Dissertations / Theses on the topic 'Antigènes parasitaires'

L’épithélium intestinal est la porte d’entrée de Trichinella lors de l’invasion de l’hôte. Parmi les cellules immunitaires du GALT (gut associated lymphoid tissue), les mastocytes jouent un rôle clé dans la phase innée d’expulsion de Trichinella. Cependant leur rôle dans l’initiation de la réponse spécifique reste mal connu. Dans ce cadre, différents antigènes du stade intestinal du cycle de T. Spiralis ont été produits. L’analyse in vitro de la stimulation par l’antigène 411 de mastocytes murins génère la libération du TNF-α et de l’histamine. De plus, ces cellules montrent une régulation positive d’ARNm pour des molécules de co-stimulation, des molécules du CMH I et II et des cytokines (IL-1α, IL-1β, CXCL-1, CCL-5). Ces résultats indiquent que les mastocytes stimulés pourraient communiquer avec les lymphocytes T. Afin de mieux comprendre le rôle des mastocytes et de 411 dans la protection, des études in vivo d’efficacité vaccinale après test d’épreuve ont été effectuées avec évaluation de la charge parasitaire musculaire finale. Les souris vaccinées avec l’antigène 411, présentent un taux de protection d’environ 25 % par rapport aux souris non vaccinées. Lorsque ce même vaccin contient l’adjuvant Montanide™ ISA 70 VG, ce taux augmente à 40 %. Le suivi sérologique démontre en outre, une bonne réponse anticorps IgG1 et IgG2a amplifiée en présence d’adjuvant. L’analyse des coupes de tissus intestinaux n’a pas révélé de mastocytose après vaccination, comme cela peut être observé lors d’une infection naturelle. Ces résultats montrent un rôle protecteur de 411 dans un vaccin anti-Trichinella avec induction d’une fonction immunostimulante modérée des mastocytes
The intestinal epithelium is the gateway of Trichinella during host infection. Among immune cells of the gut associated lymphoid tissue, mast cells play a key role in the expulsion of T. Spiralis. However, mast cells roles’ in the initiation of the specific immune response against T. Spiralis remains poorly understood. Here, different antigens of the intestinal stage of T. Spiralis were generated. Murine bone marrow mast cells (mBMMC) stimulated with antigen 411 induced the release of TNF- α and histamine. Moreover, stimulated mBMMC showed an upregulation of mRNA for several costimulatory molecules, MHC class I and II molecules and cytokines (IL-1α, IL-1β, CXCL-1, CCL-5). These results indicate that stimulated mast cells could directly communicate with T cells. In vivo studies based on vaccine trials with challenge, were also performed to explore the role played by mast cells and antigen 411 in protection. Mice vaccinated with antigen 411 exhibited a protection rate of 25 % compared with unvaccinated mice. When vaccine containing 411 and the adjuvant Montanide ™ ISA 70 VG were tested, the protection rate reached 40%. Serological analysis demonstrates a good IgG1 and IgG2a response amplified in adjuvanted group. Intestinal tissue sections did not show mastocytosis after vaccination, as observed in a natural infection. These results demonstrated that 411 antigen induced both a protective role in anti-Trichinella vaccine and a moderate immunostimulation of mast cells in vivo

Trois molécules du stade épimastigote de Trypanosoma cruzi se fixent à une colonne de glutathion. Ces holoprotéines de 45, 30, et 25 kDa sont exprimées par tous les stades parasitaires et sont immunogènes au cours des infections chagasiques naturelle et expérimentale. Spécifiques de Trypanosoma cruzi, leur expression est augmentée en présence de phénobarbital. Injectées en présence de Bordetella pertussis et d'alun, elles sont capables de protéger des souris contre une infection léthale de trypomastigotes sanguicoles, alors qu'administrées avec de l'adjuvant de Freund, elles n'induisent pas d'immunité protectrice. Seuls les sérums des animaux immunisés par les trois protéines fixant le glutathion, injectées en présence de Bordetella pertussis et d'alun, sont capables de lyser des parasites vivants. De plus, seuls ces sérums possèdent des taux significatifs d'immunoglobulines G2a, G2b et E spécifiques. Des mécanismes effecteurs pouvant être impliqués dans la protection observée sont proposés. Les protéines de 25 et 30 kDa ont ensuite clonées et séquencées. Elles sont codées par une famille de gènes très proches et traduites par deux ARNs de taille différente. Ces protéines ne possèdent pas d'homologie significative avec d'autres glutathion S-transférases déjà clonées, mais avec des facteurs d'élongation de type 1 béta, impliqués dans la régulation de la synthèse des protéines. Au vu de ces observations, nous discutons du rôle probable de ces deux antigènes dans la biologie du parasite, ainsi que de l'orientation à apporter à notre stratégie vaccinale

