Dissertations / Theses on the topic 'Anticorpo policlonal'

Introdução: O emprego de técnicas de interpretação imunológica de agentes infecciosos, de uma maneira geral, confere maior sensibilidade e especificidade ao exame histopatológico; o anticorpo policlonal anti-BCG tem sido testado como uma coloração imunoistoquímica de triagem para espécimes de biópsias cutâneas, com suspeita de origem infecciosa; em casos de infecções fúngicas e bacterianas, os resultados mostraram-se claramente superiores aos conseguidos pelas técnicas histoquímicas convencionais. Objetivos: Verificar a positividade da reação imunoistoquímica com o anti-BCG em granulomas imunológicos cutâneos, que não puderam ter o seu diagnóstico etiológico definido pelos métodos histoquímicos usuais de coloração para agentes infecciosos (Grocott e Ziehl-Neelsen) e também descrever a sensibilidade e especificidade deste anticorpo, através da comparação com os exames culturais para fungos e micobactérias. Metodologia: Procedeu-se à técnica imunoistoquímica com o anti-BCG em 33 biópsias cutâneas com granulomas imunológicos, com colorações de Grocott e Ziehl-Neelsen negativas. Também foram selecionados 13 casos de hanseníase virchowiana e 11 de granulomas por degeneração do colágeno, para que servissem de controles positivos e negativos, respectivamente. A leitura das lâminas foi realizada por dermatopatologista do HCPA que não tinha conhecimento dos dados clínicos dos pacientes. Não foi realizada a quantificação do antígeno nos cortes. Resultados: Dos 33 casos estudados, 13 (39,4%) apresentaram imunoistoquímica positiva com o anti-BCG, os diagnósticos finais foram: 4 casos (12,12%) de tuberculose, 4 casos de esporotricose, 1 caso (3.03%) de cromomicose, 1 caso de hanseníase tuberculóide e 3 casos (9.09%) que não puderam ter o diagnóstico conhecido, pois perderam o acompanhamento médico. A sensibilidade do anti-BCG quando comparado com a cultura para fungos foi de 57,1% e a especificidade de 66,7%; na comparação com a cultura para micobactérias a sensibilidade foi de 100%, porém só haviam 2 exames positivos, e a especificidade foi de 67,7%. Nos casos de hanseníase virchowiana, a sensibilidade e a especificidade foi de 100%. Conclusão: A técnica imunoistoquímica com o anticorpo anti-BCG é relativamente fácil, rápida e de baixo custo e mostrou ser útil na identificação de microorganismos que não foram prontamente visualizados com as colorações de Grocott e Ziehl-Neelsen. Entretanto, o pequeno número de controles pode ter influenciado no desempenho do método.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 µg desse anticorpo reconheceu 0,6 µg de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 µg de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina α no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo.
Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 µg of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 µg of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and α intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz Soccol
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 27/02/2015
Inclui referências : f.98-108
Resumo: A febre aftosa é uma doença altamente contagiosa que acomete animais biungulados. Tem distribuição cosmopolita, mas é endêmica na Ásia, África e em alguns países da América do Sul, sendo que o Brasil é considerado zona livre com vacinação. No Brasil o controle epidemiológico da doença é realizado mediante a vacinação e vigilância sanitária sendo necessário diagnóstico diferencial entre animais vacinados de portadores do vírus, para provar a ausência da doença. Desta forma é fundamental o desenvolvimento de testes para diferenciar animais vacinados de doentes e para o controle do processo de produção da vacina. A resposta a anticorpos, contra proteínas não estruturais do vírus, tem sido amplamente utilizada para este propósito, como é o caso do ensaio imuno-enzimático-ELISA/EITB. A proteína 3ABC é uma proteína não estrutural do vírus da febre aftosa e está presente em altos níveis no soro de animais infectados. Visando a diferenciação entre animais doentes e vacinados a proteína ABC deve ser removida durante o processo de produção da vacina, para que o animal imunizado não apresente anticorpos detectáveis contra ela. O objetivo deste estudo foi produzir e caracterizar anticorpos policlonal e monoclonal contra a proteína 3ABC do vírus da febre aftosa, para serem utilizados no desenvolvimento de um teste imunoenzimático que permita monitorar os processos de purificação da vacina, para remover as proteínas não estruturais e controle de qualidade das partidas produzidas visando sua aprovação pelos órgãos fiscalizadores como o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Para a produção dos anticorpos policlonal e monoclonal primeiramente foi produzida a proteína 3ABC recombinante a partir do plasmídeo contendo gene que codifica a proteína 3ABC, já com a mutegênese do gene 3ABC no sítio ativo da protease 3Cpro para sua inativação, produzido por Gonzales, 2013. A produção da proteína foi realizada por fermentação da Escherichia coli recombinante em erlenmeyer de um litro e realizada as etapas de semi purificação (anticorpo policlonal) e ou purificação (anticorpo monoclonal). O anticorpo policlonal, produzido em coelhos, apresentou altos títulos a partir de 75 dias pós-imunização. A puriticação foi realizada por cromatografia de afinidade com proteína G, o que resultou em uma imunoglobulina altamente pura, tornando-a mais específica para a proteína de interesse. Para a produção do anticorpo monoclonal foram imunizados camundongos BALB/c por via intramuscular. A fusão realizada originou 217 colônias de hibridomas, sendo 10 deles positivos no tese ELISA indireto. Após clonagem e expansão dos clones positivos, foi realizado o teste de estabilidade permitindo a seleção de dois clones estáveis. Os anticorpos foram caracterizados pelas metodologias de ELISA e Western Blotting e mostraram alta reatividade contra a proteína 3ABC e podem ser utilizados no desenvolvimento do teste ELISA para o monitoramento dos processos de purificação da vacina contra a febre aftosa. Todos os experimentos foram realizados na empresa Ourofino Saúde Animal. Palavras chave: febre aftosa; proteína 3ABC; anticorpo policlonal anti-3ABC; anticorpo monoclonal anti-3ABC.
Abstract: FMD is a highly contagious disease that affects cloven-hoofed animals and is endemic in Asia, Africa and some countries in South America. In Brazil the epidemiological disease control is achieved by vaccination and health surveillance. For this control is necessary differential diagnosis between vaccinated animals and those carrying the virus, to prove the absence of the disease. Thus it is important to develop tests to differentiate vaccinated animals from sick animals. The antibody response against nonstructural proteins of the virus, have been widely used for this purpose, such as the enzyme-immunoassay ELISA / EITB. The 3ABC is a nonstructural protein of FMD virus and it is present in high levels in infected animals serum. It is necessary to be removed during vaccine production, so the immunized animal does not produce detectable antibodies against them. The aim of this study was to produce and characterize polyclonal and monoclonal antibodies against the 3ABC protein of FMD virus, for their use to develop an enzymatic immunoassay experiments. Such experiments will allows the monitoring of the vaccine purification processes, which removes non-structural proteins and also the quality control process of the produced batches for approval by regulatory agencies such as the Ministry of Agriculture Livestock and Supply (MAPA). In this study, the plasmid to heterologous protein 3ABC production was produced by GONZALEZ, 2013. The expression has been optimized for subsequent production of polyclonal and monoclonal antibodies. For animal's immunization, either rabbit or mouse, the protein used was the semi purified protein. And for the monoclonal antibody screening tests, the protein used was the purified protein. The purification in this stage was due to the need of a specific test to select the monoclonal antibody which is also highly specific. The polyclonal antibody produced in rabbits, showed high titers from 75 days post-immunization. The large amount of polyclonal antibody obtained enabled the using of affinity chromatography using protein G, as a purification method, which resulted in a highly pure immunoglobulin, making it more specific to the protein of interest. For the production of monoclonal antibody (Mabs) BALB/c Mice were immunized intramuscularly. The fusion carried out originated 217 hybridomas colonies, 10 of them were positives for antibody production by ELISA test. After cloning and expansion of positive clones, stability tests were performed wich allowed the selection of two stable clones. The antibodies were characterized by ELISA and Western Blotting approaches. The mabs obteined showed high reactivity against 3ABC protein and as a result they can be used in the development of an ELISA assay to monitor the purification processes of the vaccine against FMD. All experiments were performed in Ourofino Animal Health Company. Key-words: FMD; 3ABC protein; polyclonal anti-3ABC; monoclonal anti-3ABC.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gizele_lima_de_sa.pdf: 488608 bytes, checksum: fe16f7b595024fb9112b8c23f5da90ca (MD5) Previous issue date: 2012-02-14
Neosporosis is considered a disease of worldwide distribution. It is caused by the apicomplexa protozoan Neospora caninum, responsible for neuromuscular disorders in dogs and abortions in bovines, which makes it an important pathogen in cattle breeding. The diagnosis of this disease can be accomplished by identifying the parasites by histological sections or by detection of specific antibodies. However, serological methods can be hampered by cross-reactivity with other apicomplexa parasites, such as Toxoplasma gondii. Parasite-specific antigens used for detection of antibodies or in the production of antiserum for the detection of tachyzoites can improve the specificity and sensitivity of diagnostic tests and studies of the biology of the parasite. Among specific antigens of Neospora genus, NcSRS2 (Nc-p43) which is an immunodominant surface protein stands out. It is present in tachyzoites as well as bradyzoites. In this study, Nc-p43 protein was produced in its recombinant form (rNcp43), by inserting the gene NcSRS2 in the cloning vector pET100/DTOPO, which was used to transform Escherichia coli BL21 Star. rNc-p43 protein was evaluated for reactivity with immune sera from naturally infected bovine, ovine and canine species, and used to immunize BALB/c mice for the production of a polyclonal antibody (pAb). rNc-p43 (pAb/rNc-p43) antibody was conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) and the reactivity with the native protein on the surface of the parasite was evaluated by immunofluorescence. rNc-p43 protein was recognized by anti N. caninum present in immune sera by ELISA and dot blot and it was able to generate antibodies against the p43 antigen. The pAb/rNc-p43 reacted with the rNc-p43 protein in indirect ELISA and Western blotting, detecting N. caninum tachyzoites in direct and indirect immunofluorescence, with a fluorescence pattern only in the apical complex of the parasite, maintaining affinity even after conjugation with FITC. pAb/rNc-p43 showed no cross-reactivity with T. gondii. The results of this study suggest that the rNc-p43 obtained and the pAb produced can be useful in developing diagnostic tests based on the detection of specific antibodies and the antigen present on the surface of the parasite.
A neosporose é considerada uma doença de distribuição mundial, causada pelo protozoário apicomplexa Neospora caninum, causador de desordens neuromusculares em cães e abortos em bovinos, o que o torna um patógeno de relevância na bovinocultura. O diagnóstico desta enfermidade pode ser realizado através da identificação do parasito em cortes histológicos ou pela detecção de anticorpos específicos. No entanto, os métodos sorológicos aplicados podem ser dificultados por reações cruzadas com outros parasitos apicomplexas, como Toxoplasma gondii. Antígenos específicos do parasito utilizados para detecção de anticorpos ou na produção de insumos biológicos para a detecção de taquizoítos podem melhorar a especificidade e a sensibilidade dos testes de diagnóstico e de estudos da biologia do parasito. Entre os antígenos específicos de Neospora, destaca-se a proteína de superfície imunodominante NcSRS2 (Nc-p43), presente tanto em taquizoítos quanto em bradizoítos. Neste estudo, a proteína Nc-p43 foi produzida em sua forma recombinante (rNc-p43), através da inserção do gene NcSRS2 no vetor de clonagem pET100/DTOPO, o qual foi utilizado para transformar a bactéria Escherichia coli BL21 Star. A proteína rNc-p43 foi avaliada quanto a reatividade com soros imunes de animais naturalmente infectados das espécies bovina, ovina e canina; e utilizada para imunizar camundongos da linhagem BALB/c para a produção de um anticorpo policlonal (pAb). O anticorpo anti rNc-p43 (pAb/rNc-p43) foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e avaliado quanto a reação com a proteína nativa na superfície do parasito por imunofluorescência. A proteína rNc-p43 foi reconhecida por anticorpos anti N. caninum presente nos soros imunes, através de ELISA e Dot blot e foi capaz de gerar anticorpos contra o antígeno rNc-p43. O pAb/rNc-p43 reagiu com a proteína rNc-p43 em ELISA indireto e Western blotting, detectou taquizoítos de N. caninum em imunofluorescência indireta e direta, apresentando um padrão de fluorescência somente no complexo apical do parasito, mantendo sua afinidade mesmo após sua conjugação com FITC. O pAb/rNc-p43 não apresentou reação cruzada com T. gondii. Os resultados deste estudo sugerem que a rNc-p43 obtida e o pAb gerado podem ser úteis no desenvolvimento de testes de diagnóstico baseados na detecção de anticorpos específicos e do antígeno presente na superfície do parasito.

Orientadores: Pedro Eduardo de Felicio, Carlos Termignoni
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-25T14:10:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rubensam_JaneMaria_D.pdf: 3334187 bytes, checksum: 061c9d779e7f5da6e43706dd56bfc44e (MD5) Previous issue date: 1999
Resumo: Este trabalho teve como objetivo estudar a relação da atividade de calpastatina e a força de cisalhamento da carne bovina bem como produzir anticorpo policlonal anti-calpastatina para futuro uso em estudos do potencial da calpastatina como indicador da maciez tendo em vista que esta característica é considerada como a mais importante para a qualidade sensorial da carne bovina. Foram realizados dois experimentos. No primeiro, estudou-se a influência do genótipo B0S indicus na atividade de calpastatina e na textura do músculo longissimus dorsi de novilhos criados no Sul do Brasil e a variabilidade destas características. A atividade de calpastatina foi determinada pelo ensaio de inibição da m-calpaína e a textura através da força de cisalhamento (Warner Bratzler Shear). Amostras de contrafilé (músculo L. dorsi) provenientes de 26 bovinos, sendo 14 Polled Hereford (HH), sete ¾ Hereford 1/4Nelore (3/4H1/4N) e cinco S/8Hereford 3/8Nelore (S/8H3/8N), machos castrados, abatidos aos dois anos de. idade, foram coletadas 24 h após o abate e analisadas quanto à atividade de calpastatina e textura, tanto no 1 ° dia post moriem quanto após um período de maturação de 10 dias a 2° C. A carne de novilhos S/8H3/8N apresentou, no 1° dia, maior (p0,05) entre os grupos HH e 3/4H1/4N para as mesmas características. Após 10 dias, houve uma diferença na atividade de calpastatina, porém não significativa (p>O,OS), entre o grupo 5/8H3/8N (1,S7U/g) e os demais (HH=1,23U/g; 3/4H1/4N=1,35U/g), e diferença significativa entre os grupos HH e S/8H3/8N para força de cisalhamento (3,67 e 5,00kg, respectivamente).Neste experimento, concluiu-se que a atividade de calpastatina determinada 24 horas post moriem, pode ser útil para a previsão da textura da carne, maturada ou não. Além disso, a participação do genótipo B.os indicus nos rebanhos bovinos da Região Sul poderá resultar em carne de pior textura. No segundo experimento, o gene contendo os domínios 2, 3, 4 e a região não traduzida 3' da calpastatina muscular bovina, inserido no vetor pGEX-5X-2, denominado pBSA1 (Killefer & Koohmaraie, 1994), gentilmente cedido pelo Dr. Mohammad Koohmaraie, pesquisador líder do Meat Animal Research Center, Clay Center, Nebraska, EUA, foi utilizado para expressão da calpastatina na forma de GST-calpastatina, em células de Escherichia coli AD202 DH5a. Após purificação em coluna de Glutathione-Sepharose 4B, inoculou-se 100 µg de GSTcalpastatina em coelho, via subcutânea, por 4 vezes, com intervalos de 21 dias. O anticorpo policlonal anti GST -calpastatina, purificado em Proteína G HiTrap, reconheceu calpastatina de extrato muscular bovino aquecido, com 67 kDa, através do método Western Blot. Através do teste ELlSA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de. competição, o anticorpo policlonal anti GSTcalpastatina, em concentrações de 60 a 230 µg IgG/poço, reconheceu 70 mU da calpastatina muscular presente no extrato aquecido numa concentração dez vezes maior. GST -calpastatina também foi expressada em E. coli XL 1 Blue e, após purificação em cromatografia de afinidade, foi inoculada em coelho para obtenção de anticorpo policlonal. Este anticorpo foi utilizado em teste ELISA de captura de anticorpos para identificação da calpastatina muscular bovina em extrato muscular aquecido. A concentração de anticorpo policlonal anti GST -calpastatina, igual a 45 µg/ml, apresentou resposta proporcional à quantidade de calpastatina no extrato muscular. A produção e purificação de anticorpo policlonal anti GST -calpastatina constituirá um importante passo rumo ao desenvolvimento de testes, para determinação direta da atividade de calpastatina em amostras de músculos bovinos coletados por biópsia
Abstract: The objective of this work was to study the relationship between the longissimus dorsi muscle calpastatin activity and the shear force trom steers of different genotypes as well to produce polyclonal anti-calpastatin antibodies to be used as meat tenderness predictor in further research. Tenderness is considered the most important sensory quality attribute of beef. Two experiments were conducted. In the first, it was studied the Bos indicus genotype influence on calpastatin activity and texture of boneless rib steaks (longissimus dorsi muscle) at 24 hours after slaughter and at the 10th day of aging at 2°C from steers raised in thé South of Brazil. Calpastatin activity was determined by m-calpain inhibition assay anel texture by shear force (Warner-Bratzler). Beef rib samples from 26 steers, being 14 Polled Hereford (HH), seven 3/4 Hereford 1/4 Nelore (3/4H1/4N) and five 5/8 Hereford 3/8 Nelore (5/8H3/8N) were analysed. Rib samples from 5/8H3/8N steers showed higher (p<0.05) calpastatin activity and shear force values than beef trom HH and 3/4H1/4N steers in the 1st day. No differences (p>0.05) were detected in the same traits between groups HH and 3/4H1I4N. After 10 days of aging, there was a difference in calpastatin activity, although non-significant (p>0.05), amongst group 5/8H3/8N (1.57U/g) and others (HH=1.23U/g; 3/4H1/4N=1.35U/g), and a significant difference in shear force between groups HH and 5/8H3/8N (3.67 and 5.00kg, respectively). It was concluded that the calpastatin activity determined 24 hs post mortem can be useful to predict the texture of beef, aged or not. Also, the increasing participation of Bos indicus genotype in the South Region cattle herds, besides the productivity advantages, may result in beef of lower texture quality. In the second experiment, polyclonal antibodies were raised in rabbits from a cloned pBSA1 (vector pGEX-5X-2, Pharmacia) encoding domains 2, 3, 4 and the 3' untranslated region of bovine calpastatin gene, kindly provided by Or. Mohammad Koohmaraie, leader researcher trom Meat Animal Research Center Roman L. Hurska, Clay Center, Nebraska, USA.. The cloned pBSA1 (KILLEFER & KOOHMARAIE, 1994) was used to expression of a GST-calpastatin form in Escherichia coli AD202 and DH5a cells. After purification in Glutathione Sepharose 4B column, aliquot of 100 µg GST-calpastatin was inoculated in rabbit, four times with 21 day intervals. The polyclonal antibodies purified in Protein G HiTrap recognized a 67 kDa protein from prerigor bovine heated muscle homogenates by Western blot method. By ELlSA competition assay, polyclonal anti-GST-calpastatin antibodies within the range of 60 to 230µg IgG/well detected until 70 mU of calpastatin trom bovine prerigor longissimus dorsi muscle homogenate in which original activity was ten times higher. GST -calpastatin was also expressed in E. coli XL 1 Blue that after an affinity purification was used to raise polyclonal antibodies in rabbits. The polyclonal antibodies anti-GST-calpastatin were used to perform an antibodies capture ELlSA test to identify calpastatin from a heated muscle homogenate. A 45 J..lg/ml of antiGST -calpastatin polyclonal antibodies concentration presented a proportional response in relation to the muscle heated homogenate calpastatin concentration. The polyclonal anti-GST -cal pastati n antibodies obtained in this work could be used to develop field tests useful to determine calpastatin activity in bovine muscles collected by biopsy
Doutorado
Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientadores: Dagmar Ruth Stach-Machado, Gisele Abigail Montan Torres
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-13T19:49:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorenzi_MarcelSalmeron_M.pdf: 4641112 bytes, checksum: 98293f35d81cf7287376bbbf8a203993 (MD5) Previous issue date: 2009
Resumo: No Brasil a batata é considerada uma das principais hortaliças produzidas, tanto em área plantada quanto em consumo. A produção anual é em torno de 2 milhões de toneladas, ocupando uma área superior a 130 mil hectares, gerando cerca de 500 mil empregos. Nos últimos anos, a bataticultura brasileira vem sofrendo perdas significativas devido ao aumento da incidência de viroses, principalmente provocadas pelo vírus Y da batata (Potato virus Y - PVY). Mundialmente, são conhecidas pelo menos três linhagens distintas do vírus Y: PVYO, PVYC e PVYN, cujos sintomas variam de acordo com o ambiente e a planta hospedeira. A linhagem PVYN apresenta uma variante denominada PVYNTN, que provoca sintomas de mosaico foliar mais intenso e a indução de formação de anéis necróticos nos tubérculos. A presença de focos de infecção de PVY em índices acima de 4% (limite de tolerância regulamentada pelo Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento) é suficiente para condenar o uso de determinadas lavouras para a produção de batata-semente, além de representar grandes danos em cultivos comerciais de batata para consumo. Já o PVX pode representar um grande problema quando em associação com o PVY. É um vírus cosmopolita, sendo transmitido mecanicamente e caracterizado por mosaico leve nas folhas, mais visíveis na metade inferior da planta. Atualmente, a análise de fitossanidade e a indexação viral da batata-semente destinada à multiplicação comercial no Brasil são efetuadas através da combinação da utilização de plantas indicadoras, que demanda tempo, e por testes sorológicos como ELISA, os quais representam custos adicionais à cadeia produtiva, uma vez que o Brasil é dependente da importação dos antisoros de detecção. Deste modo, considerando a relevância do estabelecimento de testes de diagnóstico nacionais que permitam a identificação específica dos vírus Y e X, em virtude da grande incidência de infecções do PVY e da grande necessidade de proteção contra o aumento da introdução do PVX, com oagravante de grandes prejuízos na co-infecção, os objetivos específicos deste projeto foram produzir soros policlonais específicos para o PVX e PVY, estabelecer ELISA indireto e desenvolver diagnóstico molecular dos vírus através de primers específicos e do IC-RTPCR. Esse trabalho conseguiu isolar e purificar os vírus X e Y através da indexação biológica e protocolos de extração. Com isso, foi possível produzir e caracterizar os anticorpos policlonais para o PVY e o PVX, com grande especificidade e poder de detecção. Após essas etapas, foi realizado a construção de primers específicos, e o desenvolvimento de técnicas moleculares de detecção baseadas na extração de material genético de folhas infectadas e PCR com os respectivos primers, obtendo-se os respectivos fragmentos esperados, concluindo com sucesso o estabelecimento do teste. Por fim, tentouse estabelecer o IC-RT-PCR, todavia o tamanho reduzido das partículas virais inviabilizou a realização do teste, mas a execução da detecção por ELISA e molecular separadamente foi estabelecido com sucesso, permitindo agregar novas tecnologias nacionais e contribuindo com a redução dos custos para a execução dos testes de fitossanidade, importantes e imprescindíveis para o controle das viroses predominantes na bataticultura nacional.
Abstract: The potato culture (Solanum tuberosum L.) represents the fourth major vegetal production in the world, reaching productivity indexes which overcome that of cerals in 5 times. Potato crop may be affected by several disease. Actually, some references point out near 40 in a total of 70 disorders are caused by viral agents. Among the most important viruses of potato, virus X and Y usually cause major concern, due to their harmfull effects in productivity and comercialization of potato. Nowadays, the viral infecctions have found their way into Brazil's potato production reagions in a very fast maner. The state of São Paulo is the most afeccted. Althought potato crop is among the stocks 10 major crops in the country, its production relies on virus-free imported potato-seeds to mantain its production. This is not only responsable by a considerable part of the production costs, but also represents a dangerous entrance door for a number of exotic pathogens inexistent in our territory. Thus, a fitosanity control of imported seed-potato lots, which enter Brazil via Santos harbor in the State of São Paulo, has fundamental importance. The usage of imunodiagnosis like ELISA, althought being efficient and widely applied, results in an additional cost due to the dependency of Brazil on the importation of policlonal antisera and monoclonal antibodys necessaries for the proper detection of the most important virus afeccting the national potato plantations. It has becoming a must for the seed-potato production a program in Brazil to have our independence of the diagnoses antiserum reagents for ELISA to at least the most important seed-potato viruses. The independence on importation of these biotecnological products and the modernization of imunodiagnosis by applying molecular techniques with specifics primers and like IC-RT-PCR (ImmoCapture - Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction), which makes possible to detect the major potato's virus in a fast, efficient and cheap way in order to screen the sanity of the material produced in the country, leading to a increase in production and stating the quality of it. This work isolated and purified the virus X and Y by biological indexing and extraction protocols. Therefore, it was possible to produce and to characterize the polyclonals antiserum to PVX and to PVY, with great specificity and power of detection. After these steps, it was made specifics primers and the development of molecular detection techniques based on extraction of genetic material from infected leaves and PCR with the primers. The expected fragments was obtained, concluding with successful the establishment of the test. Finally, there was the attempt to establish the IC-RT-PCR, however the small size of viral particles prevented the test, but the implementation of detection by ELISA and molecular separately was successful, add new national technologies allowing and contributing to the reduction of costs for implementing of the fitosanitty tests, importants and essentials for the control of viruses prevailing in the national potato culture.
Mestrado
Imunologia
Mestre em Genética e Biologia Molecular

