Dissertations / Theses on the topic 'Antígenos virais'

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A Dengue constitui um dos principais problemas de Saúde Pública no mundo, e um dos fatores que colaboram com esta situação é a falta de uma vacina eficaz contra a doença, sendo que em parte, essa dificuldade para obtenção, se deve à inexistência de um modelo experimental que represente o quadro de infecção e manifestação da doença similar aos observados em humanos. Dessa forma, o Instituto Evandro Chagas demonstrou a presença de antígenos virais de dengue, através do teste de Imuno-histoquímica, em primata não humano (PNH) da espécie Callithrix jacchus, o qual evoluiu a óbito com quadro de dengue hemorrágica. Diante do exposto, aliados ao fato de que o fígado é o órgão onde se observa as principais alterações provocadas pelo Virus Dengue (VDEN) em humanos, torna-se importante analisar o fígado de primatas do gênero Callithrix a fim de estudar a patogênese e a imunopatologia da infecção sequencial pelo VDEN. No total, 26 PNH da espécie Callithrix penicillata foram submetidos a infecção primária (IP) por via subcutânea com VDEN-3 (3,23 x 103 PFU/mL), sendo 13 destes animais anestesiados e sacrificados diariamente por sete dias pós-infecção (dpi) (fase aguda) e em intervalos aleatórios até 60 dpi (fase convalescente); a infecção secundária (IS) com VDEN-2 (4,47 x 104 PFU/mL) foi realizada dois meses após a IP nos demais 13 animais. Animais sentinelas não infectados foram reservados até o final do experimento. O fígado dos animais foram processados para histopatologia e imunohistoquímica usando anticorpos policlonais para VDEN e anticorpos para análises da resposta imune inata, celular e citocínica. Os PNH estudados foram suscetíveis à replicação sequencial do VDEN-3 e VDEN-2 no fígado, havendo expressão de antígenos virais em hepatócitos, células de Kupffer e nos corpúsculos de Councilman; o comprometimento histopatológico do fígado foi caracterizado por: presença de apoptose; focos de necrose lítica; esteatose; tumefação cellular; inflamação acinar, no espaço porta (EP) e na veia hepática central (VHC); hiperplasia/hipertrofia em células de Kupffer, bem como, hemossiderina em células de Kupffer; e dilatação dos sinusóides. A intensidade da lesão hepática foi proeminente na fase aguda da IP e IS, apresentando discreta hepatite aguda. A apoptose foi a forma predominante de morte em hepatócitos; bem como, necrose lítica e o infiltrado inflamatório apresentaram padrão de distribuição predominante em Z2. Observou-se aumento na expressão acinar de macrófagos ativados, células NK, proteína S-100 e linfócitos B durante as fases da IP e IS; houve ainda, aumento da expressão acinar de linfócitos TCD4+ durante a fase aguda da IP; observou-se aumento na expressão acinar de IFN- durante as fases da IP e IS, TNF-α e IL-8 com maior prevalência na IS, TGF-β e IL-10 mais expressas na fase aguda da IP, proteína Fas durante a fase aguda da IP e IS e VCAM na fase aguda da IS e aumento na expressão nos EP. Esses achados foram semelhantes aos observados em fígados de casos fatais de dengue em humanos, porém com intensidade e amplitude menor, sugerindo que PNH da espécie Callithrix penicillata é um bom modelo experimental para o estudo da infecção pelo VDEN, especialmente os aspectos imunopatológicos.
Dengue is one of most important public health problem in the world, and one of the factors that contribute with this situation is the lack of an effective vaccine against the disease, and in part, this difficulty to obtain is due clinical the lack of an experimental model that mimic the infection and manifestation of the disease as those observed in humans. Then, the Evandro Chagas Institute showed the presence of dengue antigens using the Immunohistochemistry assay, in the liver of a non-human primate (NHP) of the species Callithrix jacchus, with a fatal outcome following dengue hemorrhagic fever. Based in the above considerations and in addition to the fact that the liver is the targetb organ for Dengue Virus (DENV) in humans, it is important to analyze the liver of primates of the genus Callithrix in order to study the pathogenesis and the immunopathology of sequential infection by DENV. A total of 26 NHP Callithrix penicillata were submitted to primary infection (PI) subcutaneously with DENV-3 (3.23 x 103 PFU/mL), and 13 of these animals anesthetized and sacrificed daily for seven days post-infection (dpi) (acute phase) and in random intervals until 60 dpi (convalescent phase); the secondary infection (SI) with DENV-2 (4.47 x 104 PFU/mL) was performed two months after the PI in the remaining 13 animals. Uninfected sentinels animals were reserved up ending of the experiment. The liver of the animals were processed for histopathology and Immunohistochemical assay using polyclonal antibodies to DENV and antibodies for analyses of the innate and cellular immune response as well as the cytokine expression . The NHP were susceptible to sequential infection by DENV-3 and DENV-2; in the liver viral antigens were expressed in hepatocytes, Kupffer cells and Councilman bodies; the histopathological changes in liver was characterized by the presence of apoptosis, focal lytic necrosis, steatosis, swelling cellular, inflammation (acinar, EP and HCV), hyperplasia/hypertrophy in Kupffer cells, hemosiderin in Kupffer cells and sinusoidal dilatation; the intensity of the liver damage was prominent in the acute phase of PI and SI resulting in acute hepatitis. In addition the apoptosis was the most frequent mechanism of death of hepatocytes; lytic necrosis and inflammatory infiltrate showed predominant distribution pattern in Z2. An increase of the acinar expression of activated macrophages, NK cells, S-100 protein and B-lymphocytes during the stages of PI and SI; as well as, increased acinar expression of TCD4 + lymphocytes during the acute phase of PI; as to the quantification of cytokines and molecules, was observed an increase in acinar expression of: IFN- during the stages of PI and SI, TNF-α and IL-8 with higher prevalence in SI, TGF-β and IL-10 with prevalence in acute phase of PI, Fas protein during the acute phase of PI and SI and VCAM in acute phase of SI, as well as increase in expression in the EP. These findings were similar to those observed in livers from fatal cases of dengue fever in humans, but with lower intensity and amplitude, thus indicating that NHP Callithrix penicillata species is a good experimental model for infection by DENV, involving immunopathologic studies.

Cultivos de células VERO em microcarregadores porosos de celulose (Cytopore) e porosos de gelatina (Cultispher G) com rendimento celular três vezes maior, foram obtidos em relação às culturas em microcarregadores sólidos de DEAE-dextran (Cytodex tipo 1). No Cytopore e Cultispher G atingimos 1.265 e 1.103 células/microcarregador, respectivamente e no Cytodex 1, 256 células/microcarregador. A concentração celular nos suportes porosos Cytopore aumentou 43 vezes o número de células iniciais, 37,5 vezes no Cultispher G e 17 vezes no Cytodex 1. As culturas de células VERO nos microcarregadores porosos foram utilizadas com êxito para a replicação do vírus rábico (PV/VERO), quando infectadas com MOI de 0,05. Títulos de 104,8 FFD50/mL determinados pelo método de inibição de focos fluorescentes (RFFIT) foram obtidos 96 horas após a infecção. Estudos de microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão para análise da estrutura destes suportes, mostraram boa colonização celular e a eficiência da replicação viral. A padronização de metodologia para cultura e infecção viral de células VERO nos microcarregadores porosos indica a utilidade destes suportes para produção de antígenos e vacinas virais e a potencialidade do sistema para a obtenção de produtos biotecnológicos em geral.
Cultures of VERO cell on porous cellulose-coated microcarriers (Cytopore) and on porous gelatin-coated (Cultispher G) with a cellular yield 3 times higher, was obtained in relation to DEAE-dextran solid microcarriers (Cytodex type 1). In the cultures on Cytopore and Cultispher G we obtained 1.265 and 1.103 cells/microcarrier, respectively and 256 cells/microcarrier on Cytodex 1. The cell concentration for the Cytopore porous suports increased 43 times from the initial cell number, 37,5 times for the Cultispher G and 17 times for the Cytodex 1. The VERO cell cultures on porous microcarriers were efficiently used for the replication of the rabies virus (PV/VERO), when infected with 0,05 MOI. Titers of 104,8 FFD50/mL determined by the fluorescent focus inhibition method (RFFIT) were obtained 96 hours post-infection. Studies on light microscopy and scanning and transmission eletronic microscopy carried out to analyse the suports structure, showed a good cell population and efficiency of virus infection. The standardization of a methodology for culture and virus infection of VERO cells on porous microcarriers indicate the usefulness of these porous supports to the antigens and viral vaccines production and the potenciality of this system for the attainment of biotechnological products.