Afin de mieux connaitre les mecanismes immunitaires mis en jeu au cours de la fasciolose et afin de rechercher des antigenes <<<>candidats-vaccins<>>>, nous avons etudie, chez des moutons infestes experimentalement, la cinetique des reponses humorale et cellulaire dirigees contre des fractions purifiees des produits d'excretion/secretion de f. Hepatica (pesfh) ainsi que les sous-populations lymphocytaires peripheriques et locales mises en jeu au cours de l'infestation. Par differentes techniques, 9 fractions ont ete purifiees a partir des pesfh : 6 fractions de 50-70, 35-40, 27-30, 24, 20 et <17 kda (electrophorese preparative), 1 fraction glucidique (gel filtration), une fraction 18/8g de 25 et 27 kda (chromatographie d'affinite avec des anticorps monoclonaux) et une fraction gst de 26,8 et 27,2 kda. La reponse humorale anti-pesfh est precoce et dure tout au long de l'infestation. Elle est dirigee contre un grand nombre d'antigenes dont 14 sont reconnus par une majorite de moutons. Elle se caracterise par la predominance d'igg1 par rapport aux igg2 et par une production d'igm tout au long de l'infestation. La reponse cellulaire anti-pesfh est precoce et transitoire, entre jpi7 (7#e#m#e jour post-infestation) et jpi35. Une cinetique similaire de la reponse immunitaire est observee avec les fractions purifiees par electrophorese preparative et avec la fraction 18/8g. Une reponse humorale anti-fraction sucree a ete detectee precocement mais aucune reponse cellulaire dirigee n'a ete decelee. Enfin, aucune reponse immunitaire n'a ete observee contre les gst. Par phenotypage et par immunohistochimie, nous avons montre la predominance de la reponse humorale au cours de la fasciolose. La caracterisation des immunoglobulines de surface montre l'existence de nombreuses cellules igg+ et igm+ tout au long de l'infestation, l'augmentation du nombre de cellules iga+ en jpi10 et de cellules igg2+ en jpi20. Les variations de proportion des lymphocytes t se caracterisent par un recrutement local autour des lesions et dans les espaces portes hepatiques des lymphocytes peripheriques ovcd4+. Aucune stimulation preferentielle des lymphocytes par les pesfh n'a ete decelee. En revanche, les lymphocytes stimules par les pesfh produisent precocement, entre jpi7 et jpi4, de l'ifng et plus tardivement, en jpi35-42 de l'ii10.

L'hydatidose est une maladie parasitaire due au cestode Echinococcus granulosus. Le clonage moléculaire des antigènes echinococciques a été entrepris afin de participer au développement d'un nouveau test sérologique. A partir d'arme extrait de protoscolex d'e. Granulosus, une banque d'adnc a été réalisée en vecteur d'expression lambda gt11, est criblée avec un mélange de 5 sérums de patients hydatiques. 13 clones ont été sélectionnés, dont 10 se sont révélés identiques. La séquence nucléotidique a été déterminée, de 456bp, codant pour 152 aminoacides (17,3 kda). Aucune homologie n'a été trouvée par consultation des banques de données actuelles. La protéine de fusion clonée (pf6) est reconnue par 11 des 12 sérums humains hydatiques, ainsi que par des sérums de patients infestés par d'autres parasites proches. Pf6 est aussi reconnue par l'anticorps monoclonal eg 02 154/12 spécifique de l'antigène 5 d'e. Granulosus. Les anticorps selectionnés sur le clone eg6 reconnaissent parmi les antigènes du liquide hydatique une molécule de 37 kda, de même masse moléculaire qu'une des sous-unités de l'antigène 5. Ces résultats mettent en évidence l'existence d'une corrélation entre l'antigène 5 et le polypeptide cloné

Les bases moléculaires de la reconnaissance immunitaire permettent la prévision des épitopes b et t d'une protéine à la seule vue de sa structure primaire. Afin de valider et d'améliorer ces méthodes, nous les avons utilisées dans plusieurs modèles parasitaires et viraux pour sélectionner des peptides, les synthetiser et, en collaboration avec plusieurs équipes d'immunologistes, en étudier les propriétés. Du point de vue de l'antigénicité, il est possible de synthétiser une protéine complète et d'observer sa reconnaissance par des sérums de sujets infectés. Par ailleurs, les fragments peptidiques sont de bons outils pour cartographier les épitopes d'une protéine et peuvent dans certains cas constituer des antigènes plus performants que la protéine elle-même. Il est également possible d'induire une organisation spatiale chez un peptide afin d'en ameliorer l'antigénicité. Du point de vue de l'immunogénicité, nous avons mis en évidence plusieurs peptides actifs, parmi lesquels certains possedaient une structure modifiée par rapport à la séquence naturelle leur conférant des propriétés nouvelles, telle la génération d'une réponse cellulaire cytotoxique spécifique de l'antigène naturel

