Dissertations / Theses on the topic 'Antigènes de surface du virus de l'hépatite B'

Le mécanisme de bourgeonnement du virus de l'hépatite B (HBV) repose entièrement sur ses protéines d'enveloppe. Celles-ci s'oligomérisent et bourgeonnent spontanément dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE), essentiellement sous la forme de particules sous-virales vides, sécrétées en abondance par une cellule infectée. Occasionnellement, les protéines d'enveloppe recrutent la nucléocapside HBV et conduisent à la formation de virions complets, ou particules de Dane. Ce mode de bourgeonnement atypique est parasité par les ribonucléoprotéines du virus de l'hépatite delta (HDV), qui s'associent aux protéines d'enveloppe et sont sécrétées sous la forme de virions HDV. Les protéines d'enveloppent HBV sont au nombre de trois : la petite, S-AgHBs, la moyenne, M-AgHBs et la grande, L-AgHBs. Elles partagent un domaine C-terminal commun et diffèrent par la taille de leur extrémité N-teminale. La protéine S est constituée du seul domaine S, la protéine M des domaines S et preS2 et la protéine L-AgHBs, des domaines S, preS2 et preSl. La protéine S-AgHBs est le moteur du bourgeonnement des particules HBV et HDV. C'est une protéine intégrale synthétisée à la membrane du RE. Son domaine N-terminal contient deux domaines transmembranaires délimitant une boucle cytosolique et une boucle antigénique (BAG), présentée à la surface des virus. Sa partie C-terminale est très hydrophobe et prédite comme membranaire. Par ailleurs, deux déterminants d'infectiosité ont été identifiés sur preSl et la BAG. La première partie de nos travaux a consisté à caractériser le mode de fonctionnement des deux déterminants d'infectiosité. Nos résultats sont en faveur d'un fonctionnement indépendant de preSl et de la BAG à l'entrée virale. De plus, le rôle de la BAG nécessiterait la coordination de nombreuses protéines de surface alors que seulement quelques domaines preSl sont suffisants à l'infection. Finalement, le mode de fonctionnement de preSl semble reposer sur une coopération allostérique des différents sous-éléments qu'il contient. La deuxième partie de nos travaux a consisté à préciser la topologie du domaine C-terminal de la protéine S-AgHBs de manière à caractériser plus précisément son rôle dans la morphogénèse HBV et HDV. Cette région s'associerait aux membranes cellulaires vraisemblablement par les domaines 154-174 et 202-226. Les résidus 202-226 sont très hydrophobes et pourrait participer, avec la région 71-102, à la dimérisation des protéines de surface. La région 154-174 est probablement organisée en hélice amphiphile positionnée parallèlement aux membranes ; elle pourrait participer au recrutement du cholestérol. Enfin, les résidus 193-204 serait cytoplasmiques, en accord avec leur fonction dans le recrutement de la ribonucléoprotéine HDV
The budding mechanism of the Hepatitis B Virus (HBV) is entirely dépendent on its envelope proteins. These proteins form oligomers and spontaneously bud into the lumen of the endoplasmic réticulum (ER), mainly as empty subviral particles that are secreted in large quantities by infected cells. The envelope proteins occasionally recruit HBV nucleocapsids leading to the formation of complete virions also called Dane particles. Ribonucleoproteins of the Hepatitis Delta Virus (HDV) take advantage of this unusal budding mechanism: they bind to the envelope proteins and are secreted as HDV virions. There are three HBV envelope proteins: the small protein S-AgHBs, the medium protein M-AgHBs, and the large protein L-AgHBs. They share a common C-terminal domain but the size of their N-terminal domains differs. The S protein contains only the S domain, while the M and the L proteins consist respectively of the S and preS2 domains, and the S, preS2, and preSl domains. The S-AgHBs protein drives HBV and HDV budding. This integral protein is synthesized at the ER membrane. Its N-terminal region contains two transmembrane domains forming a first cytosolic loop and an antigenic loop (AGL) that is presented at the surface of the viruses. Its C-terminal domain is highly hydrophobic and predicted as a membrane domain. In addition two infectivity determinants have been identified on the preSl domain and the AGL. First our study aimed at characterizing the mechanism of action of the two infectivity determinants. Our results indicate that these determinants are functionaly independant at viral entry. The role of the AGL may require the intervention of many surface proteins while only a few domains of preSl are sufficient for infection. Finally, the mode of action of the preSl domain seems to be mediated by an allosteric cooperation of its sub-elements. The second part of our study aimed at specifying the topology of the C-terminal domain of the S-AgHBs protein in order to further characterize its role in HBV et HDV morphogenesis. This region most likely associates with cellular membranes through the 154-174 and 202-226 domains. The 202-226 residues are highly hydrophobic and may be implicated, together with the 71-102 region, in the surface proteins dimerization. The 154-174 region is presumably organized as an amphipathic helix, which is parallel to membranes. It may participate in cholesterol recruitment. Lastly, residues 193-204 may be exposed cytoplasm in agreement their role in HDV ribonucleoprotein recruitment

