Dissertations / Theses on the topic 'Anticorps bispécifique'

Nous avons developpe et etudie in-vitro ainsi qu'in-vivo deux nouveaux types d'anticorps bispecifiques (ac-bs). Le premier de ces ac-bs a ete developpe pour cibler et concentrer une cytokine specifiquement dans un site tumoral. Pour cela, nous avons couple chimiquement un fragment fab' d'ac monoclonal (acm) anti-tumeur (anti-antigene carcinmbryonnaire (ace)) avec un fragment fab' d'acm anti-cytokine (anti-facteur de necrose tumoral (tnf)). A l'aide de cet ac-bs nous avons realise un ciblage tumoral specifique de tnf chez la souris nue porteuse de carcinome de colon humain. En comparaison aux souris temoins n'ayant recu que du tnf seul, nous avons a l'aide de cet ac-bs augmente par un facteur 3 la concentration de tnf dans les tumeurs portees par les souris nues. Le second type d'ac-bs developpe est dit bi-paratopique car capable de fixer simultanement 2 epitopes du meme antigene cible. Nous avons produit 6 ac biparatopiques a l'aide de 4 fragments fab' d'acm dirige contre un epitope different de l'ace en couplant chimiquement 2 a 2 ces 4 fragments. Nous avons demontre in vitro la bi-paratopicite de ces 6 acs et observe l'augmentation des constantes d'affinite pour l'ace de ces acs bi-paratopiques. L'evaluation in vivo des 6 acs biparatopiques en comparaison aux acs parentaux a permis de selectionner 1 ac bi-paratopique pour sa capacite a se localiser et son temps de retention au site tumoral plus important.

L'objectif de cette thèse est de concevoir un nouveau type d’anticorps thérapeutiques bispécifiques pour éliminer de manière ciblée des facteurs solubles pro-tumoraux du microenvironnement tumoral selon un mécanisme de sweeping antibody via le ciblage du récepteur de la transferrine (TfR1). Le TfR1 est un récepteur surexprimé dans de nombreuses tumeurs. Il permet l’apport cellulaire en Fer selon un mécanisme FcRn-like. Le facteur soluble à éliminer choisi pour cette preuve de concept est l’interleukine (IL-6), une cytokine multifonctionnelle impliquée dans la progression tumorale. Trois formats d’anticorps différents bispécifiques ont été conçus à partir d’anticorps antagonistes internalisants ciblant le TfR1 et d’un anticorps anti-IL-6 non neutralisant à liaison pH-dépendante. Nous avons mis en évidence que (1) les 3 formats d’anticorps bispécifiques conservent les propriétés de liaison à l’IL-6 (liaison à pH physiologique mais pas à pH acide) et au TfR1 des anticorps parentaux (blocage de l’internalisation du ligand holo-transferrine via le TfR1) et (2) qu’ils permettent l’internalisation de l’IL-6 via le TfR1. L’activité sweeping a été évaluée in vitro par une comparaison des activités inhibitrices des anticorps bispécifiques et de la combinaison des anticorps parentaux sur des lignées cellulaires à croissance IL-6 dépendante (myélome XG-6 et XG-7) ou non (lymphome RAJI). L’élimination de l’IL-6 a également été mise en évidence in vivo en monitorant la concentation d’IL-6 dans le plasma de souris xénogreffées avec une lignée de cancer du pancréas productrice d’IL-6. Les résultats de cette thèse montrent qu’il est possible d’obtenir une activité sweeping TfR1-dépendante ce qui ouvre un large panel d’applications thérapeutiques dans le ciblage de facteurs solubles pro-tumoraux par l’utilisation de récepteurs tumeurs spécifiques-TfR1-like
The objective of this thesis is to design a new type of bispecific therapeutic antibodies to selectively eliminate soluble pro-tumoral factors from the tumor microenvironment by a sweeping antibody mechanism by targeting the transferrin receptor (TfR1). TfR1 is an overexpressed receptor in many tumors. It allows iron cell supply by a FcRn-like mechanism. The soluble factor chosen for this proof of concept is interleukin (IL-6), a multifunctional cytokine involved in tumor progression. Three different bispecific antibody formats have been developed based on internalizing antagonistic antibodies targeting TfR1 and a pH-dependent non neutralizing anti-IL-6 antibody. We highlight that (1) the 3 formats of bispecific antibodies retain the binding properties to IL-6 (binding at physiological pH but not at acidic pH) and TfR1 of parental antibodies (blocade of holo transferrine internalization) and (2) allow the internalization of IL-6 via TfR1. Sweeping activity was evaluated in vitro, by comparing the inhibitory activities of bispecific antibodies and the combination of parental antibodies on cell lines with IL-6 growth dependent (myeloma XG-6 and XG-7) or not (lymphoma RAJI). IL-6 elimination was also demonstrated in vivo by monitoring IL-6 elimination in the plasma of xenografted mice with an IL-6-producing pancreatic cancer line. The results of this thesis show that it is possible to obtain a TfR1-dependent sweeping activity, which opens up a wide range of therapeutic applications in the targeting of pro-tumor soluble factors by the use of specific TfR1-like tumor receptors

Stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale constitue une voie d’avenir indiscutable pour le traitement des cancers. Aujourd'hui, les thérapies ciblées à base d'anticorps ont une place majeure dans l’immunothérapie des cancers du sein de par leur impact positif sur le pronostic des patientes. Cependant, les cancers du sein triple négatifs (TNBC) résistent aux innovations thérapeutiques actuelles, et, par défaut de traitement ciblé efficace, restent de sombre pronostic. Notre équipe développe des stratégies d’immunothérapie à base d'anticorps bispécifiques (bsFabs) conçus à partir de fragments d'anticorps de camélidés qui présentent la particularité de cibler simultanément les cellules immunitaires et tumorales. Ainsi, mon projet visait à évaluer le potentiel anti-tumoral de deux bsFabs sur des modèles précliniques de TNBC à travers leur capacité à activer et à rediriger le système immunitaire contre les cellules tumorales. La finalité du projet est de proposer un nouvel axe de thérapie ciblée susceptible d'améliorer le pronostic des patientes atteintes de TNBC
Mounting evidence of the key contribution of NK cells in immunity against cancer has boosted the investigations on NK cell-based therapies. Among these strategies, monoclonal antibody-based therapeutics (mAbs) are currently the fastest growing segment of the medicine market. Despite therapeutic innovations, triple negative breast cancers (TNBC) remain insensitive to the current targeted or hormono-therapies. Our objective is to manipulate NK cell functions and tumor targets using an original format of nanobody-based bispecific antibodies (bsFab) to revert the dampened immune response for treating TNBC. Thus, we generate two bsFabs able to crosslink NK and tumor cells. NK antitumor effects driven by mAbs and bsFabs, alone or in combination, were investigated in vitro and in vivo on preclinical TNBC models. Here, we demonstrate the potential of bsFabs to enlarge the number of patients eligible for breast cancer immunotherapy and prompt to consider combination strategies