L'isolement biochimique et immunochimique du composant 5 de Trypanosoma cruzi, réalisé à partir de différentes sources antigéniques (extrait antigénique total, fraction enrichie en composant 5 et surnageant de milieu de culture), a permis de préciser ses caractéristiques biochimiques. Tous les résultats concordent pour dire que le composant 5 correspond à une famille de glycoprotéines constituée principalement d'une molécule majeure de 72 kD de poids moléculaire apparent, riche en glucides (GP72) et d'une autre molécule de 90 kD. Ces deux molécules ne présentent pas dans nos conditions expérimentales de relations immunologiques détectables. Il est intéressant de noter que l'approche biochimique de la purification du composant 5 permet l'obtention, avec un très bon rendement, d'une fraction enrichie en ce composant. Celle-ci conduit à la purification d'un antigène 24 kD, riche en protéines, qui conservent les propriétés antigéniques et immunogéniques du composant 5. Cette molécule semble correspondre à un produit de clivage de la GP72. En raison de la nécessité, dans la maladie de Chagas, d'un test diagnostique sensible et spécifique, une partie plus appliquée nous a permis de mettre au point une trousse diagnostique utilisant la fraction enrichie en antigène 24 kD et un anticorps monoclmonal correspondant dans un test de compétition ELISA.

L'un des objectifs prioritaires dans le domaine de la vaccinologie reside dans le developpement de nouvelles strategies exploitant le systeme immunitaire muqueux. Dans ce contexte, nous avons evalue le potentiel de bordetella pertussis, agent etiologique de la coqueluche, comme vecteur vivant vaccinal administrable par voie nasale. Pour cela, nous avons utilise l'adhesine majeure de cette bacterie, l'hemagglutinine filamenteuse ou fha. Nous nous sommes interesses au mecanisme de secretion de cette proteine afin de determiner les regions dans lesquelles une proteine etrangere pouvait etre inseree sans alterer la biogenese ni modifier les proprietes intrinseques de la fha. L'antigene heterologue choisi est un candidat vaccinal tres prometteur, la glutathion s-transferase de 28 kda exprimee par le parasite schistosoma mansoni (sm28gst). L'administration nasale d'une souche recombinante de b. Pertussis exprimant une proteine hybride fha-sm28gst est capable de stimuler la production d'iga secretoires au niveau des muqueuses du tractus respiratoire et d'induire une memoire immune specifique de la proteine parasitaire. L'attenuation de cette souche recombinante nous a permis de reduire la pathogenicite de ce vecteur tout en augmentant la reponse anticorps contre la fha et la sm28gst. Notre protocole d'immunisation se revele efficace dans les conditions defavorables que sont une primovaccination contre la coqueluche ou une primo-infection par b. Pertussis. L'administration nasale d'une souche recombinante attenuee de b. Pertussis est donc capable de proteger les souris contre une infection par b. Pertussis et contre l'infection heterologue par s. Mansoni. Cette protection peut egalement etre obtenue chez des sujets deja infectes par le parasite. L'ensemble de ce travail montre l'efficacite de b. Pertussis comme vecteur vivant attenue exprimant une proteine hybride fha-antigene heterologue. Son administration par voie nasale induit la production d'anticorps au niveau des muqueuses du tractus respiratoire et au niveau serique, et protege les souris contre une infection homologue et heterologue.

La 4e de couverture indique : "L'immunité à médiation cellulaire représente le mécanisme principal de défense contre T. Gondii. L'objectif de ce travail a été de préciser la réactivité lymphocytaire T vis-à-vis d'antigène toxoplasmique soluble et de mieux caractériser les protéines responsables d'une réponse cellulaire chez les patients qui présentent une maladie spontanée. Nous avons exploré cette réactivité par l'étude de l'expression de molécule d'activation (CD25+ chaîne a du récepteur de l4IL-2) à la surface des cellules lymphocytaires T en cytometrie en flux (CMF) et par l'étude de la sécrétion de cytokines. Tous les sujets explorés (n=394) sauf 2 ont une immunité cellulaire explorable en CMF, en particulière les nouveau-nés de moins de 1 an atteints de toxoplasmose congénitale. Pour diagnostiquer une infection toxoplasmique, la technique a montré une sensibilité de 99% et une spécificité de 94% avec un seuil à 5% des cellules activées chez les immunocompétents de plus de 1 an et une sensibilité de 95% et une spécificité de 89% chez les nouveau-nés de moins de 1 an avec un seuil de à 7%. La réactivité des cellules lymphocytaires T circulantes, spécifiques de l'antigène toxoplasmique soluble, est identique chez les patients atteints de toxoplasmose oculaire congénitale ou acquise. Cette réponse est caractérisée par la sécrétion de cytokines de type Th1. La réponse cellulaire vis-à-vis d'antigènes recombinants (GRA1, GRA6, GRA7 et SAG1) est variable entre individus infectés. Cette réponse est également caractérisée par la sécrétion de cytokines de type Th1. Nous avons exploré la réponse lymphocytaire T vis-à-vis de fractions d'antigènes toxoplasmiques séparés par électrophorèse et migration sur nitrocellulose. Une variabilité de la réponse cellulaire vis-à-vis de ces fractions a été observée chez les femmes enceintes atteintes de toxoplasmose chronique. C'est ainsi que 90 à 95% de ces patientes ont montré une réactivité lymphocytaire T vis-à-vis des protéines de 26 à 36. 9kDa. Une meilleur caractérisation de ces protéines devrait permettre de mieux définir les protéines candidates à une immunité vaccinale protectrice. "