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (HBV) reste un problème de santé publique majeure à l'échelle mondiale puisqu'elle touche près de 300 millions d'individus. Le HBV est un virus à ADN de la famille des Hepadnaviridae, dont l'enveloppe du virion est composée de lipides d'origine cellulaire et de glycoprotéines transmembranaires de trois types, S-, M- et L-AgHBs. La protéine S- AgHBs, majoritaire dans l'enveloppe virale, est l'élément moteur de l'assemblage, et elle porte dans le domaine exposé à la surface des particules virales, un déterminant immunodominant appelé "déterminant- a" contre lequel la majorité des anticorps neutralisants sont dirigés. Ce déterminant antigénique est intimement associé à un déterminant du caractère infectieux qui assure l'interaction avec les sulfates d'héparane à l'étape initiale d'entrée. A ce jour, nous possédons très peu d'information sur la structure de la boucle antigénique (BAG) de la protéine S-AgHBs qui sous-tend le caractère antigénique et fonctionnel d'entrée virale. L'objectif du travail de thèse était d'obtenir des informations sur l'organisation tridimensionnelle du polypeptide BAG, afin de mieux comprendre son rôle à l'étape d'entrée virale. La première étape a été de déterminer la sous-unité minimale de l'enveloppe des particules virales, qui porte le déterminant-a, en utilisant une série d'anticorps monoclonaux spécifiques de ce déterminant. Nous avons montré que la plupart des anticorps étaient bien spécifiques d'épitopes conformationnels, qu'ils étaient neutralisants, et qu'ils réagissaient avec des formes dimériques de protéines S-AgHBs. La majorité des épitopes du déterminant-a sont donc présents sur des dimères de protéines S-AgHBs solubles. De plus, nous avons mis en évidence la présence de deux isoformes de dimères à la surface des particules virales, que nous pouvons distinguer par leur comportement électrophorétique en gel SDS et par leur réactivité avec les anticorps monoclonaux. Nous pensons que les deux isoformes de protéines S-AgHBs correspondent à deux combinaisons de ponts disulfures inter- ou intra-chaînes entre les nombreux résidus cystéine de la BAG. Dans le but d'obtenir des préparations homogènes et pures de dimères de protéines S-AgHBs comme substrat de cristallisation, nous avons suivi plusieurs stratégies : la production de la protéine S- AgHBs par traduction in vitro, la production dans Escherichia coli, et la purification de particules virales à partir de surnageant de culture de cellules Huh-7 ou de plasmas infectieux. La stratégie de purification de particules produites en culture de cellules Huh-7 est apparue la plus fiable en termes de qualité et rendement, et la plus adaptée à l'analyse de mutants de la protéine S-AgHBs
Chronic infection with the hepatitis B virus (HBV) represents a major public health concern worldwide because an estimated 300 million individuals are affected. HBV is the prototype of the Hepadnaviridae family, a DNA virus with an envelope consisting of cell derived lipids associated to three types of transmembrane glycoproteins: S-, M- et L-HBsAg. S-HBsAg, the most abundant in the viral envelope, is the driving force of viral particle assembly, but it also bears in its ectodomain, an immunodominant determinant, referred to as the a-determinant, against which most of the neutralizing antibodies are directed. This antigenic determinant is also closely associated to an infectivity determinant responsible for interacting with cell surface heparan sulfate at the initial step of viral entry. As of today, we have little information on the structure of the antigenic loop (AGL) of the S-HBsAg protein that underlies the antigenic and function at viral entry. The aim of this thesis project was to gather information on the three dimensional organization of the AGL polypeptide, for a better understanding of its function at viral entry. The first step of the study was to identify the minimum subunit of the viral envelope, which bears the a-determinant. This was achieved using a panel of monoclonal antibodies that are specific for the a-determinant. We have shown most of the antibodies were: i) directed to conformational epitopes, ii) neutralizing, and iii) reactive with the dimeric forms of S-HBsAg. We concluded that most of a-determinant epitopes are conserved on the soluble dimeric forms of S-HBsAg. Furthermore, we demonstrate the presence in the HBV envelope, of two isomers of S- HBsAg dimers, which can be separated by SDS-PAGE and identified by isomer-specific antibodies. We propose that the two isomers correspond to two distinct networks of disulfide bonds between the numerous AGL cystein residues. In an effort to obtain pure and homogenous preparations of S-HBsAg dimers, as substrate for crystallization, we adopted several strategies: i) production of S-HBsAg by in vitro translation, ii) production in E. Coli, and iii) the purification of viral particles from transfected Huh-7 cell culture medium or from infectious plasmas. The purification of S-HBsAg dimers from cell culture-derived particles clearly appeared as the strategy of choice, in terms quality and yield, and flexibility of the approach in case of S- HBsAg mutants analysis

