Thus this study points now strengthened on a correlation between the height of the expression on growth factors and the quantitative occurrence of located angiopathia. Besides clinical correlations could be pointed out. Thus the maternal age was clearly with the occurrence of located such changes over with inconspicuous placentas, a result, which confirmed previous investigations. Small differences concerning the maternal age existed between chorangiomas and chorangiomatoses. Regarding the pregnancy complications were no differences between chorangiomas and chorangiomatoses. Accompanying maturing disturbances were in such a way also in this study collective, that chorangiomas combines and more frequently still chorangiomatoses with this occurrence. Investigations to the apoptoses and proliferation rate in chorangiomas with differing histological subtyp did not furnish a reference to the influence of the apoptoses on the growth of these tumor-like lesions. To chorangiomas an easily increased proliferation rate pointed itself compared with regularly developed ripe placental tissue. Remarkably it was only that chorangiomas with endotheliomatos subtyp the highest proliferation rate exhibited. Studies of intrauterin deaths of the early and middle fetal periode could show, which are vague hypervascularisation of obviously reactive nature. Investigations to the expression of angiogenic growth factors showed the fact that these are exprime and so that in the container development of the placenta in the fetal periode is involved already. Differences regarding the expression of the growth factors in plazentas with hypervascularisationen and inspection samples were not however morphologically. The increased container formation in the early fetal periode is obviously a reactive adjustment of the villous trees on the hypoxia. Drop representations of two further placenta tumors, a incidentially chorangiocarcinoma as well as a angiomyxoma of the umbilical cord did not furnish dependence on the examined growth factors regarding the container component in these tumors. Expressive analyses of the frequency, morphologic characteristics and correlations between chorangiomas and clinical findings permitted a study of 136 chorangiomas from 22439 plazentas. Thus significant dependence between the occurrence of a chorangioma and the maternal age, the gestational high pressure symptomatology, the parity, the childlike sex showed up and accompanying maturing disturbances of the placenta.

Syphilis is a chronic inflammatory disease transmitted by the spirochete Treponema pallidum. The bacterium is usually acquired by direct contact, generally sexual; the disease is worldwide spread and it represents an important global health problem. Syphilis is indeed a major sexually transmitted disease, particularly in developing countries, but an increasing number of new cases have also been recently noted in USA and Europe. Syphilis is a progressive and multistage disease with diverse and wide-ranging manifestations. Syphilis is an evolving disease and can be divided in three main stages. In the first stage, a red papule appears at the site of inoculation, usually genitals. Within the first few days, the papule ulcerates, producing the typical chancre of primary syphilis, which is painless and filled with treponemes. The chancre is accompanied by regional lymphadenopathy. If untreated, bacteria can also proliferate in the chancre and can be transported via lymphatics to the bloodstream, from which they disseminate throughout the body, giving rise to secondary syphilis: this represents the second stage and is a systemic disease. The most common manifestation of secondary syphilis is a disseminated mucocutaneous rash, which usually resolves spontaneously. In untreated patients, the symptoms are absent for a variable period of time, which is called latent stage. Afterwards, one-third of untreated patients can develop symptomatic late syphilis: the third stage of the disease, which is subdivided into gummatous syphilis, neurosyphilis and cardiovascular syphilis. This disease could be cured with an antibiotic treatment, but, if not adequately treated, syphilis can lead patients to death. Nowadays there are no available vaccines to prevent syphilis in particular due to the difficulties in cultivating T. pallidum in vitro make more difficult to study this pathogen as well as the identification of its virulence factors. Little is known about the mechanism by which the bacterium causes the clinical manifestations that accompany the different stages of the disease, however it is established that T. pallidum is able to invade and survive in a wide variety of