Les lymphocytes T (LT) CD8 jouent un rôle majeur dans la protection de l'hôte contre les parasites intracellulaires. Les LT CD8 reconnaissent des antigènes (ag) présentés par les molécules du CMH I à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). En fonction de l'origine des ag, deux voies d'apprêtement et de présentation sont connues et caractérisées : la voie 'classique' pour les ag endogènes et viraux, et la voie 'croisée' pour les ag exogènes internalisés. Néanmoins, il existe des situations physiologiques de présentation d'ag exogènes par les molécules du CMH I qui ne correspondent à aucune de ces deux voies. C'est le cas lors de l'infection par Toxoplasma gondii (T. gondii). Les mécanismes d'apprêtement dans ce contexte infectieux sont encore mal connus. T. gondii est un parasite intracellulaire obligatoire résidant dans une vacuole qui est un compartiment distinct d'un phagosome. L'infection des cellules se fait par un mécanisme d'entrée actif qui induit la formation et la maturation de la vacuole parasitophore (PV). Les protéines de granules denses (GRA) sont une large famille de protéines du parasite, essentielles à la maturation de la PV. Les protéines GRA sont sécrétées sous forme soluble dans la vacuole, puis certaines sont adressées vers différentes structures membranaires, tel que le réseau membranaire intravacuolaire (IVN : intravacuolar network) et la membrane limitante de la PV (PVM), auxquels elles s'associent de manière périphérique ou transmembranaire. L'une de ces protéines GRA, GRA6, est l'ag source de l'épitope immunodominant HF10. Des travaux ont mis en évidence, dans une lignée de cellules dendritiques (DC), le rôle de la protéine SNARE Sec22b dans la fusion membranaire entre des vésicules du réticulum endoplasmique (RE) et la PV, et dans la présentation de l'ag soluble Ova sécrété par T. gondii. Nous avons étudié le rôle de Sec22b sur la présentation d'ag fortement associés aux membranes (GRA6) dans des DC primaires et des macrophages par le CMH I en utilisant un protocole de déplétion par transduction lentivirale de shRNA. Nos résultats ont confirmé le rôle de Sec22b sur la présentation de l'ag soluble dans les DC, ce qui n'est pas le cas dans les macrophages. Enfin, dans les DC et les macrophages, nous avons montré que Sec22b n'impacte pas la présentation d'ag fortement associés aux membranes tel que GRA6. En parallèle, notre équipe a mis en évidence que GRA6 est insérée dans la PVM, avec le Cter exposé du côté du cytosol de la cellule hôte. Auparavant, notre équipe a publié que la présentation efficace d'épitope dérivé de GRA6 requiert sa localisation au Cter de la protéine. Ces données nous ont incitées à étudier l'impact de la topologie d'ag transmembranaires, sur leur accessibilité à la voie d'apprêtement et de présentation CMH I. Nous avons développé un modèle d'étude pour comparer l'apprêtement et la présentation par le CMH I de l'épitope HF10 en fonction de son exposition : côté cytosol de la cellule hôte, ou, côté lumière de la vacuole. Les mesures de présentation antigénique par des macrophages et des DC primaires infectés ont révélé une diminution de la présentation de HF10 lorsqu'il est exposé du côté lumière de la vacuole. Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence de nouveaux éléments dans la compréhension de la régulation de l'immunogénicité des ag de T. gondii aux niveaux cellulaire et moléculaire
CD8 T lymphocytes play a major role for host protective immunity against intracellular parasites. CD8 T cells recognize antigens (Ag) presented by MHC I on the surface of antigen-presenting cells (APCs). Depending on the origin of Ag, two different processing and presentation pathways have been described: the classic one for endogenous and viral Ag, and the cross-presentation pathway for internalized exogenous Ag. Nevertheless, there are physiological conditions of exogenous Ag presentation by MHC I which do not fit any of these two pathways. It is the case for Toxoplasma gondii (T. gondii) infection. The mechanisms of processing in this infectious context are still unclear. T. gondii is an obligate intracellular parasite residing in a vacuole, a distinct compartment of a phagosome. Infection occurs via an active mechanism that induces the formation and maturation of parasitophorous vacuole (PV). Dense granule proteins (GRA) are a large parasite protein family, essential for the maturation of PV. GRA proteins are secreted as soluble proteins in the vacuole, and some are addressed to different membrane structures, such as the membrane intravacuolar network (IVN) and the vacuole limiting membrane (PVM). One of these GRA proteins (GRA6) is the source of an immunodominant epitope (HF10). Previous work highlighted in one dendritic cell line (DC), the role of SNARE Sec22b protein in membrane fusion between vesicles of the endoplasmic reticulum (ER) and the PV, and in the presentation of soluble Ova Ag, secreted by T. gondii. We have studied the role of Sec22b on Ag presentation of membrane-bound Ag (GRA6) in primary DC and macrophages by MHC I, using lentiviral transduction of shRNA. Our results confirmed the role of Sec22b on soluble Ag presentation in DC, which is not the case in macrophages. Finally, in DC and macrophages, we have shown that Sec22b does not impact on Ag presentation of membrane-bound Ags, such as GRA6. Besides this, our team highlighted that GRA6 is inserted in the PVM, with Cter exposed towards the host cell cytosol. Previously, our team published that effective presentation of the epitope derived from GRA6 requires its location at Cter of the protein. The association of these data prompted us to study the impact of Ag transmembrane topology on accessibility to MHC I processing and presentation. We developed a model to compare MHC I presentation of the HF10 epitope based on its exposition: at host cell cytosol, or, at vacuole lumen. Antigen presentation measurements by infected primary macrophages showed a decrease in HF10 presentation when exposed to the vacuole lumen side. My PhD work shed new light on the regulation of immunogenicity of T. gondii Ag at the cellular and molecular levels