Avec 350 millions de porteurs chroniques dans le monde, le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème majeur de santé publique. L'évolution de l'infection peut conduire au développement d'une cirrhose et/ou d'un carcinome hépatocellulaire. L'ensemble de mes travaux de thèse a pour but d'étudier la corrélation entre la réponse au traitement, les marqueurs de l'hôte et ceux du virus chez des patients atteints d'hépatite chronique B (CHB). Dans un premier temps, nous avons étudié l'impact du polymorphisme rs12979860 de l'IFNL3 sur la réponse à l'IFN standard chez 97 patients atteints de CHB, AgHBe-positif. Aucune association n'a été observée entre le génotype de l'IFNL3 (rs12979860) et la réponse au traitement par IFN. Dans un deuxième temps, mes travaux ont porté sur la variabilité génomique de l'AgHBs chez les patients CHB, traités par IFN-pégylé plus Ténofovir. 12, 5% des patients traités (n=40) ont une perte de l'Ag HBs. L'analyse des quasi-espèces virales a montré qu'il y avait une variabilité génomique dans le gène S chez les non-répondeurs. Ces mutations sont localisées au niveau de la RHM et plus spécifiquement dans le déterminant « a ». L'analyse, in vitro, a montré que la présence des mutations dans le déterminant «a » est associée à une plus faible production de l'AgHBs mais à une réplication virale équivalente au virus sauvage. En conclusion, mes travaux de thèses ont permis de mieux comprendre le rôle de l'IFNL3 et de l'AgHBs, dans les mécanismes de réponse au traitement. Ces recherches ont pour but d'optimiser l'utilisation de ces marqueurs, dans la pratique, clinique afin d'améliorer la prise en charge des patients CHB
Hepatitis B virus (HBV) chronic infection remains a serious global public health problem with 350 million people infected. The major aim of my thesis is to study the association between the response to treatment of interferon (IFN) and host and virolgic markers in patients with chronic hepatitis B (CHB). In the first part of our work, we have assessed the impact of IFNL3 polymorphism (rs12979860) on response to IFN in 97 patients with HBeAg positive CHB. No significant relationship was observed between IFNL3 and response to IFN therapy. The second part of our work forked on indentifying the S gene variability of patients at baseline of Pegylated interferon (PegIFN) plus tenofoviron (TDF) combination therapy in order to determine the role of HBsAg variants on response to treatment. A SVR was observed in 22% of patients and HBsAg loss in 12% patients. N-SVR patients showed more variability along the S protein. The Accumulation of residue substitutions in and around the "a" determinant at baseline should be a sensitive predictor of response to combination of PegIFN and TDF therapy in CHB patients. In vitro analysis showed less HBsAg secretion in N-SVR group accompanying with similar viral replication to wild type HBV. In conclusion, my thesis work led to a better understanding of the role of IFNL3 and HBsAg in the mechanism of response to IFN treatment. These researches aimed to optimize the use of these markers to improve the clinical management of CHB patients

Des lignées de souris transgéniques (Tg) pour les protéines d'enveloppe du VHB et les molécules de classe I (HLA-A2) et II (DRB1) du complexe majeur d'histocompatibilité humain ont été créées dans le but de caractériser l'implication de l'antigène HBs (AgHBs) porté par les protéines d'enveloppe lors l'infection chronique par le VHB. Ces souris expriment de manière constitutive l'AgHBs à des taux élevés dans le foie. L'AgHBs est sécrété dans le sérum en l'absence de toute production d'anticorps anti-HBs et de pathologie hépatique. Le statut immunologique des souris triple Tg (AgHBs/HLA-A2/HLA-DRBl) est comparable par plusieurs aspects à celui des porteurs chroniques du VHB infectés à la naissance chez lesquels le virus se multiplie à bas bruit. L'injection d'un plasmide (pCMV-S2. S) codant pour deux des protéines d'enveloppe du VHB permet de rompre la tolérance au niveau des cellules T CD8+. Par contre, le compartiment T CD4+ est tolérisé. La présence mutuellement exclusive des lymphocytes T CD4+ et de F AgHBs souligne le rôle de ce dernier dans le maintien de la tolérance vis à vis des lymphocytes T CD4+. Parrallélement à cette étude, la sécurité et l'immunogénicité d'un vaccin à base d'ADN a été apprécié chez dix porteurs chroniques du VHB dans un essai de phase I de vaccination thérapeutique. Les injections de pCMV-S2. S ont entraîné une diminution marquée de la charge virale chez deux patients et une baisse transitoire de la charge virale de plus de 50% chez quatre autres patients. Des cellules T CD8+ et CD4+ mémoires spécifiques de l'enveloppe du VHB ont été mises en évidence chez tous les patients après vaccination