L'imagerie TEP par la technique de préciblage, exposée dans cette thèse, est proposée avec le gallium-68. Ce travail s'articule en deux axes. La première partie évalue une nouvelle technique de production chimique par le N,N′-(o-phénylène)dimalémide d'un anticorps bispécifique ciblant à la fois un antigène tumoral et un haptène. La seconde partie étudie le radiomarquage et les propriétés radiochimiques des complexes du 68Ga avec différents chélatants pour la fonctionnalisation de l'haptène bivalent di-HSGL. L'optimisation de la technique de synthèse de l'anticorps bispécifique a montré qu'un pourcentage de 5 % (p/p) de pepsine est suffisant pour obtenir une digestion optimale de l'anticorps en F(ab')2. Les études sur la réduction des ponts disulfures du F(ab')2 et sur l'intégrité des Fab' formés montrent qu'un réducteur doux limite la dégradation du Fab' tout en maintenant un bon rendement de réduction. L'étude d'affinité indique que l'affinité de l'anticorps bispécifique synthétisé avec le dimalémide est suffisante pour le ciblage efficace de tumeurs positives à l'antigène CEA. La deuxième partie de ce travail concerne l'étude radiochimique du chélatant cyclique DOTA et acyclique HBED complexés au 68Ga. L'ensemble des résultats de radiomarquage et des études de stabilité semblent montrer que l'HBED est un chélatant de choix pour le radiomarquage de l'haptène avec le 68Ga. Son radiomarquage est réalisable à faible température et avec une activité spécifique supérieure à celle du DOTA. Le rendement de radiomarquage du complexe HBED-68Ga et l'optimisation de la technique doivent permettre d'injecter le peptide radiomarqué sans purification du produit fini
In this study, the affinity enhancement system is proposed with nuclear imaging using gallium-68. This work is presented in two parts. The first part investigates new chemistry system used N,N′-(o-phenylene)dimalemide to produce a bispecific antibody which targets a tumour antigen and a hapten. The second part evaluates radiolabel and radiochemistry properties of 68Ga complexes using two chelators in order to radiolabel divalent hapten named di-HSGL. Synthesise optimisations show that the optimal digestion of antibody is realized with 5 % of pepsin (p/p). F(ab')2 reduction studies indicate that cysteamine, a soft powerful reducing agent, is enough to reduce disulfide bonds and does protect the integrity of created Fab'. Eventually, the affinity studies of the new divalent vector confirm the good affinity constants to both antigen and hapten. The second part presents radiochemistry studies of DOTA and HBED chelators for 68Ga. They show HBED is more interesting than DOTA to radiolabel hapten with 68Ga. Radiolabel is made at room temperature. Its specific activity is better than DOTA's one. Radiolabel rate and method optimization should allow to inject the final product without purification stage

LE FACTEUR DE NECROSE TUMORALE ALPHA (TNFalpha) A MONTRE UN EFFET RADIOSENSIBILISANT DANS PLUSIEURS MODELES IN VITRO ET IN VIVO. EN CLINIQUE, SON UTILISATION SYSTEMIQUE A ETE MARQUEE PAR UNE TOXICITE MAJEURE. NOTRE METHODE DE CIBLAGE PAR LES ANTICORPS BISPECIFIQUES (AcBs) A PERMIS DE DELIVRER LE TNFalpha AU SEIN DE LA TUMEUR EN CIBLANT L'ANTIGENE CARCINOEMBRYONNAIRE (ACE). LE PREMIER OBJECTIF A ETE DE MONTRER L'EFFET RADIOSENSIBILISANT DU TNFalpha IN VITRO DANS DIFFERENTS MODELES DE CANCERS DIGESTIFS EXPRIMANT L'ACE EN ESSAYANT D'ANALYSER LE MECANISME IMPLIQUE, EN PARTICULIER, CONCERNANT LE CYCLE CELLULAIRE. LE SECOND OBJECTIF A ETE DE TRANSPOSER CES RESULATS IN VIVO DANS DIFFERENTS MODELES PRE-CLINIQUES EN UTILISANT UN AcBs ANTI-ACE/ANTI-TNFalpha. IN VITRO, NOUS AVONS MONTRE UN EFFET ADDITIF DE L'ASSOCIATION RADIOTHERAPIE (RT) + TNFalpha DANS DEUX MODELES DE TUMEUR HUMAINE EXPRIMANT L'ACE : LES LIGNEES COLIQUE LS174T ET PANCREATIQUE BxPC-3. APRES TRAITEMENT PAR LE TNFalpha, L'ETUDE DU CYCLE CELLULAIRE A MIS EN EVIDENCE UNE DIMINUTION DE L'ARRET EN G2 RADIO-INDUIT ET DE LA PHASE S AU DEPEND D'UNE AUGMENTATION DU NOMBRE DE CELLULES DANS LA PHASE G1. IN VIVO, DES SOURIS NUES GREFFEES ONT RECU DIFFERENTS TRAITEMENTS : SERUM PHYSIOLOGIQUE (NaCI), TNFalpha, AcBs, TNFalpha + AcBs, RT + NaCI, RT + TNFalpha + AcBs. UNE DIFFERENCE SIGNIFICATIVE DU DELAI DE PROGRESSION TUMORALE A ETE MISE EN EVIDENCE ENTRE LE GROUPE RT + NaCI ET LE GROUPE RT + AcBs + TNFalpha. DES EXPERIENCES AVEC DES SOURIS TRANSGENIQUES POUR L'ACE GREFFEES AVEC DES TUMEURS COLIQUES MURINES TRANSFECTEES AVEC LE GENE DE L'ACE ONT MONTRE UN DELAI DE PROGRESSION TUMORALE NETTEMENT INFERIEUR DANS LE GROUPE RT + TNFalpha HUMAIN + AcBS DONT DEUX GUERISONS. DES EXPERIENCES UTILISANT UN TNFalpha MURIN SONT EGALEMENT EN COURS AFIN D'EVALUER TOUT LE POTENTIEL THERAPEUTIQUE ET LES TOXICITES LIMITANTES DE CETTE STRATEGIE DANS UN MODELE ANIMAL IMMUNOCOMPETENT AVANT L'OUVERTURE D'UNE ETUDE CLINIQUE DE PHASE I.