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem importância vital em muitos processos fisiológicos e apresenta uma multiplicidade de funções de regulação no corpo humano, tais como neurotrasmissão, vasodilatação, participa nas respostas imunes e em vários processos associados com o desenvolvimento dos tumores. Vários estudos fornecem evidências sobre as propriedades tumoricidas do óxido nítrico e doadores de NO que podem ser usados para o tratamento de tumores malignos e são objetos de interesse na atualidade. Baseado nisto o objetivo deste trabalho foi de sintetizar e descrever aspectos estruturais dos compostos [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = ácido 4,4\'-dicarboxi-2,2\'-bipiridina, bpy = 2,2\'-bipyridina) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = cloreto), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridina) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO], além de ensaios de citotoxicidade in vitro para alguns dos complexos sintetizados. Ensaios de citotoxicidade com solução aquosa de complexos rutênio-nitrosilo em linhagem de células metastáticas B16-F10 mostrou resultados relativamente baixos. Medidas de viabilidade celular mostrou que estes decrescem cerca de 10 % em relação ao controle. Este resultado foi interpretado como sendo devido a baixa interação entre o complexo e a célula. Bioconjugação de rutênio-nitrosilo com anticorpo policlonal IgG foi obtido por interação convalente e mostrou maior especificidade com um alvo na célula. Cromatografia de exclusão foi utilizada para separar o bioconjugado --IgG, que foi caracterizado por teste Western Blotting. Após a bioconjugação, o --IgG foi submetido a estudos de citotoxicidade com células metastáticas e a viablidade celular avaliada com ensaios MTT. Os resultados exibiram um incrível aumento na citotoxicidade de células B16-F10. Viabilidade celular foi determinada e valores de morte celular de cerca de 90 % obtida para uma das frações de --IgG. Nossos resultados demonstraram que o bioconjugado --IgG pode aumentar a resposta citotóxica e quiçá ser útil em terapia clínica.
Nitric oxide (NO) is a biological messenger that has vital importance in many physiological processes and shows a multitude of regulatory roles in the human body, such as neurotrasmission, vasodilatation, immune responses and also participates in various processes associated with cancer development. Several studies provide evidences of the tumoricidal properties of NO donors that can be used for the treatment of malignant tumors and nowadays are objects of interest. Based on this the aim of this work was synthesize compounds that in a controlled manner can deliver NO in a biological process. The synthesis, structural aspects, and in vitro cytotoxic properties of [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = 2,2\'-bipyridine-4,4\'-dicarboxylic acid), 2\'-bipyridine; bpy = 2,2\'-bipyridine) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = chloride), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridine) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO] are described. Citotoxicity assays with aqueous nitrosyl ruthenium complex in metastatic B16-F10 cells displayed very little effect. Cell viability measurement showed decrease around 10 % in comparison to the control. It was associated due to the low interaction between nitrosyl ruthenium specie and the cell. Bioconjugation of nitrosyl ruthenium specie with polyclonal antibody IgG was achieved by covalent interaction and showed more specific interaction between bioconjugated and target cell. Exclusion chromatography was used to isolate --IgG conjugated, which was characterized by Western Blotting test. Following bioconjugation, the --IgG was submitted to cytotoxic studies with metastatic cells and the viability evaluated by MTT assay. The results displayed incredible increase of citotoxicity for B16F10 cells. Cell viability was achieved to decrease until to 90 % in comparison to the control when one fraction of --IgG was used. Taken together, the present findings demonstrate that the --IgG complex may elicit citotoxicity responses that may find useful applications in clinical therapy.

Resumo: As doenças infecciosas e parasitárias causam perdas importantes em vários setores da produção da pecuária mundial. Estima-se que mais de 600 milhões de bovinos de países tropicais e subtropicais estejam expostos à infecção por Babesia spp., gerando um prejuízo econômico de mais de 1,3 bilhão de dólares por ano. Parte significativa dessa soma destina-se a defensivos e insumos veterinários, os quais poderiam ser substituídos por tecnologias mais eficazes e econômicas, como, por exemplo, animais geneticamente resistentes a parasitas. Os gêneros Babesia e Plasmodium são hemoparasitas pertencentes ao filo Apicomplexa e apresentam características comuns no processo de invasão eritrocitária. A babesiose bovina causada por Babesia bigemina e Babesia bovis apresenta sinais clínicos similares a malária humana causada por Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum. O antígeno Duffy é o único receptor para o P. vivax em humanos. A maioria dos indivíduos negros africanos é resistente a este parasita devido a uma mutação que provoca a ausência de expressão deste antígeno na superfície das hemácias.Tendo em vista esse fato, e que animais da subespécie Bos taurus taurus são mais susceptíveis à babesiose quando comparados à animais Bos taurus indicus, este projeto foi desenvolvido com o objetivo de averiguar se essa maior resistência dos animais zebuínos está associada ao fato do antígeno Duffy estar ausente ou expresso em menor quantidade nas hemácias desses animais. Para detecção e quantificação do antígeno Duffy, na superfície das hemácias de bovinos dessas subespécies, foi produzido um anticorpo policlonal anti-Duffy bovino, visto que sua detecção não é possível pelos anticorpos desenvolvidos para a proteína humana, em função dessa diferir da proteína bovina, principalmente na seqüência de aminoácidos da região N-terminal. Para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Cattle business worldwide has been affected by all sorts of infections. It's estimated that more than 600 million bovines from tropical and sub-tropical areas are exposed to Babesia spp. infection causing loss of more than US$ 1,3 billion a year. An important part of this amount is spent on veterinarian drugs and vaccines. However this scenario could be changed if cheaper and more efficient technologies such as animal breeding for resistance to parasites were used. The genera Babesia and Plasmodium are hemoparasites which belong to phylum Apicomplexa and share features such as the RBCs invasion process. Clinic signs presented by cattle infected with Babesia bigemina and Babesia bovis are very similar to those presented by human beings infected with Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum. The glycoprotein Duffy is the only human erythrocyte receptor for P.vivax. The majority of black African people are resistant to this parasite due to a mutation which abolishes expression of the Duffy antigen on its erythrocytes surfaces. Detailed information on molecular interaction between Babesia parasite and its receptors on the bovine host cells surface is limited. Moreover, animals from subspecies Bos taurus taurus are more susceptible to babesiosis infection than those from Bos taurus indicus. This project investigated if this higher resistance of Bos taurus indicus animals is due to the fact that the Duffy antigen is absent or less expressed on its RBC surface. Aiming at detecting and quantifying Duffy antigen on erythrocyte surfaces of Bos taurus indicus and Bos taurus taurus, a polyclonal antibody against bovine Duffy was produced, because antibodies against human Duffy can not recognize this bovine protein which has different aminoacid sequence at N-terminal. Synthetic decapeptide (YNETDVEAAA) corresponding to aminoacid 34 to 43 of the N-terminal extracelullar domain of the bovine protein... (Complete abstract click electronic access below)
Orientador: Lígia Souza Lima Silveira da Mota
Coorientador: Débora Colombi
Coorientador: Rogério Abdallah
Banca: Rosângela Zacarias
Banca: Ivan de Godoy Maia
Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-14Bitstream added on 2014-06-13T20:43:01Z : No. of bitstreams: 1 antonangelo_atbf_me_botib.pdf: 947571 bytes, checksum: 2289cbcd7df8db2d703a841907574c99 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
As doenças infecciosas e parasitárias causam perdas importantes em vários setores da produção da pecuária mundial. Estima-se que mais de 600 milhões de bovinos de países tropicais e subtropicais estejam expostos à infecção por Babesia spp., gerando um prejuízo econômico de mais de 1,3 bilhão de dólares por ano. Parte significativa dessa soma destina-se a defensivos e insumos veterinários, os quais poderiam ser substituídos por tecnologias mais eficazes e econômicas, como, por exemplo, animais geneticamente resistentes a parasitas. Os gêneros Babesia e Plasmodium são hemoparasitas pertencentes ao filo Apicomplexa e apresentam características comuns no processo de invasão eritrocitária. A babesiose bovina causada por Babesia bigemina e Babesia bovis apresenta sinais clínicos similares a malária humana causada por Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum. O antígeno Duffy é o único receptor para o P. vivax em humanos. A maioria dos indivíduos negros africanos é resistente a este parasita devido a uma mutação que provoca a ausência de expressão deste antígeno na superfície das hemácias.Tendo em vista esse fato, e que animais da subespécie Bos taurus taurus são mais susceptíveis à babesiose quando comparados à animais Bos taurus indicus, este projeto foi desenvolvido com o objetivo de averiguar se essa maior resistência dos animais zebuínos está associada ao fato do antígeno Duffy estar ausente ou expresso em menor quantidade nas hemácias desses animais. Para detecção e quantificação do antígeno Duffy, na superfície das hemácias de bovinos dessas subespécies, foi produzido um anticorpo policlonal anti-Duffy bovino, visto que sua detecção não é possível pelos anticorpos desenvolvidos para a proteína humana, em função dessa diferir da proteína bovina, principalmente na seqüência de aminoácidos da região N-terminal. Para...
Cattle business worldwide has been affected by all sorts of infections. It´s estimated that more than 600 million bovines from tropical and sub-tropical areas are exposed to Babesia spp. infection causing loss of more than US$ 1,3 billion a year. An important part of this amount is spent on veterinarian drugs and vaccines. However this scenario could be changed if cheaper and more efficient technologies such as animal breeding for resistance to parasites were used. The genera Babesia and Plasmodium are hemoparasites which belong to phylum Apicomplexa and share features such as the RBCs invasion process. Clinic signs presented by cattle infected with Babesia bigemina and Babesia bovis are very similar to those presented by human beings infected with Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum. The glycoprotein Duffy is the only human erythrocyte receptor for P.vivax. The majority of black African people are resistant to this parasite due to a mutation which abolishes expression of the Duffy antigen on its erythrocytes surfaces. Detailed information on molecular interaction between Babesia parasite and its receptors on the bovine host cells surface is limited. Moreover, animals from subspecies Bos taurus taurus are more susceptible to babesiosis infection than those from Bos taurus indicus. This project investigated if this higher resistance of Bos taurus indicus animals is due to the fact that the Duffy antigen is absent or less expressed on its RBC surface. Aiming at detecting and quantifying Duffy antigen on erythrocyte surfaces of Bos taurus indicus and Bos taurus taurus, a polyclonal antibody against bovine Duffy was produced, because antibodies against human Duffy can not recognize this bovine protein which has different aminoacid sequence at N-terminal. Synthetic decapeptide (YNETDVEAAA) corresponding to aminoacid 34 to 43 of the N-terminal extracelullar domain of the bovine protein... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-13T14:40:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Leidiane A. S. Galvão.pdf: 2769437 bytes, checksum: cd70444b94b36102f02a5102e38a68c8 (MD5)
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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Due to rising rates of morbidity and mortality caused by human rotavirus, detection methods have been used routinely in clinical and epidemiological studies. The diagnosis of rotavirus infections is based on the detection of particles, antigens or viral RNA from the fecal material. This study aimed to develop the VP4 and VP6 protein detection tools for immunodiagnostic of Rotavirus group A. Rabbit and mice anti-VP4 and anti-VP6 IgGs were obtained from immunizations made with VP4 and VP6 recombinant proteins of Rotavirus A, both built in this study, and tested by flow cytometry and Western blot against the recombinant antigen and the native antigen. The region of the VP4 protein, selected for the generation of mice and rabbit anti-VP4 IgGs, was efficient to recognize native antigen in denatured form, as observed in western blot assays. The cytometry analysis demonstrated that generated anti-VP4 antibodies were not specific enough to be used in techniques where the VP4 protein is in its native form. Selected regions for production of VP6 protein have been efficient for the generation of anti-VP6 antibodies, able to recognize the native protein in its denatured and non-denatured form. Future studies will aim to increase the specificity of the antibodies obtained to allow their use in a greater number of immunoassays.
Devido as crescentes taxas de morbidade e mortalidade causada por Rotavírus humanos, métodos de detecção têm sido empregados rotineiramente em estudos clínicos epidemiológicos. O diagnóstico das infecções por Rotavírus baseia-se na detecção das partículas, antígenos ou RNA virais a partir de material fecal. O objetivo deste estudo foi desenvolver ferramentas de detecção das proteínas VP4 e VP6 para imunodiagnósticos de Rotavírus do tipo A. IgG de coelho e camundongos anti-VP4 e anti-VP6 foram obtidos a partir de imunizações feitas com as proteínas recombinantes VP4 e VP6 de Rotavírus A (ambas construídas neste estudo) e testados através de citometria de fluxo e western blot contra o antígeno recombinante e o antígeno nativo. A região da proteína VP4 selecionada para a geração de IgG de camundongo e coelho anti-VP4 foi eficiente para o reconhecimento do antígeno nativo em sua forma desnaturada, como foi possível observar nos ensaios de western blot. As análises de citometria demonstraram que os mesmos anti-VP4 gerados não foram específicos o suficiente para serem utilizados em técnicas onde a proteína VP4 está em sua forma nativa. As regiões selecionadas para a produção da proteína VP6 foram eficientes para a geração de anticorpos anti-VP6 capazes de reconhecer a proteína nativa em sua forma desnaturada e não desnaturada. Futuros trabalhos terão como objetivo o aumento da especificidade dos anticorpos obtidos de modo a permitir sua aplicação em um maior número de imunoensaios.

A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k29, k317, k248, k284, k2232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k317 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do desenvolvimento de um kit de ELISA competição. Com relação ao anticorpo policlonal, o antígeno de imunização foi MCLR-mcKLH, enquanto que o antígeno de sensibilização foi MCLR-cBSA para o ensaio de titulação de anticorpos de classe IgG por ELISA indireto. Na seqüencia, foi padronizado um ensaio ELISA competição utilizando somente a toxina MCLR como antígeno de sensibilização. Este método Caseína foi padronizado, validado e comparado com o kit comercial Abraxis®. O kit ELISA competição que utiliza anticorpo policlonal, nomeado como método Caseína, foi avaliado quanto Limite Inferior de Quantificação, Especificidade, Seletividade, influência do metanol no ensaio, Recuperação, Linearidade, Precisão, Exatidão e Robustez. Este método de triagem apresentou excelente resultado quando comparado ao kit comercial Abraxis®, pois foi capaz de detectar tanto variantes de microcistinas como nodularinas no ambiente aquático. O ensaio ELISA competição utilizando anticorpo policlonal anti-MCLR foi submetido à patente pela Agência USP de Inovação (I.N.P.I. 018090046230).
The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232) were obtained; however only 5 were stables (k29, k317, k248, k284, k2232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k317 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as immunization antigen, while MCLR-cBSA was used as sensitizing antigen for the IgG titration assay by indirect ELISA. In the sequence, a competition ELISA assay was standardized using the MCLR toxin as sensitizing antigen. This Casein method was standardized, validated and compared to the commercial kit Abraxis®. The competition ELISA kit using polyclonal antibody, known as Casein method, was analyzed concerning its Quantification Inferior Limit, Specificity, Selectivity, methanol influence of the assay, Recuperation, Linearity, Precision, Accuracy and Robustness. This screening method reached excellent results if compared to the commercial kit Abraxis®, for being able to detect both the microcystins variants and the nodularins in aquatic environmental. The competition ELISA assay using anti-MCLR polyclonal antibody was submitted to the grant of a patent by USP Innovation Agency (INPI 018090046230).

O ovo é o alimento naturalmente mais completo, uma vez que possui todos os nutrientes necessários, como vitaminas, aminoácidos e minerais essenciais para manter uma vida. Porém, em contra partida, possui várias proteínas promotoras de alergias em considerável parcela da população mundial. Para determinar as proteínas dos alimentos alergênicos, um dos testes mais utilizados é o imunoensaios tais como ELISA (ensaio imunoenzimático - enzyme linked immunosorbent assay), onde o anticorpo reconhece o antígeno e essa conexão é mostrada por um sistema enzimático, em outras palavras, a densidade óptica. O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência do anticorpo policlonal, produzido em laboratório, para identificar a presença do antígeno ovomucóide em ovos tratados por irradiação gama para a sua desativação. Para avaliar os tratamentos, o anticorpo policlonal foi produzido em quatro (04) coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo feminino, com 45 dias de vida, imunizadas com ovomucóide bioconjugado. Foi utilizado o adjuvante de Freund completo na primeira imunização e a solução tampão PBS, foram realizadas, posteriormente, quatro imunizações a cada quinze dias, mais um reforço 48 horas antes da retirada do plasma sanguíneo. O soro sangüíneo foi titulado por PTA-ELISA (Plate trapped antigen). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal do Instituto de Ciência Animal e Pastagens (IZ) e precedida de acordo com as normas europeias para o bem-estar e ética animal. Foram utilizados ovos comerciais in natura, fornecidos pelo Departamento de Genética da Universidade de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" - ESALQ / USP. As amostras foram submetidas à radiação gama proveniente de uma fonte de Co60, do tipo Multipropósito no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), sob uma taxa de dose de 19,4 e 31.8Gy/hora, nas doses: 0 (controle); 10kGy; 20KGy e 30KGy, em todas as taxas. Pelo teste de ELISA, foi encontrado o alérgeno ovomucóide das amostras ovo e, pelo resultado apresentados, constatou-se que o tratamento da radiação não mostrou alterações significativas, quando avaliado por anticorpos policlonais. Assim, podemos concluir que o anticorpo produzido é capaz de identificar a proteína alergênica ovomucóide e, a irradiação gama em tais taxas não apresenta mudanças na estrutura da proteína, por esta forma de avaliação. Porém, apresentou algumas alterações na cor e viscosidade visual das amostras de ovos
The egg is the most complete natural food; it has all the necessary nutrients such as vitamins, aminoacids and essential minerals to maintain a life. However, although, has several proteins that promote allergies in considerable part of the world population. To determine allergenic food proteins, one of the most used tests is the immunoassays such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), where the antibody recognizes the antigen and this connection is showed by an enzymatic system, in other words, optical density. The aim of this study was to determine the polyclonal antibody efficiency, produced in laboratory, to identify the presence the ovomucoid antigen in treated eggs by gamma irradiation for its inactivation. To evaluate the treatments, polyclonal antibody was produced in four New Zealand female rabbits, at 45 days old, immunized with bioconjugated ovomucoid. Was used Freund Complete Adjuvant at first immunization and PBS Buffer at four subsequently immunizations every fifteen days, plus a booster 48 hours before the blood retreated. The blood serum was tittered by PTAELISA (Plate trapped antigen). All procedures were approved by Institute of Animal Science and Pastures (IZ)´s Committee of Ethical and Animal Experimentation and preceded according to European Norms for ethical and animal welfare. It was used, in nature, commercial laying eggs, from the Genetic Department of Agricultural University Luiz de Queiroz ESALQ/USP. So the samples were submitted to the gamma radiation coming from a source of Co60, type Multipurpose at the Energetically Researches and Nuclear Institute (IPEN), under a dose rate of 19.4 and 31.8Gy/hour, in the doses: 0 (control); 10KGy; 20KGy and 30KGy, in all rates. By the ELISAs test we can find the egg allergen ovomucoid and the radiation treatment do not showed considerable changes. So we can concluded that the antibody produced is capable of identify the ovomucoid allergenic protein and the gamma irradiation in such rates does not shows changes in that protein, therefore showed some changes in the color and visual viscosity of the egg samples

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T19:19:08Z No. of bitstreams: 1 117110029.pdf: 698994 bytes, checksum: ceaed51c4f43c77fa5dcfffa7ec011b5 (MD5)
Made available in DSpace on 2015-03-08T19:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 117110029.pdf: 698994 bytes, checksum: ceaed51c4f43c77fa5dcfffa7ec011b5 (MD5) Previous issue date: 2013-08-09
Os vírus são importantes agentes patogênicos de várias espécies animais, entre elas bovinos. No Brasil, diversos agentes virais foram descritos causando infecções no rebanho bovino, e produzindo perdas econômicas significativas. A identificação dos animais infectados por um vírus pode ser realizada de diferentes formas; no entanto, a confirmação definitiva requer a demonstração do agente ou da resposta imune. Para isto, vários métodos com capacidade de detectar a partícula viral, atividade biológica, genoma, antígenos virais, ou então a resposta imune específica foram desenvolvidos. Os imunoensaios são testes amplamente utilizados na rotina laboratorial para detecção de antígenos virais em amostras clínicas ou de pesquisa. Estes ensaios apresentam boa sensibilidade, especificidade e facilidade de execução. A metodologia dos imunoensaios tem como base, o emprego de anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para os antígenos virais. Assim sendo, o objetivo do presente estudo foi produzir anticorpos policlonais para alguns vírus bovinos, e avaliar a reatividade destes em testes de imunofluorescência, imunoperoxidase e slot blot. Para isto, cepas e/ou isolados do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), herpesvírus bovino tipo 2 (BoHV-2), herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), herpesvírus bovino tipo 5 gE deletado (BoHV-5 gEΔ), vírus da diarreia viral bovina (BVDV), vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), vírus da língua azul (BTV) e vírus da vaccínia (VACV) foram amplificados em cultivo celular e o sobrenadante utilizado para imunizar coelhos. Os animais foram imunizados cinco vezes pela via subcutânea, e cinco dias após o último reforço coletou-se sangue. O soro foi separado do sangue por centrifugação. O soro foi diluído em PBS (1:100 a 1:204.800) e utilizado como anticorpo primário nos ensaios de imunofluorescência, imunoperoxidase e slot blot. A diluição de trabalho foi selecionada pela diluição que produziu reação específica nas células infectadas, e sinal fraco ou ausente nas células controle. Os antissoros apresentaram maior reatividade na técnica de imunoperoxidase do que na imunofluorescência e slot blot. Ainda, para os antissoros do BoHV-1, BoHV-5, BVDV e BRSV demonstrou-se a reatividade com amostras heterólogas nos ensaios de imunofluorescência e imunoperoxidase. Conclui-se que os anticorpos policlonais produzidos em coelhos possuem elevadas concentrações de anticorpos específicos, o que foi detectado pela reatividade nos ensaios de imunofluorescência, imunoperoxidase e slot blot. Desta maneira, estes reagentes podem ser considerados uma importante ferramenta para a detecção e caracterização de vários vírus bovinos na rotina de diagnóstico e pesquisa.
The viruses are significant important pathogenic agents of several animal species, including cattle. In Brazil, several viral agents causing infections have been described in cattle and they produce significant economic losses. The identification of animals infected by a virus can be performed in different ways; however, definitive confirmation requires demonstration of the agent or immune response. For this purpose, various methods with the capacity to detect the viral particle, biological activity, genome, viral antigens, or specific immune response have been developed. Immunoassays are widely used in laboratory routine for detection of viral antigens in clinical or research. These assays exhibit good sensitivity, specificity and easy for implantation. The immunoassay methodologies are based on the employment of monoclonal or polyclonal antibodies specific to the viral antigens. Therefore, the aim of this study was to produce polyclonal antibodies for some bovine virus, and evaluate their reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot tests. For this purpose, strains and/or isolates of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2), bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), bovine herpesvirus type 5 gE deleted (BoHV-5 gEΔ), bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bluetongue virus (BTV), and vaccinia virus (VACV) were amplified in cell culture and the supernatant were used to immunize rabbits. The animals were immunized five times by the subcutaneous route, and five days after the last boost the blood was collected. The serum was obtained by centrifugation. The serum was diluted (1:100 a 1:204.800) and used as primary antibodies in the immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. The working dilution was selected among those produced specific reaction with infected cells and absent or weak background in control cells. The antiserum showed higher reactivity in immunoperoxidase technique than the immunofluorescence and slot blot. The antiserum of the BoHV-1, BoHV-5, BVDV and BRSV presented the reactivity when tested with eterologous isolates in immunofluorescence, immunoperoxidase assays. In summary, that the polyclonal antibodies raised in rabbits have high concentrations of specific antibodies, which were demonstrated by the reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. Additionally, these reagents can be considered an important tool for the detection and characterization of various bovine viruses in diagnostic and research routine.