tissues and organs and that it promotes the formation of new blood vessels. Angiogenesis could have a crucial role in syphilis pathogenesis, at least for two reasons: i) the bacterium has limited metabolic capabilitie, thus probably it requires support from the host and it may derive most essential macromolecules from the blood. ii) Increased vascular permeability is one of the first stages in angiogenesis and the organism could take advantage of the vascular leakage to access to and egress from the bloodstream, resulting in systemic spread. Another distinctive feature of syphilis consists in the fact that it becomes chronic in untreated patients and this probably reflects the ability of the bacterium in eliciting a T regulatory response, which could be associated with the fading of the host effector immune responses against the pathogen. We have recently demonstrated that the bacterioferritin TpF1, a major antigen of T. pallidum, plays a pivotal role in driving this suppressive immune response, by modulating the release of specific cytokines by monocytes. TpF1 is a protein homolog to another immunomodulant antigen produced by the bacterium Helicobacter pylori and called HP-NAP. Both these proteins belong to the Dps-like family, a versatile group of bacterial stress miniferritins with a nearly spherical dodecameric structure. HP-NAP, besides interacting with neutrophils, monocytes and dendritic cells and modulating their activity (as TpF1 does), also binds to endothelial cells, in which it is internalized by transcytosis. Considering the homology between HP-NAP and TpF1 and the fact that angiogenesis is a characteristic of the secondary syphilis, we wondered whether TpF1 could interact with endothelial cells and promote their proliferation. We have demonstrated that TpF1 induces proliferation and migration of human endothelial cells (HUVECs); moreover, the protein activates endothelial cells to form microcapillary-like structures in vitro inducing marked changes in the cell pattern with the formation of tubules assembled by elongation and joining of the cells; a similar pattern was observed with VEGF. With the aim of understanding the mechanism underlying the activity of TpF1, we have addressed the possibility of an indirect effect mediated by VEGF or IL-8, both proangiogenic factors. We have excluded any contribution by VEGF: indeed, the latter is not released by the endothelial cells upon TpF1 stimulation. On the contrary, we have found that TpF1 triggers the release of IL-8 and, notably, the blockage of the cytokine strongly prevents the angiogenic activity of the bacterial protein inhibiting endothelial cell proliferation, migration and micro capillary-like structures formation. We also verified that the secretion of IL-8 relies on the induction of intracellular cAMP, produced by cellular adenylate cyclases, which is able to induce gene transcription through the activation of the two transcription factors NF-κB and CREB (cAMP response element-binding protein). Finally we have observed that TpF1 induces new blood vessels formation in vivo in a zebrafish model. Moreover TpF1 promotes, in zebrafish, IL-8 gene expression suggesting a role for this cytokine in the TpF1-induced angiogenesis process also in vivo.<br>La sifilide è una malattia infiammatoria cronica trasmessa dalla spirocheta Treponema pallidum. Il batterio è spesso trasmesso attraverso contatto diretto, generalmente sessuale; la malattia è diffusa a livello mondiale e rappresenta ancora oggi un importante problema sanitario globale. La sifilide è, infatti, la principale malattia a trasmissione sessuale, specialmente nei paesi in via di sviluppo, un crescente numero di nuovi casi è comunque stato riscontrato anche in USA e in Europa. La sifilide è una malattia progressiva e multistadio con manifestazioni cliniche diverse e ad ampio raggio. La sifilide è una malattia in continua evoluzione ed è caratterizzata da tre stadi principali. Nel primo stadio, una papula rossastra appare nel sito d’ infezione, generalmente i genitali. Entro i primi giorni, la papula tende ad ulcerare, dando origine alla chancre tipica della sifilide primaria, una lesione indolore contenente un alto numero di treponemi. La chancre è inoltre accompagnata da linfoadenopatia regionale. Se la malattia non è trattata, i batteri possono proliferare all’interno della chancre e, attraverso la via linfatica, raggiungere il flusso sanguigno dal quale disseminano in tutto l’organismo dando così origine alla sifilide secondaria: questa rappresenta il secondo stadio della malattia ed ha carattere sistemico. Nei pazienti non trattati, i sintomi possono rimanere assenti per un periodo