By using HLA-A2-/HLA-DRl-transgenic H-2 class Wclass II-knockout mice, we have generated transgenic (Tg) mouse lineages expressing the HBV enveloppe proteins in a context of human MHC molecules. The Tg mice express high amount of hepatitis B surface antigen (HBsAg) carried by the envelope proteins in the liver. The HBsAg is secreted and present in the serum of mice during the animal's lifetime. This preclinical humanized mice model mimics in some aspects the tolerance to HBsAg observed in chronic HBV carriers. As a therapeutic tool, a DNA plasmid encoding the small and the middle protein of HBV was used to immunize Tg mice. Despite a high concentration of HBsAg in sera, injection of this DNA induced a high frequency of CD8+ T cells secreting IFNgamma. Nevertheless, the DNA-based immunization elicited no CD4+ T cell responses. However, when pro-inflammatory stimuli were given before or after DNA-based immunization, the HBsAg was cleared from the serum. This model provides evidence that HBsAg displayed a strong tolerogenic effect on the CD4+ T cell compartment. We also carried out a phase I trial evaluating tolerance to vaccination with a naked DNA vaccine encoding the small and middle envelope proteins in ten patients chronically infected with HBV who did not respond to existing treatments. This vaccination was well tolerated. In two patients a decrease in viral DNA levels accompanied by an HBe/anti-HBe seroconversion was observed. In four other patients the decrease was only transient, even if a fourth injection was given. However, after genetic vaccination, we demonstrated the induction or reactivation of IFNgamma-secreting envelope-specific T-cells in ail patients

L'hépatite chronique B (HCB) peut évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Mes travaux de thèse ont consisté à évaluer le pouvoir prédictif de marqueurs non-invasifs de l'hôte et du virus vis-à-vis de la réactivation chez les patients AgHBe négatif asymptomatiques et de la sévérité de l'atteinte hépatique. Un total de 129 et 377 patients ont été inclus dans la première et la deuxième étude, respectivement. Dans une première partie, un seuil d'AgHBs > 1000 UI/mL associé à un seuil d'ADN-VHB > 200 UI/mL permet d'identifier dès la première visite les patients AgHBe négatif risquant de réactiver (sensibilité : 92 %, VPN : 96 %). Ces patients doivent être traités pour éviter la progression de la fibrose. Un seuil d'AgHBs < 1000 UI/mL ainsi qu'une décroissance annuelle > 0,3 logioUl/mL permettent de prédire la perte de l'AgHBs (VPP : 89 %, VPN : 95 %). Dans une seconde partie, l'âge (p < 0,0001), les titres d'ALT (p = 0,02) et d'ADN-VHB (p = 0,0006) et la présence de mutants du VHB (promoteur basal du core (BCP) et precore (PC), p < 0,0001) sont indépendamment associés à la fibrose significative (METAVIR > F2). La combinaison de ces 4 variables non-invasives permet de prédire avec précision (c-index = 0,76 [95 % IC 0,71-0,81]) la fibrose significative chez les patients atteints d'HCB. La forte association de la mutation du BCP avec la sévérité de la maladie suggère son influence sur l'évolution de l'histoire naturelle de la maladie. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser plusieurs marqueurs non-invasifs cliniquement pertinents pour améliorer le suivi des patients atteints d'HCB et aider à la décision d'initier un traitement
Chronic hepatitis B (CHB) infection is associated with an increased risk of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The aim of my thesis was to study both host and viral non-invasive markers to predict i) the viral reactivation in asymptomatic HBeAg negative patients and ii) the severity of liver fibrosis. A total of 129 and 377 patients were respectively included in the two studies. First, a combination of HBsAg > 1000 IU/mL and HBV-DNA > 200 IU/mL at the first visit, allows to identify HBeAg negative CHB patients who are at high risk of reactivation with a high sensitivity (92 %) and negative predictive value (NPV, 96 %). These patients will benefit from a treatment to limit the progression of liver disease. Interestingly, a single HBsAg measurement < 1000 UI/mL or an annual decrease > 0. 3 logioUl/mL predict HBsAg seroclearance (PPV: 89 %, NPV: 95 %). We next investigated factors associated with significant fibrosis (METAVIR >F2). Advanced age (p < 0. 0001), ALT level (p = 0. 02), HBV-DNA viral load (p = 0. 0006) and the presence of HBV variants (basal core promoter (BCP) and precore (PC), p < 0. 0001) are independently associated with significant fibrosis (METAVIR >F2). The combination of these 4 non-invasive variables accurately predicts significant fibrosis (c-index = 0. 76 [95% IC 0. 71-0. 81]) in CHB patients. The strong association of the BCP mutation with the severity of the disease suggests its impact on the natural history of CHB. In this work, we characterized several non-invasive markers clinically relevant to improve the management of CHB patients in particular regarding the decision to initiate a treatment