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5α e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 864 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos.
Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 α and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 Δtir, E2348/69 EscN-, CVD 206 ΔeaeA, UMD 872 ΔEspA, UMD 874 ΔEspB, UMD 870 ΔEspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 89125 bytes, checksum: 3903e49d4814eabf34674e8391c030ca (MD5) Previous issue date: 2007-06-28
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Some bacteria produce antimicrobial peptides called bacteriocins that show bactericidal or bacteriostatic effect against other bacteria from the same species or species that are phylogenetically related. These peptides have been studied mainly due to their potential application in food industry, in medicine and in livestock production. Bovicin HC5, a bacteriocin produced by Streptococcus bovis HC5, is similar to the lantibiotics and has a wide spectrum of action. Despite the great potential for practical applications, the production of bacteriocins is frequently limited by the methods used for detection, quantification and purification. However, immunoenzymatic assays can be used as an effective alternative to detect and purify antimicrobial peptides. This work aimed to produce polyclonal antibodies to detect and quantify the bacteriocin bovicin HC5 by immunoenzymatic assays and also to determine the cytotoxic effect of this bacteriocin on Vero cells. Production of the polyclonal antibodies was performed using HPLC-purified peptide followed by immunization of New Zealand rabitts and BALB/c mice. Periodical blood harvests were performed for up to 60 days. Immunoenzymatic analysis was carried out by indirect ELISA and Western blotting with samples from blood serum, S. bovis HC5 cell extracts or supernatants from cultures grown in basal media. Bovicin HC5 generated a immune response of moderated intensity. Nonspecific reactions were not observed between the antibody and the supernatants of other lactic acid cultures by Western blotting and indirect ELISA analysis. Only the purified bovicin HC5 was detected using these techniques. Agar diffusion assays indicated that the anti-bovicin HC5 anti-serum could neutralize 75 % of the bacteriocin activity. The bioassay also indicated that production of bovicin HC5 by S. bovis HC5 started during exponential phase and the biological activity of the bacteriocin increased when the culture reached stationary phase. Bovicin HC5 could be detected in the cell extract and in the supernatant of the S. bovis HC5 culture using the indirect ELISA technique. There was a direct relationship between the activity determined by the ELISA technique and the bioassays. Bovicin HC5 showed toxic effect against Vero cells at concentrations equal to or greater than 100 μg mL-1. These results indicated that immunoenzymatic assays can be used to detect bovicin HC5, but further work is needed to improve the sensitivity of the technique. The effect of bovicin HC5 on different cell lineages must also be investigated to evaluate the toxicity of the peptide and its potential application in animal production.
Algumas bactérias produzem peptídeos antimicrobianos denominados bacteriocinas, que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre bactérias da mesma espécie ou de espécies filogeneticamente relacionadas. Esses peptídeos têm sido estudados principalmente devido ao potencial para aplicação na indústria de alimentos, na medicina e na agropecuária. Bovicina HC5, uma bacteriocina produzida por Streptococcus bovis HC5, apresenta similaridade com os lantibióticos e possui amplo espectro de ação. Apesar do grande potencial de aplicação das bacteriocinas, a produção destes peptídeos é frequentemente limitada pelos métodos de detecção, quantificação e purificação utilizados. Entretanto, os ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados como uma alternativa mais eficiente para a detecção e purificação de peptídeos antimicrobianos. Este trabalho teve como objetivo produzir anticorpos policlonais para detectar e quantificar a bacteriocina bovicina HC5 por meio de ensaios imunoenzimáticos e determinar o efeito citotóxico da bacteriocina sobre células Vero. A produção de anticorpos policlonais foi realizada com o peptídeo purificado em HPLC seguido da imunização de coelhos New Zealand e camundongos BALB/c e coleta periódica de sangue por até 60 dias. A análise imunoenzimática foi realizada por ELISA indireta e Western blotting em amostras coletadas de soro sanguíneo, extrato de células de S. bovis HC5 ou sobrenadante das culturas cultivadas em meio basal. Bovicina HC5 foi capaz de gerar resposta imunológica, de intensidade moderada. Nenhuma reação inespecífica dos anticorpos foi observada com o sobrenadante de outras culturas lácticas nos ensaios de Western blotting e ELISA indireta, sendo detectada somente a bovicina HC5 purificada. No ensaio de difusão em meio sólido, o antissoro anti-bovicina HC5 neutralizou a atividade da bacteriocina em 75 %. Bioensaios indicaram que a bovicina HC5 começou a ser produzida durante o crescimento exponencial de S. bovis HC5 e a atividade biológica da bacteriocina aumentou quando a cultura atingiu a fase estacionária de crescimento. A bovicina HC5 foi detectada no extrato de células e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 pela técnica de ELISA indireta, a qual apresentou correlação com a atividade determinada por meio de bioensaios. A bovicina HC5 apresentou efeito tóxico sobre células Vero em concentrações iguais ou superiores a 100 μg mL-1. Esses resultados indicam que ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados para a detecção de bovicina HC5, porém outros trabalhos deverão ser realizados para aumentar a sensibilidade da técnica. O efeito de bovicina HC5 sobre diferentes linhagens celulares deverá ser determinado para avaliar o potencial tóxico deste peptídeo e sua possível aplicação na produção animal.

Orientadora : Profª Drª Larissa M. Alvarenga
Coorientadoras : Profª Drª Adriana Oliveira Costa e Profª Drª Juliana F. de Moura
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 20/03/2012
Inclui referências : f. 56-68
Área de concentração: Patologia
Resumo: As amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba encontram-se amplamente distribuídas na natureza e são consideradas organismos potencialmente patogênicos. Ocasionalmente podem desencadear infecções humanas, como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite amebiana. A investigação de características diferenciais entre as linhagens patogênicas e aquelas não associadas à infecção pode auxiliar a determinar fatores relacionados à patogenicidade e desenvolvimento de testes de diagnóstico. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente, por meio de critérios fisiológicos, morfológicos e imunoquímicos, amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba. Trofozoítos de quatro isolados foram utilizados: uma amostra clínica, obtida de caso de ceratite amebiana, outra amostra ambiental, obtida da poeira da residência do mesmo paciente, e outras duas amostras de referência A. poliphaga #2, de ceratite amebiana (ATCC 30641) e A. poliphaga #4, de água de um lago (ATCC 30782). Os quatro isolados foram cultivados axenicamente em meio PYG (proteose-peptona, extrato de levedo e glicose) usados para análise por microscopia eletrônica de varredura e submetidos individualmente à lise em ultra-som para obtenção de extrato protéico bruto. Os extratos foram utilizados para determinação do perfil protéico por eletroforese e na imunização de camundongos para produção anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos produzidos foram caracterizados por ELISA, Western Blotting e imunofluorescência. A análise do perfil protéico apresentou distinções quanto à presença e expressão de algumas proteínas entre os isolados. Os resultados obtidos com os anticorpos policlonais sugerem a presença de proteínas específicas para cada uma das amostras estudadas, além de um perfil imunoquímico com anticorpos co-reativos para componentes conservados. Dez clones de anticorpos monoclonais foram obtidos, dos quais o mAb3 reconhece proteínas de três das quatro amostras estudadas. O conhecimento adquirido com a realização desse trabalho poderá ser empregado na padronização de novos critérios para identificação e caracterização de linhagens desse gênero. Além disso, permitirá que proteínas previamente caracterizadas imunoquimicamente possam ser utilizadas como marcadores de patogenicidade. Palavras - chaves: Acanthamoeba, ceratite amebiana, perfil protéico, anticorpos policlonais e monoclonais, patogenicidade.
Abstract: The free-living amoebae of the genus Acanthamoeba are widely distributed in nature and are considered potentially pathogenic organisms. Occasionally they can trigger human infections such as granulomatous amoebic encephalitis and amoebic keratitis. The investigation of differentiating characteristics between pathogenic strains and those not associated with infection may help to determine factors related to pathogenicity and the development of diagnostic tests. In this sense, the aim of this study was to perform a comparative evaluation; by means of physiological, morphological and immunochemical criteria; between clinical and environmental samples of Acanthamoeba. Trophozoites of four isolates were used: a clinical sample, obtained from a confirmed case of amoebic keratitis; an environmental sample, obtained from the dust of the residence of the same patient; and two reference samples A. poliphaga #2, obtained from an amoebic keratitis (ATCC 30641) and A. poliphaga #4, obtained from the water of a lake (ATCC 30782). The four isolates were axenically grown in PYG (proteose-peptone, yeast extract and glucose), used for analysis by scanning electron microscopy and individually submitted to lysis by ultrasound to obtain a crude protein extract. The extracts were used to determine the protein profile by electrophoresis and were used for the immunization of mice to produce polyclonal and monoclonal antibodies. The antibodies produced were characterized by ELISA, Western Blotting and Immunofluorescence. The analysis of the protein profile presented distinctions about the presence and expression of some proteins among the isolates. The results obtained with polyclonal antibodies suggest the presence of specific proteins for each of the studied samples, besides an immunochemical profile with co-reactive antibodies to conserved components. Ten clones of monoclonal antibodies were obtained, from which mAb3 recognizes three of the four samples studied. The knowledge acquired from the development of this work may be employed at the standardization of new criteria for identification and characterization of strains from this genus. Furthermore, it can enable that previously immunochemically characterized proteins could be used as markers for pathogenicity. Keywords: Acanthamoeba, amebic keratitis, protein profile, polyclonal and monoclonal antibodies, pathogenicity.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais
Specific polyclonal antibodies obtained from egg yolk of the immunized chicken are named immunoglobulin Y (IgY). Although functionally related to mammal immunoglobulin G (IgG), IgY presents advantages, as follows: (i) elevated purified amounts of antibodies from one egg; (ii) the reduced of immunized animal number (iii) no interference with rheumatoid factor or mammal Complement proteins; (iv) binds only to chicken specific Fc fragment receptor. Polyclonal IgY antibodies could be employed as a primary or secondary reagent to investigate pathogen and host relationship, proteomic studies or infectious microorganisms biology. Toxoplasma gondii is a worldwide intracellular parasite which infects warm-blood hosts, including human. Toxoplasmosis causes fetal disorders in human and domestic animals. Tachyzoites and bradyzoites of T. gondii are stages related to host cell parasitism and also toxoplasmosis pathogeny. The specific IgG antibodies of mice are used to investigate virulence factors associated to T. gondii and evaluate mechanisms correlated to host immune response modulation by parasite antigens. However reduced amounts of specific IgG antibodies are obtained from a bled animal. Chickens and mice could have distinct antigenic proteins recognition profile even though using identical immunization protocols, probably this a consequence of phylogenetic distance between these two species. Specific polyclonal IgY were obtained from T. gondii soluble total antigens (STAg) immunized chickens at average of 4 mg/mL of pure yolk by a low cost and easy method. High avidity anti-STAg polyclonal IgY recognized distinct weight molecular antigenic proteins at second booster, and these antibodies were applied in standardized immunoassays with T. gondii. First, tissue cysts, parasitophorus vacuoles and also extracellular tachyzoites were detected in sections of chronically infected mice brain by a IgY-immunohistochemistry assay, complementally tachyzoites also were identified in a monolayer of infected HeLa cells by a IgY-immunocytochemistry assay, both methods used a anti-IgY FITC-conjugate secondary antibody. Additionally, STAg proteins two-dimensionally resolved were proved against T. gondii purified specific IgY and mice antiserum by a Western blot assay, the results demonstrated that egg yolk chicken antibodies identified acid antigens better than mice antisera. Finally, incubation of T. gondii tachyzoites with polyclonal anti-STAg IgY reduced intracellular parasitism in HeLa cells culture. In conclusion, polyclonal anti-STAg IgY antibodies present efficacy for application in immunoassays which investigate antigenic proteins candidates to diagnostic or vaccines and T. gondii biology.
Anticorpos policlonais específicos podem ser obtidos em grandes quantidades a partir da gema do ovo de galinhas imunizadas, denominados anticorpos IgY. Embora semelhantes funcionalmente aos anticorpos IgG de mamíferos, os anticorpos IgY apresentam vantagens: (i) extração sem estresse para o animal; (ii) menor número de animais utilizados na produção; (iii) grandes concentrações de anticorpos por gema; (iii) não sofre interferência do fator reumatóide e de proteínas do sistema complemento de mamíferos; (iv) interage apenas com receptores para Fc de galinha. Os anticorpos IgY são utilizados em estudos da relação patógeno versus hospedeiro, proteômica e biologia de agentes infecciosos. Toxoplasma gondii é um parasito amplamente distribuído e com grande número de hospedeiros, incluindo o homem, e pode ocasionar lesões em fetos humanos e de animais domésticos. A relação T. gondii versus hospedeiros, o papel dos antígenos do parasito nos processos de infecção e manutenção do parasitismo intracelular, podem ser investigados pela incubação do parasito com anticorpos específicos obtidos de mamíferos. Os anticorpos de mamíferos são obtidos em concentrações limitadas e por meio de procedimentos dolorosos. Neste estudo, galinhas foram imunizadas com antígenos solúveis de T. gondii da cepa RH. Foram extraídos, em média, 4 mg de IgY/ mL de gema de ovo. Detectaram-se anticorpos IgY anti-STAg de alta avidez após o segundo booster, também reconheceram alvos antigênicos de distintos pesos moleculares. Os anticorpos IgY anti-STAg detectaram o parasito intracelular em cultivos de células HeLa e também em cortes histológicos de tecido fixado. Diferente dos anticorpos IgG de camundongos, nos ensaios Western blot 1D e 2D, os anticorpos IgY reconheceram proteínas antigênicas de pesos moleculares e pontos isoelétricos distintos, respectivamente. Em ensaio de proliferação do parasito, observou-se que a incubação dos taquizoítos de T. gondii com os anticorpos IgY específicos reduziu parcialmente o parasitismo intracelular. Concluiu-se que anticorpos IgY policlonais são ferramentas eficazes para estudos da biologia de T. gondii e podem auxiliar na pesquisa de alvos antigênicos para utilização em diagnóstico e produção de vacinas.
Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica.
Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.