variabile di tempo denominato sifilide latente. Successivamente, un terzo dei pazienti non sottoposti a trattamento può sviluppare i sintomi dell’ultimo stadio della sifilide; la sifilide terziaria. La sifilide terziaria può essere a sua volta suddivisa in gomma sifilitica, neurosifilide e sifilide cardiovascolare. Questa malattia può essere curata attraverso una semplice terapia antibiotica ma, se non adeguatamente trattata, può portare alla morte del paziente. Ad oggi non sono ancora disponibili vaccini volti a prevenire la sifilide, in particolare la difficoltà di coltivare T. palliudm in vitro rende complicato lo studio di questo patogeno e, quindi, l’identificazione dei suoi fattori di virulenza. Il meccanismo attraverso cui il batterio provoca le tipiche manifestazioni cliniche che accompagnano i differenti stadi della malattia risulta, ancora, perlopiù sconosciuto, ad ogni modo è stato dimostrato che T. pallidum è in grado di invadere e sopravvivere in un’ampia varietà di tessuti e organi e che promuove la formazione di nuovi vasi sanguigni. L’angiogenesi potrebbe avere un ruolo cruciale nella patogenesi della sifilide almeno per due ragioni: i) il batterio ha limitate capacità metaboliche, dunque è probabile che esso richieda supporto dall’ospite e che derivi la maggior parte delle macromolecole essenziali dal sangue. ii) l’aumento della permeabilità vascolare è una delle prime fasi dell’angiogenesi e l’organismo potrebbe trarne vantaggio per accedere e uscire dal circolo sanguigno, portando ad una diffusione sistemica della malattia. Un’ulteriore caratteristica distintiva della sifilide risiede nella capacità di diventare cronica nei pazienti non trattati, una condizione che probabilmente riflette l’abilità del batterio nell’indurre una risposta T regolatoria la quale, a sua volta, può indurre l’indebolimento degli effettori della risposta immunitaria dell’ospite contro il patogeno. A tal proposito abbiamo recentemente dimostrato che la batterioferritina TpF1, uno dei principali antigeni di T. pallidum, gioca un ruolo fondamentale nel dirigere questa risposta immunitaria soppressiva, modulando il rilascio di specifiche citochine da parte dei monociti. TpF1 è una proteina omologa ad un altro antigene immunomodulante prodotto dal batterio Helicobacter pylori e chiamata HP-NAP. Entrambe queste proteine appartengono alla famiglia Dps-like, un gruppo variegato di mininferritine batteriche caratterizzate da una struttura dodecamerica approssimativamente sferica. HP-NAP, oltre ad interagire con neutrofili, monociti, cellule dendritiche e a modulare la loro attività (analogamente a TpF1), sono in grado di legare le cellule endoteliali nelle quali sono poi internalizzate per transcitosi. Considerando dunque l’omologia esistente tra HP-NAP e TpF1, e considerando che l’angiogenesi è una caratteristica peculiare della sifilide secondaria, ci siamo chiesti se TpF1 potesse interagire con le cellule endoteliali e promuovere la loro proliferazione. Abbiamo dimostrato in primo luogo come TpF1 induca la proliferazione e la migrazione di cellule endoteliali umane (HUVEC); inoltre, la proteina è in grado di attivare le cellule endoteliali promuovendo la formazione di strutture simil-capillari in vitro attraverso l’induzione di marcate modifiche nella distribuzione cellulare e nella formazione di tubuli assemblati mediante l’elongazione e la giunzione delle cellule; un simile comportamento è stato osservato anche in presenze del VEGF. Al fine di comprendere il meccanismo alla base dell’attività di TpF1, abbiamo considerato la possibilità di un effetto indiretto mediato dal VEGF o da IL-8, entrambi fattori pro-angiogenici. Abbiamo escluso qualsiasi contributo del VEGF; quest’ultimo non viene rilasciato dalle cellule endoteliali in seguito al trattamento con TpF1. Al contrario, abbiamo osservato che la stimolazione con TpF1 promuove il rilascio di IL-8, in particolare, l’inibizione di tale citochina previene fortemente l’azione angiogenica indotta dalla proteina batterica inibendo la proliferazione cellulare, la migrazione e la formazione di strutture tubulari. Abbiamo inoltre osservato che la secrezione di IL-8 risiede nella produzione di cAMP, prodotto dall’adenilato ciclasi, il quale è in grado di indurre l’espressione genica attraverso l’attivazione dei due fattori di trascrizione NF-κB e CREB (cAMP response element-binding protein). Infine abbiamo verificato che TpF1 induce la formazione di nuovi vasi sanguigni in vivo, in un modello di zebrafish. Inoltre, TpF1 promuove anche in zebrafish l’espressione genica di IL-8 suggerendo dunque, anche in vivo, un ruolo per questa chemochina nel processo angiogenico indotto da TpF1.