L’hépatite B chronique touche environ 257 millions de personnes dans le monde. La perte de l’antigène HBs (AgHBs), marqueur de guérison fonctionnelle, n’est que très rarement observée, même sous traitement antiviral (3-16 %). Les protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite B (VHB), formant l’AgHBs, sont très variables et cruciales pour le pouvoir infectieux du virus de l’hépatite B (VHB) et la physiopathologie. Nous avons émis l’hypothèse que cette variabilité pourrait expliquer, au moins partiellement, l’évolution de l’infection par le VHB, évaluée par la clairance de l’AgHBs, chez des patients traités ou non par analogues nucléos(t)idiques anti-VHB. Chez 29 patients infectés par différents génotypes du VHB (A, C et D), présentant différents profils cliniques (infection aigüe ou chronique, co-infection VHB/VIH) et thérapeutiques, une très grande variabilité des protéines d’enveloppe du VHB a été mise en évidence. Chez ces patients, la persistance de l’AgHBs était corrélée avec la présence de mutations et délétions localisées dans des régions des protéines d’enveloppe virale jouant un rôle important dans la reconnaissance du virus par le système immunitaire. Ces résultats renforcent l’hypothèse que l’étude des protéines d’enveloppe du VHB pourrait mettre en évidence des signatures moléculaires influençant le fitness du VHB et par conséquent l’évolution clinique de la maladie liée à l’infection par le VHB
Chronic hepatitis B affects about 257 million people worldwide. The loss of HBS antigen (HBsAg), a marker of the functional cure, is very rarely observed, even on anti-HBV treatment (3-16%). The hepatitis B virus (HBV) envelope proteins (HBsAg) are highly variable and crucial for the viral infectivity and pathogeny. We hypothesized that the HBV variability in the envelope proteins could explain, at least partially, the evolution of HBV infection, evaluated by HBsAg clearance, in patients treated or not by anti-HBV nucleos(t)idic analogues. For 29 patients infected with different HBV genotypes (A, C and D), presenting different clinical profiles (acute or chronic infection, HBV/HIV co-infection) and therapies, a very high variability of HBV envelope proteins was observed. In these patients, the persistence of HBsAg was correlated with the presence of mutations and deletions located in areas that play a key role in the viral recognition by the immune system. These results reinforce the hypothesis that the study of HBV envelope proteins could highlight molecular signatures influencing HBV fitness which would subsequently modify the clinical evolution of HBV-related disease

Le virus de l'hépatite B (HBV) est la cause de nombreux décès chaque année malgré la disponibilité d'un vaccin efficace. Le développement de tests de dépistages plus sensibles et spécifiques reste un enjeu important dans le domaine du diagnostic. Ce travail de thèse, effectué au sein de la société bioMérieux, s'inscrit dans un projet d'optimisation des dosages de l'HBeAg, des anticorps anti-HBe et des anticorps anti-HBc détectés au cours de l'infection par l'HBV. Les antigènes HBe et HBc actuellement utilisés dans ces différents dosages sont des antigènes recombinants. Dans le cadre de l'optimisation de ces dosages, les antigènes HBc et HBe ont été exprimés dans différents systèmes d'expression hétérologues, leurs propriétés ont été caractérisées et leur potentiel diagnostique a été évalué. D'une part, l'HBcAg a été exprimé chez Escherichia coli et Pichia pastoris. La caractérisation de ces deux antigènes a mis en évidence des différences biochimiques (degré d'oxydation des cystéines, modification de l'extrémité N-terminale) et biophysiques (dimension et stabilité des particules d'HBcAg, association aux acides nucléiques). Grâce à la mise au point d'un nouveau format de dosage des anticorps anti-HBc, le potentiel diagnostique de ces deux antigènes a pu être évalué et a permis de corréler les différences biochimiques et biophysiques à des différences antigéniques. En effet, l'HBcAg produit chez Pichia pastoris qui apparaît plus stable, permet également de développer un test plus sensible et plus spécifique. D'autre part, l'HBeAg a été exprimé sous forme sécrétée par Pichia pastoris ainsi que des cellules Cos-7 et CHO. Les résultats obtenus démontrent que la séquence signal native de cet antigène n'est pas optimale et qu'elle peut être améliorée. Une caractérisation antigénique de ces HBeAg recombinants a été effectuée en utilisant des anticorps anti-HBc et anti-HBe polyclonaux humains ainsi que des anticorps monoclonaux murins. Cette étude démontre que l'HBeAg sécrété par Pichia pastoris possède une antigénicité HBe stricte, ce qui n'est pas le cas des autres HBeAg recombinants, et que cette antigénicité est étroitement liée à la concentration de l'antigène.