Babesia canis est un hémoparasite du phylum des Apicomplexes transmis par la morsure de tique et responsable de la piroplasmose canine en Europe. Dans la perspective de développer un vaccin recombinant, nous avons réalisé deux études visant à mieux comprendre les interactions hôte/parasite au cours du cycle érythrocytaire. Nous avons étudié d'une part le rôle des antigènes parasitaires solubles (APS) dans le déclenchement des signes cliniques et d'autre part celui de l'antigène Bc28.2 codé par la famille multigénique Bc28 dans les mécanismes d'échappement à l'hôte.Les APS de B. canis induisent une réponse protectrice anti-maladie chez les chiens vaccinés. Toutefois, leur rôle exact dans la pathogénèse reste à définir. Contrairement à ce qui est décrit dans la pathogenèse à B. bovis, nos analyses réfutent l'hypothèse qu'ils pourraient agir sur le système kallicréine-kinine plasmatique. Par contre elles suggèrent, pour la première fois chez le genre Babesia, un rôle direct des APS dans le déclenchement précoce de la réponse inflammatoire observée au cours de la pathogenèse.De part leur fonction essentielle dans la survie parasitaire, les antigènes localisés à la surface de l'érythrocyte (rôle dans l'agglutination des hématies parasitées) ou des mérozoïtes (rôle dans l'invasion) sont de bons candidats vaccins. Cependant et probablement dans une perspective d'échappement à l'hôte, ils sont codés par des familles multigéniques. Chez B. canis, la famille multigénique Bc28 contient le gène Bc28.1 qui code pour un antigène à ancrage GPI préalablement caractérisé à la surface du mérozoïte. Nous montrons qu'un autre gène, désigné Bc28.2 (plusieurs copies dans le génome) contient 2 cadres de lecture chevauchant et serait capable d'exprimer des antigènes polymorphes de 28 kDa et 50 kDa par un mécanisme de recodage traductionnel +1. De façon originale, ces protéines seraient localisées non pas à la surface des mérozoïtes mais à la surface des hématies parasitées
Babesia canis is an apicomplexan haemoparasite transmitted by tick bite and responsible of canine babesiosis in Europe. Understanding host/parasite relationships during the erythrocytic cycle is crucial for further development of a recombinant vaccine. In that way, the role of soluble parasite antigens (SPA) in the onset of clinical signs and the role of Bc28.2 antigen (encoded by the B. canis Bc28 multigene family) in host evading process were investigated.B. canis-derived SPA induce a protective anti-disease immunity in vaccinated dogs but their precise role during the pathogenesis remains unknown. In contrast to B. bovis, our analysis disproved the hypothesis that B. canis SPA could act on the plasma kallikrein-kinin system. However they strongly suggest, for the first time in the genus Babesia, a direct role of these SPA in the onset of the inflammatory response which is early observed during pathogenesis. Because of their essential function in the parasite survival, antigens located on the surface of infected erythrocyte (role in agglutination of erythrocytes) or on the surface of merozoites (role in the invasion) are good vaccine candidates.However, and probably for host evading, they are encoded by multigene families. In B. canis, the Bc28 multigene family contains the Bc28.1 gene that encodes for a GPI-anchored antigen previously characterized on the merozoite surface. We demonstrated here, that another gene designated Bc28.2, is multicopy and composed of two overlapping open reading frames (Orf1 and Orf2). It allows, though +1 programmed ribosomal frameshift, expression of polymorphic antigens of 28 kDa and 50 kDa. Unexpectedly, these proteins seem localized on the surface of parasitized erythrocytes, suggesting they play a crucial function in evading host through agglutination process of infected erythrocytes