Il tumore alla mammella triplo-negativo (TNBC) rappresenta il sottotipo di tumore alla mammella più aggressivo ed è spesso associato ad una breve sopravvivenza libera da malattia. La dose massima tollerata, utilizzata come terapia standard (STD), rimane la prima opzione terapeutica per pazienti con TNBC, anche se non è sufficiente nel bloccare le recidive, le quali rimangono la prima causa di morte per questo tipo di tumore. Recentemente, è stato testato un diverso approccio terapeutico, chiamato chemioterapia metronomica (mCHT), che prevede la continua somministrazione della minima dose biologicamente attiva senza pause libere da farmaco. Ad oggi, i risultati mostrano una forte stabilizzazione della crescita del cancro ed un miglioramento della qualità della vita delle pazienti. La chemioterapia metronomica ha un effetto sia antitumorale che anti-angiogenico. In questa tesi abbiamo indagato, per la prima volta, l’effetto della somministrazione metronomica di 5-Fluorouracile (5-FU) e Vinorelbina (VNR) su linee cellulari di TNBC ed endoteliali, in confronto alla somministrazione STD. In particolare, abbiamo dimostrato che la somministrazione metronomica di 5-FU e VNR, sia in singolo che in combinazione, colpisce le cellule endoteliali e di TNBC a dosi significativamente inferiori della terapia STD. Nonostante le bassi dosi utilizzate, la somministrazione metronomica di 5-FU+VNR è più efficiente della STD nell’inibire la migrazione cellulare e la formazione di colonie sia delle cellule endoteliali che delle cellule TNBC. Per simulare l’interazione tra cellule endoteliali e TNBC, abbiamo utilizzato una co-coltura indiretta. I risultati della co-coltura indiretta mostrano che il terreno condizionato dalle cellule TNBC trattate con 5-FU+VNR secondo protocollo metronomico bloccano completamente la migrazione e la formazione di colonie delle cellule endoteliali. Inoltre, abbiamo evidenziato la dipendenza del meccanismo di morte cellulare delle cellule endoteliali e TNBC dalla modalità di somministrazione dei farmaci. In particolare, la combinazione metronomica promuove l’apoptosi nelle cellule endoteliali, mentre nelle cellule TNBC cambia la modalità di morte cellulare dall’apoptosi, indotta dalla terapia STD, all’autofagia, attivando anche la senescenza cellulare. In conclusione, la somministrazione metronomica di 5-FU+VNR è più efficiente della STD nel controllare la proliferazione, la migrazione e la capacità di ricrescita dopo trattamento delle cellule endoteliali e TNBC, suggerendo un miglior controllo sulla crescita tumorale e sulla formazione di recidive. Questi dati evidenziano inoltre i meccanismi molecolari alla base della migliore efficacia della terapia metronomica rispetto alla standard.<br>Triple-negative breast cancer (TNBC) represents the most malignant subtype of breast cancer, often associated with short disease-free survival. The maximum tolerated dose, used as standard-of-care chemotherapy (STD), remains the primary therapeutic option for TNBC patients, even though it fails to block distant recurrences, which is the first cause of death. Recently, it has been tested a different therapeutic approach, called metronomic chemotherapy (mCHT), where the minimum biological effective dose of the chemotherapeutic agent is given as a continuous administration without drug-free breaks. So far, the results show a strong stabilization of cancer growth and improved cancer patients’ quality of life. mCHT has direct cytotoxic effects on tumors and inhibits endothelial cell proliferation. In this thesis we investigated, for the first time, the effect of the mCHT administration of 5-Fluorouracil (5-FU) plus Vinorelbine (VNR) in endothelial and TNBC cell lines in comparison to the STD treatment. In particular, it has been shown that the mCHT administration of 5-FU and VNR both in single and in combination affects endothelial and TNBC cells at doses significantly lower than the STD one. Despite the low doses used, mCHT 5-FU+VNR is more effective than the STD in inhibiting cell migration and colony formation of both endothelial and TNBC cells. To simulate TNBC and endothelial cells' crosstalk, we utilized an indirect co-culture, which showed that medium conditioned by TNBC cells treated with mCHT 5-FU+VNR completely blocks endothelial cells migration and colony formation. We also pointed out that the modality of cell death of endothelial and TNBC cells depends on the schedule of treatment. In particular, the mCHT combination promotes endothelial’ apoptosis, whereas TNBC switches the modality of cell death from apoptosis, induced by STD, to autophagy, also activating senescence. In conclusion, mCHT 5-FU+VNR is more efficient than the STD in controlling cell proliferation, migration, and regrowth capacity after treatment of HUVECs and TNBC cells, suggesting better control of tumor growth and relapses. These data also highlight the molecular mechanisms that underlie the best efficacy of metronomic therapy towards the standard one.

Dans le foie adulte normal les lames basales ne sont pas detectables dans les sinusoides au contact des hepatocytes, contrairement a la plupart des cellules epitheliales. La survenue de maladies qui entrainent un remodelage de la matrice extracellulaire telles que la fibrose et le cancer est accompagnee d'un depot accru des composants matriciels dans les sinusoides et de la proliferation des micro-vaisseaux capillaires, l'angiogenese. Le carcinome hepatocellulaire (chc) est le plus frequent des cancers primitifs du foie. La forte augmentation du nombre de malades infectes par les virus des hepatites b et c serait a l'origine d'une augmentation de l'incidence du chc de 1,2 pour 100 000 habitants. L'objectif de ce travail a ete d'etudier les molecules impliquees dans le remodelage des lames basales et de rechercher des associations entre leurs niveaux d'expression et des parametres pathologiques des chc. Ainsi, nous avons demontre que l'expression de la mmp2, une metalloproteinase dont les substrats principaux sont le collagene de type iv et les laminines, est induite dans les myofibroblastes. L'expression de la mmp2 est associee a celle des molecules intervenant dans le complexe d'activation, a savoir le timp2 et la mt1mmp, et son activation est dependante des interactions avec les membranes hepatocytaires. Le collagene xviii (c18) est le precurseur de l'endostatine, un puissant inhibiteur de l'angiogenese tumorale. Nous avons demontre que le c18 est exprime par les hepatocytes adultes normaux, les cellules hepatiques stellaires actives et les cellules endotheliales, et qu'il est associe aux lames basales hepatiques. L'expression du c18, relativement stable dans le foie normal et cirrhotique, associe a l'existence de formes seriques, suggere que le collagene xviii serait responsable d'une nouvelle fonction hepatique, la regulation homeostatique de l'angiogenese. De plus, nos resultats ont montre que l'expression du c18 est associee a certains parametres pathologiques d'importance pronostique et que la balance entre l'expression de 2 peptides c-terminaux du c18 est associee a l'angiogenese et le remodelage des lames basales dans les chc. Au total, nos travaux suggerent que le remodelage des lames basales joue un role essentiel dans la progression et l'invasion tumorale.