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem.
Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-29Bitstream added on 2014-06-13T19:02:35Z : No. of bitstreams: 1 moraes_cfv_dr_botfm.pdf: 589173 bytes, checksum: c968ecfb4e13b9f57ab7e0f45cc65f43 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A Hepatite C é uma das principais causas de doença crônica hepática. A combinação entre o interferon peguilado e a ribavirina tem sido considerado o padrão-ouro de tratamento para Hepatite C. A resposta ao tratamento vem sendo associada a fatores ambientais, do vírus e também do paciente, tais como polimorfismos genéticos dos antígenos leucocitários humanos (HLA), da interleucina-10 e do fator de necrose tumoral-a. Plaquetas possuem em suas membranas glicoproteínas que expressam segmentos protéicos polimórficos, os quais são chamados de antígenos plaquetários humanos (HPA). Os sistemas HPA-1, -3, -4 e -5 residem em integrinas, proteínas que possuem interações com interferon. O objetivo desse estudo foi avaliar a associação entre freqüência dos HPA-1, -3, -4 e -5 e a resposta ao tratamento, em 138 pacientes tratados para Hepatite C. A genotipagem dos HPA-1, -3 e -4 foi realizada pela técnica de PCR-SSP e do HPA-5 pela PCR-RFLP. A genotipagem do HCV foi realizada através do Kit comercial INNO-LiPA® v.1.0 (Innogenetics, Ghent, Belgium), segundo as instruções do fabricante. Os pacientes foram divididos em grupos e subgrupos de acordo com o esquema terapêutico, a resposta ao tratamento e o genótipo do HCV. Os pacientes que possuíam o genótipo do HCV não-1 e que foram tratados com IFN-a+RBV, com falha terapêutica, apresentaram uma diferença estatística significante (p<0.05) nas freqüências alélicas e genotípicas do sistema HPA-3, com aumento do alelo 3b. O sistema HPA-3 está localizado em uma integrina que se liga a fibronectina, um receptor de interferon. Nesse contexto, a alteração conformacional glicoprotéica decorrente da presença do alelo HPA-3b, poderia estar associada à falha ao tratamento com IFN-a+RBV em pacientes portadores de genótipo viral não-1.
Hepatic fibrosis leading cirrhosis in 20 to 30% of patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Rapid progression to fibrosis has been related to environmental, viral and host factors. However, genetic polymorphisms have recently been associated with this progression, including the expression of integrins. Platelet membrane glycoproteins express several polymorphic antigenic determinants on their surface, which are called human platelet antigens (HPA). HPA-1, -3, -4 and -5 reside in integrins. The association between HPA antigens and stage of fibrosis can determine if HPA is related to progression of fibrosis. Thus, the goal of this study was to determine the association between the HPA-1, -3, -4 and -5 and the liver fibrosis stage in 175 HCV-infected patients. HPA-1, -3 and -4 genotyping was performed by PCR-SSP and, HPA-5 by PCR-RFLP. Fibrosis progression was evaluated using the METAVIR scoring system. There were no significant differences (p>0.05) in allelic and genotypic frequency distribution of HPA-1, -3 and -5, residing in integrins.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-19Bitstream added on 2014-06-13T20:04:03Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_dr_jabo.pdf: 761601 bytes, checksum: 6236742e70d7cbec76cc87afe87574a1 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN
Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:42:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monique_lima_ipec_dout_2014.pdf: 5463834 bytes, checksum: 3fce9836524ae3941506c5f46b82718e (MD5) Previous issue date: 2014-11-18
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
A utilidade da proteína NS1 para o diagnóstico precoce e seu papel como uma ferramenta de diagnóstico adicional às abordagens existentes para a identificação das infecções por dengue já foi demonstrada. No ano de 2008, o Ministério da Saúde implantou unidades sentinelas em municípios estratégicos do país, utilizando testes de captura de antígeno (Ag) NS1 como um método de triagem e de diagnóstico precoce de casos suspeitos, contudo sem avaliações prévias. O presente estudo visou atender às demandas de avaliação e confirmação do papel destes testes na investigação de casos de dengue no país. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho e as aplicações alternativas dos testes de captura de NS1 disponíveis comercialmente. O desempenho dos testes Platelia NS1 ELISA (BioRad Laboratories) e pan-E Early ELISA, primeira geração (PanBio Diagnostics) e do teste rápido Ag Strip (BioRad Laboratories) disponíveis no mercado após a introdução destes no país, foi avaliado com um painel de 450 amostras. Dentre os três kits analisados, o teste NS1 Ag Strip foi o mais sensível (89%, 197/220), seguido pelo Platelia NS1 ELISA (84%, 184/220). O menos sensível foi pan-E Early ELISA com 72% (159/220) de sensibilidade. Uma menor sensibilidade foi observada em casos de DENV-3 por todos os três kits analisados A comparação de duas gerações do ELISA para a captura de NS1 do fabricante PanBio Diagnostics (pan-E Dengue Early ELISA e Early ELISA Dengue, segunda geração), após o aperfeiçoamento do teste pelo fabricante, demonstrou um aumento significativo na sensibilidade, de 72,3% (159/220) para 80% (176/220), p=0.05, respectivamente. As sensibilidades dos testes pan-E Dengue Early ELISA, Platelia NS1 ELISA e o NS1 Ag Strip utilizados como uma ferramenta alternativa para o diagnóstico de dengue em fragmentos de tecidos de casos fatais (n=23) foi de 34,7% (08/23), 60,8% (14/23) e 91,3% (21/23), respectivamente. Na análise de 74 fragmentos tecidos provenientes dos casos fatais, o teste NS1 Ag Strip apresentou uma sensibilidade significativamente maior (78,3%, 58/74 [p<0.05]). Este teste foi mais sensível na análise do fígado (91,3%; 21/23), pulmão (71,4%; 10/14), rim (100%, 4/4), cérebro (80%; 8/10), baço (66,6%, 10/15) e timo (100%, 3/3), quando comparado com os testes de ELISA avaliados. A utilidade dos testes de captura de NS1 também foi avaliada nas vigilâncias epidemiológica e entomológica após introdução do DENV-4 no Rio de Janeiro em 2011. Tanto o teste rápido NS1 Ag Strip quanto o Platelia NS1 ELISA confirmaram 4/9 (44,4%) dos casos suspeitos ocorridos na época e confirmaram a infecção em mosquitos Ae. aegypti coletados no campo. Relatos de uma baixa sensibilidade do teste de captura de NS1 no diagnóstico de casos de DENV-4, ocorridos após a introdução deste sorotipo no país, resultou na investigação de metodologias que visassem um aumento das sensibilidades obtidas Para tal, dois métodos de dissociação de imunocomplexos antígeno-anticorpo por calor e por dissociação ácida, foram testados. Foi observado um aumento significativo na sensibilidade do teste de 46,6% (217/466), quando as amostras não sofreram dissociação, para 70,4% (328/466) e 77,5% (361/466), p=0,017, quando sofreram dissociação ácida e térmica, respectivamente. Visando estabelecer a utilização de sangue coletado por punção digital em papel de filtro como espécime alternativo para a utilização em testes de captura de NS1, cinco protocolos, para a eluição do soro do papel de filtro foram avaliados. O protocolo descrito por Matheus et al. (2007), a utilização de 6mm de papel de filtro contendo a amostra e a eluição da amostra utilizando o próprio tampão do kit comercial, foi o protocolo mas sensível para a confirmação dos casos testados. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram àqueles que demostram a utilidade da proteína NS1 no diagnóstico precoce das infecções por dengue e demonstram a aplicação alternativa na confirmação de casos fatais, detecção dos vírus em vetores e, potencialmente, sua utilização combinada com métodos menos invasivos de coleta de sangue
The usefulness of the NS1 protein for early diagnosis of dengue infections and its role as an additional tool to existing diagnostic approaches has been demonstrated. In 2008, the Brazilian Ministry of Health established sentinel units in strategic cities of Brazil , using NS1 antigen (Ag) capture tests as a screening method and early diagnosis of suspected cases, however wit hout a previous evaluation. The present study aimed to meet the demands of evaluating and confirming the role of these tests in investigating dengue cases in the country. In this context, the goal of this study was to evaluate the performance and alternati ve applications of NS1 capture tests commercially available. The performance of the Platelia NS1 ELISA (BioRad Laboratories) and pan - E Early ELISA, first generation (PanBio Diagnostics) and rapid test NS1 Ag Strip (BioRad Laboratories) available in the mar ket after the introduction of these in the country, was evaluated with a panel of 450 samples. Among the three kits analyzed, the NS1 Ag Strip test was the most sensitive (89%, 197/220), followed by the Platelia NS1 ELISA (84%, 184/220). The least sensitiv e was the pan - E Early ELISA with 72% (159 /220) of sensitivity. A lower sensitivity was observed in DENV - 3 cases by all three kits analyzed. The comparison of two generations of the NS1 Ag capture ELISA from PanBio Diagnostics (pan - E Dengue Early ELISA an d Early ELISA Dengue, second generation) after a test improvement by the manufacturer, showed a significant increase in the sensitivity, from 72.3% (159 /220) to 80% (176/220), p=0.05, respectively. The sensitivity of the pan - E Dengue Early ELISA, Platelia NS1 ELISA and NS1 Ag Strip tests used as an alternative tool for the diagnosis of dengue in tissues of fatal cases (n=23), were 34.7% (08/23), 60.8% (14/23) and 91.3% (21/23), respectively. In the analysis of 74 tissues from dengue fatal cases, the NS1 Ag Strip test showed a significantly higher sensitivity (78.3%, 58/74 [p <0,05]) . This assay was more sensitive in the analysis of the liver (91.3%, 21/23), lung (71.4%, 10 /14), kidney (100%, 4/4), brain (80 %, 8/10), spleen (66.6%, 10 /15), and thymus (10 0%,3/3), when compared to the ELISA tests evaluated. The usefulness of the NS1 capture tests was also evaluated in the epidemiological and entomological surveillance after DENV - 4 introduction in Rio de Janeiro in 2011. Both the rapid test NS1 Ag Strip and the Platelia NS1 ELISA confirmed 4/9 (44.4%) of the suspected cases occurred at the time and confirmed the infection in Ae. aegypti collected in the field. Reports of a low sensitivity of the NS1 capture tests in diagnosing DENV - 4 cases occurred after the introduction of this serotype in the country and resulted in the investigation of methodologies to increase the sensitivities obtained. In that scenario, two methods for antigen - antibody immune complexes dissociation (heat and acid dissociations) were test ed. The sensitivity observed with the samples non - dissociated (46.6%; 217/466) was significantly improved when the samples were submitted to acid dissociation (70.4% ; 328/466) and heat dissociation (77.5 %; 361/466), p =0.017. To establish the use of fingers tick blood collection on filter paper specimens as an alternative specimen to use on NS1 tests, five protocols for eluting the serum from the filter paper were evaluated. The protocol described by Mat heus et al. (2007), using 6 mm of filter paper containin g the sample and the elution of the sample using the commercial kit buffer was itself, the most effective. The results of this study support those that demonstrate the usefulness of the NS1 protein in the early diagnosis of dengue infections and demonstrat e the alternative applications in confirming fatal cases, in the surveillance of the virus in the vectors and the potentially combined with less invasive methods of blood collection use.