Plusieurs observations suggèrent que la protéine Précore d’HBV soit impliquée dans l’établissement de l’infection chronique des hépatocytes par le virus de l’Hépatite B humaine. Cette protéine est adressée à la voie de sécrétion, suite au clivage du peptide signal une protéine de 22 kDa nommée P22 est délivrée dans le lumen du RE avant d’être maturée en antigène HBe. Par ailleurs, la présence dans le cytoplasme de protéines de 22 kDa reconnues par les anticorps anti-Précore a été observée. Cependant, cette forme de Précore dite P22 cytoplasmique (P22-Cyto) n’avait pas été caractérisée. Les travaux présentés dans ce manuscrit ont visé à isoler et caractériser P22-Cyto ainsi que le mécanisme permettant son existence, puis à tenter de déterminer la fonction de cette protéine dans la biologie d’HBV. Nous avons montré que P22-Cyto résulte d’un transport rétrograde de la protéine P22 présente dans le RE via la voie ERAD (ER-associated degradation) et qu’un échappement de P22 à la dégradation par le protéasome lui permet d’atteindre le cytoplasme. Nous avons observé que P22 relocalise la protéine chaperon BiP dans le cytoplasme mais que cette relocalisation ne module pas le rôle de BiP dans la réponse à un stress du RE et n’active pas l’UPR (Unfolded protein response). La localisation précise de P22-Cyto dans la cellule a été étudiée par immunofluorescence dans des hépatocytes répliquant HBV. Nous avons montré que P22-Cyto est adressée au centrosome via un domaine CTRS-like qui lui est spécifique. Enfin, nous avons cherché à déterminer si P22-Cyto est impliquée dans la formation de pseudocapsides dépourvues en ARN pré-génomique, qui limiteraient la production virale
Several observations report a role of HBV Precore protein in the establisment of hepatocytes chronic infection. This protein is adressed to the secretory pathway and after signal peptide cleavage, a 22 kDa protein called P22 is released in the ER lumen before to be processed in HBe antigen. Moreover, a 22 kDa protein in the cytoplasm detected by antibodies directed against Precore have been observed. However this Precore protein called cytoplasmic P22 (P22-Cyto) has not been yet characterised. Our goal during this thesis was to isolate and characterize P22-Cyto as well as the mecanism allowing its existence, and then to attempt to understand its fonction in HBV life cycle. We demonstrated that P22-Cyto come from a retrotransport of ER lumenal P22 through ERAD pathway (for ER-associated degradation) and escape from the proteasome degradation to reach the cytoplasm We have shown that the chaperon BiP protein is delocalised into the cytoplasm along with P22 but this relocalisation is not involved in the control of BiP function in the response to an ER-stress and does not induce an UPR (for Unfolded protein response). Intracellular P22-Cyto exact localisation has been observed by immunofluorescence in HBV replicating hepatocytes. We point out that P22-Cyto is adressed to the centrosome through its own specific CTRS-like domain. Finally, we attempt to define if P22-Cyto could be involved in the formation of pseudocapsides devoided of pregenomic RNA, and consequently would reduce viral replication

Les trois protéines d'enveloppe S-AgHBs, M-AgHBs et L-AgHBs du virus de l'hépatite B (HBV). Synthétisées à partir d'une unique ORF via trois AUG en phase, ont une extrémité C-terminale commune, mais diffèrent par leur extension N-terminale. La protéine S-AgHBs est constituée du domaine S; la protéine M-AgHBs des domaines S et preS2; et la protéine L-AgHBs des domaines S, preSZ et preSL Le caractère infectieux HBV dépend des 75 résidus N-terminaux de preSl de la protéine L-AgHBs et d'un second déterminant porté par la boucle antigénique (BAG) du domaine S des protéines. Au cours de notre étude nous avons établi la cartographie précise du déterminant d'infectiosité de la. BAG, confirmé son association avec le déterminant majeur d'antigénicité "a", également porté par la BAG et identifié plusieurs épitopes du déterminant "a", reconnus par des anticorps monoclonaux neutralisants. Ces données suggèrent une implication du déterminant "a" à l'étape d'entrée HBV dans les hépatocytes. Enfin, nous avons montré que la BAG était suffisante pour médier l'attachement des virions aux heparans sulfate (HS) des hépatocytes. Cet attachement nécessite les résidus positivement chargés R122 et K141, et dépend de la charge globale de la BAG à la surface des virions. Nos résultats suggèrent également une seconde fonction du déterminant "a", dans urte étape qui suit l'attachement
The three HBV envelope proteins produced from a unique ORF via three AUG in frame, share the same C-terminal end, but differ in their N-terminal extension. S-HBsAg protein is made of the S domain only; M-HBsAg is made of the S and preS2 domains; and L-HBsAg is made of the S, preS2 and preSl domains. The HBV infectivity depends upon the N-terminal 75 amino acids residues of the L-HBsAg preS1 domain and a second determinant borne by the antigenic loop (AGL) of the S domain. During our study we established a précise mapping of the AGL infectivity determinant, we confirmed its strong relation with the imunodominant "a" déterminant, also borne by the AGL, and we identified several epitopes of the "a" determinant, recognized by neutralizing monoclonal antibodies. These data suggest an involvement of the "a" determinant at the HBV viral entry. Furthermore, we showed that the AGL was sufficient to mediate the heparans sulfate (HS) binding of virions at the hepatocytes surface. This binding required the positively-charged residues, R122 and K141, and depends upon the global charge of the AGL at the virions surface. Our results suggest another function of the "a" determinant, at a post-binding step

Cette étude visait à évaluer le risque résiduel de l’hépatite virale B (HVB) en mesurant son incidence chez 112 242 donneurs de sang d’Héma-Québec, via la séroconversion pour l’anticorps dirigé contre le noyau (Ac HBc) au lieu de l’habituel antigène de surface (Ag HBs). Les donneurs ayant eu une séroconversion pour l’Ac HBc et dépistés positifs pour l’Ac HBs (anticorps dirigé contre l’Ag HBs) ont été définis comme cas incidents. D’avril 2003 à avril 2005, l’identification de 13 cas incidents pour l’Ac HBc et 3 pour l’Ag HBs a permis d’estimer des incidences respectives de 12,6 x 105 personnes-années-1 et 3,35 x 105 personnes-années-1, correspondant à des risques résiduels de 1/63 018 dons et de 1/237 731 dons. L’incidence de l’HVB via l’Ac HBc est différente de celle via l’Ag HBs. Notre étude suggère que l’Ac HBc ne semble pas un marqueur fiable d’une récente infection d’HVB.