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FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas
Diarrheal diseases account for the second leading cause of death in children underfive years of age, below only pneumonia, killing about 760,000 children per year. The enterotoxigenic E. coli (ETEC) lineage is considered to be one of the most frequent causative agents of childhood diarrhea and travelers' diarrhea in low and middle-income countries. Among the virulence factors secreted by ETEC, the exoprotein EtpA has been described as an important protein that interacts with the highly conserved regions of the bacterial flagellum. These interactions are critical for adhesion, colonization, and delivery of toxins to enterocytes by ETEC. A new detection tool for enterotoxigenic E. coli bacteria was developed in the present work. Initially, the best antigenic sequence of the chimeric EtpA protein was determined by in silico prediction assays. After the construction of the recombinant antigen, we evaluated the production of anti-EtpA polyclonal antibodies in mice that were stimulated with this antigen. The mapping of epitopes using synthetic peptides demonstrated that only the 1.1 peptide was reactive to the pool of sera from the immunized animals. Specific recognition of anti-EtpA antibodies were assessed by flow cytometry. The results showed that the developed antibody was able to recognize the native EtpA protein. The evaluation of the specificity of anti-EtpA antibodies against different strains of diarrheogenic E. coli demonstrated the highest percentage and specificity for the ETEC strain (7.2%). The antibodies were then coupled into magnetic beads for the capture and detection of ETEC isolates. The results by cytometry showed high sensitivity, specificity and the efficacy of the method of separation and detection of these pathogens by magnetic beads bound to anti-EtpA antibodies.
As doenças diarreicas totalizam a segunda principal causa de morte em crianças menores de cinco anos de idade, perdendo apenas para a pneumonia. A cada ano a diarreia mata cerca de 760.000 crianças nessa faixa etária. A linhagem de E. coli enterotoxigênica (ETEC) é considerada como um dos agentes causadores mais frequentes da diarreia infantil e da diarreia dos viajantes nos países de baixa e média renda. Dentre os fatores de virulência secretados por ETEC, a exoproteína EtpA foi descrita como uma importante proteína que se interage com as regiões altamente conservadas do flagelo bacteriano. Essas interações são críticas para a adesão, colonização e entrega das toxinas nos enterócitos por ETEC. Foi desenvolvido no presente trabalho uma nova ferramenta de detecção para a bactéria E. coli enterotoxigênica. Inicialmente foi determinado a melhor sequência antigênica da proteína quimérica EtpA por ensaios de predição in silico. Após a construção do antígeno recombinante, avaliamos a produção de anticorpos policlonais anti-EtpA em camundongos que foram estimulados com esse antígeno. O mapeamento de epítopos utilizando peptídeos sintéticos demonstrou que apenas o peptídeo 1.1 foi reativo ao pool de soros dos animais imunizados. O reconhecimento específico dos anticorpos anti-EtpA foram avaliados por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que o anticorpo desenvolvido foi capaz de reconhecer a proteína EtpA nativa. A avaliação da especificidade dos anticorpos anti-EtpA contra diferentes cepas de E. coli diarreiogênicas demonstrou a maior porcentagem e especificidade para um isolado de ETEC (7.2%). Em seguida, os anticorpos foram acoplados em beads magnéticas para a captura e detecção de isolados de ETEC. Os resultados por citometria evidenciaram alta sensibilidade, especificidade e a eficácia do método de separação e detecção desses patógenos por beads magnéticas ligadas aos anticorpos anti-EtpA.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-10Bitstream added on 2014-06-13T20:58:04Z : No. of bitstreams: 1 barducci_rs_me_botfmvz.pdf: 600216 bytes, checksum: 02c04105eb253adb7140f91a569e399f (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Esse estudo foi realizado para avaliar o efeito do preparado de anticorpos policlonais (PAP) e/ou da monensina sódica (MON) sobre o desempenho, características e perfil de ácidos graxos da carcaça em bovinos Brangus Jovens confinados. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 2 com medidas repetidas no tempo, sendo os fatores a inclusão ou não de MON e de PAP, avaliados em dois períodos (crescimento e terminação), totalizando 24 baias, sendo 6 repetições (baia) por tratamento (3 animais/baia), com 72 Brangus machos não castrados (285.9 ± 38.7 kg). As dietas dos tratamentos foram diferentes apenas no tocante aos aditivos utilizados: controle (sem aditivo), MON, PAP ou MON + PAP (MIX). Não foi observado efeito (P>0,05) da inclusão do PAP (+) em relação a não inclusão do PAP (-) para nenhuma das variáveis do desempenho. Também não foi encontrada interação (P>0,05) entre os aditivos, nem como para aditivos e período para as variáveis de desempenho. No entanto, foi observado efeito (P < 0,05) da inclusão de MON (+) em relação a não inclusão de MON (-) para as variáveis ganho de peso diário (GPD), ganho de peso total (GP), peso vivo final (PVF), conversão alimentar (CA), eficiência alimentar (EA), custo para ganhar um kilo de peso vivo (CKPV) e peso de carcaça quente (PCQ), em que os animais que receberam MON (+) tiveram maior (P< 0,05) GPD, GP, PVF e melhor (P< 0,05) CA, EA e CKPV que aqueles que não receberam MON (-). Para as variáveis de ultrassom e perfil de ácidos graxos não foram observados efeitos principais (P > 0,05) dos aditivos. Contudo, foi observada interação (P < 0,05) entre MON e período para a variável área de olho de lombo final, embora não tenha sido constatada diferença estatística (P>0,05) entre animais que receberam ou não MON dentro de cada período...
This study, conducted at the São Paulo State University feedlot, Botucatu Campus, Brazil, was designed to test the effects of polyclonal antibody preparation (PAP) against rumen bacteria and/or monensin (MON) on feedlot performance, carcass characteristics and fatty acid profile of Brangus bullocks. Seventy-two 9-mo-old bullocks (285.9 ± 38.7 kg) were assigned to 24 pens (3 bullocks/pen) and used in a completely randomized design with 2 x 2 factorial arrangement of treatments, where the factors were inclusion or not of PAP or MON, measured over two phases, growing and finishing, replicated 6 times. The diets treatments were different only about feed additives used: control (no additive), MON, PAP or MON + PAP (MIX). No significant (P > 0.05) PAP main effect, interactions between feed additives or between feed additives and phase were observed for any performance variables. However, significant (P>0.05) MON main effect were observed for average daily gain (ADG), total gain (TG), final body weigh (FBW), hot carcass weight (HCW), feed:gain ratio (G:F) and cost to gain one kilo of BW (CKBW), animals fed MON had higher (P<0,05) ADG, TG, FBW and better (P<0.05) G:F and CKBW than animals not fed MON. For ultrasound and fatty acid profile (FAP) variables, no significant (P>0.05) feed additives main effect were observed. However, significant (P>0.05) interactions between MON and phase were observed for final rib eye area variable, though, no significancy (P>0.05) between animals fed MON or not inside each phase were observed. For FAP, significant (P>0.05) interactions were observed between feed additives for the variables linoleic acid, polyunsaturated fatty acid (PUFA), polyunsaturated fatty acid per saturated fatty acid (PUFA/AGS) and polyunsaturated fatty acid per monounsaturated fatty acid (PUFA/MUFA). However, no significant (P>0.05) means effects among treatments were observed... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Mario de Beni Arrigoni
Banca: Paulo Roberto Leme
Banca: Paulo Henrique Mazza Rodrigues
Resumo: Esse estudo foi realizado para avaliar o efeito do preparado de anticorpos policlonais (PAP) e/ou da monensina sódica (MON) sobre o desempenho, características e perfil de ácidos graxos da carcaça em bovinos Brangus Jovens confinados. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 2 com medidas repetidas no tempo, sendo os fatores a inclusão ou não de MON e de PAP, avaliados em dois períodos (crescimento e terminação), totalizando 24 baias, sendo 6 repetições (baia) por tratamento (3 animais/baia), com 72 Brangus machos não castrados (285.9 ± 38.7 kg). As dietas dos tratamentos foram diferentes apenas no tocante aos aditivos utilizados: controle (sem aditivo), MON, PAP ou MON + PAP (MIX). Não foi observado efeito (P>0,05) da inclusão do PAP (+) em relação a não inclusão do PAP (-) para nenhuma das variáveis do desempenho. Também não foi encontrada interação (P>0,05) entre os aditivos, nem como para aditivos e período para as variáveis de desempenho. No entanto, foi observado efeito (P < 0,05) da inclusão de MON (+) em relação a não inclusão de MON (-) para as variáveis ganho de peso diário (GPD), ganho de peso total (GP), peso vivo final (PVF), conversão alimentar (CA), eficiência alimentar (EA), custo para ganhar um kilo de peso vivo (CKPV) e peso de carcaça quente (PCQ), em que os animais que receberam MON (+) tiveram maior (P< 0,05) GPD, GP, PVF e melhor (P< 0,05) CA, EA e CKPV que aqueles que não receberam MON (-). Para as variáveis de ultrassom e perfil de ácidos graxos não foram observados efeitos principais (P > 0,05) dos aditivos. Contudo, foi observada interação (P < 0,05) entre MON e período para a variável área de olho de lombo final, embora não tenha sido constatada diferença estatística (P>0,05) entre animais que receberam ou não MON dentro de cada período... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: This study, conducted at the São Paulo State University feedlot, Botucatu Campus, Brazil, was designed to test the effects of polyclonal antibody preparation (PAP) against rumen bacteria and/or monensin (MON) on feedlot performance, carcass characteristics and fatty acid profile of Brangus bullocks. Seventy-two 9-mo-old bullocks (285.9 ± 38.7 kg) were assigned to 24 pens (3 bullocks/pen) and used in a completely randomized design with 2 x 2 factorial arrangement of treatments, where the factors were inclusion or not of PAP or MON, measured over two phases, growing and finishing, replicated 6 times. The diets treatments were different only about feed additives used: control (no additive), MON, PAP or MON + PAP (MIX). No significant (P > 0.05) PAP main effect, interactions between feed additives or between feed additives and phase were observed for any performance variables. However, significant (P>0.05) MON main effect were observed for average daily gain (ADG), total gain (TG), final body weigh (FBW), hot carcass weight (HCW), feed:gain ratio (G:F) and cost to gain one kilo of BW (CKBW), animals fed MON had higher (P<0,05) ADG, TG, FBW and better (P<0.05) G:F and CKBW than animals not fed MON. For ultrasound and fatty acid profile (FAP) variables, no significant (P>0.05) feed additives main effect were observed. However, significant (P>0.05) interactions between MON and phase were observed for final rib eye area variable, though, no significancy (P>0.05) between animals fed MON or not inside each phase were observed. For FAP, significant (P>0.05) interactions were observed between feed additives for the variables linoleic acid, polyunsaturated fatty acid (PUFA), polyunsaturated fatty acid per saturated fatty acid (PUFA/AGS) and polyunsaturated fatty acid per monounsaturated fatty acid (PUFA/MUFA). However, no significant (P>0.05) means effects among treatments were observed... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Sanidade e qualidade são requisitos do presente e futuro da produção mundial de alimentos. Perdas de grãos são comuns devido a problemas de produção e condições ambientais, doenças, pragas e procedimentos incorretos na pré e pós-colheita. Contaminantes, resíduos de pesticidas e micotoxinas podem causar problemas de saúde ao homem advindos do consumo de produtos de trigo. Assim, este trabalho teve o objetivo de desenvolver um programa integrado de gestão, para preservação da identidade/ qualidade tecnológica e garantir a inocuidade do trigo, da produção até a armazenagem. Foi realizado na Integrada Cooperativa Agroindustrial, Unidade Regional do Município de Assai-PR, durante a safra de 2005. Para tanto, as Boas Práticas Agrícolas (BPA), Boas Práticas de Armazenagem (BPAr) e Manejo Integrado de Pragas em Grãos Armazenados (MIPgrãos), já empregadas pela Cooperativa, foram revistos e monitorados e foi implementado o programa de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC). A metodologia do APPCC foi desenvolvida após um diagnóstico dos processos de cultivo, colheita, transporte, secagem e armazenagem. Foram feitas análises de contaminantes (pragas e micotoxinas) em grãos coletados periodicamente, na recepção e durante a estocagem. Para verificação da qualidade tecnológica realizaram-se análises reológicas, de glúten e de cor em farinhas obtidas dos grãos. Foi detectado um Ponto Crítico de Controle (PCC), na etapa de recepção dos grãos, referente ao perigo de micotoxinas e também de avaliação tecnológica. Os resultados das análises realizadas foram um indicativo de que o sistema, APPCC e segregação de grãos com suspeita de dano tecnológico causado pela chuva foram adequados para garantir a inocuidade e preservar a identidade do trigo produzido.
Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacillus (A. actinomycetemcomitans) is the major pathogen in human periodontitis. The routine method of A. actinomycetemcomitans isolation for diagnosis, accompanied by therapy and of periodontitis treatment monitoring used to control reinfection, requires several days of anaerobic culture. The objectives of the present work were to produce monoclonal and polyclonal antibodies, standardize a methodology for the dosage level of A. actinomycetemcomitans leukotoxin and determine the levels of soluble leukotoxin in clinical isolates. Monoclonal antibodies were obtained by fusing the splenic cells of immune BALB/C mice with P3U1 cells and polyclonal antibodies for rabbit immunization; both species were immunized with a leukotoxin fraction partially purified by chromatographic processes. After standardization of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA capture technique), samples of culture supernatants from clinical isolates of patients presenting aggressive periodontitis (AP) and necrotizing ulcerative periodontitis/AIDS (NUP/AIDS) were analyzed. The results obtained demonstrated recognition of the same fractions by polyclonal and monoclonal antibodies and the results of ELISA capture standardization demonstrated the possibility of determining leukotoxin dosages at concentrations between 25 and 100mg/ml. Analysis of the clinical isolate concentrations for ELISA capture at OD 492nm demonstrated higher levels of leukotoxin in isolated culture supernatants from the AP group (0.190375 ± 0.0574) in relation to the NUP/AIDS group (0.110455 ± 0.0430), (p<0,05). In conclusion, the results obtained showed that it is possible to determine the leukotoxin dosage for use with monoclonal and polyclonal antibodies and that A. actinomycetemcomitans isolated from patients presenting AP liberates greater quantities of leukotoxin in culture supernatants than NUP/AIDS patients. This work is pioneering regarding leukotoxin dosage for ELISA and could contribute to future epidemiological studies concerning leukotoxin production in A. actinomycetemcomitans. Moreover, after further study, this method could be important as a fast alternative diagnostic tool and for treatment monitoring.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa.
GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-07Bitstream added on 2014-06-13T21:06:29Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_e_dr_botfmvz.pdf: 757118 bytes, checksum: 8b4ac338061cf6ba7fd00cd910adc25d (MD5)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da alimentação de bovinos da raça Nelore com dietas de alto concentrado com preparado anticorpo policlonal (PAP), leveduras vivas - Saccharomyces cerevisae (LEV), monensina sódica (MON), associação entre PAP e LEV (MIX) e sem aditivos - controle (CTL) no desempenho, características de carcaça e custo do quilograma de peso vivo ganho em confinamento. Foram utilizados 95 bovinos Nelore, não castrados, com 20 meses de idade, oriundos de recria a pasto, terminados em confinamento por 112 dias com dietas de alto concentrado iso-protéicas e iso-energéticas. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON sobre ingestão de matéria seca durante o período de confinamento, porém a MON exerceu efeito (P<0,05) reduzindo a ingestão de matéria seca em percentagem do peso vivo nos primeiros 28 dias de confinamento em relação aos demais aditivos alimentares. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON em relação ao ganho de peso médio diário ao longo do confinamento, mais houve efeito negativo (P<0,05) do aditivo LEV, que diminuiu o ganho de peso dos animais ao longo do período de confinamento, consequentemente apresentou uma pior (P>0,05) conversão alimentar e um maior (P>0,05) custo para o quilo ganho em confinamento. O fornecimento de leveduras vivas também propiciou menor (P<0,05) peso de carcaça quente e peso de carcaça em arrobas. Os animais que receberam os aditivos alimentares PAP e LEV apresentaram (P<0,05) menor quantidade de gordura visceral na carcaça em relação aos animais que receberam MON. A utilização de PAP e LEV não alteram (P>0,05) as medidas de área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e espessura de gordura subcutânea do músculo Biceps femoris (EGG) em relação à MON e CTL
The objective of this study was to evaluate the effects of feeding Nellore bullocks with high concentrate diets containing: polyclonal antibody preparation (PAP), live yeast - Saccharomyces cerevisae (LEV), sodic monensin (MON), the association of PAP e LEV (MIX) and a control group on performance, carcass traits, and cost of gain. The diets were iso-energetic and iso-proteic and the feeding period was 112 days. There was no effect (P>0.05) of feeding ionophores on dry matter intake during total feeding period, however MON reduced (P<0.05) dry matter intake as body weight percentage in the first 28 days, compared to the others feed additives. There was no effect (P>0.05) of feeding MON in averaged daily gain, but on the other hand, there was found a negative effect (P<0.05) of feeding LEV, which decreased averaged daily gain, increased feed conversion and cost of gain. The addition of LEV in the diets also decreased (P<0.05) hot carcass weight. Animals that received PAP and LEV presented (P<0.05) less visceral fat than MON. The inclusion of PAP and LEV did not altered (P>0.05) ultrasound measurements compared to MON and CTL

Orientador: Mário de Beni Arrigoni
Banca: André Mendes Jorge
Banca: Rafael da Costa Cervieri
Banca: Cristiana Andrighetto
Banca: Alexandre Amstalden Moraes Sampaio
Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da alimentação de bovinos da raça Nelore com dietas de alto concentrado com preparado anticorpo policlonal (PAP), leveduras vivas - Saccharomyces cerevisae (LEV), monensina sódica (MON), associação entre PAP e LEV (MIX) e sem aditivos - controle (CTL) no desempenho, características de carcaça e custo do quilograma de peso vivo ganho em confinamento. Foram utilizados 95 bovinos Nelore, não castrados, com 20 meses de idade, oriundos de recria a pasto, terminados em confinamento por 112 dias com dietas de alto concentrado iso-protéicas e iso-energéticas. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON sobre ingestão de matéria seca durante o período de confinamento, porém a MON exerceu efeito (P<0,05) reduzindo a ingestão de matéria seca em percentagem do peso vivo nos primeiros 28 dias de confinamento em relação aos demais aditivos alimentares. Não houve efeito (P>0,05) do ionóforo MON em relação ao ganho de peso médio diário ao longo do confinamento, mais houve efeito negativo (P<0,05) do aditivo LEV, que diminuiu o ganho de peso dos animais ao longo do período de confinamento, consequentemente apresentou uma pior (P>0,05) conversão alimentar e um maior (P>0,05) custo para o quilo ganho em confinamento. O fornecimento de leveduras vivas também propiciou menor (P<0,05) peso de carcaça quente e peso de carcaça em arrobas. Os animais que receberam os aditivos alimentares PAP e LEV apresentaram (P<0,05) menor quantidade de gordura visceral na carcaça em relação aos animais que receberam MON. A utilização de PAP e LEV não alteram (P>0,05) as medidas de área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e espessura de gordura subcutânea do músculo Biceps femoris (EGG) em relação à MON e CTL
Abstract: The objective of this study was to evaluate the effects of feeding Nellore bullocks with high concentrate diets containing: polyclonal antibody preparation (PAP), live yeast - Saccharomyces cerevisae (LEV), sodic monensin (MON), the association of PAP e LEV (MIX) and a control group on performance, carcass traits, and cost of gain. The diets were iso-energetic and iso-proteic and the feeding period was 112 days. There was no effect (P>0.05) of feeding ionophores on dry matter intake during total feeding period, however MON reduced (P<0.05) dry matter intake as body weight percentage in the first 28 days, compared to the others feed additives. There was no effect (P>0.05) of feeding MON in averaged daily gain, but on the other hand, there was found a negative effect (P<0.05) of feeding LEV, which decreased averaged daily gain, increased feed conversion and cost of gain. The addition of LEV in the diets also decreased (P<0.05) hot carcass weight. Animals that received PAP and LEV presented (P<0.05) less visceral fat than MON. The inclusion of PAP and LEV did not altered (P>0.05) ultrasound measurements compared to MON and CTL
Doutor

The major goal of this thesis is the immunochemical study of the scorpion toxins. Four manuscripts were presented concerning this subject. In the first report, a detoxified immunogen was prepared by conjugation of a toxic fraction (TstFG50), of the T. serrulatus venom, with bovine serum alburnin (BSA). The immunogen was inject in mice for inducing antibodies. In vivo protection assays showed that immunized mices resist to the challenge with a dose of twice LD50 of the TstFG50. We used the Spot method to characterize epitopes of protective antibodies. It is likely that these epitopes correspond to the neutralizing epitopes. Usually, they correspond to regions of the toxins that are known to be involved in the toxin active sites. In the second manuscript, monoclonal antibodies (mAbs) against Tityus serrulatus venom were produced and characterized. The capacity of mAbs to neutralize the TstFG50 was determined by in vitro neutralization assays. Only mAbTsl neutralized 50% of the toxic effects produced by scorpion venom and showed 35% inhibition of the binding of 125I-TsVII. To map the epitope recognized by the protective mAbTsl, the Spot method was used. The neutralizing properties of mAbTs1 might be explained by spatial vicinity of epitope residues with pharmacophore residues. In the following paper, the Spot method was used to characterize the binding of the peptides of the Tsll, TslV and TsVIl with horse anti-Ts antisera for therapeutic use. Ali antisera tested showed reactivity with several peptides from ali three toxins. The reactive peptides were synthesized, coupled to KLH and used as antigens to coat the microtitration by ELISA. The mixture of the N-terminal peptides of Tsll, and TsVIl and of the C-terminal of TslV were found to give a linear relationship with the neutralizing triter of horse's serum of low neutralizing potency. However, high neutralizing antivenoms did not show the expected response in peptide ELISA. This observation is discussed in the context of the occurrence of continuous and discontinuous epitopes at the toxins. Finally, in the last paper we conducted an immunochemical study of the anatoxin Amm VIII. This protein was previously isolated from the venom of the scorpion Androctonus mauretanicus mauretanicus. Despite 87% identity with AaH II, potent a -toxin, Amm VIII is not toxic to mice. However, antisera against this protein protect mice from AaH II lethal action. Here, we report that the Amm VIII protein elicits only antibodies that recognize discontinuous-type epitopes. Anti-Amm VIII antibodies were also found to cross-react towards several of the discontinuous-continuous peptides designed from the AaH II structure, pointing to a possible involvement of the corresponding discontinuous epitopes in the in vitro AaH II neutralizing capacity displayed by anti-Amm VIII antibodies. Altogether, our results show that it is possible to design antibody-reactive peptides from discontinuous parts of scorpion toxins. The position of the reactive segments in the structural context of scorpion toxins highlights the antigenic properties of the Amm VIII anatoxin and reasonably explains the capacity of anti-Amm VIII antibodies to neutralize the potent a scorpion toxin AaH II.
Esta tese trata de um estudo imunoquímico das toxinas ecorpiônicas. Quatro artigos foram apresentados dentro desse tema. No primeiro, um imunógeno detoxificado foi preparado. Para isso, a fração tóxica do veneno de Tityus serrulatus (TstFG50) foi conjugada a albumina bovina (BSA) com gluteraldeído e injetados em camundongos, para obtenção de anticorpos. Ensaios de proteção In vivo mostraram que os camundongos vacinados resistiram ao desafio de duas DL.50 da TstFG50. Nós usamos o método de SPOT para caracterizar os epitopos dos anticorpos protetores. Acredita-se os epitopos encontrados correspondam a regiões das toxinas que são conhecidas por estarem envolvidas com o sítio ativo. No secundo artigo, anticorpos monoclonais (mAbs) contra o veneno de Tityus serrulatus foram produzidos e caracterizados. A capacidade neutralizante dos anticorpos frente a TstFG50 foi determinada em ensaios de neutralização in vitro. O mAbTsl foi capaz de neutralizer 50% dos efeitos tóxicos produzidos pelo veneno do escorpião e mostrou uma inibição de 35% da ligação de TsVIl- l125 a sinaptossomas. Para mapear os epitopos reconhecidos pelo mAbTsl, nós usamos o método de SPOT. As propriedades neutralizantes do mAbTsl poderiam ser explicadas pela localização espacial do epitopo reconhecido, que apresenta resíduos próximos aos resíduos que compõe o farmacoporo das toxinas. Num outro artigo, a técnica de SPOT foi utilizada para caracterizar a ligação dos peptídeos da Tsll, TslV eTsVIl com os soros de cavalo anti-Ts de uso terapêutico. Todos anti-soros testados mostraram reatividade com os peptídeos das três toxinas. Os peptídeos reativos foram sintetizados, acoplados a KLH e usados como antígenos em microplacas de ELISA. A mistura dos peptídeos indicou uma relação linear entre título e potencial neutralizante para os soros de baixa potência. No entanto, o mesmo não foi visto para os soros de alta potência. Esta observação é discutida no contexto de que as toxinas apresentem epitopos contínuos e descontínuos. No ultimo trabalho foi feito um estudo imunoquímico de uma proteína atóxica, a Amm VIII. Esta proteína foi previamente isolada do veneno do escorpião Androctonus mauretanicus mauretanicus. Ela apresenta 87% de identidade com a AaH II, uma potente a- toxina, e mesmo assim não é tóxica para camundongos. No entanto, anticorpos contra essa toxina foram capazes de proteger camundongos do efeito letal da AaH II. Aqui, nós mostramos que Amm VIII induz anticorpos que reconhecem somente epitopos do tipo descontínuos. Análises da localização 3D dos segmentos peptídicos descontínuos-contínuos antigenicamente ativos destaca propriedades antigênicas da anatoxina Amm VIII e explica de maneira razoável a capacidade dos anticorpos anti-AmmVIII neutralizarem uma potente a-toxina, a AaH II.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-18Bitstream added on 2014-06-13T19:35:47Z : No. of bitstreams: 1 pacheco_rdl_me_botfmvz.pdf: 741471 bytes, checksum: 835d6c59d074a8b55c1a6e52dd8cf20b (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
O presente estudo teve por objetivo avaliar os possíveis impactos causados pela suplementação de anticorpos policlonais Y contra Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum e algumas cepas de bacterias proteolíticas, ou monensina sódica na carcaça e qualidade de carne de bovinos jovens. Foram usados 72 animais, sendo 24 nelores puros, NE, 24 canchins (3/8 Nelore e 5/8 Charolês, CC) e 24 Tri-cross (½ sangue Brangus, ¼ Nelore e ¼ Angus, TC), desmamados com sete meses de idade. Os animais foram alimentados com dieta de alta proporção de concentrado duas vezes ao dia, no período da manhã e tarde e monitorados a cada 28 dias com ultra-som em tempo real. Não houve interação (P>0,05) aditivo x grupo genético. NE apresentaram menor (P<0,05) peso inicial, final, área de olho de lombo e quantidade de ácidos graxos saturados e maior CLA (P<0,01) quando comparados aos outros grupos genéticos. CC apresentou maior (P<0,05) área de olho de lombo e menor (P<0,05) espessura de gordura subcutânea, comparando TC e NE. TC obteve menor (P<0,05) rendimento de carcaça e força de cisalhamento. O grupo suplementado com anticorpos obteve menor rendimento de carcaça, enquanto não houve efeito de aditivo para os demais parâmetros avaliados. O uso de anticorpos não afetou negativamente os parâmetros estudados neste trabalho, salvo o rendimento de carcaça.
The objective of this study was to evaluate effects of feed additive (300 mg monensin/hd, MO, vs 10 mL/hd of a polyclonal antibody preparation against lactateproducing bacteria, PAP ) or biotype (Nellore, NE, Canchim cross, 5/8 Charolais, 3/8 Nellore, CC, or a 3-way cross, ½ Brangus, ¼ Nellore and ¼ Angus, TC) on ultrasound (US)-assessed measures of fat and ribeye area, carcass characteristics, and longissimus dorsi tenderness (shear force, SF, and myofibrillar fragmentation index, MFI) of bullocks fed high-concentrate diets. 72 bullocks were allocated in a 2 X 3 factorial arrangement replicated thrice (4 bullocks/pen) of feed additive (FA) and biotype (GG), and monitored monthly for a 107-d (CC and TC) or 147-d (NE) feeding period. Analyses of variance included the initial measurement covariate when appropriate (P < 0.05). Final (BW) and hot carcass weight (HCW) were unaffected (P < 0.05) by FA, but were lower (P < 0.05) for NE than CC and TC. Dressing percentage (DP) was lower (P < 0.05) for TC than NE and CC bullocks. Monensin had greater (P < 0.05) DP than PAP. There was no effect (P > 0.05) of FA on monthly measurements of fat depth (BFT), rump fat (P8), visceral fat (VF), ribeye area (REA), or SF and MFI. Bullocks of CC biotype were leaner (P < 0.05; less BFT and P8) than those of TC and NE biotypes. Bullocks of NE biotype had smaller (P < 0.05) REA than those of CC and TC biotypes. Steaks of TC biotype had lower (P < 0.05) SF values than those of the other biotypes. There were no differences (P > 0.05) in MFI or VF due to biotypes. NE presented greater (P<0,01) concentrations of unsaturated fatty acids and CLA. Other than effects of PAP on DP, PAP did not affect carcass fat, REA or tenderness.