Le système immunitaire protège un organisme du développement de pathogènes et participe activement au maintien de la tolérance immunitaire. Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules spécialisées dans l’équilibre pro et anti-inflammatoire de la réponse immunitaire. Les DC jouent un rôle important dans de nombreux contextes pathologiques notamment la transplantation d’organes, en oncologie et dans les pathologies inflammatoires. Elles sont modulables grâce à divers facteurs, intrinsèques et extrinsèques. Parce qu’elles sont capables d’induire une réponse tolérogène, ces cellules représentent des cibles intéressantes pour moduler la réponse immunitaire dans le contexte de la transplantation d’organes et des pathologies inflammatoires. Certains agents pathogènes utilisent des mécanismes d’échappement au système immunitaire en favorisant l’induction d’une tolérance immunitaire. Cette modulation est réalisée par le ciblage des récepteurs de reconnaissance des pathogènes (PRR) sur la présence des DC, induisant la synthèse d’une cytokine antiinflammatoire IL-10, un des inducteurs de la tolérance immunitaire. Notre stratégie a été de construire un anticorps bispécifique ciblant deux PRR différents à partir d’une banque d’anticorps anti-PRR. Notre travail montre que cet anticorps bispécifique est capable d’orienter les DC vers d’un profil tolérogène. Cet anticorps bispécifique induit un phénotype de DC semi-mature avec un profil de sécrétion pro-tolérogène avec de l’IL-10 et peu de cytokines inflammatoires. Le profil de tolérance immunitaire induite par ces cellules reste à explorer. Nos travaux ouvrent de perspectives intéressantes sur l’association des PRR en vue d’obtenir la modulation des cellules de l’immunité
The immune system protects an organism from the development of pathogens and actively participates in maintaining immune tolerance. Dendritic cells (DC) are specialized cells in the balance and anti-inflammatory immune response. DC play an important role in many pathological contexts, including organ transplantation, oncology and inflammatory diseases. Various factors, both intrinsic and extrinsic, can modulate. Because they are capable to inducing a tolerogenic response, these cells represent interesting targets for the immune response in the context of organ transplantation and in inflammatory pathologies. Some pathogens use mechanisms of escape to the immune system by promoting the induction of immune tolerance. This modulation is achieved by targeting the pathogen recognition receptors (PRRs) present on the surface of DC, inducing the synthesis of an anti-inflammatory cytokine IL-10, one of the main inducers of immune tolerance. Our strategy was to construct a bispecific antibody targeting two different PPRs from an anti-PRR antibody library. Our work shows that this bispecific antibody is able to direct the DC to a pro-tolerogenic profile. This bispecific antibody induces a semi-mature DC phenotype with a secretion profile of pro-tolerogenic cytokines such as IL-10 and few inflammatory cytokines. The immune tolerance profile of these DC remains to be explored. Our work opens interesting perspectives on the association of PRRs in order to obtain the modulation of the cells of the immunity

Dans le but d'améliorer le ciblage des radioisotopes pour le diagnostic et la thérapie des cancers, nous avons développé des anticorps bispécifiques ( AcBs ) qui ciblent 2 épitopes du même antigène ou 2 antigènes distincts. Dans la première partie de la thèse, nous avons préparé des AcBs dirigés contre 2 épitotes de l'antigène carcinoembryonnaire ( ACE ). Ces anticorps ont été nommés anticorps biparatopiques (AcBp). Nous avons préparé 6 AcBp et montré qu'ils ont une affinité supérieure à celle des fragments parentaux. L'évaluation in vivo a mis évidence un AcBp qui se localise mieux que ses fragments parentaux dans un modèle carcinome colique humain exprimant l'ACE. Nous avons ensuite poursuivi ces travaux en modifiant les liens de couplage des AcBp ou en préparant des anticorps triparatopiques dirigés contre trois épitotes de l'ACE. Dans la deuxième partie, nous avons appliqué le concept des AcBs aux cancers du sein en préparant des anticorps dirigés contre l'ACE et ErbB-2. Nous avons montré que dans un modèle tumoral exprimant l'ACE et ErbB-2, ce type d'anticorps se localise mieux que les fragments anti-ErbB-2 parentaux. Par contre, le taux de captation tumorale de l'AcBs est inférieur à celui des fragments anti-ACE parentaux. Cela peut être expliqué par le fait que l'AcBs est internalisé dans les cellules après fixation de son fragment anti-ErbB-2 sur son antigène cible. Dans la troisième partie, nous avons développé un Acbs pour le ciblage de cytokines, en couplant un fragment Fab' anti-interleukine 2 (IL-2) et un fragment Fab' anti-antigène associé aux mélanomes ( HMW-MAA). Les résultats préliminaires n'ont pas montré d'effet de IL-2 sur la biodistribution d'anticorps radiomarqués dans un modèle de mélanome humain et les études de paramètres vasculaires ont confirmé que l'IL-2 n'avait pas d'effet vasoactif dans ce modèle. L'ensemble de ces travaux a montré différents aspects de l'utilisation des AcBs et leur intérêt pour le diagnostic et la thérapie des cancers.