The goal of this study was to evaluate the residual risk of hepatitis B viral (HBV) by measuring its incidence among 112,242 blood donors at Hema-Quebec, via the seroconversion for the antibody directed against the core (anti-HBc) instead of the usual surface antigen (HBsAg). We considered as incident cases donors who had a seroconversion for the anti-HBc and who were screened positive for the anti-HBs (antibody directed against the HBsAg). From April 2003 to April 2005, the identification of 13 anti-HBc incident cases and 3 for HBsAg permitted us to estimate respective incidences of 12.6 x 105 person-years-1 and 3.35 x 105 person-years-1, which corresponded to residual risks of 1 in 63,018 donations and 1 in 237,731 donations. The HBV incidence via the anti-HBc seroconversion is different from the estimate via the HBsAg. Our study suggests that anti-HBc seroconversion may not be a reliable marker of recent hepatitis B infection.

La complexité de la prise en charge des hépatites B chroniques est en partie liée à la persistance virale. La clairance du virus est compliquée du fait du mode de réplication du virus et de l'interaction de HBV avec les acteurs de la réponse immunitaire innée. On distingue plusieurs stades d'infection chronique à HBV, qui se caractérisent par un équilibre variable entre réplication virale et réponse immunitaire de l'hôte. La définition clinique de ces différentes phases est insuffisante pour discriminer le risque évolutif des patients. Des études de cohorte sont nécessaires pour mieux appréhender les relations entre réplication virale et immunité lors des infections chroniques à HBV. Le premier travail est une étude de cohorte rétrospective s'intéressant aux relations entre marqueurs virologiques sériques et intrahépatiques et expression intrahépatique des gènes de l'immunité innée. Les gènes de l'immunité innée étudiés sont moins exprimés au cours des hépatites B chroniques en comparaison à des contrôles sains, sans influence de la réplication virale. Le taux d'AgHBs sérique pourrait refléter l'importance de la réponse immunitaire innée intrahépatique, notamment la réponse IFN de type I pour les patients négatifs pour l'AgHBe. Le deuxième travail est une étude de cohorte prospective, qui ne retrouve pas de bénéfice à l'addition d'un traitement par PEG-IFN chez des patients co-infectés HBV/HIV et répondant au traitement par NUCS. Cette étude souligne de façon intéressante que le taux d'AgHBs à l'initiation du traitement pourrait être prédictif de la réponse au traitement, des taux plus faibles d'AgHBs étant favorables. L'ensemble de ces résultats démontre l'importance de la relation entre réponse immunitaire et réplication virale pour expliquer les différentes phases de l'hépatite B chronique. Ces résultats pourraient se révéler intéressants pour le développement de nouvelles prises en charge thérapeutiques de patients infectés chroniquement par HBV
Chronic HBV infections (CHB) are difficult to treat diseases because of viral persistence. It’s explained by the particular replication of Hepatitis B Virus (HBV) and its interplays with host immunity. CHB is characterized by different stages, which reflect a balance between viral replication and immune response. However, our knowledge regarding the natural history of CHB is insufficient to allow us to predict patients’ prognosis. Further clinical studies are needed to improve our understanding of interplays between HBV replication and host immunity. The first study is a retrospective one about interplays between serological and intrahepatic viral markers and intrahepatic innate immunity genes expression. Immunity genes seem to be down-regulated during CHB in comparison to healthy controls, without impact of the level of viral replication. HBsAg levels in blood may reflect the intrahepatic innate immune response and especially the type I IFN response for HBeAg negative patients. The second part is a prospective study which shows any relevance of adding PEG-IFN to HIV/HBV co-infected responders to NUCS therapy patients. The results highlight the potential interest of baseline HBsAg level to predict PEG-IFN response (low HBsAg levels being more favorable). Finally, these results highlight the role of interplays between HBV replication and innate immune response during the natural history of CHB. They may be interesting in the context of the development of new antiviral strategies