Orientador: Mário De Beni Arrigoni
Banca: Telma Terezinha Berchielli
Banca: Mário Sartori Bueno
Banca: Rafael da Costa Cervieri
Banca: José Roberto Sartori
Resumo: O objetivo deste estudo foi estudar os efeitos da suplementação do preparado de anticorpos policlonais (PAP) ou monensina sódica (MON) sobre o desempenho, características de carcaça, perfil metabólico sanguíneo, flutuação da ingestão de matéria seca (IMS) e incidências de rumenites e abscessos de fígado. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 × 2, com seis repetições por tratamento, nos quais 48 bovinos machos inteiros de cada grupo genético (GG) avaliado [Brangus (BR) ou Nelore (NE)] foram alimentados com dietas contendo MON ou PAP fornecidos diariamente nas doses de 30 e 300 mg/kg de MS, respectivamente. Os animais passaram por três fases durante o estudo: adaptação (ADAP), crescimento, e terminação. As dietas fornecidas nestes períodos continham 55, 70 e 85% de concentrado, respectivamente. Não foi observado (P > 0,05) efeito principal dos aditivos alimentares (AA) sobre a maioria das características de desempenho, com exceção à IMS em quilos e em porcentagem do peso vivo, onde bovinos recebendo MON apresentaram (P < 0,05) menores IMS. Foi observado (P < 0,01) efeito principal dos AA e dos GG sobre as concentrações de bicarbonato, total de CO2 e excesso de base no fluído extra-celular, onde bovinos recebendo PAP, e aqueles da raça BR, apresentaram maiores concentrações desses metabólitos no sangue. Animais que receberam PAP e aqueles da raça BR, apresentaram maiores (P < 0,01) valores de pH na fase de ADAP que animais suplementados com MON (7,427 vs. 7,400) e animais NE, respectivamente. Bovinos BR apresentaram (P < 0,01) maior ganho de peso diário que bovinos NE em ambas as fases, contudo conversão alimentar similar (P > 0,05). Por outro lado, bovinos NE mostraram maior (P < 0,05) incidência de lesões ruminais. Assim sendo, a suplementação de PAP pode ser uma eventual alternativa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: This study, conducted at the São Paulo State University feedlot, Botucatu Campus, Brazil, was designed to test monensin (MON) and a polyclonal antibody preparation (PAP) against rumen bacteria on feedlot performance of Brangus (BR) and Nellore (NE) cattle. The experiment was designed as a 2 × 2 factorial arrangement using repeated measures over time, replicated 6 times (4 bullocks/pen), in which 48 8-mo-old bullocks of each of two breeds (BD) evaluated were fed diets containing either MON at 30 mg•kg-1 or PAP at 300mg•kg-1 of dry matter (DM). Measures over time were taken according to the phase and level of concentrate fed during the study: 55, 70 and 85%. Phases were named adaptation (AD), growing (GR), and final (FN), respectively. No significant (P > 0.05) feed additives (FA) main effect was observed for any of the feedlot performance variables, with the exception (P < 0.05) of DM intake expressed in kg (PAP= 7.60; MON=7.24) and in % of body weight (PAP= 2.11; MON=2.03). Feeding MON led to greater (P < 0.05) subcutaneous fat deposition throughout the study, and decreased (P < 0.05) the final rib eye area (RBA). As a result a reduced (P < 0.05) RBA deposition, mainly in GR phase, it was observed when feeding MON was compared to feeding PAP. A significant (P < 0.01) FA and BD main effects were found for bicarbonate, total CO2, and base excess in extracellular fluid, where bullocks receiving PAP, and those BR cattle, presented greater concentrations of these metabolites in the blood. Likewise, BR cattle and bullocks receiving PAP had (P < 0.01) higher blood pH in the AD phase than NE cattle and bullocks fed MON (7.427 vs. 7.400), respectively. BR had greater (P < 0.01) average daily gain in GR and FN phases, but similar (P > 0.05) feed conversion was observed. On the other hand, NE bullocks presented greater (P < 0.05) incidence of rumenites. Thus, feeding PAP may... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Pereira de Sousa.pdf: 2276123 bytes, checksum: a079176d073fb54e951e38fb4291c529 (MD5) Previous issue date: 2012-11-12
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Malaria is one of the most serious public health problems in the world, accounting for high morbidity and mortality. The diagnosis remains the most widely used microscopy, however this approach requires adequate infrastructure and highly skilled professionals for the exams, making it unfeasible in areas of difficult access. Tests for the rapid and simple diagnosis of malaria are commercially available, but none of national origin, complicating the deployment by the Unified Health System (SUS). Faced with this problem, this study has as main objective the production of Plasmodium vivax Lactate Dehydrogenase (pLDH), aiming at the development of polyclonal antibodies anti-LDH able to detect the native antigen in blood samples from patients infected with the intention of offering future perspectives for the development of a rapid diagnostic test for malaria. For this, pvLDH protein was produced by recombinant DNA technology in host cells chemically competent. Therefore, it was purified to inoculation into rabbits and mice Balb /c. The response of the inoculated animals as well as the performance of polyclonal antibodies anti-LDH in the recognition of native antigen were assessed by ELISA immunoassays and sandwich system, respectively. The animals showed good antibody titers anti-pLDH after the third inoculation of the recombinant protein pLDH, and the rabbit antibody response than the response of mice with absorbance values at dilution 1/100, 2,600 and 2,100, respectively. Polyclonal antibodies anti-pLDH were able to recognize the native protein pLDH 131 samples to 154 samples positive malaria and incapable of recognizing human isoforms of LDH when evaluated against malaria negative samples, since the 23 negative samples evaluated, all also remained negative during the tests. The proposal idealized in this study proved extremely viable and promising. The results of this study meet expectations and provided future prospects as regards the use of recombinant pvLDH for the development of polyclonal and monoclonal antibodies functional in murine model for use in rapid diagnostic test (RDT) for malaria in attempt to offer alternatives to diagnosis in Brazil, or for use in immunoassay targeting the monitoring of the disease course.
A malária é um dos mais sérios problemas de saúde pública do mundo, sendo responsável por elevada morbidade e mortalidade. O diagnóstico mais utilizado continua sendo a microscopia, contudo esta metodologia exige infraestrutura adequada e profissionais altamente qualificados para a realização dos exames, tornando-se inviável em áreas de difícil acesso. Testes para o diagnóstico rápido e simples de malária estão disponíveis no mercado, porém nenhum de origem nacional, dificultando a implantação pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Diante desta problemática, o presente estudo tem como principal objetivo a produção de Lactato Desidrogenase de Plasmodium vivax (pvLDH), visando o desenvolvimento de anticorpo os policlonais anti-LDH capazes de detectar o antígeno nativo em amostras sanguíneas de pacientes infectados com a pretensão de oferecer perspectivas para a elaboração de um teste diagnóstico rápido para a Malária. Para isto, a proteína pvLDH foi produzida pela tecnologia do DNA recombinante em células hospedeiras quimicamente competentes. Logo, a proteína foi purificada para a imunização de coelho e camundongos Balb/c. A resposta dos animais as inoculações assim como o desempenho dos anticorpos policlonais anti-LDH no reconhecimento do antígeno nativo foram avaliados por ensaios imunoenzimáticos ELISA indireto e em sistema sanduíche, respectivamente. Os animais demonstraram boa resposta de anticorpos anti-pvLDH após a terceira imunização de proteína recombinante, sendo a resposta de anticorpos do coelho superior a resposta dos camundongos, com valores de absorbância de até 2.600 e 2.100, respectivamente. Os anticorpos policlonais anti-pvLDH foram capazes de reconhecer a proteína LDH nativa em 131 amostras de 154 amostras positivas para malária e incapazes de reconhecer isoformas de LDH humana quando avaliados em relação a amostras negativas para malária, uma vez que das 24 amostras negativas avaliadas, todas se mantiveram também negativas nos ensaios. A proposta idealizada neste trabalho se mostrou extremamente viável e promissora. Os resultados obtidos neste estudo corresponderam às expectativas e forneceram perspectivas futuras no que diz respeito à utilização da pvLDH recombinante para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais funcionais, em modelo murino, para a utilização em teste diagnóstico rápido (TDR) para a malária, na tentativa de oferecer alternativas ao diagnóstico no Brasil, ou para a utilização em imunoensaio visando o monitoramento do curso da doença.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-19Bitstream added on 2014-06-13T19:03:46Z : No. of bitstreams: 1 millen_dd_dr_botfmvz.pdf: 1326502 bytes, checksum: 08bc5e39d90b72a1b5690395dfc8a16e (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
O objetivo deste estudo foi estudar os efeitos da suplementação do preparado de anticorpos policlonais (PAP) ou monensina sódica (MON) sobre o desempenho, características de carcaça, perfil metabólico sanguíneo, flutuação da ingestão de matéria seca (IMS) e incidências de rumenites e abscessos de fígado. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 × 2, com seis repetições por tratamento, nos quais 48 bovinos machos inteiros de cada grupo genético (GG) avaliado [Brangus (BR) ou Nelore (NE)] foram alimentados com dietas contendo MON ou PAP fornecidos diariamente nas doses de 30 e 300 mg/kg de MS, respectivamente. Os animais passaram por três fases durante o estudo: adaptação (ADAP), crescimento, e terminação. As dietas fornecidas nestes períodos continham 55, 70 e 85% de concentrado, respectivamente. Não foi observado (P > 0,05) efeito principal dos aditivos alimentares (AA) sobre a maioria das características de desempenho, com exceção à IMS em quilos e em porcentagem do peso vivo, onde bovinos recebendo MON apresentaram (P < 0,05) menores IMS. Foi observado (P < 0,01) efeito principal dos AA e dos GG sobre as concentrações de bicarbonato, total de CO2 e excesso de base no fluído extra-celular, onde bovinos recebendo PAP, e aqueles da raça BR, apresentaram maiores concentrações desses metabólitos no sangue. Animais que receberam PAP e aqueles da raça BR, apresentaram maiores (P < 0,01) valores de pH na fase de ADAP que animais suplementados com MON (7,427 vs. 7,400) e animais NE, respectivamente. Bovinos BR apresentaram (P < 0,01) maior ganho de peso diário que bovinos NE em ambas as fases, contudo conversão alimentar similar (P > 0,05). Por outro lado, bovinos NE mostraram maior (P < 0,05) incidência de lesões ruminais. Assim sendo, a suplementação de PAP pode ser uma eventual alternativa...
This study, conducted at the São Paulo State University feedlot, Botucatu Campus, Brazil, was designed to test monensin (MON) and a polyclonal antibody preparation (PAP) against rumen bacteria on feedlot performance of Brangus (BR) and Nellore (NE) cattle. The experiment was designed as a 2 × 2 factorial arrangement using repeated measures over time, replicated 6 times (4 bullocks/pen), in which 48 8-mo-old bullocks of each of two breeds (BD) evaluated were fed diets containing either MON at 30 mg•kg-1 or PAP at 300mg•kg-1 of dry matter (DM). Measures over time were taken according to the phase and level of concentrate fed during the study: 55, 70 and 85%. Phases were named adaptation (AD), growing (GR), and final (FN), respectively. No significant (P > 0.05) feed additives (FA) main effect was observed for any of the feedlot performance variables, with the exception (P < 0.05) of DM intake expressed in kg (PAP= 7.60; MON=7.24) and in % of body weight (PAP= 2.11; MON=2.03). Feeding MON led to greater (P < 0.05) subcutaneous fat deposition throughout the study, and decreased (P < 0.05) the final rib eye area (RBA). As a result a reduced (P < 0.05) RBA deposition, mainly in GR phase, it was observed when feeding MON was compared to feeding PAP. A significant (P < 0.01) FA and BD main effects were found for bicarbonate, total CO2, and base excess in extracellular fluid, where bullocks receiving PAP, and those BR cattle, presented greater concentrations of these metabolites in the blood. Likewise, BR cattle and bullocks receiving PAP had (P < 0.01) higher blood pH in the AD phase than NE cattle and bullocks fed MON (7.427 vs. 7.400), respectively. BR had greater (P < 0.01) average daily gain in GR and FN phases, but similar (P > 0.05) feed conversion was observed. On the other hand, NE bullocks presented greater (P < 0.05) incidence of rumenites. Thus, feeding PAP may... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Mário de Beni Arrigoni
Banca: Paulo Roberto Leme
Banca: Rafael da Costa Cervieri
Resumo: O presente estudo teve por objetivo avaliar os possíveis impactos causados pela suplementação de anticorpos policlonais Y contra Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum e algumas cepas de bacterias proteolíticas, ou monensina sódica na carcaça e qualidade de carne de bovinos jovens. Foram usados 72 animais, sendo 24 nelores puros, NE, 24 canchins (3/8 Nelore e 5/8 Charolês, CC) e 24 Tri-cross (½ sangue Brangus, ¼ Nelore e ¼ Angus, TC), desmamados com sete meses de idade. Os animais foram alimentados com dieta de alta proporção de concentrado duas vezes ao dia, no período da manhã e tarde e monitorados a cada 28 dias com ultra-som em tempo real. Não houve interação (P>0,05) aditivo x grupo genético. NE apresentaram menor (P<0,05) peso inicial, final, área de olho de lombo e quantidade de ácidos graxos saturados e maior CLA (P<0,01) quando comparados aos outros grupos genéticos. CC apresentou maior (P<0,05) área de olho de lombo e menor (P<0,05) espessura de gordura subcutânea, comparando TC e NE. TC obteve menor (P<0,05) rendimento de carcaça e força de cisalhamento. O grupo suplementado com anticorpos obteve menor rendimento de carcaça, enquanto não houve efeito de aditivo para os demais parâmetros avaliados. O uso de anticorpos não afetou negativamente os parâmetros estudados neste trabalho, salvo o rendimento de carcaça.
Abstract: The objective of this study was to evaluate effects of feed additive (300 mg monensin/hd, MO, vs 10 mL/hd of a polyclonal antibody preparation against lactateproducing bacteria, PAP ) or biotype (Nellore, NE, Canchim cross, 5/8 Charolais, 3/8 Nellore, CC, or a 3-way cross, ½ Brangus, ¼ Nellore and ¼ Angus, TC) on ultrasound (US)-assessed measures of fat and ribeye area, carcass characteristics, and longissimus dorsi tenderness (shear force, SF, and myofibrillar fragmentation index, MFI) of bullocks fed high-concentrate diets. 72 bullocks were allocated in a 2 X 3 factorial arrangement replicated thrice (4 bullocks/pen) of feed additive (FA) and biotype (GG), and monitored monthly for a 107-d (CC and TC) or 147-d (NE) feeding period. Analyses of variance included the initial measurement covariate when appropriate (P < 0.05). Final (BW) and hot carcass weight (HCW) were unaffected (P < 0.05) by FA, but were lower (P < 0.05) for NE than CC and TC. Dressing percentage (DP) was lower (P < 0.05) for TC than NE and CC bullocks. Monensin had greater (P < 0.05) DP than PAP. There was no effect (P > 0.05) of FA on monthly measurements of fat depth (BFT), rump fat (P8), visceral fat (VF), ribeye area (REA), or SF and MFI. Bullocks of CC biotype were leaner (P < 0.05; less BFT and P8) than those of TC and NE biotypes. Bullocks of NE biotype had smaller (P < 0.05) REA than those of CC and TC biotypes. Steaks of TC biotype had lower (P < 0.05) SF values than those of the other biotypes. There were no differences (P > 0.05) in MFI or VF due to biotypes. NE presented greater (P<0,01) concentrations of unsaturated fatty acids and CLA. Other than effects of PAP on DP, PAP did not affect carcass fat, REA or tenderness.
Mestre

Resumo: O presente ensaio de pesquisa objetivou avaliar o preparado de anticorpos policlonais contra as bactérias ruminais precursoras de distúrbios nutricionais (Streptococccus bovis, Lactobacillus ssp. e Fusobacterium necrophorum) na forma sólida, como aditivo alimentar preventivo à acidose ruminal em bovinos e substituto à monensina. Nove vacas canuladas no rúmen com 677±98 kg de peso vivo médio foram agrupadas em baias individuais através de delineamento inteiramente casualizado com dois períodos de 20 dias. Separaram-se os animais em três tratamentos: controle (CTL), preparado de anticorpos policlonais (PAP) e monensina sódica (MON). Nos primeiros cinco dias de cada período, os animais receberam apenas cana e úreia como alimento. Em seguida, foi fornecida a dieta desafio com aproximadamente 74% de concentrado por 15 dias, com o intuito de causar acidose ruminal. Houve um tempo de 15 dias entre cada período para a readaptação dos animais à dieta de volumoso. As variáveis experimentais foram: ingestão de matéria seca (em kg, IMKG; % do peso vivo, IMPV; e metabólico, IMPM, respectivamente), flutuação da ingestão de matéria seca (FIMS) dos dias subseqüentes ao desafio com a dieta de concentrado e os parâmetros de fermentação ruminal (pH do líquido ruminal, lactato ruminal, concentração de ácidos graxos de cadeia curta, nitrogênio amoniacal e lactato ruminal). Não houve efeito de tratamento (P > 0.05) tanto para a ingestão de matéria seca quanto para a flutuação da ingestão de matéria seca. Os animais tratados com monensina apresentaram pH mais alto (P < 0.0001) que os demais tratamentos (MON = 6.06 vs. PAP = 5.89 e CTL = 5.91), independente de tempo. A concentração ruminal de lactato permaneceu baixa (0.23 mM), mesmo após o desafio com concentrado. A concentração de N-amoniacal do CTL foi menor (P = 0.0039), comparado à MON e PAP... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: This study was designed to evaluate the potential of the dry form of a multivalent polyclonal antibody preparation against several nutritional disturbs precursors ruminal bacteria (Streptococccus bovis, Fusobacterium necrophorum and Lactobacillus ssp.), as acidosis preventative feed additive to high concentrate fed cattle and as an alternative to monensin. It was used nine cannulated cows (677±98 kg of BW) allocated in a completely randomized desing with two periods of 20 d. Animals were separated in three treatments: control (CTL), multivalent polyclonal antibody preparation (PAP) and monensin sodium (MON). During the first five days of each period, animals were fed all forage diet. Ruminal acidosis was induced by an abrupt diet switch to a 74% concentrate diet during 15 d. An interval of 15 d was considered as ruminal washout in the meantime of the two periods, when animals were refed all forage diet to restablish normal ruminal pH conditions and cellulolitic microbial population. Ruminal acidosis evaluation parameters were: dry matter intake (kg/d, % of BW and % of BW0,75; DMIK, DMIB and DMIM respectivelly), dry matter intake fluctuations (DMIF) during the subsequent days after concentrate challenge, ruminal fermentation (pH; SCFAs, lactate and NH3-N concentrations). There were no treatment main effects (P > 0.05) for DMIK, DMIB, DMIM or DMIF. Higher pH was measured (P < 0.0001) in MON, compared to the other two treatments (MON = 6.06 vs. PAP = 5.89 and CTL = 5.91). Ruminal lactate concentration remained low (0.23 mM) throughout the entire experimental period. Ruminal ammoniacal-N concentration of CTL was lower (P = 0.0039), compared to MON and PAP (14.74 and 13.64 vs. 11.20 mg/dl, for MON, PAP and CTL, respectivelly). Molar concentration of acetate was not affected (P = 0.3288) by treatments. However, an interaction day x treatment (P = 0.0079) for propionate molar concentration was... (Complete abstract click electronic access below)
Orientador: Mário de Beni Arrigoni
Coorientador: Paulo Henrique Mazza Rodrigues
Banca: Jane M. Ezequiel
Banca: Paulo Roberto Meirelles
Banca: Carolina T. Marino
Banca: Paulo Roberto Lemes
Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-13Bitstream added on 2014-06-13T20:44:24Z : No. of bitstreams: 1 pacheco_rdl_dr_botfmvz.pdf: 836072 bytes, checksum: c4d361ff1ec1e97c14ef8f5e7fb6adbd (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
O presente ensaio de pesquisa objetivou avaliar o preparado de anticorpos policlonais contra as bactérias ruminais precursoras de distúrbios nutricionais (Streptococccus bovis, Lactobacillus ssp. e Fusobacterium necrophorum) na forma sólida, como aditivo alimentar preventivo à acidose ruminal em bovinos e substituto à monensina. Nove vacas canuladas no rúmen com 677±98 kg de peso vivo médio foram agrupadas em baias individuais através de delineamento inteiramente casualizado com dois períodos de 20 dias. Separaram-se os animais em três tratamentos: controle (CTL), preparado de anticorpos policlonais (PAP) e monensina sódica (MON). Nos primeiros cinco dias de cada período, os animais receberam apenas cana e úreia como alimento. Em seguida, foi fornecida a dieta desafio com aproximadamente 74% de concentrado por 15 dias, com o intuito de causar acidose ruminal. Houve um tempo de 15 dias entre cada período para a readaptação dos animais à dieta de volumoso. As variáveis experimentais foram: ingestão de matéria seca (em kg, IMKG; % do peso vivo, IMPV; e metabólico, IMPM, respectivamente), flutuação da ingestão de matéria seca (FIMS) dos dias subseqüentes ao desafio com a dieta de concentrado e os parâmetros de fermentação ruminal (pH do líquido ruminal, lactato ruminal, concentração de ácidos graxos de cadeia curta, nitrogênio amoniacal e lactato ruminal). Não houve efeito de tratamento (P > 0.05) tanto para a ingestão de matéria seca quanto para a flutuação da ingestão de matéria seca. Os animais tratados com monensina apresentaram pH mais alto (P < 0.0001) que os demais tratamentos (MON = 6.06 vs. PAP = 5.89 e CTL = 5.91), independente de tempo. A concentração ruminal de lactato permaneceu baixa (0.23 mM), mesmo após o desafio com concentrado. A concentração de N-amoniacal do CTL foi menor (P = 0.0039), comparado à MON e PAP...
This study was designed to evaluate the potential of the dry form of a multivalent polyclonal antibody preparation against several nutritional disturbs precursors ruminal bacteria (Streptococccus bovis, Fusobacterium necrophorum and Lactobacillus ssp.), as acidosis preventative feed additive to high concentrate fed cattle and as an alternative to monensin. It was used nine cannulated cows (677±98 kg of BW) allocated in a completely randomized desing with two periods of 20 d. Animals were separated in three treatments: control (CTL), multivalent polyclonal antibody preparation (PAP) and monensin sodium (MON). During the first five days of each period, animals were fed all forage diet. Ruminal acidosis was induced by an abrupt diet switch to a 74% concentrate diet during 15 d. An interval of 15 d was considered as ruminal washout in the meantime of the two periods, when animals were refed all forage diet to restablish normal ruminal pH conditions and cellulolitic microbial population. Ruminal acidosis evaluation parameters were: dry matter intake (kg/d, % of BW and % of BW0,75; DMIK, DMIB and DMIM respectivelly), dry matter intake fluctuations (DMIF) during the subsequent days after concentrate challenge, ruminal fermentation (pH; SCFAs, lactate and NH3-N concentrations). There were no treatment main effects (P > 0.05) for DMIK, DMIB, DMIM or DMIF. Higher pH was measured (P < 0.0001) in MON, compared to the other two treatments (MON = 6.06 vs. PAP = 5.89 and CTL = 5.91). Ruminal lactate concentration remained low (0.23 mM) throughout the entire experimental period. Ruminal ammoniacal-N concentration of CTL was lower (P = 0.0039), compared to MON and PAP (14.74 and 13.64 vs. 11.20 mg/dl, for MON, PAP and CTL, respectivelly). Molar concentration of acetate was not affected (P = 0.3288) by treatments. However, an interaction day x treatment (P = 0.0079) for propionate molar concentration was... (Complete abstract click electronic access below)