Les lymphocytes T CD8 jouent un rôle central dans l'immunité protectrice contre les pathogènes intracellulaires tels que le parasite Toxoplasma gondii (T. gondii). T. gondii réside à l'intérieur d'une cellule hôte et dans une vacuole parasitophore. L'interface entre l'hôte et le parasite comprend une membrane limitant la vacuole ainsi qu'un réseau intravacuolaire (IVN) composé de tubules membranaires fortement incurvés et dont la fonction reste incertaine. Beaucoup d'effecteurs parasitaires, incluant des sources potentielles d'antigènes pour les lymphocytes T CD8, sont sécrétés par T. gondii dans la vacuole et adressés à différents endroits dans la vacuole ou au-delà, dans la cellule hôte. A l'heure actuelle, les mécanismes contrôlant l'adressage des antigènes parasitaires dans la cellule hôte demeurent mal compris et nous ne savons pas comment le transport intracellulaire des protéines de T. gondii influence leur disponibilité par la voie de présentation CMH I et leur capacité à induire l'immunité T CD8. En utilisant une approche multidisciplinaire combinant la génétique inverse de T. gondii, la microscopie, la présentation antigénique in vitro et l'expérimentation animale, mes travaux de thèse ont montré que l'insertion d'un antigène immunodominant à la membrane limitante de la vacuole constitue une des clés de l'immunogénicité. J'ai également montré que l'association de cet antigène à l'IVN limite sa présentation par les molécules du CMH I et réduit les réponses T CD8 spécifiques de cet antigène chez la souris. L'IVN pourrait jouer un rôle immuno-modulateur dans lequel il limiterait l'accès de protéines parasitaires sécrétées au cytosol de la cellule hôte et à la voie CMH I
CD8 T cells play a key role in protective immunity against intracellular pathogens such as Toxoplasma gondii (T. gondii) parasite. T. gondii resides inside host cell in parasitophorous vacuole. The host-T. gondii interface comprises a vacuole limiting membrane and a highly curved membraneous IntraVacuolar Network (IVN) of uncertain function. Many parasite effectors, including potential epitopes for CD8 T cells, are secreted by T. gondii to and across the boundary of their parasitophorous vacuole. Currently, the mechanisms controlling the targeting of parasite antigens to host cell are misunderstood et we don't kwnow how the intracellular transport of T. gondii proteins impacts on their access to MCH I pathway and their ability to induce CD8 T cell immunity. Using a multidisciplinary approach which combined reverse genetics in T. gondii, microscopy, antigen presentation measurements and in vivo experiments, I showed that insertion of a T. gondii dominant antigen at the vacuole limiting membrane is key for immunogenicity, yet that association of this antigen to high curvature IVN limits its presentation and curtails specific CD8 responses in mice. The IVN may play a role in immune modulation by limiting the access of parasite proteins to host cytosol and thus to MHC I pathway

L'hypodermose bovine est une affection parasitaire provoquée par un agent de myiases, Hypoderma bovis et lineatum (insecte diptère oestridae). Elle affecte principalement les bovins et est rresponsable de pertes économiques importantes pour l'élevage et l'industrie du cuir. Actuellement, seule la chimiothérapie permet un contrôle de la maladie. Mais ces moyen prophylactiques ne sont pas sans risques pour la santé humaine et l'environnement. Aussi la vaccination pourrait apporter un moyen alternatif pour lutter contre cette parasitose. L'étude partielle des interactions entre les systèmes de défense de l'hôte et le parasite ont permis de définir l'activité antiinflammatoire des sécrétions du parasite, les hypodermines A, B et C. L'objectif de cette étude visait à analyser l'action de ces hypodermines sur la réponse immunitaire humorale et cellulaire à partir de deux approches. Une étude in vitro : des cultures de lymphocites naïfs stimulés par différents mitogènes, en présence d'hypodermines, ont permis de démontrer que ces dernières avaient une activité modulatrice sur la réponse lymphocitaire : elles stimulent la réponse, dans le cas de l'hypodermine B, ou l'inhibent, dans le cas des hypodermines A et C. Cette activité modulatrice affecte les lymphocytes et les non les mitogènes. Une étude in vivo : à partir de lymphocytes de bovins non infestés ou déjà infestés recevant des injections d'ypodermines A ou C, l'activité inhibitrice de lypodermine A sur la réponse lymphocytaire a également été démontrée, tandis que l'hypodermine C ne présentait aucune activité modulatrice. Enfin des injections d'hypodermine A induisent, aussi bien chez les animaux non infestés qu'infestés, des réponses humorales et cellulaires homologues. Des essais de stimulation de la réponse immunitaire, à partir d'injections d'hypodermine A en présence de différents adjuvants, a induit une protection à l'infestation naturelle qui n'excède pas 30%
Bovine hypodermosis associated to an insect producing myasis is widely spread all over the herds of the northern hemisphere. Its economic incidence (on meat and leather production) had led to national programs of control. They are all based on chemotherapy. But, if very efficient molecules are not applicable to dairy cow due to their long lasting residue in milk. Howerver, a development of resistance to these antiparasitic molecules could be suspected. So a control by vaccination could be a alternative issue. The relationships between the parasite and the defense system of the host need to bu understood. In previous studies we have already demonstrated the antiinflammatory activity of the parasite secretions : hypodermins A, B and C. This study aimed to analyse the activity of these hypodermins on the bovine cellular and humoral responses. In vitro studiees : the lymphocytes co-cultivated with different mitogens and hypodermins modulate the proliferative response of lymphocytes to mitogens : hypodermin B increases this response, whereas hypodermins A and B decrease it. In vivo studies : lymphocytes from previously uninfested and infested cattle, receiving hypodermins A or C by injection and co-cultivated with mitogens confirm the in vitro inhibiting activity of hypodermin A, whereas hypodermin C does not modify the lymphoproliferation. Moreover, hypodermin A injections induce, on previously unfested and non unfested animals, a similar humoral and cellular response. Immunization of naive cattle with hypodermin A associated with different adjuvants leads to a low protection against natural infestation which do not reach 30%