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As inflamações do fígado provocadas pelos vírus hepatotrópicos atingem milhões de pessoas e representa significativo problema de saúde pública em todo o mundo. Existem interações entre viroses hepatotrópicas e o sistema imunológico do hospedeiro que podem influenciar na patogenicidade da agressão hepática. O objetivo deste trabalho foi investigar a freqüência de auto-anticorpos em pacientes portadores do vírus da hepatite C, e sua correlação com os genótipos encontrados. Foram estudados 51 pacientes com diagnóstico confirmado pelo PCR de infecção pelo vírus da hepatite C e um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames sorológico para doenças infecto-contagiosas negativos. Os 51 pacientes portadores do vírus C apresentavam idade média de 43 anos, +/- 11,3, em fase pré-tratamento, 34 (66,7%) eram do gênero masculino e 17 (33,3%) do gênero feminino. Desses 13 (25,5%) apresentaram FAN positivo, 45 (88,2%) eram genótipo tipo 1 e 11,8% genótipo tipo 3. Os pacientes que se apresentaram com anticorpos detectáveis não apresentavam níveis de AST, ALT, AST/ALT, γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-anticorpos negativos. Desta forma, conclui-se que os anticorpos presentes na amostra do estudo são independentes da evolução da doença e do prognóstico do paciente, entretanto parece estar ligada ao genótipo tipo 1.
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and represents a significant public health problem worldwide. There are interactions between hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of liver injury. The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies in patients with hepatitis C virus, and its correlation with the genotypes found. We studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100 blood donors with all serological tests for infectious diseases negative. The 51 patients with virus C had an average age of 43 years, + / - 11.3, in the pre-treatment, 34 (66.7%) were male and 17 (33.3%) were female. Of these 13 (25.5%) were ANA positive, 45 (88.2%) were with genotype 1 and 11.8% with genotype 3. Patients who presented with antibodies had no detectable levels of AST, ALT, AST / ALT, γ-GT and alkaline phosphatase significantly different from those with negative antibody titers. Thus, we conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease progression and patient prognosis, though seems to be linked with genotype 1.

A hantavirose (infecção por Hantavírus) é uma das zoonoses que vem preocupando as autoridades sanitárias de todo o mundo. Sua ocorrência se deve principalmente os distúrbios ecológicos é transmitida ao homem através de inalação de partículas virais contida na excreta de roedores. São conhecidas duas doenças humanas distintas causadas pelo Hantavírus: a Febre Hemorrágica com Síndrome Renal (FHSR) e a Síndrome Pulmonar e Cardiovascular (SPCVH). O objetivo deste estudo foi verificar a ocorrência de anticorpos IgG anti-hantavírus, através do ELISA, em populações da Amazônia e Sudeste brasileiro, que vivem em contato com os roedores silvestres, utilizando a proteína recombinante do vírus Araraquara expressa em Escherichia coli. Do total de estudados 1308 soros humanos estudados, na Amazônia (1078) encontramos 59 soros positivos (5%). Na cidade Machadinho do OesteRO os soros coletados durante o ano 2003, foram analisados 638, onde foram encontrados 20 soros positivos (4,5%); e no Rio Machado RO. foram analisados 435 soros da população ribeirinha onde foram encontrados 39 (5%) soros positivos, respectivamente. Após análise realizada em 151 soros humanos provenientes do Vale do Ribeira, em 2007; e 84 no Pontal do Paranapanema, em 2008, foram observados 14 positivos (9%) e 6 (7%) das amostras, respectivamente.
The genus Hantavirus of the family Bunyaviridae includes a large number of rodent-borne viruses that are distributed worldwide. The occurrence is due mainly to ecological disturbances and it is transmitted to the humans through inhalation of virus particles contained in the excreta of wild rodents. Two different human diseases known to be caused by Hantavirus: are Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS) and Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome (HPS). The main objective of this study was detected antibody against hanatavirus (IgG) by ELISA, in Amazon region and Brazilian Southwest populations who live in contact with the wild rodents, using recombinant protein (antigen) of the Araraquara virus expressed in Escherichia coli. We study 1308 human sera (1078 from Amazon region) and there were found 59 (5%) positive sera. From the city of Machadinho do Oeste RO (2003 year), 633 sera were analysed, where there were found to be 20 positive (4.5%) serums. In Machado river RO (2005 year), 435 sera of the river-dwelling population were analysed where there were found 39 (5%) positive sera, respectively. After analysis was accomplished for 151 human sera coming from the Vale do Ribeira - SP, in 2007, and 84 from the Pontal do Paranapanema - SP, in 2008, 14 (9%) and 6 (7%) of the samples were observed to be positive, respectively.

La present tesi doctoral està centrada en l'estudi de l'expressió dels receptors d'entrada del virus de l'hepatitis C (VHC) i la detecció dels antígens virals en mostres de fetge parafinades de pacients sotmesos a un trasplantament hepàtic (TH). La primera part de l'estudi està basada en la caracterització i anàlisi, mitjançant tècniques d'immunofluorescència i microscòpia confocal, de l'expressió dels receptors d'entrada claudina-1 (CLDN1), ocludina (OCLN) i SRB1. També s'ha dut a terme l'estudi de la cinètica viral precoç amb mostres de sèrum obtingudes abans i després del TH. Els resultats obtinguts mostren que la localització de les proteïnes CLDN1 i OCLN resta inalterable al pol apical de la cèl.lula, on colocalitzen fortament independentment de la fase de la infecció. Paral.lelament s'observa una correlació significativa entre: 1. els nivells d'SRB1 en el moment de la reperfusió del nou òrgan i la disminució de la càrrega viral (CV) a les 24h després del TH, el que suggereix l'entrada massiva del virus a l'empelt i 2. els nivells de CLDN1 i OCLN i l'increment de la CV a la setmana després del TH, el que és indicatiu de l'elevada capacitat d'adaptació i replicació del VHC. En la segona part del treball s'analitza l'expressió dels antigens virals core i NS5A i es determina la colocalització entre abdues proteïnes i la seva distribució relativa versus les estructures cel.lulars denominades gotes lipídiques. Els resultats mostren que en un 75% de les biòpsies de fase aguda analitzades és possible detectar l'antigen core, l'expressió del qual es limita als hepatòcits. El marcatge és citoplasmàtic i granular, amb diferents graus d'intensitat. El patró de distribució de la tinció és difús, amb certa tendència a concentrar-se a les zones periportals. Existeix una correlació significativa entre el percentatge de cèl.lules core positives i: 1. l'activitat inflamatòria al lobulet i 2. els nivells de transaminasas ALT i AST. La detecció de l'expressió de la proteïna core s'associa de forma significativa amb la CV i existeix colocalització entre NS5A, core i adipofil.lina (proteïna constitutiva de les gotes lipídiques). Aquesta localització es dóna en forma d'estructures circulars, essent NS5A la proteïna que es situa majoritàriament a la part més perifèrica. Els resultats demostren per primera vegada in vivo la importància de les gotes lipídiques en la replicació i l'assamblatge del VHC.
Liver transplantation (LT) is a unique model to study the mechanisms of hepatitis C virus (HCV) entry into hepatocytes. The aims of the first study of this thesis were: 1) to characterize the expression patterns of SBR1, claudin-1 and occludin in grafts from LT recipients; 2) to explore their potential changes after infection. Our results showed that SRB1 expression was particularly abundant in the sinusoidal domain. Claudin-1 and occludin expression was restricted to the apical zone. There was a significant correlation between the amount of SRB1 at the time of reperfusion and the HCV-RNA decay during the first 24 hours following LT. Similarly, there was significant correlation between the levels of claudin-1 and occludin and the HCV-RNA increase during the first week after LT. Overall, SRB1 levels remained stable after LT, whereas claudin-1 and occludin expression increased significantly 12 months after LT, both in patients with mild and severe HCV recurrence. Despite the increase in claudin-1 and occludin levels, their expression pattern remained unchanged and restricted to the apical membrane, where claudin-1 and occludin colocalized strongly. The aim of the second study was to detect HCV antigens in liver biopsies of these patients. All reperfusion biopsies were negative for either core or NS5A staining. NS5A and core were detected in 75% of liver biopsies obtained during the acute phase of HCV infection and in 33% of biopsies belonging to patients with active infection. Importantly, HCV antigens were not detected in any of the 11 samples from patients who cleared HCV after antiviral treatment. Single infected hepatocytes were found throughout the liver sections, with propensity to localize in the periportal areas. Immunostaining was mainly hepatocellular with a granular cytoplasmic pattern and a wide spectrum of intensity. There was strong colocalization of both proteins and in some cells the staining revealed ring-like structures, supporting the localization of core and NS5A around lipid droplets. A detailed 3D analysis showed the relative position of each protein in these structures, with core localized inside and NS5a in the periphery.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-12Bitstream added on 2014-06-13T18:41:57Z : No. of bitstreams: 1 taniwaki_sa_dr_botfmvz.pdf: 2369992 bytes, checksum: ab720e0ce2ca7ee265903369c23fc91e (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
A infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) é uma das mais importantes doenças infecciosas dos felinos domésticos. Os gatos infectados apresentam sinais clínicos inespecíficos, portanto para confirmar a infecção são necessários testes laboratoriais específicos. A detecção de anticorpos anti-FIV possui uma correlação direta com a infecção viral, pois uma vez infectado o gato permanece infectado permanentemente. No presente estudo, foram produzidos antígenos recombinantes do capsídeo viral (p24) e proteína de matriz (p17) do FIV. Os fragmentos codificantes da p24 e p17 foram amplificados a partir do DNA pró-viral extraído do sangue periférico de gatos naturalmente infectados pelo FIV (subtipo B), e clonados e expressos em fase com a cauda de histidina (6xHis) na porção amino ou carboxi-terminal. Os antígenos p24, p17, p24 fundido com o epítopo transmembrana (p24/TM) e peptídeo sintético TM do FIV foram utilizados na padronização e aplicação dos testes de ELISA indireto rápido e Western blot para detecção de anticorpos anti-FIV. A reatividade dos antígenos foi analisada separadamente no ELISA indireto rápido, e permitiu a comparação dos antígenos quanto aos valores de sensibilidade e especificidade relativa. O antígeno FIVp24/TM apresentou melhor desempenho, com concordância de 100% com o teste SNAP® FIV/FeLV Combo test (n=110). A validação do ELISA indireto rápido com o antígeno FIVp24/TM mostrou características desejáveis para o uso comercial, tais como alta precisão e manutenção da reatividade durante o armazenamento. Pode-se concluir que a produção de antígenos recombinantes do FIV foi eficiente e possibilitou o desenvolvimento de um teste rápido (ELISA indireto rápido) e um teste confirmatório (Western blot) para o diagnóstico da infecção pelo FIV
Infection with feline immunodeficiency virus (FIV) is one of the most important infectious diseases of domestic cats. Infected cats exhibit non-specific clinical signs, so specific laboratory assays are necessary to confirm the diagnosis of FIV infection. Detection of anti-FIV antibodies has a direct correlation with the viral infection, because once a cat has been infected it will remain infected permanently. In the present study, we produced FIV recombinant capsid antigen (p24) and matrix protein (p17). The coding fragments of p24 and p17 were obtained from proviral DNA extracted from peripheral blood of cats naturally infected with FIV (subtype B). These fragments were cloned and expressed in phase with amino or carboxi-terminal histidine tag (6xHis). The antigens FIVp24, FIVp17, p24 fused to transmembrane epitope (FIVp24/TM) and synthetic peptide TM were used for standardization and implementation of rapid indirect ELISA and Western blot assays for detection of anti-FIV antibodies. The reactivity of the antigens was analyzed separately in rapid indirect ELISA and allowed the determination of relative sensitivity and specificity of the antigens. The FIVp24/TM antigen has better performance, with 100% of agreement with SNAP® FIV/FeLV Combo test (IDEXX laboratories). The validation of the FIVp24/TM rapid indirect ELISA showed desirable characteristics for commercial use, such as high precision and maintenance of reactivity during storage. In conclusion, production of FIV recombinant antigens was efficient and allowed the development of a rapid test (rapid indirect ELISA) and a confirmatory test (Western blot) for diagnosis of FIV infection