O objetivo com o presente trabalho foi avaliar o efeito do preparado de anticorpos policlonais (PAP) contra bactérias ruminais específicas (Streptococcus bovis e Fusobacterium necrophorum) sobre o consumo de matéria seca, digestibilidade aparente total da dieta, parâmetros de fermentação ruminal e contagem ruminal de protozoários, em animais adaptados ou não a dietas com alta proporção de carboidratos fermentescíveis. Foram utilizadas 6 vacas fistuladas no rúmen em dois quadrados latinos 3x3, em arranjo fatorial de tratamentos 3x2 referentes a dois aditivos PAP pó (PAPP) e PAP líquido (PAPP), mais o grupo controle e 2 tipos de manejo de adaptação à dieta. O primeiro quadrado latino recebeu uma adaptação gradual à dieta: do D0 ao D4 100% forragem; D5 ao D9 30% de concentrado e do D10 ao D14 60% de concentrado. O segundo quadrado latino recebeu 100% de forragem do D0 ao D14. Nos dias D15 e D16, todos os animais receberam uma dieta com 80% de concentrado. Para as análises, amostras de líquido ruminal foram coletadas diariamente às 3 h após a alimentação matinal. Os dados foram analisados pelo procedimento MIXED do SAS com nível de significância de 0,05. A variável consumo de matéria seca apresentou efeito de interação entre tempo e adaptação à dieta com alta proporção de carboidratos prontamente fermentescíveis (P<0,0001), onde o grupo adaptado apresentou consumo mais elevado em relação aos não adaptados (12,4 vs 6,6, respectivamente) do D0 ao D17. Para a variável digestibilidade da MS foi observado efeito de adaptação (P<0,0001), sendo que nos animais adaptados, a digestibilidade da MS foi superior (65,9%) à dos não adaptados (55,3%). Foi também observado efeito de aditivo (P=0,0186), onde o tratamento com PAPL apresentou maior digestibilidade da MS (63,6%), quando comparados aos tratamentos PAPP e controle (58,4% e 59,6%, respectivamente). A digestibilidade da PB apresentou efeito de interação entre proporção de carboidratos na dieta e o tipo de adaptação (P<0,0001), onde os animais adaptados apresentaram maior digestibilidade da PB (83,2%) em comparação aos não adaptados (79,3%), ambos recebendo 100% de forragem. Quando os animais adaptados receberam 60% de concentrado na dieta, este grupo apresentou menor digestibilidade da PB (69,4%), quando comparado ao grupo de animais não adaptados (83,6%). Já para a variável digestibilidade da FDN, os animais adaptados apresentaram maior digestibilidade da FDN (40,6%) em relação aos não adaptados (36,3%) (P=0,0332). Quanto ao efeito de aditivo (P=0,0248), os animais tratados com o aditivo PAPL apresentaram maior digestibilidade da FDN (44,0%), quando comparados aos tratados com PAPP (36,2%) e o grupo controle (35,4%). Quanto à digestibilidade do amido, foi observada interação entre dieta e adaptação (P=0,05), onde, na segunda semana, o grupo dos adaptados apresentou maior digestibilidade (92,8%) quando comparado ao grupo dos não adaptados (73,9%). Para a digestibilidade de carboidratos totais, foi observado efeito de adaptação (P<0,0001) e de aditivo (P=0,0312), onde o grupo dos adaptados apresentou maior digestibilidade quando comparados aos não adaptados (66,4% vs. 55,5, respectivamente), e os animais tratados com PAPL, apresentaram maior digestibilidade (63,9%) de carboidratos totais, que os tratados com PAPP (59,0%) e controle (59,9%). Ocorreu interação entre tempo e adaptação para a variável pH (P <0,0001), sendo que o grupo adaptado apresentou menor pH (6,40) quando comparado ao grupo dos não adaptados (6,77) entre o D2 e o D16. Ainda, foi verificado efeito de aditivo sobre a variavel pH ruminal (P=0,0432), onde o grupo PAPL apresentou maiores valores (6,62) quando comparado ao grupo PAPP (6,57) e ao controle (6,56). Ocorreu interação entre tempo e adaptação (P<0,0001) para a concentração AGCCt, onde os animais adaptados apresentaram valores mais elevados que o grupo dos não adaptados (100,3 vs. 77,7, respectivamente). Para a variável relação acetato:propionato (Ac:Pr), houve efeito de interação entre tempo e adaptação (P<0,0001). No D2, 5, 6 e D7, o grupo dos animais adaptados apresentou menor relação Ac:Pr quando comparados aos animais não adaptados (2,29 vs. 1,96, respectivamente). Porém, nos dias 12 a 16, houve inversão desta relação e os animais adaptados passaram a apresentar maior relação Ac:Pr (2,87) quando comparados ao grupo dos não adaptados (2,41). Não foi observado efeito de adaptação (P>0,05) bem como aditivo (P>0,05) para a variável concentração de lactato no líquido ruminal. A concentração de N-NH3 apresentou interação entre tempo e adaptação (P=0,0003), onde o grupo dos adaptados apresentou maiores valores quando comparado ao dos não adaptados (24,68 vs 15,97 mg/dL, respectivamente) entre o D1 e D15. Quanto as populações de protozoários, observou-se interação entre tempo, adaptação e aditivo para as populações de Dasytricha sp (P=0,0305) e Entodinium sp (P=0,0398), sendo observada manutenção das populações de Dasytricha sp (P=0,0188) nos animais não adaptados e decréscimo nos animais adaptados. Conseqüentemente, para a população de Entodinium sp, foi observado aumento nos animais adaptados (80,78%) e manutenção nos não adaptados (45,3%). Nos animais tratados com PAPL, a população de Dasytricha sp foi superior (38,3%) quando comparados às populações dos tratados com PAPP (31,50%) e grupo controle (34,7%), sem diferença entre estes últimos dois grupos. Quanto a população de Entodinium sp, os animais tratados com PAPL apresentaram menor porcentagem deste gênero de protozoários (58,5%) quando comparados ao grupo controle (64,0%) e ao PAPP (66,7%). A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que o preparado de anticorpos policlonais tanto na apresentação líquida como em pó não alterou o consumo de matéria seca bem como a concentração AGCCt, proporção molar de acetato, propionato e butirato, assim como a concentração ruminal de lactato e N-NH3. O preparado de anticorpos policlonais na apresentação líquida melhorou a digestibilidade da MS, FDN e carboidratos totais. Quanto ao pH ruminal, o PAP na apresentação líquida, se mostrou mais eficiente, em evitar a sua redução, quando comparado ao preparado na apresentação em pó e que o grupo controle durante o pico de fermentação. A adaptação melhorou a digestibilidade da MS, PB, EE, FDN, FDA e carboidratos totais, assim como aumentou as concentrações de AGCCt, sem que ocorresse aumento nas concentrações de lactato.
The objective with the present work was to evaluate the polyclonal antibody preparation (PAP) against specific rumen bacteria (Streptococcus bovis and Fusobacterium necrophorum) on dry matter intake, total apparent digestibility of diet, ruminal fermentation patterns and ruminal protozoa counting on adapted and non-adapted animals to highly fermentable carbohydrates diets. Six ruminally cannulated cows were used in two Latin squares 3x3, in a factorial arrangement of treatments 3x2 regarding two feed additives (PAP in powder presentation (PAPP) and PAP in liquid presentation (PAPL)) plus control group (CON) and two managements of diets adaptation. The first Latin square received a step-up diet adaptation: from D0 to D4 100% forage; D5 to D9 30% of concentrates and D10 to D14 60% of concentrates. The second Latin square received 100% forage from D0 to D14. On D15 and D16, all animals received a diet with 80% of concentrates. For analysis, rumen fluid samples were daily collected 3h after morning meal. Data were analyzed by MIXED procedure with a significance level of 0.05. The variable dry matter intake presented interaction between time and adaptation to highly fermentable carbohydrate diets (P<0.0001), where the adapted group had greater DMI compared with non-adapted animals (12.4 vs. 6.6, respectively) from D0 to D17. For DM digestibility, it was observed effect of adaptation (P<0.0001), where the adapted group had greater values (65.9%) compared with the non-adapted group (55.3%). It was also observed effect of additive for this variable (P=0.0186), where the treatment PAPL had greater DM digestibility (63.6%) compared with treatments PAPP and control (58.4% and 59.6%, respectively). Crude protein digestibility had effect of interaction between carbohydrate proportion in diet and type of adaptation (P<0.0001), where the adapted animals had greater CP digestibility (83.2%) in relation to non-adapted animals (79.3%), both receiving 100% of forage. When the adapted animals received 60% of concentrates in diet, this group had lower CP digestibility (69.3%) compared with non adapted group (83.6%). For NDF digestibility, adapted animals had greater values (40.6%) in relation to non-adapted animals (36.3%) (P=0.0332). It was also observed an additive effect (P=0.0248), where the animals in PAPL group had greater NDF digestibility (44.0%) compared with PAPP (36.2%) and control (35.4%) groups. For starch digestibility, it was observed interaction between diet and adaptation (P=0.05), where, in the second week, the adapted group had greater digestibility (92.8%) compared with non-adapted group (73.9%). For total carbohydrates digestibility, it was observed effect of adaptation (P<0.0001) and additive (P=0.0312), where the adapted group had greater values compared with non-adapted animals (66.4% vs. 55.5, respectively), and the animals in PAPL group had greater total carbohydrates digestibility (63.9%) than PAPP (59.0%) and control (59.9%) groups. It was observed an interaction between time and adaptation for ruminal pH (P <0.0001), where the adapted group had lower pH (6.40) compared with non-adapted group (6.77) between D2 and D16. Moreover, it was verified additive effect for ruminal pH (P=0.0432), where PAPL group had higher values (6.62) compared with PAPP (6.57) and control (6.56) groups. It was observed an interaction between time and adaptation (P<0.0001) for total concentration of short chain fatty acids (SCFA), where the adapted animals had greater values than non-adapted animals (100.33 vs. 77.72, respectively). For acetate:propionate ratio (Ac:Pr), there was effect of interaction between time and adaptation (P<0.0001). At D2, 5, 6 and D7, the group of adapted animals had lower Ac:Pr ratio than non-adapted group (2,29 vs. 1,96, respectively). However, at D12 to D16, there was an inversion of this relation and the adapted animals had greater Ac:Pr ratio (2.87) when compared with non-adapted animals (2.41). It was not observed effect of adaptation (P>0.05) as well as effect of additive (P>0.05) for ruminal lactate concentration. The concentration of N-NH3 showed interaction between time and adaptation (P=0.0003), where the adapted group had greater values compared with non-adapted group (24.7 vs. 16.0 mg/dL, respectively) between D1 and D15. For rumen protozoa population, it was observed an interaction between time, adaptation and additive for Dasytricha sp (P=0.0305) and Entodinium sp (P=0.0398), where the number of Dasytricha sp (P=0.0188) population was maintained in non-adapted animals and decreased in adapted animals. Consequently, for Entodinium sp population, it was observed increase in its number in adapted animals (80.8%) and maintenance of its number in non-adapted animals (45.3%). In animals treated with PAPL, the population of Dasytricha sp was greater (38.3%) when compared with the animals treated with PAPP (31.5%) and control group (34.7%), without difference between these last two groups. For Entodinium sp population, the animals treated with PAPL had lower percentage of these protozoa (58.5%) when compared with control (64.0%) and PAPP (66.7%) groups. From these results, it was possible to conclude that polyclonal antibody preparation both in liquid or powder presentation did not alter dry matter intake, total concentration of SCFA, molar proportion of acetate, propionate and butyrate as well as ruminal concentration of lactate and NH3-N. Polyclonal antibody presentation in liquid presentation improved DM, NDF and total carbohydrates digestibility. For ruminal pH, PAP in liquid presentation was more efficient in preventing its reduction, when compared with PAP in powder presentation and control group during the peak of fermentation. Adaptation to highly fermentable carbohydrate diets improved DM, CP, EE, NDF, NDA and total carbohydrates digestibility even as increased total concentration of SCFA without increase in lactate concentration.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-12Bitstream added on 2014-06-13T19:15:02Z : No. of bitstreams: 1 sarti_lmn_me_botfmvz.pdf: 903641 bytes, checksum: 047f7d8f364a869975bf468d835307c3 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos anticorpos policlonais, preparados contra as bactérias ruminais Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Lactobacillus e endotoxina, ou monensina sódica sobre perfil metabólico sanguíneo e variações na ingestão diária de matéria seca de bovinos jovens confinados com diferentes níveis de concentrado. Foram utilizados 72 animais Brangus, machos, não castrados, desmamados com nove meses de idade, com peso vivo médio inicial de 261,04 ± 34,73 kg divididos em 24 baias (3 animais/baia), com 6 repetições (baias) em cada tratamento. Todos os animais foram submetidos à mesma dieta (ad libitum), tipo de alojamento e manejo. As dietas apenas foram diferentes no tocante aos aditivos alimentares utilizados: controle (sem aditivo), monensina sódica - MON, anticorpos policlonais – PAP ou mistura de monensina sódica com anticorpos policlonais – MIX, estes, na forma de pó. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 2 com medidas repetidas no tempo, sendo os fatores: inclusão ou não de monensina sódica e inclusão ou não de anticorpos policlonais. Medidas de tempo foram tomadas de acordo com o período: adaptação, crescimento e terminação. Os dados de gasometria foram avaliados após 21 dias do início de cada período. A ingestão e a variação diária de matéria seca (IDMS e VIDMS, respectivamente) foram obtidas nos quatro primeiros dias após mudança do período de adaptação para crescimento e de crescimento para terminação. Não houve efeito (P<0,05) de aditivos para IDMS e VIDMS, apenas interação entre período e os 4 dias para as duas variáveis, com maior IDMS no dia 3 seguido de queda no dia 4 durante o período de crescimento e VIDMS nos quatro dias após mudança de dieta. Durante a terminação houve menor IDMS no dia 2 mas não foi observado VIDMS nos quatro primeiros...
The aim of this study was to evaluate the effects of polyclonal antibodies preparation (PAP) or monensin (MON) against rumen bacteria (Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Lactobacillus and endotoxin) on blood metabolic profile and variations in daily dry matter intake (DM) of feedlot cattle fed high concentrate diets. Seventy-two 9-mo-old bullocks (261.04 ± 34.73 kg) were housed in 24 pens (3 bullocks/pen) and assigned to a completely randomized with 2 x 2 factorial arrangement with 6 replications per treatment. All animals received the same diet (ad libitum), type of accommodation and management. The diets treatments were different only about feed additives used: control (no additive), MON, PAP or MON + PAP (MIX). Factors were inclusion or not of PAP or MON, at a dose of 300 mg/kg DM or at 30 mg/ kg DM, respectively. Measures over time were taken according to the phase: adaptation, growing and finishing. Blood samples were collected and evaluated after 21 days of the beginning of each phase. The intake and daily variation of dry matter (IDMS and VIDMS, respectively) were obtained in the first four days of each phase. There was no effect (P < 0.05) additive for IDMS and VIDMS, only interaction between phase and four days for both variables, with higher IDMS on day 3 and then decreased on day 4 during the growth phase and VIDMS during four days after changing the diet. During the finishing, IDMS was lower on day 2, but was not observed VIDMS the first four days after change of diet. PAP and MON treatments had higher blood pH compared to MIX, but not different from control. In the finishing phase was observed lower blood pH compared with other phases... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-11Bitstream added on 2014-06-13T18:31:47Z : No. of bitstreams: 1 millen_dd_me_botfmvz.pdf: 639274 bytes, checksum: cd47f616a6044fb18da77875d3325af1 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Esse estudo, conduzido no confinamento experimental da UNESP – Botucatu, foi realizado para testar anticorpos contra as bactérias ruminais S. bovis e F. necrophorum e várias cepas de bactérias proteolíticas sobre o desempenho e incidências de paraqueratose ruminal (IPR) e abscesso hepático em bovinos jovens com diferentes graus de sangue Zebu. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 3X2 em parcelas subdivididas com três repetições (4 animais/baia), aonde três grupos genéticos (24 Tri-Cross (TC) - ½ Brangus, ¼ Angus, ¼ Nelore; 24 Canchim (CC) - ⅝ Charolais, ⅜ Nelore e 24 Nelores (NE)) e dois aditivos alimentares (anticorpos policlonais – 10 ml/cabeça/dia (AP) e monensina sódica – 30 mg/kg de dieta (MN)) foram as variáveis estudadas em três períodos de coleta de dados, correspondentes as três dietas com níveis crescentes de concentrado (73, 82 e 85%). Não houve interação (P>0,05) entre os grupos genéticos e os aditivos alimentares estudados. Animais suplementados com AP apresentaram similares (P>0,05) ganho de peso diário (GPD), ingestão de matéria seca em quilos (IMSKG), conversão alimentar (CA) e custo para ganhar um quilo de peso vivo que aqueles suplementados com MN. A ingestão de matéria seca em porcentagem do peso vivo (IMSPV) foi maior (P<0,05) para animais suplementados com AP que aqueles suplementados com MN. As IMSPV e IMSKG foram maiores na dieta de 73% de concentrado (P<0,05) para animais suplementados com AP e não diferiram entre os aditivos alimentares para as outras duas dietas (P>0,05). Conforme as dietas propostas, GPD e IMSPV diminuíram (P<0,05) e CA e IMSKG aumentaram, linearmente, durante o estudo (P<0,05). Animais suplementados com AP apresentarem menor (P=0,09) IPR que àqueles suplementados com MN. TC e CC apresentaram maiores (P<0,05) IMS e GDP e melhor (P<0,05) CA que NE. Rumens de NE mostraram, significativamente (P<0,05), maiores IPR que TC e CC.
This study, conducted at the São Paulo State University feedlot, Botucatu Campus, Brazil, was designed to test antibodies against S. bovis, F. necrophorum, and several strains of proteolytic bacteria (RMT) on performance and parakeratosis and liver abscesses incidences of Bos indicus-based types (BIBT). The experiment was designed as a split plot 3X2 factorial scheme, replicated thrice (4 bulls/pen), in which 24 8-mo-old bulls (297 kg) of each of three BIBT: 3-way cross (½ Brangus, ¼ Angus, ¼ Nellore; TC), Canchim (⅝ Charolais, ⅜ Nellore; CC), or Nellore (NE) were fed one of two diets containing either monensin (MO) at 30 mg/kg of diet or RMT at 10 mL/head/d and evaluated in increasing levels of concentrate (73, 82 and 85%). There were no interactions (P>0.05) between breed type and feed additives. Bulls fed RMT had similar (P>0.05) average daily gain (ADG), dry matter intake in kilos (DMIKG), cost to gain one kilo of body weight and feed conversion (FC) as those fed MO. When analyzed as percentage of BW, bulls fed RMT consumed (P<0.05) more feed than those fed MO. DMIKG and DMIBW were higher in 73% concentrate but did not differ in the others two diets evaluated. According to diets offered, ADG and DMIBW were reduced (P<0.05) and DMIKG and FC (P<0.05) were increased as the level of concentrate in the diet got higher. Bulls fed RMT to have lesser (P=0.09) rumen parakeratosis scores than those fed MO. TC and CC had greater (P<0.05) DMI and ADG, and better (P<0.05) FC than NE. Rumens from NE bulls had greater (P<0.05) parakeratosis scores than CC and TC. Just one liver abscess was found in this study what led to conclude as no abscesses incidence. Feeding RMT enhanced intake of Bos indicus-based bulls fed 73% concentrate diet while maintaining rumen health, and permitting performance similar to that of bulls fed monensin. RMT could be an eventual substitute if monensin was really prohibited.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-11Bitstream added on 2014-06-13T19:15:05Z : No. of bitstreams: 1 mariani_tm_me_botfmvz.pdf: 521848 bytes, checksum: 2d5f794a732e1c41512018d52c981410 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Esse estudo foi realizado para avaliar o preparado de anticorpos policlonais (PAP) sobre o comportamento ingestivo (CING) e desempenho de bovinos Brangus (BR) e Nelore (NE) confinados. Foram utilizados 32 machos inteiros (254,1 ± 12,7 kg), de cada um dos 2 grupos genéticos, e estes foram alimentados por 144 dias com dietas contendo ou monensina sódica (MON) ou PAP nas dosagens de 30 e 300 mg/kg de matéria seca (MS) respectivamente. Medidas no tempo foram coletadas de acordo com os períodos avaliados durante o estudo: adaptação, crescimento, terminação 1 e terminação 2. As observações foram feitas a cada 5 minutos durante 24h, aonde os dados das variáveis de CING foram coletados: tempos médios de ruminação (TR), de alimentação (TAL), de ócio, número de idas ao bebedouro, e número de refeições ao dia (REF/dia). As eficiências de alimentação (EAL) e ruminação (ERU) da MS e do FDN foram calculadas usando-se combinações dos dados de CING com os dados de consumo de MS e FDN. Não foi observado (P > 0,05) efeito dos aditivos alimentares sobre as EAL e ERU da MS e do FDN. Houve efeito sobre REF/dia e TAL despendido por refeição (TALREF), onde animais suplementados com MON apresentaram maiores (P < 0,05) REF/dia, TR e animais recebendo PAP tiveram maior (P < 0,05) TALREF. Animais recebendo PAP e MON apresentaram similares (P > 0,05) GPD, CMS e CA. Os animais BR apresentaram maior (P < 0,05) TALREF e CMS por refeição. Observouse (P < 0,05) efeito dos grupos genéticos sobre EAL e ERU da MS e da FDN (P < 0,01), onde bovinos BR apresentaram melhores eficiências quando comparados aos animais NE. Assim sendo, devido às similaridades nos resultados de CING, EAL, ERU e desempenho, PAP pode ser uma eventual alternativa à MON em dietas de alto teor de concentrado.
This study was designed to test polyclonal antibody preparation (PAP) against several rumen microorganisms on feeding behavior and feedlot performance of Brangus (BR) and Nellore (NE) cattle. The experiment was designed as a 2 × 2 factorial arrangement of treatments using repeated measures over time, replicated 4 times (4 bullocks/pen), in which 32 9-mo-old bullocks (254,1 ± 12,7 kg) of each of two breeds evaluated were fed for 144 days, diets containing either monensin (MON) or PAP at 30 or 300 mg/kg of dry matter (DM) daily; respectively. Measures over time were taken according to the periods evaluated during the study: adaptation, growing, finishing 1 and finishing 2. Visual appraisal was made every five minutes during 24h, and feeding behavior data was collected as follows: time spent eating (EAT), ruminating (RUM), resting, visits to water through and number of meals per day (MEA). Feed offerings and refusals were weighed daily. Feeding (FEEF) and rumination efficiencies (RUEF) of DM and NDF were calculated using combinations of feeding behavior data with DM and NDF intakes data. No significant (P > 0,05) feed additives main effects were observed for FEEF and RUEF of DM and NDF, and for any of feeding behavior variables evaluated with the exception of RUM, MEA and EAT per meal (EATMEA); in which bullocks fed MON presented longer (P < 0,05) RUM and greater (P < 0,05) MEA and bullocks receiving PAP had longer (P < 0,05) EATMEA. In addition, a similar feedlot performance was observed (P > 0,05) between bullocks fed either MON or PAP. BR bullocks had longer (P < 0,05) EATMEA and greater (P < 0,05) DM intake per meal. Significant (P < 0,05) breeds main effects were observed for all of FEEF and RUEF of DM and NDF, indicating that BR bullocks were more efficient than NE bullocks in all variables evaluated. In terms of feedlot performance, BR bullocks presented greater (P < 0,05) average daily gain ...