African trypanosomes are a major plague in sub-Saharan Africa. They cause sleeping sickness in humans and nagana in cattle. These parasites are transmitted between their mammalian hosts by tsetse flies. They are adapting to their different environments through differentiation processes. These processes involve, amongst other things, the expression of different surface coats. These coats are made of procyclin protein at the insect midgut procyclic stage and of variant surface glycoprotein (VSG) at the mammalian bloodstream stage. At a given time, one VSG is expressed from a single VSG gene out of a repertoire of more than 1500 VSG genes present in the trypanosomes genome. The expressed VSG gene is always located at one of fifteen telomeric polycistronic transcription units called expression sites (ES). The VSG coat is changed regularly in a process called antigenic variation allowing trypanosomes to escape the immune response. The exact mechanism controlling the selection of the active ES is not yet known and controversies have been raised concerning the ES transcription control. Although several molecular factors involved in the ES monoallelic-expression have been identified, none of them seems to be a critical regulator.

Thus during my thesis we decided to explore two aspects of ES expression: (A) deciphering the level at which this expression is controlled and (B) fishing for new protein factors controlling this expression.

A) It is not even clear at which level the ES transcription control takes place. In particular, there has been debate on whether it is taking place at the transcription initiation or elongation level. Previous experiments generated contradictory conclusions and gave rise to two different models. The first model suggested that transcription initiation takes place in all ESs simultaneously. The second model suggested that transcription is initiated in only two ESs, one being fully active and a second being pre-active. These two models were equally able to account for the finding of transcripts from different ES within a trypanosome population provided the pre-active ES differs between individual cells. In order to decide if a single or multiple ES promoters can initiate transcription in a given cell, single cell RT-PCR targeting the beginning of the ES was required. Thus single cell RT-PCR was performed and an analysis of the obtained transcripts showed that transcription initiation is taking place on many ES while only one VSG is transcribed. This permitted the unambiguous conclusion that the monoallelic expression of VSG is exerted by controls operating downstream from transcription initiation, suggesting transcription elongation or RNA processing as critical control steps.

B) We have characterized a new nuclear protein, Tb alba3, involved in the repression of silent VSGs. Its invalidation lead to chromatin opening in the silent expression sites and to a raise in their expression. As this protein is cytoplasmic and binding procyclin mRNAs at the procyclic stage, it could be a new versatile factor, shuttling between the cytoplasm and the nucleus and involved both in the inverse regulation of major surface antigens at different differentiation stages and the control of antigenic variation.

These results enhance our understanding of ES transcription control and of ES monoallelic expression.
Doctorat en Sciences
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Le trypanosome est le parasite responsable de la maladie du sommeil chez l’homme et de la Nagana chez le bétail. Afin d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère, il remplace périodiquement la protéine VSG (Variant Surface Glycoprotein) présente en 10 millions d’exemplaires à sa surface. Ce mécanisme a pour nom la variation antigénique.

Pour être exprimé, le gène de VSG (VSG) doit se trouver en fin d’un site d’expression (ES) particulier. Cet ES est polycistronique, télomérique et transcrit par une ARN polymérase de type ribosomique (Pol I). 20 à 40 ESs similaires et un millier de VSGs sont recensés dans le génome du trypanosome. Cependant, un seul ES est totalement transcrit (actif) et un seul VSG est exprimé. La variation antigénique est donc possible par deux mécanismes: soit l’activation d’un autre ES, soit le remplacement du VSG dans l’ES actif. La base de ce système est l’activation d’un seul ES à la fois (contrôle monoallélique).

Au laboratoire, un modèle a été proposé où la transcription s’initie au niveau de tous les ESs mais n’aboutit au VSG que dans le cas de l’ES actif (Vanhamme et al. 2000). Dans ce cas uniquement, le transcrit primaire subit une maturation correcte (épissage et polyadénylation) et est exporté dans le cytoplasme. Etant donné que des transcrits Pol I subissent une maturation identique à des transcrits Pol II, la régulation s’effectuerait par recrutement d’une machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II (Pol II « RNA factory »). Cette dernière serait uniquement localisée au niveau de l’ES actif dans le compartiment nucléaire appelé ES body (Navarro and Gull, 2001).