Le laboratoire a développé une nouvelle génération d’anticorps bispécifiques, basée sur l’utilisation de domaines variables d’anticorps de lamas simple-chaîne lourde (VHH). Les domaines humains Ck et CH1 ont été utilisés comme motif de dimérisation de 2 VHH, liant l’antigène carcinoembryonnaire (CEA) et le récepteur activateur FcγRIIIA (ou CD16A) exprimé par les cellules Natural Killer. Différents formats d’anticorps bispécifiques ont été produits en système bactérien et caractérisés in vitro et in vivo. Après incubation à 37°C en sérum humain, les formats bsFab sont stables au moins 7 jours, et les bsFab2 31h. Une biodistribution en souris nude montre une rétention des bsAb dans les tumeurs CEA+. Un suivi de la compétition avec les IgG humaines sériques pour la liaison au CD16A humain a montré que les bsAb ne sont pas en compétition avec les IgG humaines. De plus, les bsAb sont capables d’induire une cytotoxicité de Natural Killer de donneurs à très faibles concentrations in vitro
The lab has designed a new kind of bispecific antibodies, based on the use of llama domain antibodies (VHH). Human Ck and CH1 domains have been used as a natural dimerization motif to bring together two domain antibodies binding to carcinoembryonic antigen (CEA) and activating receptor FcγRIIIA (CD16A) expressed by NK cells. Differents bispecific antibodies formats (bsFab and bsFab2) with variable binding profiles on the target cells have been produced in bacterial system and caracterized in vitro and in vivo. BsFab are stable at least for 7 days when incubated in human serum at 37°C, and bsFab2 are stables for 31h. Biodistribution in nude mice showed that bsAb are retained in CEA+ tumor. A competition study of CD16A binding with human IgG showed that bsAb are not in competition with human IgG, contrary to Fc-bearing molecules. Moreover, bsAb are able to induce, via CD16A binding, donnor’s Natural Killer cytotoxicity in vitro et very low concentrations

Deux souches d'hybrides d'hybridomes, l'une E13 sécrétant une IgG1 anti-Cytomegalovirus, l'autre 70B12 sécrétant une IgG3 anti-Chlamydia trachomatis, ont été fusionnées pour obtenir des anticorps monoclonaux bispécifiques murins et démontrer la réassociation hétérologue "in vivo" des chaînes lourdes gamma 1 et gamma 3. Après fusion, nous avons obtenu des clones de "quadromes" avec un rendement de 27%. 77 % de leur surnageant présentent des immunoglobulines à la fois positives sur cellules MRC5 infectées par Cytomegalovirus et sur cellules Hela infectées par Chlamydia trachomatis. Mais cette double spécificité ne prouve pas l'existence d'anticorps hybrides car l'hybride d'hybridomes peut produire simultanément l'anticorps bispécifique et les deux anticorps monospécifiques parentaux. Parmi les sept clones choisis au hasard, six présentent dans leur surnageant des immunoglobulines hybrides IgG1/IgG3. Après immunopurification de deux ascites différentes, 10 % d'anticorps hybrides ont été mis en évidence. Ce ne sont pas des hétéroaggrégats formés à partir de deux immunoglobulines parentales. Ces anticorps présentent les quatre types de chaînes lourdes et légères, et des paires homologues de chaînes lourdes et légères de chaque type sont capables de se réassocier pour donner les deux activités immunologiques
A fusion technique between E13 hybridomas secreting an anti-Cytomegalovirus (IgG1) and 70B12 hybridomas secreting an anti-Chlamydia trachomatis (IgG3) was set up to obtain murin bispecific monoclonal antibodies and to demonstrate the possible "in vivo" association between gamma 1 and gamma 3 heavy chains. After fusion, 27 % of seeded wells showed hybridomas growth and 77% of their supernatants were reactive with both Cytomegalovirus infected cells and Chlamydia trachomatis infected cells. But, this double specificity is not sufficient to prove the existence of a hybrid antibody molecule : hybrid hybridoma can produce simultaneously the bispecific antibody and the parental monospecific antibodies. Among seven clones random selected, six surpernatants of them showed IgG1/IgG3 hybrid immunoglobulins and 10% hybrid antibodies were revealed in immunopurified ascites of two hybrid hybridomas ascites. We showed that they were not heteroaggregats made up of two parental immunoglobulins. These antibodies exhibited four types of heavy and light chains ; and heavy chain of each type might associate with light chain of homologue type to give two immunological activities

Avec quatorze anticorps utilisés en oncologie, les anticorps monoclonaux ont enfin une place de choix dans l'arsenal thérapeutique anticancéreux. Cependant, l'un des modes d'action les plus importants de ces molécules, la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), souffre de plusieurs limites en raison de la nécessité d'une interaction optimale avec le FcγRIIIA. L'équipe du Dr. Daniel Baty a conçu de nouveaux formats d'anticorps bispécifiques basés sur l'utilisation de domaine unique d'anticorps de lamas (sdAb) et capables de contourner la plupart de ces limites. Des banques de phages issus de lamas immunisés ont permis de sélectionner deux sdAbs (d'affinités différentes) dirigés contre le FcγRIIIA exprimé par des cellules NK et les macrophages, ainsi qu'un sdAb dirigé contre l'antigène tumoral carcino-embryonnaire (ACE). En utilisant les domaines CH1 et Ck d'IgG1 humaine comme motif d'hétérodimérisation et les sdabs anti-ACE et anti-FcγRIII précédemment sélectionnés, nous avons développé des formats innovants d'anticorps bispécifiques Fab-like nommés bsFabs. Ces molécules sont faciles à produire, très stables et peuvent déclencher la lyse des cellules tumorales par les cellules NK humaines à des concentrations de l'ordre du picomolaire. Elles ne se lient pas au récepteur inhibiteur FcγRIIB, n'entrent pas en compétition avec des IgG sériques pour la liaison aux récepteurs, et leur activité cytotoxique est indépendante de la glycosylation du Fc et du polymorphisme du FcγRIIIA
With fourteen antibodies used in oncology, monoclonal antibodies finally have a place in the therapeutic arsenal against cancer. However one of the modes of action of the most important of these molecules, cell-mediated cytotoxicity antibody-dependent (ADCC), suffers from several limitations due to the need for optimal interaction with the FcγRIIIA. Daniel Baty's team has developed new formats of bispecific antibodies based on the use of single domain llama antibodies (SdAb) that are capable of circumventing most of the these limitations. Phage libraries from immunized llamas were used to select two sdAbs directed against the FcγRIIIA expressed by NK cells and macrophages (with different affinities for FcγRIII), as well as one SdAb directed against the tumor antigen carcinoembryonic (CEA). Using CH1 and Ck domains of human IgG1 as a motif for heterodimerization and sdabs previously selected, we have developed innovative anti-CEA and anti-FcγRIII formats of bispecific antibodies Fab-like named bsFabs. These molecules are easy to produce, very stable and can trigger tumor cell lysis by human NK cells at picomolar concentrations. They do not bind FcγRIIB inhibitory receptor, do not compete with serum IgG and their cytotoxic activity is independent of FcγRIIIA polymorphism. In addition, they slow tumor growth in mouse model. In terms of pharmacokinetics, although bsFabs have a reasonable tumor retention, one of the limitations of these formats is size, which leads to rapid renal elimination. Such findings led us to consider the creation of new antibody formats to both increase tumor retention and secondly the half-life of antibodies in the body