Orientador: Mário De Beni Arrigoni
Banca: Rafael da Costa Cervieri
Banca: Flávio Augusto Portela Santos
Resumo: Esse estudo, conduzido no confinamento experimental da UNESP - Botucatu, foi realizado para testar anticorpos contra as bactérias ruminais S. bovis e F. necrophorum e várias cepas de bactérias proteolíticas sobre o desempenho e incidências de paraqueratose ruminal (IPR) e abscesso hepático em bovinos jovens com diferentes graus de sangue Zebu. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 3X2 em parcelas subdivididas com três repetições (4 animais/baia), aonde três grupos genéticos (24 Tri-Cross (TC) - ½ Brangus, ¼ Angus, ¼ Nelore; 24 Canchim (CC) - ⅝ Charolais, ⅜ Nelore e 24 Nelores (NE)) e dois aditivos alimentares (anticorpos policlonais - 10 ml/cabeça/dia (AP) e monensina sódica - 30 mg/kg de dieta (MN)) foram as variáveis estudadas em três períodos de coleta de dados, correspondentes as três dietas com níveis crescentes de concentrado (73, 82 e 85%). Não houve interação (P>0,05) entre os grupos genéticos e os aditivos alimentares estudados. Animais suplementados com AP apresentaram similares (P>0,05) ganho de peso diário (GPD), ingestão de matéria seca em quilos (IMSKG), conversão alimentar (CA) e custo para ganhar um quilo de peso vivo que aqueles suplementados com MN. A ingestão de matéria seca em porcentagem do peso vivo (IMSPV) foi maior (P<0,05) para animais suplementados com AP que aqueles suplementados com MN. As IMSPV e IMSKG foram maiores na dieta de 73% de concentrado (P<0,05) para animais suplementados com AP e não diferiram entre os aditivos alimentares para as outras duas dietas (P>0,05). Conforme as dietas propostas, GPD e IMSPV diminuíram (P<0,05) e CA e IMSKG aumentaram, linearmente, durante o estudo (P<0,05). Animais suplementados com AP apresentarem menor (P=0,09) IPR que àqueles suplementados com MN. TC e CC apresentaram maiores (P<0,05) IMS e GDP e melhor (P<0,05) CA que NE. Rumens de NE mostraram, significativamente (P<0,05), maiores IPR que TC e CC.
Abstract: This study, conducted at the São Paulo State University feedlot, Botucatu Campus, Brazil, was designed to test antibodies against S. bovis, F. necrophorum, and several strains of proteolytic bacteria (RMT) on performance and parakeratosis and liver abscesses incidences of Bos indicus-based types (BIBT). The experiment was designed as a split plot 3X2 factorial scheme, replicated thrice (4 bulls/pen), in which 24 8-mo-old bulls (297 kg) of each of three BIBT: 3-way cross (½ Brangus, ¼ Angus, ¼ Nellore; TC), Canchim (⅝ Charolais, ⅜ Nellore; CC), or Nellore (NE) were fed one of two diets containing either monensin (MO) at 30 mg/kg of diet or RMT at 10 mL/head/d and evaluated in increasing levels of concentrate (73, 82 and 85%). There were no interactions (P>0.05) between breed type and feed additives. Bulls fed RMT had similar (P>0.05) average daily gain (ADG), dry matter intake in kilos (DMIKG), cost to gain one kilo of body weight and feed conversion (FC) as those fed MO. When analyzed as percentage of BW, bulls fed RMT consumed (P<0.05) more feed than those fed MO. DMIKG and DMIBW were higher in 73% concentrate but did not differ in the others two diets evaluated. According to diets offered, ADG and DMIBW were reduced (P<0.05) and DMIKG and FC (P<0.05) were increased as the level of concentrate in the diet got higher. Bulls fed RMT to have lesser (P=0.09) rumen parakeratosis scores than those fed MO. TC and CC had greater (P<0.05) DMI and ADG, and better (P<0.05) FC than NE. Rumens from NE bulls had greater (P<0.05) parakeratosis scores than CC and TC. Just one liver abscess was found in this study what led to conclude as no abscesses incidence. Feeding RMT enhanced intake of Bos indicus-based bulls fed 73% concentrate diet while maintaining rumen health, and permitting performance similar to that of bulls fed monensin. RMT could be an eventual substitute if monensin was really prohibited.
Mestre

Orientador: Mario De Beni Arrigoni
Banca: Rafael Cervieri
Banca: Renata Helena Branco
Resumo: Esse estudo foi realizado para avaliar o preparado de anticorpos policlonais (PAP) sobre o comportamento ingestivo (CING) e desempenho de bovinos Brangus (BR) e Nelore (NE) confinados. Foram utilizados 32 machos inteiros (254,1 ± 12,7 kg), de cada um dos 2 grupos genéticos, e estes foram alimentados por 144 dias com dietas contendo ou monensina sódica (MON) ou PAP nas dosagens de 30 e 300 mg/kg de matéria seca (MS) respectivamente. Medidas no tempo foram coletadas de acordo com os períodos avaliados durante o estudo: adaptação, crescimento, terminação 1 e terminação 2. As observações foram feitas a cada 5 minutos durante 24h, aonde os dados das variáveis de CING foram coletados: tempos médios de ruminação (TR), de alimentação (TAL), de ócio, número de idas ao bebedouro, e número de refeições ao dia (REF/dia). As eficiências de alimentação (EAL) e ruminação (ERU) da MS e do FDN foram calculadas usando-se combinações dos dados de CING com os dados de consumo de MS e FDN. Não foi observado (P > 0,05) efeito dos aditivos alimentares sobre as EAL e ERU da MS e do FDN. Houve efeito sobre REF/dia e TAL despendido por refeição (TALREF), onde animais suplementados com MON apresentaram maiores (P < 0,05) REF/dia, TR e animais recebendo PAP tiveram maior (P < 0,05) TALREF. Animais recebendo PAP e MON apresentaram similares (P > 0,05) GPD, CMS e CA. Os animais BR apresentaram maior (P < 0,05) TALREF e CMS por refeição. Observouse (P < 0,05) efeito dos grupos genéticos sobre EAL e ERU da MS e da FDN (P < 0,01), onde bovinos BR apresentaram melhores eficiências quando comparados aos animais NE. Assim sendo, devido às similaridades nos resultados de CING, EAL, ERU e desempenho, PAP pode ser uma eventual alternativa à MON em dietas de alto teor de concentrado.
Abstract: This study was designed to test polyclonal antibody preparation (PAP) against several rumen microorganisms on feeding behavior and feedlot performance of Brangus (BR) and Nellore (NE) cattle. The experiment was designed as a 2 × 2 factorial arrangement of treatments using repeated measures over time, replicated 4 times (4 bullocks/pen), in which 32 9-mo-old bullocks (254,1 ± 12,7 kg) of each of two breeds evaluated were fed for 144 days, diets containing either monensin (MON) or PAP at 30 or 300 mg/kg of dry matter (DM) daily; respectively. Measures over time were taken according to the periods evaluated during the study: adaptation, growing, finishing 1 and finishing 2. Visual appraisal was made every five minutes during 24h, and feeding behavior data was collected as follows: time spent eating (EAT), ruminating (RUM), resting, visits to water through and number of meals per day (MEA). Feed offerings and refusals were weighed daily. Feeding (FEEF) and rumination efficiencies (RUEF) of DM and NDF were calculated using combinations of feeding behavior data with DM and NDF intakes data. No significant (P > 0,05) feed additives main effects were observed for FEEF and RUEF of DM and NDF, and for any of feeding behavior variables evaluated with the exception of RUM, MEA and EAT per meal (EATMEA); in which bullocks fed MON presented longer (P < 0,05) RUM and greater (P < 0,05) MEA and bullocks receiving PAP had longer (P < 0,05) EATMEA. In addition, a similar feedlot performance was observed (P > 0,05) between bullocks fed either MON or PAP. BR bullocks had longer (P < 0,05) EATMEA and greater (P < 0,05) DM intake per meal. Significant (P < 0,05) breeds main effects were observed for all of FEEF and RUEF of DM and NDF, indicating that BR bullocks were more efficient than NE bullocks in all variables evaluated. In terms of feedlot performance, BR bullocks presented greater (P < 0,05) average daily gain ...
Mestre

Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos anticorpos policlonais, preparados contra as bactérias ruminais Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Lactobacillus e endotoxina, ou monensina sódica sobre perfil metabólico sanguíneo e variações na ingestão diária de matéria seca de bovinos jovens confinados com diferentes níveis de concentrado. Foram utilizados 72 animais Brangus, machos, não castrados, desmamados com nove meses de idade, com peso vivo médio inicial de 261,04 ± 34,73 kg divididos em 24 baias (3 animais/baia), com 6 repetições (baias) em cada tratamento. Todos os animais foram submetidos à mesma dieta (ad libitum), tipo de alojamento e manejo. As dietas apenas foram diferentes no tocante aos aditivos alimentares utilizados: controle (sem aditivo), monensina sódica - MON, anticorpos policlonais - PAP ou mistura de monensina sódica com anticorpos policlonais - MIX, estes, na forma de pó. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 2 com medidas repetidas no tempo, sendo os fatores: inclusão ou não de monensina sódica e inclusão ou não de anticorpos policlonais. Medidas de tempo foram tomadas de acordo com o período: adaptação, crescimento e terminação. Os dados de gasometria foram avaliados após 21 dias do início de cada período. A ingestão e a variação diária de matéria seca (IDMS e VIDMS, respectivamente) foram obtidas nos quatro primeiros dias após mudança do período de adaptação para crescimento e de crescimento para terminação. Não houve efeito (P<0,05) de aditivos para IDMS e VIDMS, apenas interação entre período e os 4 dias para as duas variáveis, com maior IDMS no dia 3 seguido de queda no dia 4 durante o período de crescimento e VIDMS nos quatro dias após mudança de dieta. Durante a terminação houve menor IDMS no dia 2 mas não foi observado VIDMS nos quatro primeiros... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The aim of this study was to evaluate the effects of polyclonal antibodies preparation (PAP) or monensin (MON) against rumen bacteria (Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Lactobacillus and endotoxin) on blood metabolic profile and variations in daily dry matter intake (DM) of feedlot cattle fed high concentrate diets. Seventy-two 9-mo-old bullocks (261.04 ± 34.73 kg) were housed in 24 pens (3 bullocks/pen) and assigned to a completely randomized with 2 x 2 factorial arrangement with 6 replications per treatment. All animals received the same diet (ad libitum), type of accommodation and management. The diets treatments were different only about feed additives used: control (no additive), MON, PAP or MON + PAP (MIX). Factors were inclusion or not of PAP or MON, at a dose of 300 mg/kg DM or at 30 mg/ kg DM, respectively. Measures over time were taken according to the phase: adaptation, growing and finishing. Blood samples were collected and evaluated after 21 days of the beginning of each phase. The intake and daily variation of dry matter (IDMS and VIDMS, respectively) were obtained in the first four days of each phase. There was no effect (P < 0.05) additive for IDMS and VIDMS, only interaction between phase and four days for both variables, with higher IDMS on day 3 and then decreased on day 4 during the growth phase and VIDMS during four days after changing the diet. During the finishing, IDMS was lower on day 2, but was not observed VIDMS the first four days after change of diet. PAP and MON treatments had higher blood pH compared to MIX, but not different from control. In the finishing phase was observed lower blood pH compared with other phases... (Complete abstract click electronic access below)
Orientador: Mário De Beni Arrigoni
Coorientador: Paulo Roberto Leme
Banca: Ricardo de Albuquerque
Banca: Paulo Henrique Mazza Rodrigues
Mestre

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-05Bitstream added on 2014-12-02T11:21:05Z : No. of bitstreams: 1 000777406_20141231.pdf: 641973 bytes, checksum: 588137dce1974a2914edd3aadb3736f1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-05T11:00:55Z: 000777406_20141231.pdf,Bitstream added on 2015-01-05T11:01:50Z : No. of bitstreams: 1 000777406.pdf: 2095617 bytes, checksum: c1c25558e3e61efd44b8465985d10f95 (MD5)
A proteína MxA humana é membro da superfamília de GTPases dinaminas. De maneira geral, as chamadas proteínas Mx estão presentes na grande maioria dos organismos vertebrados, estudados até o momento, e possuem dois domínios estruturais, chamados GTPase e CID-GED (stalk), além da capacidade de homooligomerização e associação com membranas intracelulares. Além disso, as proteínas Mx são produzidas unicamente após a sensibilização celular por interferons do tipo I e III. Entre as propriedades funcionais de MxA, destaca-se a sua vasta atividade contra diferentes vírus de RNA e DNA, incluindo o vírus influenza e membros da família dos buniavírus. Além disso, o silenciamento gênico de MxA está associado ao fenótipo de imortalização celular em uma série de neoplasias. Assim, MxA desperta o interesse por ser uma das proteínas chave nas respostas mediadas por interferons e por estar envolvida no controle da proliferação celular. Recentemente, por meio de rastreamento de duplo-híbrido, utilizando uma biblioteca de cDNA preparada a partir de cérebro fetal humano, foi possível mostrar que MxA interage com fatores envolvidos no processo de SUMOilação de proteínas e na formação de corpúsculos nucleares denominados PMLNB e com uma série de proteínas relacionadas com o controle da transcrição e apoptose. Neste estudo, foi investigada a interação entre MxA e as proteínas envolvidas nos processo de SUMOilação. Assim, foi possível confirmar a interação física entre a proteína MxA e os ligantes Ubc9 e SUMO1, por ensaios de coimunoprecipitação. A seguir, através de ensaios de duplo-híbrido, foi possível determinar que a região EIL (E67-interacting Loop) de SUMO1 e o domínio CID-GED de MxA estão envolvidos na interação entre essas proteínas e que esta interação independe de sequências SIM (SUMO-interacting motif) presentes em MxA. Ainda, foi possível determinar que Ubc9 interage diretamente com ...
The human MxA protein is a member of the superfamily of GTPases dynamins. The so called Mx proteins are present in the majority of the vertebrate organisms investigated so far and contain two structural domains, named GTPase and CID-GED (stalk), besides the capabilities of homo-oligomerization and association with intracellular membranes. Moreover, the Mx proteins are strictly produced upon cell sensibilization with type I and III interferons. The vast antiviral activity against RNA and DNA viruses, including the Influenza virus and members of the bunyaviridae family, is among the functional properties of MxA. Moreover, MX1 epigenetic silencing is associated with cellular immortalization in neoplasias. Therefore, the study of MxA is of great interest as it is a key component of the Interferon-mediated pathways and cell proliferation control. Recentely, in a two-hybrid screen using a fetal brain cDNA library, it was possible to reveal that MxA interacts with proteins related to the post-translational modification process named SUMOylation and to the assemble of the nuclear bodies named PML-NBs and with proteins implicated in the control of transcription and apoptose. In this study, it was investigated the interaction between MxA and the components of the protein SUMOylation pathway. It was possible to confirm the physical interaction between MxA and Ubc9 and SUMO1, using co-immunopreciptation assay. Then, using the yeast two-hybrid system, it was possible to determine that the EIL (E67-interacting loop) region on SUMO1 interacts with the CID-GED domain of MxA without the requirement of the SIM sequences (SUMO-interacting motif) present in MxA. Moreover, it was determined that Ubc9 interacts with the GTPase domain of MxA and that MxA homo-oligomerization is important for its interaction with SUMO1 and Ubc9. Also, we were able to demonstrate for the first time that the protein MxA undergoes SUMOylation by SUMO1, SUMO2 and SUMO3. Finally, it ...

Orientador: Sandro Roberto Valentini
Co-orientador: Cleslei Fernando Zanelli
Banca: Alexandra Ivo de Medeiros
Banca: Andréia Machado Leopoldino
Banca: Mari Cleide Sogayar
Banca: Érico Tosoni Costa
Resumo: A proteína MxA humana é membro da superfamília de GTPases dinaminas. De maneira geral, as chamadas proteínas Mx estão presentes na grande maioria dos organismos vertebrados, estudados até o momento, e possuem dois domínios estruturais, chamados GTPase e CID-GED (stalk), além da capacidade de homooligomerização e associação com membranas intracelulares. Além disso, as proteínas Mx são produzidas unicamente após a sensibilização celular por interferons do tipo I e III. Entre as propriedades funcionais de MxA, destaca-se a sua vasta atividade contra diferentes vírus de RNA e DNA, incluindo o vírus influenza e membros da família dos buniavírus. Além disso, o silenciamento gênico de MxA está associado ao fenótipo de imortalização celular em uma série de neoplasias. Assim, MxA desperta o interesse por ser uma das proteínas chave nas respostas mediadas por interferons e por estar envolvida no controle da proliferação celular. Recentemente, por meio de rastreamento de duplo-híbrido, utilizando uma biblioteca de cDNA preparada a partir de cérebro fetal humano, foi possível mostrar que MxA interage com fatores envolvidos no processo de SUMOilação de proteínas e na formação de corpúsculos nucleares denominados PMLNB e com uma série de proteínas relacionadas com o controle da transcrição e apoptose. Neste estudo, foi investigada a interação entre MxA e as proteínas envolvidas nos processo de SUMOilação. Assim, foi possível confirmar a interação física entre a proteína MxA e os ligantes Ubc9 e SUMO1, por ensaios de coimunoprecipitação. A seguir, através de ensaios de duplo-híbrido, foi possível determinar que a região EIL (E67-interacting Loop) de SUMO1 e o domínio CID-GED de MxA estão envolvidos na interação entre essas proteínas e que esta interação independe de sequências SIM (SUMO-interacting motif) presentes em MxA. Ainda, foi possível determinar que Ubc9 interage diretamente com ...
Abstract: The human MxA protein is a member of the superfamily of GTPases dynamins. The so called Mx proteins are present in the majority of the vertebrate organisms investigated so far and contain two structural domains, named GTPase and CID-GED (stalk), besides the capabilities of homo-oligomerization and association with intracellular membranes. Moreover, the Mx proteins are strictly produced upon cell sensibilization with type I and III interferons. The vast antiviral activity against RNA and DNA viruses, including the Influenza virus and members of the bunyaviridae family, is among the functional properties of MxA. Moreover, MX1 epigenetic silencing is associated with cellular immortalization in neoplasias. Therefore, the study of MxA is of great interest as it is a key component of the Interferon-mediated pathways and cell proliferation control. Recentely, in a two-hybrid screen using a fetal brain cDNA library, it was possible to reveal that MxA interacts with proteins related to the post-translational modification process named SUMOylation and to the assemble of the nuclear bodies named PML-NBs and with proteins implicated in the control of transcription and apoptose. In this study, it was investigated the interaction between MxA and the components of the protein SUMOylation pathway. It was possible to confirm the physical interaction between MxA and Ubc9 and SUMO1, using co-immunopreciptation assay. Then, using the yeast two-hybrid system, it was possible to determine that the EIL (E67-interacting loop) region on SUMO1 interacts with the CID-GED domain of MxA without the requirement of the SIM sequences (SUMO-interacting motif) present in MxA. Moreover, it was determined that Ubc9 interacts with the GTPase domain of MxA and that MxA homo-oligomerization is important for its interaction with SUMO1 and Ubc9. Also, we were able to demonstrate for the first time that the protein MxA undergoes SUMOylation by SUMO1, SUMO2 and SUMO3. Finally, it ...
Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:00:43Z : No. of bitstreams: 1 cangiani_ee_dr_arafcf.pdf: 879107 bytes, checksum: bd2b88a537298b5f3ad944c986ece870 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Yersinia enterocolitica é um enteropatógeno que pode levar ao desenvolvimento de artrite reativa. Um dos mecanismos imunomoduladores usados pelos patógenos artritogênicos é a ativação policlonal de linfócitos. O objetivo deste estudo foi verificar se ocorre ativação policlonal de linfócitos B e comparar o padrão isotípico de imunoglobulinas produzidas durante a infecção com Y. enterocolitica O:8 em linhagens de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6), bem como analisar o padrão de secreção de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias pelas populações de células T CD4+ e CD8+.
Yersinia enterocolitica is an enteropathogen that can lead to the development of reactive arthritis. One of the immunomodulating mechanisms used by arthritogenic pathogens is the polyclonal activation of lymphocytes. The objective of this study was to verify if the polyclonal activation of B-lymphocytes occur and to compare the different immunoglobulin (Ig) isotypes produced during the infection with Y. enterocolitica O:8 in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice strains. We also analyzed the production of pro-inflammatory and regulatory cytokines in T CD4+ and T CD8+ lymphocytes populations.