Les norovirus sont l'une des causes principales de gastroentérite. Depuis 2002, des variants de norovirus GII.4 successifs ont circulé dans la population par cycle de 2-3 ans, ce qui suscite des interrogations quant au rôle de leurs ligands, les antigènes tissulaires de groupes sanguins (HBGA), dans leur évolution. Nous avons analysé l'interaction entre des variants de GII.4 représentatifs et des HBGA, et déterminé le rôle d’acides aminés (aa) clés. Par mutagénèse dirigée, nous avons montré qu’une configuration stricte des aa directement impliqués dans l’accroche est indispensable. La suppression de la thréonine 395, caractéristique des variants après 2002, confère la capacité de se lier à Lex et Si-Lex, démontrant que les aa en dehors du site de liaison peuvent modifier les propriétés d’attachement. L'analyse de l'accroche de VLP de 6 variants isolés de 1987 à 2007 à des échantillons de salive phénotypés et des HBGA synthétiques montre que tous les variants sont capables de s’attacher à la salive des sécréteurs indépendamment du phénotype ABO et aux oligosaccharides propres au phénotype sécréteur. Deux variants récents ont pu également s’accrocher aux sucres présents dans la salive des nonsécréteurs Le(+). Nos données suggèrent que la capacité de se lier à Lex et Si-Lex serait une conséquence de la variation génétique des aa situés à proximité du site de liaison. L'analyse des propriétés d’attachement par résonance plasmonique de surface a montré que seuls les variants après 2002 présentent une affinité forte pour les antigènes A et B, suggérant que l’accélération évolutive des GII.4 pourrait être liée à une affinité accrue des variants pour les HBGA après 2002
Noroviruses are one of the leading causes of gastroenteritis worldwide. Since 2002 successive GII.4 variants have circulated in the population before being replaced every 2-3 years, which raises questions about the role of their histo-blood group antigen (HBGAs) receptors in their evolution. We analyzed the interaction between representative GII.4 variants and HBGAs and determined the role of selected amino acids (aa) in the binding profiles. By mutagenesis, we showed that there was a strict structural requirement for the aa directly implicated in HBGA bindings. The ablation of the threonine 395 residue, an epidemiological feature of the post 2002 variants, allowed to gain the capacity to bind to the Lewis x and sialyl-Lewis x antigens, demonstrating that aa residues outside the HBGA binding site can modify the binding properties. The analysis of the attachment of VLPs from 6 variants isolated from 1987 to 2007 to phenotyped saliva samples and synthetic HBGAs shows that all variants could attach to saliva of secretors irrespective of the ABO phenotype and to oligosaccharides characteristic of the secretor phenotype. Interestingly, two recent variants additionally bound to carbohydrates present in the saliva of Lewis-positive non-secretors. Our data suggest that GII.4 binding to Lex and Si-Lex antigens might be a by-product of the genetic variation of the aa located in the vicinity of the binding site. Analysis of the binding properties by surface plasmon resonance showed that only post 2002 variants presented a strong affinity for A and B antigens, suggesting that the GII.4 evolution could be related to an increased affinity for HBGAs for the post 2002 variants

L'hépatite B chronique reste un problème majeur de santé publique. Sous traitement par analogues nucléos(t)idiques (NUCs), l'objectif thérapeutique ultime est la clairance de l'antigène (Ag) HBs. Nous avons étudié l'influence de la variabilité des protéines d'enveloppe, impliquées dans l'entrée cellulaire du virus et cibles de la réponse immune, sur la clairance de l'Ag HBs. Des patients traités par NUCs ayant obtenu une clairance de l'Ag HBs (resolvers) ont été appariés à des non-resolver. Deux mutations combinées sT125M/sP127T, caractéristiques des non-resolver, étaient associées à une baisse de l'antigénicité prédite. L'analyse par séquençage haut débit montrait une plus grande variabilité du gène S chez les non resolver. Des tests fonctionnels portant sur des particules virales mutées en sT125M et sP127T sont en cours. Ces données moléculaires sont en faveur de l'existence de "motifs" spécifiques dans le gène S associés à la persistance de l'Ag HBs sous traitement par NUCs
Hepatitis B virus (HBV)-related chronic infection remains difficult to eradicate. On treatment by nucleos(t)ide analogues (NUCs), HBs Antigen (Ag) clearance is the ultimate but difficult therapeutic goal. Our aim was to investigate how variability of HBV envelope protein, crucial in viral cellular entry and targeted by host immune response, could play a role in HBsAg clearance. HBV chronically infected patients, treated by NUCs with HBsAg clearance (resolver) were matched with patients without HBsAg clearance (non resolver). Combined mutations sT125M/sP127T, associated with HBsAg persistence, displayed a lower predicted antigenicity. Ultra Deep Sequencing of S gene showed a higher variability in non resolver. Functional assays on viral particles including sT125M and sP127T mutations versus reference particles are in progress. As a conclusion, molecular features observed in non NR argue in favor of a different pattern in HBV S characteristics according to variable NUCs efficiency