Les cellules Natural Killer (NK) sont des cellules de l'immunité innée qui jouent, avec les lymphocytes T, un rôle majeur dans l'immunosurveillance anti-tumorale. Elles sont capables d'identifier une cellule maligne par un jeu de récepteurs inhibiteurs et activateurs, qui agissent en balance pour déclencher ou réprimer le processus de lyse cellulaire. Parmi les récepteurs activateurs des cellules NK, le récepteur NKG2D est celui pour lequel les ligands ont été les mieux caractérisés. Il s'agit notamment chez l'homme de la molécule MICA (MHC class I Chain-related protein A), de forte homologie avec les molécules de CMH I, et exprimée à la membrane cellulaire suite à un stress (infection virale, transformation tumorale. . . ). Toutefois, comme les cellules tumorales sont capables d'échapper à la lyse par les lymphocytes T cytotoxiques, via la perte d'expression des molécules de CMH I, elles sont également capables d'empêcher leur reconnaissance par les cellules NK, par une diminution de l'expression à leur membrane de la molécule MICA. L'objectif de ce projet était de restaurer l'expression de ce ligand, pour favoriser la reconnaissance et la lyse de cellules tumorales par les cellules NK. Pour cela, il a été élaboré, par biochimie et par biologie moléculaire, des molécules bifonctionnelles associant la molécules MICA à une structure de reconnaissance antigénique spécifique d'un antigène associé aux tumeurs. L'évaluation in vitro de ces molécules a démontré (i) leur capacité à cibler de manière spécifique la membrane de cellules tumorales, (ii) à recouvrir ces cellules de molécules MICA et (iii) à induire leur lyse par des cellules NK via NKG2D. L'évaluation in vivo de ces molécules a confirmé leur capacité à cibler de manière spécifique, après injection systémique, des cellules tumorales et à favoriser leur rejet par les cellules NK. Ces molécules pourraient donc constituer de bons candidats en clinique, en thérapie de seconde ligne, pour le ciblage et la destruction des nodules métastatiques.

Ce travail a évalué la toxicité et l'efficacité de la radioimmunothérapie (RIT) en deux temps avec l'anticorps bispécifique murin anti-CEA/anti-DTPA F6-734 et le haptène bivalent di-DTPA-131I (réactifs AES) chez des souris greffées avec un cancer médullaire de la thyroi͏̈de (CMT) et chez 26 patients porteurs de récidives de CMT inclus dans une étude de phase I/II. Chez l'animal, la biodistribution des réactifs AES était plus favorable que celle du même anticorps anti-ACE directement marqué et la RIT en deux temps aussi efficace et moins toxique que la RIT en un temps. Des injections répétées de réactifs AES ou l'association avec le paclitaxel améliorait l'efficacité de la RIT sans altérer la tolérance, l'association ayant un effet synergique. Dans l'étude clinique, la toxicité hématologique a limité l'escalade de dose. La dose maximale tolérée était de 48 mCi/m2. Les résultats dosimétriques étaient favorables et quatre réponses tumorales ont été observées
This study evaluated toxicity and efficacy of two-step radioimmunotherapy (RIT) using anti-CEA/anti- DTPA F6-734 murine bispecific antibody F6-734 and di-DTPA-131I bivalent hapten (AES reagents) in mice grafted with a medullary thyroid carcinoma (MTC) and in 26 patients with recurrences of MTC enrolled in a phase I/II trial. In animal, biodistribution was more favorable with AES reagents than with directly labeled fragment of the same anti-CEA antibody. Two-step RIT was at least as efficient as one-step RIT, and markedly less toxic. Repeated injection of AES reagents increased RIT efficacy without increasing toxicity. Addition of paclitaxel improved RIT efficacy with synergistic effect, without increasing toxicity. In the clinical trial, dose-limiting toxicity was hematological, and maximum tolerated dose 48 mCi/m2. Dosimetric results were favorable and four tumor responses were observed