Durant cette thèse, diverses stratégies ont été élaborées pour tester la validité du modèle. La première visait à comparer l’état de maturation d’un ES en fonction de son activité. Nos résultats ont appuyé l’idée que les transcrits d’ESs ayant subi une maturation correcte provenaient préférentiellement de l’ES actif mais le(s) facteur(s) en quantité limitante ne permettant cette maturation qu’au niveau de l’ES actif doivent encore être identifiés. Le seconde stratégie analysait l’acétylation des histones ainsi qu’un éventuel attachement différentiel à la matrice nucléaire de l’ES suivant son activité. Le niveau d’acétylation d’un ES lorsqu’il est actif n’a pu être étudié. Des résultats préliminaires en faveur d’une association préférentielle de l’ES à la matrice nucléaire lorsqu’il est actif ont été obtenus. Enfin, nous avons cloné deux homologues d’un facteur général de la transcription appelé TFIIS. Ce dernier permet à la Pol de redémarrer lorsqu’elle est bloquée par un site de pause. Individuellement chacun de ces facteurs ne semble pas être essentiel au trypanosome. Cependant, un retard de croissance a été observé lorsque les deux facteurs sont invalidés dans la même lignée cellulaire. Ce phénotype particulier doit être caractérisé. En parallèle, nous avons envisagé de caractériser le complexe de la Pol I du trypanosome. Cette stratégie constituait la manière la plus simple de mettre en évidence un éventuel contact physique et/ou fonctionnel entre la Pol I transcrivant l’ES et la machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II « RNA factory ». 5 sous-unités du complexe ont été identifiées, associées à une protéine de fonction inconnue ainsi qu’à des histones. L’identification d’autres protéines associées au complexe constitue notre perspective principale. La phosphorylation de la plus grande sous-unité du complexe a été démontrée mais son rôle doit encore être élucidé.

Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
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Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface.

Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome.

Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée.

Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines.

Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.

Doctorat en Sciences
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La toxoplasmose, déterminée par le parasite Toxoplasma gondii, est l'une des infections les plus répandues au monde, en raison de la persistance à vie sous forme latente de ce parasite au sein de ces hôtes. Ce parasite fait partie des Apicomplexa et détourne les voies de signalisation de l'hôte par des mécanismes épigénétiques qui convergent vers des protéines nucléaires clés. Nous rapportons ici une nouvelle stratégie de persistance parasitaire impliquant la protéine de rhoptries ROP16 de T. gondii, sécrétée précocement lors de l'invasion, qui cible le facteur de transcription UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING fingers domain 1) et induit un arrêt du cycle de la cellule-hôte. Ceci est induit par l'activité de la DNMT et le remodelage de la chromatine au niveau du promoteur du gène de la cycline B1 par le recrutement d’UHRF1 phosphorylé associé à un complexe protéique multienzymatique répressif. Cela conduit à la désacétylation et à la méthylation de l'histone H3 entourant le promoteur de la cycline B1 pour réduire de manière épigénétique son activité transcriptionnelle. De plus, l'infection par T. gondii provoque une hyper-méthylation de l'ADN dans la cellule hôte par la régulation positive des DNMTs. ROP16 est déjà connue pour activer et phosphoryler des facteurs de transcription de l'immunité protectrice tels que STAT 3/6/5 et le suppresseur tumoral p53 impliqué dans la progression du cycle cellulaire. De plus, ROP16 module ces voies de signalisation de l'hôte de manière souche-dépendante. Comme dans le cas de STAT3, les effets de ROP16 sur UHRF1 dépendent du polymorphisme d'un seul acide aminé du domaine kinase de ROP16. Ce travail montre que Toxoplasma module un nouvel initiateur épigénétique, UHRF1, via un événement précoce initié par la kinase parasitaire ROP16
Toxoplasmosis, caused by the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, is one of the most common infections in the world due to the lifelong persistence of this parasite in a latent stage in its hosts. T. gondii hijacks host signaling pathways through epigenetic mechanisms which converge on key nuclear proteins. Here we report a new parasite persistence strategy involving Toxoplasma rhoptry protein ROP16 secreted early during invasion, which targets the transcription factor UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING fingers domain 1), and leads to host cell cycle arrest. This is mediated by DNMT activity and chromatin remodeling at the cyclin B1 gene promoter through recruitment of phosphorylated UHRF1 associated with a repressive multienzymatic protein complex. This leads to deacetylation and methylation of histone H3 surrounding the cyclin B1 gene promoter to epigenetically silence its transcriptional activity. Moreover, T. gondii infection causes DNA hypermethylation in its host cell, by upregulation of DNMTs. ROP16 is already known to activate and phosphorylate protective immunity transcription factors such as STAT 3/6/5 and the tumor suppressor p53 involved in cell cycle progression. Moreover, ROP16 modulates host signaling pathways in a strain-dependent manner. Like in the case of STAT3, the strain-dependent effects of ROP16 on UHRF1 can be attributed to a single amino-acid polymorphism in ROP16. This study demonstrates that Toxoplasma hijacks a new epigenetic initiator, UHRF1, through an early event initiated by the ROP16 parasite kinase