Os estudos aqui descritos, realizados sobre o isolado vira) GP, de oliveira, permitiram caracterizá-lo e identificá-lo como um isolado de Tobacco necrosis viras (TNV). O vírus foi propagado em plantas de Nicotiana benthamiana e, subsequentemente, purificado por três métodos diferentes sendo o mais eficaz, o que incluiu uma fase de precipitação com polietileno glicol. As preparações virais revelaram, através de análises apropriadas, morfologia isométrica, com diâmetro de 30 rim, cápside proteica e genoma constituídos, respectivamente, por um péptido de cerca de 30 KDa e por RNA de cadeia simples com 3800 Kb. Em hospedeiros herbáceos infectados com GP, observaram-se três espécies replicativas de RNA, com 2,6x106 Da; 1,05x106 Da e 0,94x106 Da. As preparações de GP reagiram positivamente em testes ELISA (enzyme linkedimmunosorbent assay), com antisoro (comercial) para TNV. O conjunto destas propriedades demonstram que GP é um isolado de TNV. Para efeitos de diagnóstico, produziu-se um antisoro policlonal específico ípara GP e optimizaram-se todos os parâmetros para aplicação na detecção viral, por ELISA. A aplicação comparativa de três métodos de diagnóstico viral, a tecidos de oliveiras infectadas, não foram conclusivos, tornando-se necessário adaptá-los melhor à natureza específica deste material lenhoso. /*** Abstract - Studies here described on a viral isolate obtained from olive, GP, allowed its characterization and identification as Tobacco necrosis virus (TNV) Virus was propagated in Nicotiana benthamiana plants and purified through three different methods, the best of which involved a precipitation step with polyethylene glycol. Further analysis of virus preparations revealed an isometric morphology with 30 nm in diameter, a coat protein and genome made up, respectively, of a peptide with 30 KDa and a single strand RNA molecule with 3800 Kb. In GP-infected herbaceous hosts, three replicative RNA species with 2.6x106 Da; 1.05x106 Da e 0.94x106 Da were observed. Viral GP preparations reacted positively, in ELISA (enzyme linked-immunosorbent assay), with a specific (commercial) ante-TNV. Ali these properties show that GP is a TNV isolate. For diagnoses purposes a specific polyclonal GP antiserum was produced, conditions for ELISA tests were optimised and applications to plant material were carried out. Comparative application of three different virus diagnostic methods to olive plant tissues, were not conclusive regarding their efficacy, and more work is needed to adapt them to the specific nature of this woody material.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de um preparado de anticorpos policlonais (PAP) contra bactérias ruminais específicas, Streptococcus bovis e Fusobacterium necrophorum, em parâmetros ruminais da fermentação, em vacas canuladas, adaptadas ou não a uma dieta de alta proporção de carboidratos prontamente fermentescíveis, após indução à acidose. O delineamento experimental utilizado foi o quadrado latino 3X3 replicado em arranjo fatorial de tratamentos 3X2, sendo 2 aditivos alimentares (PAP na apresentação em pó - PAPP e PAP na apresentação líquida - PAPL) mais um grupo controle (CON) e dois manejos de adaptação à dieta, resultando em seis tratamentos. O primeiro quadrado latino foi submetido a um protocolo de adaptação à dieta do tipo gradual ou step-up: dos dias D0 a D4 os animais receberam 100% de forragem; do D5 ao D9, 30% de concentrados e do D10 ao D14, 60% de concentrados. O segundo quadrado latino recebeu 100% de forragem do D0 ao D14 (sem adaptação). Nos D15 e D16, todos os animais receberam dieta com 80% de concentrados. Para as análises foram coletadas amostras de líquido ruminal a cada 3 horas a partir da 0h antes da alimentação até as 36h (D15 e D16) durante o desafio com uma dieta de 80% de concentrados. Os dados foram analisados pelo procedimento Mixed do SAS com nível de significância de 0,05. Foi observada interação entre tempo e adaptação (P<0,05) para pH ruminal com diferença entre método de adaptação nas 0, 3, 6, 9, 12 e 36 horas pós alimentação, quando o grupo não adaptado teve valores maiores que o grupo adaptado, sendo que na hora 24 ocorreu o contrário. Para a concentração de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), nas horas 0, 3, 6, 9 e 36 pós alimentação o grupo adaptado obteve maiores valores comparado ao grupo não adaptado. Para proporção molar de acetato, a 0 hora o grupo sem adaptação obteve valores maiores comparado ao grupo adaptado. Já nas horas 24, 27 e 30 o grupo com adaptação que obteve maiores valores. Para a proporção molar de propionato o grupo sem adaptação teve valores mais altos em comparação ao outro grupo das 3 às 36 horas pós alimentação. Quanto à proporção acetato:propionato (Ac:Pr) às 6, 12, 24, 27, 30 e 36 horas pós alimentação, o grupo de animais adaptados teve valores mais altos que o grupo não adaptado. Na proporção molar de butirato, o grupo de animais adaptados obteve maiores valores nas horas 0, 3, 6, 9, 12, 33 e 36. Para os valores de nitrogênio amoniacal (N-NH3), às 6 horas pós alimentação, o grupo não adaptado obteve maiores valores que o grupo adaptado (26,1 vs. 19,3, respectivamente). Nas horas 9, 30, 33 e 36 ocorreu o contrário. Observou-se também interação entre tempo e aditivo (P=0,0430) para a proporção molar de butirato. Porém, quando a análise foi realizada por tempo, nenhum efeito foi observado. Para os valores relativos de protozoários mensurados (Dasytricha, Isotricha, Epidinium, Diplodinium e Entodinium) apenas o Entodinium apresentou efeito de adaptação (P<0,0236) tendo sua proporção maior no grupo adaptado. Os valores de haptoglobina também não foram influenciados nem por aditivo nem por adaptação. O preparado de anticorpos policlonais não foi tão eficaz quanto a adaptação gradual à dieta de alto concentrado para controlar alterações dos parâmetros ruminais.
The objective of this trial was to evaluate the effects of polyclonal antibodies preparation (PAP) against specific rumen bacteria Streptococcus bovis and Fusobacterium necrophorum on rumen fermentation parameters in ruminally cannulated cows adapted or not to highly fermentable carbohydrates diets (HFC) after an acidosis challenge. The experimental design was two 3X3 Latin squares in a factorial arrangement of treatments 3X2 regarding two feed additives (PAP in powder presentation - PAPP and PAP in liquid presentation - PAPL) plus control group (CON) and two managements of diets adaptation, resulting in six treatments. The first Latin square had a step-up diet adaptation: from D0 to D4 100% forage; D5 to D9 30% of concentrates and D10 to D14 60% of concentrates. The second Latin square received 100% forage from D0 to D14. On D15 and D16, all animals received a diet with 80% of concentrates. For analysis, rumen fluid was sampled at 0 and every 3 h posfeeding totaling 36 h (D15 and D16) of challenge with a diet with 80% of concentrates. Data were analyzed by MIXED procedure with a significance level of 0.05. An interaction between time and adaptation (P<0,05) was observed for ruminal pH. At 0, 3, 6, 9, 12 and 36 h postfeeding, the non-adapted group had higher values compared to the adapted group and at 24 h postfeeding, the inverse was observed. For total short-chain fatty acids concentration, at 0, 3, 6, 9 and 36 h postfeeding, the adapted group had higher values compared to non-adapted group. For molar proportion of acetate at 0h postfeeding, the non-adapted group had higher values than the adapted group, and at 24, 27 and 30h, the adapted group had greater values than the non-adapted group. For molar proportion of propionate the non-adapted group had greater values compared to the adapted group from 3 to 36h postfeeding. For acetate:propionate (Ac:Pr) ratio at 6, 12, 24, 27, 30 and 36 h postfeeding, the adapted group had greater values compared to the nonadapted group. For butyrate molar proportion at 0, 3, 6, 9, 12, 33 and 36h postfeeding the adapted group had greater values than the non-adapted group. For ammonia nitrogen (NH3- N) concentration at 6h, the non-adapted group had greater values than the adapted group (26.1 vs. 19.3, respectively), however at 9, 30, 33 and 36h postfeeding, the adapted group had higher values compared to the non-adapted group. It was also observed an interaction between time and additive (P=0.0430) for butyrate molar proportion, but when the analysis was performed by time no effect was observed. For the relative values of protozoa measured (Dasytricha, Isotricha, Epidinium, Diplodinium and Entodinium) only Entodinium presented adaptation effect (P<0.0236) with a higher proportion in the adapted group. Haptoglobin values was also not influenced (P>0.05) by additive or adaptation effect. Polyclonal antibodies preparation was not as effective as the gradual adaptation to the diet high concentrate to control changes of ruminal parameters.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-13Bitstream added on 2014-06-13T19:55:43Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_wfp_me_araca.pdf: 257034 bytes, checksum: 74c2e0dcd5f52341aac3382521691e4d (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O objetivo deste estudo foi padronizar a reação de Imunofluorescência direta (IFD) para detecção de oocistos de Cryptosporidium parvum em amostras fecais de bezerros. Os anticorpos policlonais anti-C. parvum foram produzidos em dois coelhos adultos da raça Nova Zelândia, e titulados por meio do ensaio imuno-enzimático indireto (ELISA). A fração de imunoglobulina G (IgG) foi purificada a partir do soro do coelho imunizado, utilizando-se diálise em sulfato de amônio seguida de cromatografia em coluna de DEAE celulose e conjugação com isotiocianato de fluoresceína. Por meio da IFD padronizada, foi testada a reatividade cruzada do conjugado produzido contra outras espécies de Cryptosporidium (C. andersoni e C. serpentis) e com outros agentes etiológicos presentes em fezes de bovinos (Escherichia coli, Eimeria sp. e Candida sp.). A IFD foi comparada à microscopia com contraste de fase em solução de Sheather (MCF), avaliando a capacidade de detecção de oocistos de Cryptosporidium sp. em alíquotas de fezes de bezerro inoculadas com oocistos de C. parvum, e em amostras fecais de bezerros naturalmente infectados provenientes de 37 propriedades leiteiras da região de Araçatuba, SP. Nas amostras comprovadas como positivas, foi ainda feita uma análise semi-quantitativa de oocistos de Cryptosporidium sp., visualizados por campo de microscopia em ambas as técnicas. O conjugado anti-C. parvum apresentou reatividade com C. andersoni e C. serpentis. A IFD foi utilizada com sucesso para detecção de oocistos de C. parvum em fezes de bezerros, apresentando sensibilidade para detecção de até 104 oocistos em 3 g de fezes. Entre as 300 amostras fecais de bezerros naturalmente infectados, 19,67% (59/300) foram positivas para a presença de oocistos de Cryptosporidium sp. pela IFD, apresentando diferença estatisticamente significante (p<0.05) em relação às amostras positivas pela MCF
The objective of this experiment was to standardize the direct immunofluorescence assay (DIF) for detection of Cryptosporidium parvum oocysts in fecal samples of calves. The anti-C. parvum polyclonal antibodies were produced in two adult rabbits of New Zealand breed, and titrated by an indirect enzyme-linked immunosorbent (ELISA). The immunoglobulin G (IgG) was purified from the serum of immunized rabbits by dialysis in ammonium sulfate followed by column chromatography on DEAE cellulose, and conjugated with fluorescein isothiocyanate. Using DIF the anti-C. parvum conjugate was tested for the presence of cross-reactivity against other species of Cryptosporidium (C. andersoni and C. serpentis), and other infectious agents present in cattle fecal samples (Escherichia coli, Eimeria sp. and Candida sp.). A comparison between the DIF and phase contrast microscopy in Sheather solution (MCF) was accomplished for evaluation of the efficiency of both techniques for detection of Cryptosporidium sp. oocysts in fecal samples of calves seeded with C. parvum oocysts, and in fecal samples from naturally infected calves from 37 dairy farms in the region of Araçatuba, SP. A semi-quantitative analysis of Cryptosporidium sp. oocysts per microscopic field was accomplished for both techniques. The anti-C. parvum conjugate showed cross-reactivity with C. andersoni and C. serpentis oocysts. The DIF has been used successfully in the detection of C. parvum oocysts in fecal samples of calves, with sensitivity for detecting 104 oocysts in 3 g of fecal samples. Among the 300 fecal samples from naturally infected calves, 19.67% (59/300) were positive for Cryptosporidium oocysts by DIF, with significant statistical difference (p <0.05) when compared to the number of positive samples by MCF

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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
Nove fêmeas bovinas canuladas no rúmen foram utilizadas para avaliar um preparado de anticorpos policlonais (PAP) de origem aviária contra as bactérias ruminais Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Clostridium aminophilum, Peptostreptococcus anacrobius e Clostridium sticklandii. O delineamento experimental foi o quadrado latino 3 X 3 replicado 3 vezes, em arranjo fatorial de tratamentos 3 X 3 referente a 2 modificadores ruminais, monensina (MON) e PAP mais o grupo controle (CON) e 3 fontes energéticas, milho seco moído (MSM), silagem de grão úmido de milho (SGUM) e polpa cítrica (PC). Cada subperíodo experimental foi composto de 21 dias, onde a coleta de líquido ruminal foi realizada às 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 h após a alimentação no último dia do período. Foram avaliados o consumo de matéria seca e os parâmetros de fermentação ruminal pH, concentração total de ácidos graxos de cadeia curta (AGCCt), lactato total e nitrogênio amoniacal (N-NH3). O PAP mostrou-se tão eficaz como a monensina em elevar o pH ruminal de bovinos alimentados com dietas ricas em concentrados, às 4 h após a alimentação, sem contudo, alterar (P>0,05) o consumo de matéria seca, a concentração total de ácidos graxos de cadeia curta, a proporção molar de acetato ou as concentrações de lactato total e nitrogênio amoniacal. Foi observada diminuição (P<0,05) na proporção molar de propionato com a utilização do PAP em relação a monensina, porém não em relação ao controle.
Nine ruminally cannulated cows were used to test an avianderived polyclonal antibody preparation (PAP) against the specific ruminal bacterias Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Clostridium aminophilum, Peptostreptococcus anacrobius and Clostridium sticklandii. The experimental design was a 3 X 3 latin square replicated 3 times with a factorial arrangement of treatments 3 X 3 regarding 2 rumen modifiers (monensin (MON) and PAP) plus control group (CON) and 3 energetic sources. The energetic sources utilized were dry-grounded corn grain (CG), high moisture corn silage (HMCS) and citrus pulp (CP). Each trial had 21 days; the ruminal fluid sampling was carried out on the last day of the period at 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 h after morning meal. Dry matter intake and rumen fermentation parameters such as pH, total short chain fatty acids (tSCFA), lactic acid and ammoniacal nitrogen (NH3-N) concentration were analyzed in this trial. PAP was as effective as monensin in increasing ruminal pH of cattle fed high concentrate diets, 4 h after feeding, without interfering (P>0.05) on dry matter intake, total short chain fatty acids concentration, molar proportion of acetate, lactic acid and ammoniacal nitrogen (NH3-N) concentration. A decrease (P<0.05) in molar proportion of propionate was observed with PAP utilization compared to monensin but not in relation to control.

Resumo: Nove fêmeas bovinas canuladas no rúmen foram utilizadas para avaliar um preparado de anticorpos policlonais (PAP) de origem aviária contra as bactérias ruminais Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Clostridium aminophilum, Peptostreptococcus anacrobius e Clostridium sticklandii. O delineamento experimental foi o quadrado latino 3 X 3 replicado 3 vezes, em arranjo fatorial de tratamentos 3 X 3 referente a 2 modificadores ruminais, monensina (MON) e PAP mais o grupo controle (CON) e 3 fontes energéticas, milho seco moído (MSM), silagem de grão úmido de milho (SGUM) e polpa cítrica (PC). Cada subperíodo experimental foi composto de 21 dias, onde a coleta de líquido ruminal foi realizada às 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 h após a alimentação no último dia do período. Foram avaliados o consumo de matéria seca e os parâmetros de fermentação ruminal pH, concentração total de ácidos graxos de cadeia curta (AGCCt), lactato total e nitrogênio amoniacal (N-NH3). O PAP mostrou-se tão eficaz como a monensina em elevar o pH ruminal de bovinos alimentados com dietas ricas em concentrados, às 4 h após a alimentação, sem contudo, alterar (P>0,05) o consumo de matéria seca, a concentração total de ácidos graxos de cadeia curta, a proporção molar de acetato ou as concentrações de lactato total e nitrogênio amoniacal. Foi observada diminuição (P<0,05) na proporção molar de propionato com a utilização do PAP em relação a monensina, porém não em relação ao controle.
Abstract: Nine ruminally cannulated cows were used to test an avianderived polyclonal antibody preparation (PAP) against the specific ruminal bacterias Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Clostridium aminophilum, Peptostreptococcus anacrobius and Clostridium sticklandii. The experimental design was a 3 X 3 latin square replicated 3 times with a factorial arrangement of treatments 3 X 3 regarding 2 rumen modifiers (monensin (MON) and PAP) plus control group (CON) and 3 energetic sources. The energetic sources utilized were dry-grounded corn grain (CG), high moisture corn silage (HMCS) and citrus pulp (CP). Each trial had 21 days; the ruminal fluid sampling was carried out on the last day of the period at 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 h after morning meal. Dry matter intake and rumen fermentation parameters such as pH, total short chain fatty acids (tSCFA), lactic acid and ammoniacal nitrogen (NH3-N) concentration were analyzed in this trial. PAP was as effective as monensin in increasing ruminal pH of cattle fed high concentrate diets, 4 h after feeding, without interfering (P>0.05) on dry matter intake, total short chain fatty acids concentration, molar proportion of acetate, lactic acid and ammoniacal nitrogen (NH3-N) concentration. A decrease (P<0.05) in molar proportion of propionate was observed with PAP utilization compared to monensin but not in relation to control.
Orientador: Mário de Beni Arrigoni
Coorientador: Paulo Henrique Mazza Rodrigues
Banca: Rafael da Costa Cervieri
Banca: Renata Helena Branco Arnandes
Banca: Flávio Augusto Portela Santos
Banca: Telma Teresinha Berchiell
Doutor

Aggregatibacter actinomycetemcomitans está freqüentemente associado a vários quadros de periodontites e infecções não orais. Há controvérsias quanto aos dados de nível de imunoglobulinas específicas em pacientes com periodontites, o que pode ser decorrente da ação de protease de A. actinomycetemcomitans. O objetivo do trabalho foi obter e utilizar os anticorpos policlonais para a análise de protease à IgG humana em isolados de A. actinomycetemcomitans, avaliar nível de IgG específica, analisar efeito de sobrenadante de cultivo de A. actinomycetemcomitans no nível de IgG específica em salivas de pacientes com periodontites, avaliar nível de protease à imunoglobulina G no decorrer da infecção experimental em camundongos. Foram obtidos inicialmente anticorpos policlonais de coelho e de camundongos por imunização dos mesmos com a fração cromatográfica de sobrenadante de cultura de Aa ATCC 43718 com atividade de protease. Os anticorpos obtidos foram analisados por western blotting (WB) e por cromatografia em coluna de sephadex G-150. Esses anticorpos policlonais foram utilizados para determinar níveis de protease em amostras de sobrenadante de cultivo de isolados provenientes de pacientes com periodontite agressiva localizada (PAL) e com periodontite ulcerativa necrotizante associada à síndrome da imunodeficiência adquirida (PUN/SIDA), por ELISA captura. Adicionalmente foi realizada a análise de nível de IgG anti-protease em amostras de salivas de pacientes com PAL e controles saudáveis e o efeito de sobrenadante de cultura de cepa de referência (ATCC 43718) no nível de IgG anti-leucotoxina em salivas de pacientes com PAL utilizando ELISA indireto. Utilizando a mesma metodologia foi realizada a análise de nível de protease em tecidos e plasma além de anticorpo específico em camundongos BALB/c infectados por inoculação bucal de A. actinomycetemcomitans (ATCC 43718 sorotipo b) nos dias 15, 30 e 60 pós-infecção. Os resultados obtidos demonstraram que os anticorpos interagem com antígeno de ~50kDa por WB, sendo capazes reconhecerem as frações cromatográficas contendo atividade de protease. Por ELISA captura, foi observado nível similar de protease nos isolados com PAL e PUN/SIDA. Por ELISA indireto foi observado nível significativamente mais elevado de IgG anti-protease em grupo de salivas de pacientes com PAL em relação ao grupo saudável e após a incubação de salivas com sobrenadante de cultura houve decréscimo no nível de IgG específica em todas as amostras analisadas. Em camundongos infectados foram observados níveis significativamente elevados de protease em tecidos e no plasma, sendo em nível maior na fase inicial da infecção para amostras de gengiva palatal enquanto que os níveis cardíaco e cerebral foram maiores na fase mais tardia (60 dias). Foi observado também aumento significativo no nível plasmático de IgG anti-protease em nível mais elevado no período de 15/30 que 60 dias pós-infecção. Concluímos pelos resultados obtidos que a protease presente no sobrenadante de cultura de A. actinomycetemcomitans possivelmente apresenta MM de ~50 kDa, que os níveis de protease à IgG são similares entre os isolados provenientes de pacientes com PAL e PUN/SIDA, que ocorre aumento no nível salivar de IgG específica e que os níveis de anticorpos específicos podem sofrer decréscimo pela atuação de sobrenadante de cultivo de A. actinomycetemcomitans, sugerindo potencial desse microrganismo em alterar título de anticorpos na saliva. Concluímos também que a infecção bucal de camundongos com A. actinomycetemcomitans induz aumento no nível de protease à IgG, tanto localmente como de forma sistêmica e, se esse aumento interfere na diminuição de IgG específica à A. actinomycetemcomitans no decorrer da infecção, requer estudos adicionais.
Aggregatibacter actinomycetemcomitans is frequently associated to periodontitis and extra oral infections. The immunoglobulins specific’s level controversies in the literature could be due to the protease released by this microorganism with capacity of degrading immunoglobulin G. The objective of present work was to produce policlonals antibodies to A. actinomycetemcomitans protease and to use these antibodies for the protease dosage in A. actinomycetemcomitans clinical isolates, for evaluate the salivary specific IgG levels and for the effect of culture supernatants in salivary specific IgG level from periodontitis patients and also for evaluate the protease levels and specific IgG levels in the course of the experimental infection in mice. Initially, rabbit and mice policlonal antibodies were obtained by using protease fraction (Aa ATCC 43718 sephadex G-150 chromatography fractions) and analyzed by western blotting (WB) and by chromatography fractions interactions. By using these antibodies, the levels of protease were determined in A. actinomycetemcomitans culture supernatants (A. actinomycetemcomitans isolated from localized aggressive periodontitis (LAP), with necrotizing ulcerative periodontitis associated to acquired immunodeficiency syndrome NUP/AIDS) and reference Aa ATCC 43718), by ELISA capture. Additionally salivary IgG anti-protease level and the effect of Aa ATCC 43718 culture supernatant in the level of IgG anti-leucotoxin were determined by indirect ELISA. Also the protease levels in palatal, cardiac and cerebral tissues and plasma from BALB/c mice infected with oral inoculation of A. actinomycetemcomitans (ATCC 43718 serotype b) were analyzed by ELISA capture, at 15, 30 and 60 days post-infection (p.i). Additionally IgG anti-protease to IgG level was determined by indirect ELISA. The results showed the antibodies interaction with ~50kDa antigen by WB, and also recognition of protease active chromatography fractions. By ELISA capture, it was observed protease levels are similar between clinical isolated of LAP and PUN/AIDS group. Also higher IgG anti-protease level was detected in the PAL salivary samples in relation to healthy group by indirect ELISA. According to expected after the incubation of saliva with culture supernatants it was observed decreased specific IgG level. In conclusion, the A. actinomycetemcomitans protease to IgG possibly presents MM of ~50 kDa, it was observed protease levels are similar between clinical isolated of LAP and PUN/AIDS group. Also the salivary IgG anti-protease is increased in PAL patients and the specific salivary antibodies levels can be decreased by soluble proteases presents in A. actinomycetemcomitans culture supernatants, suggesting potential of this microorganism in altering title of antibodies in the saliva. In infected mouse it was observed significantly increased levels of protease to IgG in plasma and infected tissues, with higher levels in the initial phase of the infection (15 days) in the palatal and later phase in cardiac and cerebral tissues. Also significantly IgG anti-protease increased levels was observed in plasma of infected group, more evident in 15/30 than 60 days p.i. In conclusion, the A. actinomycetemcomitans protease to IgG possibly presents MM of ~50 kDa, the protease levels are similar between clinical isolated of LAP and PUN/AIDS group, the salivary IgG anti-protease is increased in PAL patients and the specific salivary antibodies levels can be decreased by A. actinomycetemcomitans culture supernatants, suggesting potential of this microorganism in altering title of antibodies in the saliva. Also the oral A. actinomycetemcomitans mice infection induces local as systemic increase in the protease level and, if this increased level interferes in the reduction of specific IgG to A. actinomycetemcomitans in the course of the infection, require additional studies.