Le myélome multiple (MM) est une maladie hématologique caractérisée par la prolifération anormale de plasmocytes tumoraux dans la moelle osseuse (MO). Les traitements actuels, qui incluent les inhibiteurs du protéasome et les agents immunomodulateurs, ont amélioré la qualité de la réponse et de la survie des patients. Cependant, ils ne permettent pas de guérir les malades, et certains sous-groupes présentent des rechutes rapides, des chimiorésistances et un faible taux de survie. Des stratégies immuno-thérapeutiques ont été récemment développées pour compléter les traitements anti-tumoraux conventionnels. Dans les hémopathies malignes, l'utilisation d’anticorps bi- et tri-spécifiques a permis des régressions tumorales chez des patients en rechute. Ces molécules reconnaissent des protéines exprimées, d’une part par les cellules tumorales, et, d’autre part, par des cellules immunitaires cytotoxiques du malade. Des essais cliniques réalisés avec des anticorps bispécifiques de type Bispecific T-cell Engagers (BiTEs), reconnaissant l’antigène CD19 à la surface des cellules tumorales et l’antigène CD3 à la surface des lymphocytes T, se sont révélés efficaces, notamment dans le traitement des leucémies aiguës lymphoblastiques B. Une stratégie similaire, ciblant des antigènes présents sur les plasmocytes tumoraux pourrait être adaptée au traitement du MM.Nous avons développé des BiTEs dirigés contre les plasmocytes tumoraux des patients atteints de MM. Ces molécules reconnaissent, d’une part, l’antigène CD38, fortement exprimé à la surface des plasmocytes tumoraux, et, d’autre part, recrutent et activent les lymphocytes T via leurs récepteurs CD3e. Nos résultats montrent que ce BiTE, Bi38-3, est capable de reconnaître spécifiquement les plasmocytes tumoraux. En présence de ce BiTE, les lymphocytes T issus de donneurs sains sont capables de développer une forte activité cytotoxique spécifiquement contre les lignées cellulaires de MM in vitro. D’une façon intéressante, le Bi38-3 ne présente pas d’effet cytotoxique contre les cellules B, T et NK qui expriment de faibles niveaux de CD38 en comparaison des cellules de MM. Enfin, le Bi38-3 est capable de contrôler de manière efficace la croissance tumorale dans un modèle murin de xénogreffe de cellules myélomateuses.Ces résultats démontrent que Bi38-3 représente un nouvel agent immuno-thérapeutique anti-myélomateux, qui, utilisé seul ou en association avec les immuno-modulateurs, pourrait améliorer le pronostic des malades réfractaires aux traitements actuellement disponibles
Multiple Myeloma (MM) is a hematological malignancy characterized by the uncontrolled proliferation of clonal tumor plasma cells in the bone marrow. Current treatments, including proteasome inhibitors and immunomodulatory drugs, have improved response and survival rates. However, these treatments are not able to cure patients and sub-groups of patients still show rapid relapse, chemo resistance and low survival rates.Recently, novel immunotherapeutic strategies have been developed to complement these conventional treatments. Bi-and Tri-Specific antibodies have shown to efficiently reduce tumor growth in different hematological diseases. These antibodies on one hand recognize proteins that are expressed on the surface of the tumor cells and on the other hand proteins that are expressed on the surface of cytotoxic cells of the immune system. Clinical trials carried out using BiTEs (Bispecific T-cell Engagers) that recognize CD19 on the surface of tumor cells and CD3 on the surface of T cells, have shown efficient treatment of B acute lymphoblastic leukemia. These promising results have prompted similar strategies targeting antigens expressed on the surface of tumor cells in MM. We have built a new BiTE antibody (Bi38-3), that targets CD38, an antigen highly expressed on tumor plasma cells and also recruits and activate T cells through CD3e. Our results demonstrate that Bi38-3 specifically recognizes malignant plasma cells. We showed that this antibody stimulated cell-lytic activity of T cells isolated from healthy donors against MM cell lines in vitro. In the presence of these antibodies we observed that T cells, isolated from healthy donors, have a lytic effect on MM cell lines in vitro. Interestingly, Bi38-3 does not exhibit cytotoxic effect against B, T and NK cells that express low levels of CD38 compared to MM cell lines. These results have been confirmed using T cells and tumor plasma cells isolated from newly diagnosed and relapsed MM patients. Moreover, Bi38-3 is able to efficiently reduce myeloma tumor growth in a MM pre-clinical mouse xenograft model.Altogether, these results suggest that Bi38-3 represents a promising new immunotherapeutic drug for the treatment of MM that could be used either alone or in combination with immunomodulatory drugs, to improve the prognosis of relapsed or refractory patients

Ce travail a évalué un système de radioimmunothérapie préciblée (PRIT) avec l'anticorps bivalent bispécifique anti-ACE x anti-HSG (TF2) et les peptides bivalents di-HSG IMP325 et IMP288 chez des souris greffées avec des cellules de cancer colique. La greffe tumorale hépatique par voie intraportale apparaît fiable et reproductible. La captation tumorale des anticorps est alors supérieure en comparaison des tumeurs sous-cutanées. La bioluminescence permet un suivi individuel des tumeurs intrahépatiques et fournit des données objectives quantitatives pour les essais thérapeutiques. L'optimisation des paramètres du système de préciblage permet d'obtenir une captation tumorale précoce du peptide marqué atteignant environ 9% DI/g. Les isotopes à demi-vie courte apparaissent les plus adaptés à ce système. L'astate-211 permettrait de délivrer la dose la plus importante à la tumeur (41,5 Gy en considérant un effet biologique relatif de 5) pour une faible quantité de peptide (0,04 nmol), le rein étant l'organe limitant. L'yttrium-90 et le bismuth-213 permettraient de délivrer des doses élevées à la tumeur (18,6 et 5,3 Gy respectivement) pour des doses plus élevées de peptide (0,1 nmol) tout en restant acceptables pour les reins. Il ne serait pas attendu de toxicité médullaire
This study investigated pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) with a divalent antiCEA x anti HSG antibody (TF2) and radiolabeled peptides IMP325 and 288 for human colonic cancer cells grafted in mice. The intraportal route of graft is reliable and reproductible and tumor uptake is higher compared to subcutaneous tumors. Bioluminescence allows follow-up with quantitative data for therapeutic trials. Optimisation of pretargeting allows early tumor uptake of the radiolabeled peptide of environ 9% ID/g. Short half-lives nuclides appear more favorable. For a low dose of peptide (0. 04 nmol), 211At is predicted to deliver a high absorbed dose to tumors (41. 5 Gy considering a relative biologic effect of 5), kidneys being the dose limiting. Yttrium-90 and bismuth-213 would deliver high absorbed doses to tumor (18. 6 and 5. 3 Gy, respectively for 0. 1 nmol) and acceptable absorbed doses to kidneys. Bone marrow absorbed dose is expected to be without significant toxic effects

La place aujourd'hui incontournable des anticorps (Ac) dans l'arsenal thérapeutique s'explique notamment grâce aux technologies diverses utilisées pour accroître leur efficacité, à une meilleure connaissance de la biologie des antigènes ciblés ainsi qu'une meilleure sélection des patients traités. De plus afin de pallier la résistance thérapeutique et d'augmenter l'efficacité des traitements, l'association de thérapie ciblant les cellules cancéreuses à différents niveaux semble être une des stratégies les plus prometteuses. Mon travail de thèse a consisté à utiliser le concept original des anticorps bispécifiques (AcBs) en tant que vecteur de molécule cytotoxique (TNFα), mais également en tant que molécule ciblant deux récepteurs fortement impliqués dans la carcinogénèse : l'EGFR et HER2. Dans une première partie, nous avons montré grâce à notre AcBs anti-TNFα/anti-ACE, l'effet radiosensibilisant du TNFα in vitro et in vivo dans différents modèles de cancers digestifs exprimant l'ACE. Un important délai de la croissance tumorale a été observé dans les groupes de souris traités avec la radiothérapie (RT) associée à l'AcBs-TNFα à la fois dans des modèles de souris immuno-déprimés xénogreffées avec des lignées humaines mais également dans un modèle de souris immunocompétent transgénique pour l'ACE. Dans une seconde partie, nous avons démontré l'effet thérapeutique in vitro et in vivo, dans différents types de carcinomes de l'association de deux Ac humanisés utilisés en clinique, le trastuzumab (Ac anti-HER2) et le matuzumab (Ac anti-EGFR). Cette combinaison d'Ac a induit un fort ralentissement de la croissance tumorale associé à des réponses complètes dans deux modèles de carcinomes pancréatiques exprimant faiblement HER2. Nous avons donc synthétisé un AcBs anti-HER2/anti-EGFR. Des résultats prometteurs ont été obtenus sur l'inhibition de la prolifération de diverses lignées cellulaires mais une optimisation de la méthode de production est néanmoins indispensable pour une évaluation in vivo. Suite aux résultats pré-clinique obtenus dans ces deux projets de recherche, deux études clinques de phase I/II sont en voie d'être développées dans les cancers du pancréas.