El virus de l’hepatitis delta (VHD) es un virus d’ARN que requereix de l’antigen de superfície del virus de l’hepatitis B (HBsAg) per completar el seu cicle replicatiu. Aquest virus es l’agent etiològic de l’hepatitis delta, la forma més greu d’hepatitis viral en humans, que s’estima que afecta un total de 15 a 20 milions de persones en tot el món. El genoma del VHD es una molècula d’ARN d’una sola cadena, circular, al voltant de 1700 nucleòtids i de polaritat negativa. Aquest genoma codifica solament una proteïna, l’antigen delta (HDAg), que té dos isoformes (la llarga i la curta) generades gracies a una modificació postranscripcional (desaminació) durant la replicació viral, que canvia el codó 196 de stop (TAG) a l’aminoàcid W (TGG). Aquest procés també es coneix com edició i està catalitzat per la adenosina desaminasa que actua sobre ARN 1 (ADAR-1). A més a més el genoma conte un domini amb activitat enzimàtica capaç de processar al propi genoma (autoescisió), essencial per la replicació viral, la ribozima. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha sigut estudiar la quasiespècies del VHD mitjançant seqüenciació massiva (NGS), analitzant la conservació o variabilitat de les regions funcionals del virus, corresponents al HDAg (quantificació de la seva edició) y a la ribozima. En el primer estudi es va incloure una mostra de plasma de 4 pacients amb hepatitis delta crònica, per validar la quantificació de percentatges de poblacions de genomes editats i no editats per NGS, comparant-la amb la metodologia de seqüenciació Sanger dels productes de la clonació. A més a més, es va estudiar la precisió i la sensibilitat de la NGS, utilitzant barreges de diferents proporcions de productes de clonació editats i no editats, i es van observar els patrons de canvis nucleotídics per analitzar si l’edició es un fenomen general que té lloc a tota la regió codificant del HDAg analitzada. Per altra banda, en el segon estudi es van incloure 36 mostres de plasma de 12 pacients amb hepatitis delta crònica y es va analitzar el grau de conservació o variabilitat de la quasiespècies en les regions analitzades del HDAg i de la ribozima. A més a més es va determinar l’existència de patrons de mutacions a nivell aminoacídic en el HDAg. Mitjançant els resultats obtinguts s’ha demostrat que la NGS es una metodologia útil per detectar proporcions de genomes del VHD editats i no editats, més sensible i precisa que la seqüenciació Sanger dels productes de clonació. També s’ha observat que el fenomen d’edició en la regió codificant del HDAg podria no ser exclusiu de la posició d’edició. A més a més els resultats van mostrar que la regió del HDAg es variable i que els patrons de mutacions aminoacídiques generalment podrien estar relacionats amb l’escapament del sistema immunitari, possiblement sense afectar significativament la funcionalitat de les regions del HDAg on es troben. Per últim, s’ha observat que la regió de la ribozima conté un elevat nivell de conservació a la seva seqüència.
El virus de la hepatitis delta (VHD) es un virus de ARN que requiere del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) para completar su ciclo replicativo. Este virus es el agente etiológico de la hepatitis delta, la forma más grave de hepatitis viral en humanos, que se estima que afecta un total de 15 a 20 millones de personas en todo el mundo. El genoma del VHD es una molécula de ARN de una sola hebra, circular, de alrededor de 1700 nucleótidos y de polaridad negativa. Este genoma codifica tan solo una proteína, el antígeno delta (HDAg), que tiene dos isoformas (la larga y la corta) generadas gracias a una modificación postranscripcional (desaminación) durante la replicación viral, que cambia el codón 196 de stop (TAG) al aminoácido W (TGG). Este proceso también se conoce como edición y está catalizado por la adenosina desaminasa que actúa sobre ARN 1 (ADAR-1). Además el genoma contiene un dominio con actividad enzimática capaz de procesar al propio genoma (autoescisión), esencial para la replicación viral, la ribozima. El objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar la quasiespecies del VHD mediante secuenciación masiva (NGS), analizando la conservación o variabilidad de las regiones funcionales del virus, correspondientes al HDAg (cuantificando su edición) y a la ribozima. En el primer estudio se incluyó una muestra de plasma de 4 pacientes con hepatitis crónica delta, para validar la cuantificación de porcentajes de poblaciones de genomas editados y no editados por NGS, comparándola con el método de secuenciación Sanger de los productos de clonación. Además, se estudió la precisión y sensibilidad de la NGS, utilizando mezclas de diferentes proporciones de productos de clonación editados y no editados, y se observaron los patrones de cambios nucleotídicos para analizar si la edición es un fenómeno general que tiene lugar en toda la región codificante del HDAg analizada. Por otro lado, en el segundo estudio se incluyeron 36 muestras de plasma de 12 pacientes con hepatitis crónica delta y se analizó el grado de conservación o variabilidad de la quasiespecies en las regiones analizadas del HDAg y de la ribozima. Además se determinó la existencia de patrones de mutaciones a nivel aminoacídico en el HDAg. Mediante los resultados obtenidos se ha demostrado que la NGS es un método útil para detectar proporciones de genomas del VHD editados y no editados, más sensible y preciso que la secuenciación Sanger de los productos de clonación. También se ha observado que el fenómeno de edición en la región codificante del HDAg podría no ser exclusivo de la posición de edición. Además, los resultados mostraron que la región del HDAg es variable y que los patrones de mutaciones aminoacídicas generalmente podrían estar relacionados con el escape al sistema inmunitario, posiblemente sin afectar significativamente la funcionalidad de las regiones del HDAg donde se encuentran. Por último, se ha observado que la región de la ribozima contiene un elevado nivel de conservación en su secuencia nucleotídica.
Hepatitis delta virus (HDV) is an RNA virus that requires the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) to complete its replicative cycle. This virus is the etiological agent of delta hepatitis, the most severe form of viral hepatitis in humans, which is estimated to affect a total of 15 to 20 million people worldwide. The HDV genome is around 1700 nucleotides, single-stranded, circular and negative polarity RNA molecule. This genome encodes just one protein, the delta antigen (HDAg), which has two isoforms (the large one and the short one) generated by post-transcriptional modification (deamination) during viral replication. This modification changes the stop codon 196 (TAG) into the W amino acid (TGG). This process is also known as editing and is catalyzed by adenosine deaminase that acts on RNA 1 (ADAR-1). Furthermore, the genome contains a domain with enzymatic activity capable of processing the genome itself (self-cleaving), essential for viral replication: the ribozyme. The main objective of this thesis has been to study the HDV quasispecies by next generation sequencing (NGS), analyzing the conservation or variability of the functional regions of the virus, corresponding to HDAg (quantifying its edition) and the ribozyme. In the first study, a plasma sample from 4 patients with chronic hepatitis delta was included to validate the quantification of percentages of edited and unedited genome populations by NGS and it was compared with the Sanger sequencing method of cloning products. In addition, the accuracy and sensitivity of NGS were studied, using mixtures of different percentages of edited and unedited cloning products, and nucleotide change patterns were also analyzed to confirm whether editing is a general phenomenon taking place along the entire coding region of the analyzed HDAg. On the other hand, 36 plasma samples from 12 patients with chronic hepatitis delta were included in the second study, and the conservation or variability of quasispecies in the analyzed regions of HDAg and ribozyme was analyzed. Furthermore, the existence of amino acid mutation patterns in HDAg was determined. The obtained results showed that NGS is a useful method to detect proportions of edited and unedited HDV genomes, more sensitive and accurate than Sanger sequencing of cloning products. It has also been observed that the editing phenomenon taking place along the entire HDAg coding region analyzed may not be unique to the editing position. Furthermore, the results showed that the HDAg region is variable and that amino acid mutation patterns could generally be related to escape from immune system, possibly without significantly affecting the functionality of the HDAg regions where they are found. Finally, it has been observed that the ribozyme region contains a high level of conservation in its nucleotide sequence.