Le trastuzumab est le traitement de référence des cancers du sein « HER2 amplifié ». Outre les limitations inhérentes à toute IgG, cet anticorps est inefficace pour traiter les tumeurs exprimant que modérément (cancers hormonaux) ou faiblement (triple négatif) HER2. L'objectif de ces travaux de thèse est de concevoir de nouveaux anticorps bispécifiques destinés au traitement de cancers du sein échappant à l'action du trastuzumab. Nous nous sommes appuyés sur des formats innovants, basés sur l'utilisation d'anticorps simple domaine de lama (sdAb) comme unité de reconnaissance antigénique. Deux anticorps bispécifiques Fab-like (bsFab) ont été développés, l'un dirigé contre HER2 (HER2bsFab) et l'autre ciblant la mésothéline (MesobsFab), un antigène surexprimé dans 30 à 70% des cancers du sein « triple négatif ». En liant spécifiquement et de façon efficace FcγRIII, ces deux bsFabs ne compètent pas avec les IgG endogènes, ne fixent pas FcγRIIB et activent fortement les NKs. In vitro, HER2bsFab induit de fortes sécrétions de cytokines pro-inflammatoires et de puissantes ADCCs contre des lignées de cancer du sein indépendamment du niveau d'expression d'HER2 et du polymorphisme FcγRIIIA-158. In vivo, HER2bsFab montre une nette supériorité comparé au trastuzumab contre des tumeurs ne surexprimant que modérément HER2. HER2bsFab et MesobsFab induisent in vitro de fortes cytotoxicités contre deux lignées de cancer du sein « triple négatif » et des résultats préliminaires réalisés chez la souris semblent confirmer ces observations. A termes, l'utilisation de ces anticorps permettrait d'étendre la proportion de patientes traitables de façon efficace par immunothérapie
Trastuzumab is established as standard of care for the treatment of HER2high breast cancers. However, in addition to Fc-related limitations inherent to IgG antibodies, trastuzumab is inefficient to treat low- (triple-negative) or moderate-HER2-overexpressing (hormone-receptor-positive) breast cancers. Based on the unique structural and functional properties of llama single domain antibodies (sdAbs), we report the design of two Fab-like bispecific antibodies targeted to HER2 (HER2bsFab) and mesothelin (MesobsFab), an antigen overexpressed in several human tumors, including triple-negative breast cancers. The two bsFabs display a unique, specific and high affinity for FcγRIII. As a consequence, they do not bind the FcγRIIB inhibitor receptor and bypass competition with endogenous IgGs. HER2bsFab mediated ADCC at picomolar concentration against HER2high as well as HER2moderate cell lines. In vivo HER2bsFab potently inhibited HER2high tumor growth and more importantly, exhibited a net superiority over trastuzumab at inhibiting HER2moderate tumor growth. Moreover, FcγRIIIA-engagement by HER2bsFab was independent of FcγRIIIA-158 polymorphism and induced a stronger NK cells activation in response to target cell recognition. Such findings led us to investigating the efficacy of bsFabs in a context of low-HER2-overexpression displays by triple-negative breast cancers. In vitro characterization showed that both HER2bsFab and MesobsFab trigger efficient lysis of two different triple-negative breast cancer cell lines. Altogether, these findings would enable the treatment of a broader population of patients than that eligible with current HER2-targeted therapies

Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne, en partie, d’un échappement tumoral au système d’immunosurveillance. Par conséquent, la restauration ou l’induction de ces mécanismes de défense anti-tumorale est une des stratégies thérapeutiques actuelles. Un des principes de l’immunothérapie est basé sur l’injection d’anticorps ayant pour cible la cellule tumorale ou les cellules effectrices de l’immunité. L’efficacité anti-tumorale de ces anticorps a été considérablement améliorée par une meilleure compréhension des modes d’action et des effets modulateurs de ces anticorps. Ainsi, afin d’optimiser l’action des effecteurs immunitaires sur les cellules tumorales, un anticorps bispécifique, trifonctionnel, le catumaxomab, capable de se lier à la molécule d'adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) exprimée par les cellules tumorales et à l'antigène CD3 des lymphocytes T, a été développé, essentiellement en traitement intra-péritonéal des ascites néoplasiques réfractaires.L’objectif de cette étude était de déterminer les effets immunomodulateurs du catumaxomab sur des cellules néoplasiques exprimant EpCAM, à partir de deux modèles expérimentaux (allogénique et autologue), de rechercher une cytotoxicité induite par la catumaxomab, et de la caractériser, notamment en analysant la présence ou non de signaux de stress inducteurs d’une mort immunogène tels que l’exposition membranaire de la calréticuline par les cellules tumorales pré-apoptotiques, la libération d’HMGB1 et d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extra-cellulaire, responsables d’une activation des lymphocytes T.En présence de cellules EpCAM+, le catumaxomab entrainait une activation majeure des lymphocytes T (expression de CD69, CD107a, HLA-DR et PD1), stimulait une réponse inflammatoire de type Thelper 1(Th1), et provoquait la synthèse d’interféron-gamma par les lymphocytes T CD8. Le catumaxomab engageait le CD16 (FcR) des cellules monocytaires et NK. De plus, sur des modèles allogéniques, le catumaxomab, provoquait une mort cellulaire associée à la libération d’ATP et induisait une mort immunogène après pré-incubation dans de l’oxaliplatine.Par conséquent, le catumaxomab permet de moduler l’environnement immunitaire dans les ascites néoplasiques, et de convertir une inflammation chronique et immunosuppressive (Th2) en une inflammation aigüe et immunogène (Th1). En revanche, dans ces conditions, l’administration seule de catumaxomab ne semble pas déclencher de mort immunogène.Différents moyens pourraient permettre d’améliorer la cytotoxicité de cet anticorps bispécifique : (1) le combiner avec un agent anti-néoplasique tel que l’oxaliplatine afin de promouvoir une mort immunogène, (2) affiner son action sur le CD3 des lymphocytes en modifiant sa configuration spatiale (anticorps BiTE), (3) amplifier son affinité pour le récepteur Fcdes cellules accessoires (Fc défucosylé), (4) augmenter sa cytotoxicité en modifiant la cible dirigée contre la molécule du système immunitaire (anti-PD-1…). Enfin, l’utilisation clinique pourrait être facilitée en humanisant cet anticorps chimérique murin afin d’éviter la formation d’anticorps anti-murins, dirigés contre le catumaxomab.Un essai thérapeutique de phase II dont le but est d’évaluer l’efficacité du catumaxomab intrapéritonéal après chirurgie de cytoréduction complète d’une carcinose gastrique, chez des patients ayant reçu en préopératoire une chimiothérapie systémique à base d’oxaliplatine vient de débuter. Au cours de cette étude, nous allons valider la capacité du catumaxomab 1) à induire un stress cellulaire immunogène et la mort des cellules cancéreuses, 2) à modifier la polarisation des cellules effectrices vers une maladie inflammatoire Th1, 3) à promouvoir l'expression des molécules de costimulation et TRAIL sur les cellules NK et monocytes, et corréler ces biomarqueurs immunitaires à l’efficacité du traitement
The development of cancer in an immunocompetent individual reflects, in part, a tumor escape from the immunosurveillance. The tumor escape is a complex, multifactorial, in which tumor cells will evade the defense mechanisms of the host by changing their microenvironment. Therefore, restoration or induction of these defense mechanisms is one of the therapeutic strategies against cancer. One of the principles of immunotherapy is based on the injection of antibodies that target tumor cells or effector cells of immunity. The anti-tumor efficacy of these antibodies has been greatly improved by a better understanding of modes of action and modulatory effects of these antibodies.Thus, to optimize the action of immune effectors to tumor cells, a bispecific antibody, trifunctional: catumaxomab, capable of binding to the adhesion molecule of the epithelial cells (EpCAM), expressed by tumor cells and the CD3 antigen of T cells, has been developed mainly in intraperitoneal treatment of refractory malignant ascites.The objective of this study was to determine the immunomodulatory effects of catumaxomab on tumoral cells expressing EpCAM, from two experimental models (allogeneic and autologous), evaluate and characterize cytotoxicity induced by catumaxomab, and analyze the presence of stress signals inducing immunogenic cell death such as membrane exposure of calreticulin by pre-apoptotic tumor cells, release of HMGB1 and of adenosine triphosphate (ATP) in the extracellular medium, inducing a T cell activation.In the presence of EpCAM + cells, catumaxomab induced a major the activation of T cells (expression of CD69, CD107a, HLA-DR and PD1), stimulated an inflammatory response Thelper type 1 (Th1) and the synthesis of interferon-gamma by CD8 T cells. Catumaxomab committed CD16 NK cells and monocytes. More, in models allogeneic catumaxomab, caused cell death associated with ATP release and induced an immunogenic cell death after pre-incubation of oxaliplatin.Therefore, catumaxomab modulates the immune environment in malignant ascites, and convert chronic and immunosuppressive inflammation (Th2) in acute and immunogenic inflammation (Th1). However, in these conditions, catumaxomab alone does not seem to trigger immunogenic cell death.the cytotoxicity of this bispecific antibody could be enhance by different techniques: (1) combining with chemotherapy such as oxaliplatin to promote immunogenic cell death, (2) refining its action on CD3 lymphocytes by changing its spatial configuration (BiTE antibody), (3) increasing its affinity for the FcR of accessory cells (Fc aglycosylated), (4) increasing its cytotoxicity by changing the target directed against the immune molecule (anti-PD-1 ...). Finally, the clinical use could be facilitated by this humanizing murine chimeric antibody to prevent the formation of anti-murine antibodies directed against catumaxomab.A phase II clinical trial aimed to evaluate the efficacy of intraperitoneal catumaxomab after complete cytoreductive surgery of gastric carcinomatosis in patients who received preoperative systemic chemotherapy with oxaliplatin have just started. In this study, we will validate the ability of catumaxomab 1) to induce immunogenic cell stress and death of cancer cells, 2) to change the polarization of effector cells to Th1 inflammatory disease, 3) to promote the expression of costimulatory molecules and TRAIL on NK cells and monocytes, and we will correlate these immune biomarkers to treatment efficacy

L’objectif de ces travaux de thèse est l’étude des modifications post-traductionnelles de la protéine ATF7. Cette protéine est phosphorylée sur les résidus thréonine (T) 51, T53 et T112 lorsque les cellules subissent un stress (UVs, choc osmotique). Cela permet à la protéine d’être active transcriptionnellement. En absence de stress une fraction de la protéine ATF7 est sumoylée et cela induit une inhibition de son activité transcriptionnelle. Le premier projet consiste à développer des outils qui permettent l’étude de la forme sumoylée de la protéine ATF7. Ces travaux ont permis l’élaboration de scFv-bispécifiques tétramériques qui permettent la reconnaissance simultanée de la protéine ATF7 et de la protéine SUMO1. L’autre projet principal était l’étude du rôle de la phosphorylation de la T112 en absence de stress. Les travaux menés au laboratoire ont permis de montrer que cette thréonine est phosphorylée pendant la phase M du cycle cellulaire et que cet événement est conduit par une autre voie de phosphorylation que la voie du stress et met en jeu la CDK1
The objective of this thesis work was is the study of post-translationnal modifications (PTM) of the protein ATF7. This protein is phosphorylated on several threonine (T) residues upon stress (UVs, osmotic chock). This allows the protein to be transcriptionally active. In the absence of stress, a fraction of the protein is sumoylated resulting in an inhibition of its transcriptional activity. The first project raise to the development of tools that will enable the study of the sumoylated form of ATF7 protein. This work raise to the development of tetrameric bispecific scFv possessing a simultaneously recognizing ability of the proteins ATF7 and SUMO1. The other main project was the study of ATF7 T112 phosphorylation in the absence of stress. The experiments drove in the lab have shown that thus threonine is phosphorylated during mitosis by a specific pathway, which includes the CDK1