Leishmaniasis is endemic in many countries in Old an New World. The amastigote specific antigen A2 of Leishmania is a virulence factor shared by L donovani, L. chagasi and L. amazonensis, which are main etiologic agents of visceral and other forms of leishmaniaisis. A2 was also shown to induce protection against experimental Leishmania amazonensis infection in mice. Using predicted hydrophilic as well as class I and II MHC-binding synthetic peptides, we defined the A2 epitopes recognized by antibodies, CD4+ T as well as CD8+ T cells elicited during immunization protocols. Immunization of highly susceptible BALB/c mice with the adenovirus vector expressing A2 (AdA2) resulted in low levels of anti-A2 antibody response, contrasting with high levels of IFN- producing CD4+ T, as well as CD8+ T cells. Further, A2-specific CD8+ T cells from immunized mice were also capable of lysing peptide-sensitized target cells in in vivo cytotoxic assays. Finally, we demonstrated that mice immunized with AdA2 and challenged with 107 live L. chagasi parasites, presented reduced parasite loads at both liver and spleen. Thus, vaccination with AdA2 induces high levels of A2-specific CD4+ T cell as well as CD8+ T lymphocytes that produce high levels of IFN-, display in vivo cytolytic activity, and are associated with protective immunity against murine visceral leishmaniasis.
A leishmaniose é endêmica em muitos países do Velho e do Novo Mundo. O antígeno amastigota específico A2 é um fator de virulência que já foi descrito em várias espécies de Leishmania, entre elas L. donovani, L. chagasi e L. amazonensis. Também já foi mostrado que a A2 é capaz de induzir proteção contra L. amazonensis em camundongos. Neste trabalho, foram definidos os epítopos reconhecidos por anticorpos, assim como os epítopos para células T CD4+ e T CD8+ reconhecidos após a imunização com o antígeno A2. A imunização de camundongos BALB/c, altamente susceptíveis à infecção com Leishmania, com adenovírus expressando a A2 (AdA2), resultou em baixos níveis de anticorpos anti-A2, contrastando com altos níveis de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN-. Além disso, células T CD8+ específicas de camundongos imunizados foram capazes de lisar células alvo sensibilizadas com peptídeo em ensaios de citotoxicidade in vivo. Finalmente, foi demonstrado que camundongos imunizados com duas doses de AdA2, em um protocolo prime/boost homólogo, e desafiados com 107 promastigotas de L. chagasi, apresentaram número reduzido de parasitas no baço e no fígado. Assim, a vacinação com AdA2 induziu altos níveis de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN- e atividade citotóxica in vivo, sendo associada com imunidade protetora contra a leishmaniose visceral murina

Estudos recentes têm apresentado resultados in vitro satisfatórios em pacientes com Imunodeficiência Comum Variável (ICV) que receberam vacinas contra tétano, influenza e meningococo. No entanto, existem poucos ensaios clínicos que avaliem a resposta clínica e laboratorial após a exposição a antígenos específicos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a resposta clínica à imunização contra antígenos protéicos e polissacarídicos (influenza, H1N1 e pneumococo) em pacientes com diagnóstico de ICV seguidos no ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do HC-FMUSP. O diagnóstico dos pacientes foi estabelecido de acordo com os critérios da OMS / PAGID / ESID. Um grupo de 37 pacientes foi vacinado contra a influenza A (H2N3), gripe H1N1 e pneumococo e outro grupo com 16 pacientes, não foi vacinado. A avaliação clínica foi realizada através da aplicação de um score com avaliação dos seguintes parâmetros clínicos: pneumonia, sinusite, otite média, infecções de vias aéreas superiores (IVAS), amigdalites, diarréia, bronquiectasias, hospitalizações, uso de antibióticos, uso de antibióticos profiláticos, sepse e meningite. O score foi aplicado durante os 12 meses que precederam a vacinação e 12 meses posteriores à administração das vacinas. O mesmo score foi aplicado ao grupo controle, com os pacientes que não foram vacinados. A determinação da IgG contra os sorotipos do pneumococo foi feita por ELISA. A determinação da IgG específica H1N1 foi feita por hemaglutinação indireta, enquanto que a dosagem da IgG específica para influenza, por ELISA, utilizando o kit comercial RIDASCREEN ® Influenza. O grupo de pacientes vacinados incluiu 37 pacientes (51% mulheres), com idade entre 20 e 78 anos (mediana= 33 anos). Observou-se uma mediana de 7 anos de atraso no diagnóstico de ICV. A mediana de idade do grupo de pacientes (n=16, 37,5% mulheres) que não receberam a vacina foi de 41 anos e a mediana de atraso no diagnóstico foi de 8 anos. Observamos que as infecções de vias aéreas superiores (IVAS), sinusites e pneumonias foram as manifestações mais freqüentes no grupo controle. IVAS seguida por pneumonia e sinusite foram as manifestações infecciosas mais freqüentes em mulheres (80%, 78% e 55%, respectivamente). Entretanto, em homens observamos IVAS seguido por sinusite e pneumonia (78%, 65% e 35%, respectivamente). Observou-se redução significativa no score relativo ao número de infecções respiratórias superiores, sinusites e pneumonias um ano após a administração das vacinas (p <0,001). Os dados foram comparados com pacientes ICV não vacinados e neste grupo não houve diferença entre os scores dos dois períodos de 12 meses . Após a vacinação, observou-se uma tendência a aumento no título de anticorpos específicos para a H2N3, mas sem resultado significativo. Em relação aos resultados obtidos com as sorologias para o H1N1 e o pneumococo, não se observou resposta após a vacinação. Concluindo, houve redução do número de infecções, principalmente das IVAS, sinusites e pneumonias em pacientes com ICV após a vacinação contra a influenza, H1N1 e pneumococo. Embora não tenhamos encontrado correlação entre a redução do número de infecções e os títulos de anticorpos específicos para as vacinas testadas, a melhora clínica observada nos pacientes com ICV reforça o benefício da vacinação
Recent studies have shown satisfactory in vitro results in patients with CVID who received immunization against tetanus, influenza and meningococcus. However, there are only a few studies that evaluate the clinical and laboratory response after exposure to specific antigens in these patients. This study aims to evaluate the clinical response to immunization with protein and polysaccharide antigens (influenza, H1N1 and pneumococcus) in CVID patients followed at the Primary Immunodeficiency outpatient clinic of the Division of Clinical Immunology and Allergy, Hospital das Clínicas, FMUSP. CVID patients were diagnosed according the WHO/PAGID/ ESID criteria. Thirty-seven patients were immunized against influenza (H2N3), H1N1 and pneumococcal polysaccharide vaccine while another group with 16 CVID patients were not vaccinated. Clinical evaluation was performed through a score with assessment of the following parameters: pneumonia, sinusitis, otitis media, upper respiratory infections (URI), tonsillitis, diarrhea, bronchiectasis, hospitalizations, use of antibiotic therapy, and use of prophylactic antibiotics, sepsis and meningitis. The score was applied during the 12 months prior to immunization and one year after the administration of vaccines. The same score was applied to the group of CVID patients who weren´t immunized. Determination of IgG antibodies to pneumococcal serotypes was made by ELISA. H1N1-specific IgG was detected by indirect hemagglutination while the determination of influenzaspecific IgG was performed by ELISA, using the RIDASCREEN ® Influenza kit. The group of patients who were vaccinated included 37 patients (51% women), aged 20 to 78 years (mean 33 years). This group presented a median delay in the diagnosis of 7 years. The control group consisted of 16 patients (37.5% females) who were not immunized. Their median age was 41 years and the median delay in the diagnosis was 8 years. URI followed by pneumonia and sinusitis were the most frequent infections in women (80%, 78% and 55% respectively). However in men, URI followed by sinusitis and pneumonia were the most frequent (78%, 65% and 35% respectively). We observed a significant reduction in the score of URI, sinusitis and pneumonias in the year post administration of the vaccines (p <0.001). Conversely, there was no difference in the infections pre and post supposed vaccination scores in the group of CVID patients who were not immunized. There was no significant change in specific antibody titers to influenza and pneumococcus after vaccination. Regarding H1N1, there was no statistically significant production of antibodies to H1N1, although we observed a slight non-durable increase in antibody titers. In conclusion, there was a reduction in the number of infections, mainly sinusitis, URIs and pneumonias in patients with CVID vaccinated against influenza, H1N1 and pneumococcus. While we found no correlation between the reduction in the number of infections and specific antibody titers for the vaccines administered, the clinical improvement observed in CVID patients reinforces the benefit of vaccination

En el presente estudio se evaluó la protección conferida por dos vacunas conteniendo un complejo antígeno anticuerpo (Ag/Ac) conteniendo la cepa 2512 del virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bursa (EIBV) ligada a anticuerpos específicos al virus, aplicadas al primer día de edad vía subcutánea en pollos de carne. Hubo cuatro grupos experimentales. Los grupos A y B fueron vacunados al día de edad con dos vacunas complejo antígeno anticuerpo; el grupo C fue vacunado con un programa de vacunación tradicional con vacunas intermedias a los 10 y 18 días de edad y el grupo D (control) no fue vacunado. A los 35 días de edad 45 aves de cada grupo fueron desafiadas con la cepa estándar F52/70 de la EIB. A los 4, 7 y 10 días post desafío se sacrificó 15 aves respectivamente de cada grupo para su evaluación. La protección fue medida a través de los signos clínicos, Índice Bursal (I.B.), lesiones macroscópicas y microscópicas, serología y parámetros productivos después del desafío. Todos los grupos presentaron aves con depresión y diarrea, los cuales fueron mas severos en el grupo D y menores en el grupo A. Se observó edema bursal en todos los grupos hasta los 10 días post desafío. Los valores de I.B. en los cuatro grupos evidencio atrofia bursal y las lesiones macroscópicas y microscópicas fueron más severas en el grupo D que en los grupos vacunados. La seroconversión se observó solo en los grupos con vacunas complejos antígeno anticuerpo (A y B) al fin del estudio. Los grupos vacunados mostraron mejores parámetros productivos que el grupo no vacunado frente al desafío experimental con la cepa F52/70 de EIB. Aunque los resultados indican que los grupos vacunados fueron mejor protegidos que el grupo control estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p 0.05). Palabras Clave: Enfermedad infecciosa de la Bursa (EIB), complejo antígeno anticuerpo, vía subcutánea, vacunación, protección.
--- The present study evaluated the conferred protection by two imnune complex (Icx) vaccines contained a 2512 strain of Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) linked to a virus specific antibodies of vaccination at the one day old by subcutaneous route in broilers chickens. There were four experimental groups. The group A and B were vaccinated at one day old with two comercial Icx vaccines; group C was vaccinate with traditional program of vaccination with intermediate vaccines at 10 and 18 days old age and group D (control) without vaccination. At 35 days old 45 birds of each group were challenged with a standard strain F 52/70 of the IBDV. At 4, 7 and 10 days post challenge 15 birds of each challenge group was euthanazied for parameters evaluation. The protection was measured through clinical signs, bursal index (B.I.), gross and microscopic lesions, serology and productive parameters after challenge. All the groups presented clinical signs, they were severe and mild in control group and group A respectively. The bursal oedema was observe until 10 days post challenge. The values of I.B. in the four groups were compatible with bursal atrophy and the histopathology lesions were severe in the control group. Seroconversion was observed only in groups with Icx vaccines (A y B) until the end of the study. Productive parameters of the vaccinated groups were better in vaccinates group. Although the obtained results indicated that the vaccinated groups were better protected compared with control group there was not observed significant statistical difference between groups (po0.05). Key Words: Infetious bursal disease virus (IBDV), Immune complex (Icx), subcutaneous route, vaccination, protection.
Tesis

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-16T11:43:38Z No. of bitstreams: 1 mauro-franca-da-silva.pdf: 1113117 bytes, checksum: 4721a993f32ab60140b4d0cf8c0f704f (MD5)
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Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
O vírus atenuado da febre amarela, subcepa 17DD, é utilizado por Bio-Manguinhos para a produção da vacina contra a febre amarela. Esta vacina tem sido utilizada para a imunização humana com um excelente histórico de eficácia e segurança. Entretanto, nos últimos anos, devido à ocorrência de alguns casos de eventos adversos associados ao vírus vacinal cepa 17D e subcepa 17DD, apontou-se a necessidade de desenvolvimento de uma vacina inativada. Para a implementação desta nova vacina torna-se necessário o desenvolvimento de métodos de quantificação de antígenos virais. Diferentes metodologias de quantificação podem ser utilizadas na produção de vacinas inativadas, sendo as mais comuns o teste imunoenzimático (ELISA) e o teste de dose-resposta. O presente estudo teve como objetivo o estabelecimento de um ELISA visando à detecção do antígeno do vírus da febre amarela inativado. Para este propósito, foram obtidos estoques de partículas virais da subcepa 17DD, a partir de culturas de células Vero, os quais foram purificados e quantificados por métodos bioquímicos e virológicos clássicos, respectivamente. Para o desenvolvimento do teste utilizamos diferentes anticorpos como capturana fase sólida. Os resultados obtidos para os testes utilizando o anticorpo 2D12 como captura mostraram um limite de detecção do antígeno no ELISA foi de 2,21 log 10 PFU/0,1mL e (1,55 µg/0,1mL). A partir deste valor, foi estabelecido um controle positivo contendo o vírus 17DD atenuado com título de 3,06 log10 PFU/mL e (29µg/0,1mL). Os resultados mostram, também, que o ELISA foi capaz de detectar o vírus 17DD inativado por formaldeído até a diluição 1:16 (52,9 µg/0,1mL). Baseado nos resultados obtidos acredita-se que o desenvolvimento de um teste de ELISA para detecção e quantificação do antígeno 17DD possa representar umimportante avanço tecnológico no controle da produção de uma vacina inativada contraa febre amarela.
The attenuated 17DD substrain of yellow fever virus is used in Bio-Manguinhos for yellow fever vaccine production. This vaccine has been used for human immunization with an excellent history of efficacy and safety. However, in the latest years, the occurrence of adverse events associated with 17D and 17DD substrain pointed to the necessity of developing technologies for the production of an inactivated vaccine. The implementation of this new vaccine will require methods for antigen quantification. Different methodologies of quantification can be used, being the most commonlyused the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and dose response test.The aim of this study was the establishment of an ELISA for the detection of inactivated yellow fever virus antigen. For this purpose, 17DD virus was obtained from Vero cell cultures, purified and quantified by biochemical and virological classical methods, respectively. The results showed that ELISA test using the 2D12 capture antibody presented a limit of 2,21 log10PFU/0.1mL of viral titer and (1,55 µg viral protein/0.1mL). Based on this value, a positive control was established which contained the attenuated 17DD substrain of yellow fever virus with a titer of 2,95log 10 PFU/mL and (29 µg/0.1mL). The results also showed that the ELISA was able to detect 17DD virus inactivated by formaldehyde up the dilution 1:16 (52,9 µg protein/0,1mL). The development of an ELISA test for the detection and quantification of 17DD antigen can represent an important step in the production control of the inactivated vaccine against of yellow fever.

A infecção crônica pelo vírus da hepatite C (HCV) é importante fator de risco para o desenvolvimento de cirrose hepática e de carcinoma hepatocelular. A evolução para formas mais graves está relacionada a fatores ligados ao vírus, ao hospedeiro e à resposta imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos do gene HLA-E, a expressão da molécula HLA-E e a gravidade da doença hepática pelo HCV. Foram incluídos 112 pacientes com hepatite C crônica e avaliados parâmetros clínicos, bioquímicos e histológicos (esteatose, atividade inflamatória e fibrose hepática). A variabilidade do gene HLA-E foi avaliada por sequenciamento de Sanger, e a expressão hepática da molécula, por imunoistoquímica. Para comparação da expressão hepática da molécula HLA-E e da variabilidade do gene HLA-E, foram usados dois grupos controles de indivíduos sem hepatopatia da mesma região geográfica. A imunoistoquímica para HLA-E identificou expressão da molécula nos hepatócitos e nas células de Kupffer. A expressão de HLAE em hepatócitos e células de Kupffer foi encontrada em 56,3% e 43,8% dos pacientes com HCV e em 20% e 10% nos controles (P = 0,008 e 0,02), respectivamente. Foi identificado que o percentual de pacientes do sexo masculino, com expressão moderada de HLA-E em células de Kupffer, foi maior em relação aos pacientes do sexo feminino (22,8% x 7,3%; P = 0,03). As amostras de fígado classificadas como esteatose, atividade necroinflamatória e fibrose graves apresentaram maior grau de expressão de HLA-E em células de Kupffer e hepatócitos, com associação linear significativa. Na análise multivariada, as variáveis que influenciaram significativamente a gravidade da doença foram a expressão da molécula HLA-E nos hepatócitos, a idade avançada e o índice de massa corporal maior que 25. Foram identificados 14 haplótipos diferentes do gene HLA-E, quatro deles ainda não descritos na literatura. A frequência do alelo HLA-E*01:01:01:03 foi menor no grupo de pacientes, quando comparada ao controle (P = 0,0001). O alelo HLA-E*01:03:05 associou-se a maior probabilidade (OR = 4,69) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer (P = 0,046). O genótipo TT do polimorfismo +424 T/C (rs1059510) associou-se a menor probabilidade (OR = 0,06) de expressão da molécula HLA-E, na célula de Kupffer, em relação à ausência de expressão (P=0,009), a menor probabilidade (OR = 0,22) de atividade inflamatória moderada/grave em relação à leve (P = 0,047) e esteve associado a menor probabilidade (OR = 0,17) de fibrose hepática moderada/grave em relação à fibrose leve (P = 0,049). Os resultados do presente estudo sugerem que a pesquisa de fatores imunogenéticos, como a expressão hepática da molécula HLA-E e a identificação da variabilidade genética do HLA-E, pode ter aplicabilidade no manejo clínico dos pacientes, uma vez que auxilia na discriminação daqueles com maior risco de atingir formas avançadas da hepatite C crônica.
Chronic hepatitis C is an important risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The severity of liver disease can be influenced by factors related to the virus, the host and the immune response. The aim of this study was to evaluate the association between HLA-E gene polymorphisms, HLA-E molecule expression and HCV liver disease severity. We included 112 patients with chronic hepatitis C and evaluated clinical, biochemical and histological parameters (steatosis, inflammatory activity and liver fibrosis). The variability of the HLA-E gene was assessed by Sanger sequencing and liver HLA-E expression by immunohistochemistry. Two control groups of individuals without hepatopathy from the same geographical region were used to compare the HLA-E expression and the gene variability. Immunohistochemistry for HLA-E showed positivity in hepatocyte and Kupffer cell. HLA-E positivity in hepatocytes and Kupffer cells were found in 56.3% and 43.8% of HCV patients and in 20% and 10% in the controls (P = 0.008 and 0.02), respectively. We found that the percentage of male patients with moderate HLA-E expression in Kupffer cells was higher than in females (22.8% vs. 7.3%, P = 0.03). The liver samples classified as severe fibrosis, necroinflammatory activity and steatosis presented greater expression of HLA-E on Kupffer cells and hepatocytes. There was a positive linear association between HLA-E expression and severity of liver damage (P<0.05). In the multivariate analysis, the variables that significantly influenced the severity of the disease were HLA-E molecule expression in hepatocytes, advanced age and body mass index greater than 25. Fourteen different HLA-E haplotypes were identified, four of them not yet described in the literature. The frequency of the HLA-E * 01: 01: 01: 03 allele was lower in the group of patients than in the control group (P = 0.0001). The HLA-E * 01: 03: 05 allele was associated with increased likelihood (OR = 4.69) of HLA-E expression in the Kupffer cell (P = 0.046). The TT genotype of the +424 T / C polymorphism (rs1059510) was associated with a lower probability (OR = 0.06) of HLA-E expression in the Kupffer cell in relation to the absence of its expression (P = 0.009), was associated with a lower probability (OR=0,22) of moderate/severe necroinflammatory activity in relation to the mild inflammatory activity (P=0,047) and was associated with a lower probability (OR = 0.17) of moderate / severe hepatic fibrosis in relation to mild fibrosis (P = 0.049). The results of the present study suggest that the study for immunogenic factors such as HLA-E liver expression and the identification of certain polymorphisms and alleles of the HLA-E gene may have applicability in the clinical management of patients since it aids in discrimination of those at greatest risk of reaching advanced forms of chronic hepatitis C.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La anemia infecciosa del salmón es una enfermedad que afecta principalmente a los salmones del Atlántico (Salmo salar) y es causada por el virus ISA (infectious salmon anemia), el cual pertenece al género Isavirus de la familia Orthomyxoviridae. En Chile fue detectado por primera vez en salmones del Atlántico en el año 2007, causando innumerables pérdidas a la industria salmonera. El virus posee variadas proteínas de superficie, siendo las más estudiadas la neuroaminidasa, y la hemaglutinina-esterasa (HE). El gen que codifica para la proteína HE, posee una “región altamente polimórfica”, la cual le confiere gran variabilidad entre diferentes aislados del virus ISA. En el presente estudio se utilizó el gen HE del genotipo viral aislado con mayor frecuencia en Chile (genotipo EU), el cual fue sintetizado químicamente y optimizado para ser expresados por levaduras. El gen HEopt fue subclonado dentro del vector de expresión pPICZα junto a un péptido señal de secreción extracelular, el cual fue integrado al genoma de la levadura Pichia pastoris por recombinación homóloga. La cepa de la levadura que se obtuvo como resultado, fue sometida a fermentación y la cantidad de proteína HE secretada al medio de cultivo fue medida a través de la técnica de Bradford. Con el fin de corroborar la especificidad de la inmunorreacción de las proteínas recombinantes secretadas se realizaron ensayos Western blot y ELISA, utilizando un anticuerpo específico anti-ISA y sueros de salmones infectados naturalmente con el virus, respectivamente. De estos análisis se concluyó que la proteína recombinante producida y secretada por la cepa de levadura es específica y presenta inmunorreactividad positiva. De lo anterior puede inferirse que la plataforma montada y las proteínas recombinantes producidas en esta memoria serían de gran utilidad para la futura generación de técnicas tanto de diagnóstico como de control del virus de la anemia infecciosa del salmón en Chile
Financiamiento: Proyecto Bicentenario PSD 23 Conicyt y Proyecto de Iniciación en Investigación VID I/07

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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A raiva é uma zoonose por ter como hospedeiros, reservatórios e transmissores, mamíferos silvestres ou domésticos, caracterizada por doença aguda, causada pelo vírus da raiva (RABV) que compromete o sistema nervoso central, caracterizando-se por encefalite, com prognóstico fatal em quase todos os casos, em qualquer espécie de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi descrever achados patológicos e imunopatologia de diferentes cepas de vírus da raiva nos tecidos do sistema nervoso central (SNC) verificando a resposta imunologica celular e humoral durante infecção experimental de camundongos Mus musculus. Os animais foram inoculados experimentalmente com duas variantes antigênicas do RABV (VAg2 e VAg3), por diferentes vias de infecção, e um grupo controle. Os animais foram observados quanto ao desenvolvimento de sinais clínicos e sintomas, sendo coletados e eutanasiados seguindo uma cinética. Os tecidos foram fixados em formaldeído a 10%, incluídos em blocos de parafina, corados por hematoxilina-eosina para análise histopatológica, e marcados com anticorpos específicos para imunohistoquímica a fim de caracterizar e quantificar in situ a distribuição do antígeno e a resposta inflamatória. Antígenos do RABV foram encontrados no SNC de maneira difusa, mas principalmente nos neurônios. Foi observada supressão dos linfócitos TCD4+, com aumento dos linfócitos TCD8+. Observou-se apoptose importante, com morte de células da glia. Houve aumento de citocinas pro-inflamatórias (TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL- 1β e IL-8), anti-inflamatórias (TGF-β e IL-4) e iNOS em ambas as variantes antigênicas do RABV, mas sem observação de um perfil TH17. Esta análise possibilitou caracterizar a raiva como uma meningoencefalite, por acometer os microambientes meningeal, perivascular e intraparenquimatoso. E o processo inflamatório foi verificado mesmo quando na presençaa de corpusculos de Negri, porém com menor intensidade.
The rabies is considered a zoonosis due have as host, reservoirs and transmitters the domestic or wild mammals. It´s characterized in acute disease caused by rabies virus (RABV) that affects the central nervous system (CNS) characterized by encephalitis with fatal prognosis in almost all cases, in any mammalian species. The aim of this study was to describe pathological findings and immunopathology of different strains of rabies virus in the tissues of the central nervous system, checking cellular and humoral immune response during experimental infection of Mus musculus mice. The animals were inoculated with two antigenic variants of RABV (VAg2 and VAg3), by different routes of infection, and a control group. The animals were observed for development of clinical signs and symptoms, collected and euthanized following a kinetic. The tissues were fixed in formaldehyde 10%, embedded in paraffin, stained with hematoxylin-eosin for histopathological analysis and with specific antibodies for immunohistochemical to characterize and quantify in situ distribution of the antigen and the inflammatory response. RABV antigens were found in the CNS in a diffuse way, but mainly in neurons. It was observed suppression of CD4+ lymphocytes, with increase of CD8+ lymphocytes. It was observed significant apoptosis with glial cell death and an increase of proinflammatory cytokines (TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β and IL-8), anti-inflammatory (TGF-β and IL-4) and iNOS in both antigenic variants of RABV, but without observation of a TH17 profile. The analyses enable the characterization of rabies as meningoencephalitis, since it affects the meningeal, perivascular and intraparenchymal microenvironments. And the inflammatory process was observed even in the presence of inclusion bodies, but with less intensity.

A diarréia por rotavírus tem sido umas das principais causas de mortalidade infantil. Pesquisas, que relatam a presença de IgA no leite e colostro humanos reativos com o rotavírus. Nosso objetivo foi avaliar a presença de anticorpos IgA anti-G3P[2] em amostras de leite e colostro e anti-G9P[8] em amostras de leite pela técnica de ELISA, verificar sua capacidade neutralizante e analisar a reatividade pelo Immunoblotting. Todas as amostras apresentaram anticorpos detectados pelo ELISA e neutralização do vírus G3P[2] e G9P[8]. Não foi observada correlação entre os títulos de ELISA e os neutralizantes para G3P[2], mas para o sorotipo G9P[8] foi possível estabelecer uma correlação significante. As amostras reconheceram frações do antígeno viral no ensaio de Immunoblotting, mas não foi possível estabelecer uma correlação entre altos títulos e alguma fração antigênica específica. Este trabalho fornece subsídios para avaliações das estratégias de vacinação.
The rotavirus diarrhea is one of the main causes of infant mortality. Studies have shown the presence of IgA in milk and colostrum reactive with human rotavirus. Our aim was to evaluate the presence of IgA anti-G3P[2] in milk and colostrum samples and anti-G9P[8] in milk ones, evaluate the IgA reactivity by ELISA and evaluate the IgA reactivity by immunoblotting. In addition, this work aimed to verify the neutralizing all titles of the samples. All of them had antibodies reactive with G3P[2] and G9P[8] and showed varied neutralization titles. There was a significant correlation between anti-G9P[8] IgA titers and the neutralizing ones, but the same was not observed for serotype G3P[2]. All samples recognized some viral antigenic fraction in immunoblotting test, but it was not possible establish a correlation between high antibodies levels and some specific antigenic fraction. This approach may be important for studies concerning vaccination strategies.

O câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre mulheres no mundo. A maioria dos casos (83%) ocorre em países em desenvolvimento, onde são encontrados em estágios relativamente avançados e, conseqüentemente, a sobrevida média é de cerca de 49% após cinco anos. Portanto, uma vacina eficaz contra as infecções pelo HPV pode levar ao controle do câncer do colo do útero. Apesar de prevenir, a vacina profilática não é acessível em função do alto custo, além de não eliminar o vírus em mulheres já infectadas pelo HPV. Assim, propusemos o desenvolvimento de uma vacina terapêutica eficaz utilizando duas abordagens: VLPs (virus-like particles) quiméricas, que poderiam apresentar propriedades profiláticas e terapêuticas, obtidas da fusão das proteína L1 e E7; proteínas quiméricas obtidas a partir da fusão de epítopos das proteínas E6 e E7 do HPV16, com e sem ubiquitina. Após subclonagens, com a obtenção dos vetores pPICHOLI-L1ΔCE71-50 e pPICHOLI-L1ΔCE743-77, partiu-se para a indução da expressão das VLPs quiméricas em Pichia pastoris, das quais não foram detectadas expressão protéica. Realizaram-se inúmeras modificações no protocolo de indução. Mesmo após essas alterações não foi detectada nenhuma expressão das fusões L1ΔCE71-50 ou L1ΔCE743-77. Como alternativa de uma vacina terapêutica, nos propusemos a expressar em E. coli proteínas sintéticas originadas da fusão entre epítopos das proteínas E6 e E7 do HPV16, com ou sem Ubiquitina, visando aumentar a apresentação de peptídeos via MHC de classe I de modo a estimular a eliminação de células infectadas com HPV16, evitando e regredindo o desenvolvimento dessas células cancerosas. Com a proteína E6E7 solúvel e purificada, realizou-se um ensaio de imunização. Nesse experimento, 20% dos animais imunizados com a proteína E6E7 não apresentaram desenvolvimento de tumor após a inoculação de células TC1. Assim isso nos leva a crer que com o aumento da concentração de proteína e utilização de adjuvantes seria possível aumentar o número de animais resistentes ao desenvolvimento do tumor. Em um segundo experimento de imunização, comparamos as proteínas E6E7 e E6E7Ub, em duas concentrações, 15 e 40 µg, e também com ou sem o adjuvante whole cell pertussis (WCP). Independentemente da concentração e presença ou ausência de WCP, os grupos imunizados com E6E7Ub apresentaram proteção contra o tumor entre 80% e 100% dos camundongos, enquanto os grupos imunizados com E6E7 apresentaram proteção entre 0% e 25%. Esses resultados são promissores, ainda que preliminares, indicando um potencial de uso da proteína E6E7Ub como imunógeno para vacina terapêutica contra o câncer cervical induzido por HPV16
Cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide. Most cases (83%) occur in developing countries, where they are found in relatively advanced stages and, consequently, the median survival is about 49% after five years. Therefore, an effective vaccine against HPV infections can lead to control of cancer of the cervix. Although preventable, the prophylactic HPV vaccine is not accessible to all due to their high cost and in addition the vaccine does not eliminate the HPV in infected women. We have therefore proposed the development of effective therapeutic vaccines using two approaches: chimeric VLPs (virus-like particles), endowed with prophylactic and therapeutic properties, obtained from the fusion protein L1 and E7; chimeric proteins derived from the fusion of epitopes of proteins E6 and E7 of HPV16 with and without ubiquitin. After subcloning, we obtained the vectors pPICHOLI-L1ΔCE71-50 and L1 pPICHOLI- L1ΔCE743-77. After transformation of yeast Pichia pastoris with these constructions, the cells were induced, but it was not possible to detect any recombinant protein expression. As an alternative, we proposed the expression of synthetic proteins in E. coli derived from the fusion between epitopes of E6 and E7 proteins of HPV16 with or without Ubiquitin, in order to enhance the presentation of peptides through MHC class I to stimulate the elimination of HPV16-infected cells, preventing and regressing the development of cancer cells. Soluble E6E7 protein was purified and, 20% of the animals immunized with this protein did not develop tumor after inoculation of TC1 cells. In a second immunization experiment we compared the proteins E6E7 and E6E7Ub, in two concentrations, 15 and 40µg, with or without the adjuvant whole cell pertussis (WCP). Regardless of concentration and presence or absence of WCP, all the groups immunized with E6E7Ub showed protection against tumor between 80% and 100%, while the groups immunized with E6E7 showed protection from 0% to 25%. These results are promising and although preliminary, indicate the potential of E6E7Ub protein as an immunogen, for a therapeutic vaccine against cervical cancer induced by HPV16

INTRODUÇÃO: A imunoterapia baseada em células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) constitui uma estratégia promissora para o tratamento de indivíduos infectados pelo HIV. Devido à sua notória plasticidade, populações heterogêneas de MoDCs podem ser obtidas in vitro, dependendo das condições da cultura. Consequentemente, a capacidade dessas células em secretar citocinas e expressar moléculas que participam do processo de apresentação antigênica (MHC, moléculas de adesão e coestimuladoras) é variável, podendo interferir no perfil e eficácia da resposta imune induzida pela terapia. Em nosso laboratório foi desenvolvido um protocolo clínico de vacinação terapêutica baseada em MoDCs e HIV autólogo inativado para o tratamento de indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, não expostos à terapia antirretroviral. Deste modo tornou-se oportuna uma investigação in vitro mais aprofundada sobre a produção viral e as características das MoDCs utilizadas como produto vacinal. OBJETIVOS: Caracterizar o produto vacinal constituído por vírus autólogo e MoDCs de indivíduos infectados pelo HIV utilizados em imunoterapia, com relação a aspectos fenotípicos e funcionais. MÉTODOS: Foram incluídos no estudo 17 indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, participantes de um estudo clínico de fase I/II de imunoterapia com MoDCs. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidas a partir de leucaférese e parte do material foi utilizada para isolamento e expansão de HIV em sistema de cultura autólogo ou alogênico. Outra parte das PBMCs foi utilizada como fonte de monócitos para diferenciação em MoDCs imaturas que foram pulsadas ou não com o HIV quimicamente inativado pelo aldrithiol-2 (HIV-AT-2), denominadas respectivamente MoDCs HIV-AT-2 e MoDCs maduras, e posteriormente ativadas com citocinas pró-inflamatórias. MoDCs foram avaliadas fenotípica e funcionalmente quanto à expressão de moléculas de superfície, capacidade fagocítica, potencial migratório, produção de citocinas e habilidade em gerar resposta celular in vitro, avaliada por meio da capacidade em induzir proliferação, produção de citocinas e atividade citotóxica em linfócitos T autólogos. RESULTADOS: O rendimento de partículas virais foi mais elevado quando a expansão do HIV foi realizada em sistema alogênico em comparação ao sistema autólogo. Após estímulo para maturação, tanto MoDCs maduras quanto MoDCs HIV-AT-2 apresentaram aumento na expressão de moléculas de coestimulação, ativação e migração, comparado às MoDCs imaturas. Com relação à caracterização funcional, observamos que MoDCs foram capazes de fagocitar partículas de dextran-FITC, exibiram baixo potencial migratório e baixa produção de citocina polarizante para Th1. Ainda, observamos reduzida atividade citotóxica induzida tanto por MoDCs HIV-AT-2 quanto por MoDCs maduras. Por outro lado, MoDCs HIV-AT-2 promoveram proliferação de linfócitos T autólogos e maior polifuncionalidade em células TCD4+ e TCD8+ em comparação às MoDCs maduras. CONCLUSÃO: A produção de vírus autólogo através de sistema alogênico resulta em maior rendimento viral e potencial imunogênico. O produto vacinal composto por MoDCs HIV-AT-2 é capaz de induzir resposta polifuncional antígeno especifica in vitro
INTRODUCTION: Immunotherapy based on monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) is a promising strategy for the treatment of HIV-infected individuals. Due their plasticity, using different combinations of cytokines cocktail in vitro it is possible to obtain a heterogeneous MDDCs population. Consequently the capacity of these cells to secrete cytokines and express molecules that participate in antigen presentation varies (MHC, adhesion and costimulatory molecules) and can interfere in the profile and efficacy of the immune response induced by this therapy. A clinical trial was conducted in our laboratory to evaluate a immunotherapy based on dendritic cells sensitized with autologous inactivated HIV for the treatment of antiretroviral naive chronically HIV-infected individuals. Therefore, it was a good opportunity to study deeply the virus production and expansion in vitro and to characterize MDDCs used as a vaccine. OBJECTIVE. To characterize MDDCs in context of their phenotype and function as well as investigating viral production and expansion in autologous and allogenic systems. METHODS: 17 patients underwent apheresis before vaccination and their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used for autologous virus production and expansion of the virus was carried out in both autologous and allogenic systems. Monocytes were differentiated into immature MDDCs that were pulsed/or not with autologous chemically (aldrithiol-2) inactivated HIV particles (HIV-AT-2). These pulsed (HIV-AT-2 MDDCs) and non-pulsed (mature MDDCs) cells were then activated by proinflammatory cytokines. Phenotypic (cell surface marker) and functional analysis (phagocytosis, transmigration and cytokines production) of MDDCs and their priming and stimulation of lymphocyte (proliferation, polyfunctionality and cytotoxicity) was performed using flow cytometry. RESULTS. Viral yield was higher when expanded in allogenic compared to autologous system. After stimulation with proinflammatory cytokines, both HIV-AT-2 MDDCs and mature MDDCs presented increased costimulation expression, activation and migratory molecules compared to immature MDDCs. Regarding to functional characterization, we observed that MDDCs were able to phagocytize FITC-Dextran and exhibitted a low migratory potential and low production of Th1 polarizing response cytokines. Moreover we observed reduced cytotoxic activity induced by HIV-AT-2 MDDCs and mature MDDCs. On the other hand we also observed that HIV-AT-2 MDDCs were capable of inducing proliferation and polyfunctionality of autologous CD4+ and CD8+ T-lymphocytes compared to mature MDDCs. CONCLUSION. Allogenic system was found to be more efficient in increased viral yield in relation to autologous system. Besides, virus expanded in allogenic system showed a more immunogenic profile. Vaccine product (HIV-AT-2 MDDCs) was able to induce antigen specific polyfunctional response