Academic literature on the topic 'Aparato de Golgi'

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario<br>La maduración ovocitaria involucra cambios nucleares y citoplasmáticos que comprenden la reanudación de la meiosis y la redistribución de organelos como el aparato de Golgi. La coordinación de estos procesos en el tiempo es un evento crítico para el establecimiento de desarrollo embrionario normal. Este trabajo estudió la dinámica del aparato de Golgi (AG) durante la maduración de ovocitos de perra y su relación con la progresión nuclear. La localización del AG se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta en ovocitos no madurados, madurados in vitro (IVM) hasta 96 hrs y madurados in vivo, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente para ser incubados con los Ac contra las proteínas del AG GM130 y Giantin; la configuración cromatínica se determinó mediante tinción DAPI, en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), metafase I (MI) y II (MII). Los resultados mostraron dos patrones de distribución de la inmunomarca: a) Homogéneo en el citoplasma, que predominó en ovocitos no madurados (99%) presentando paralelamente el estado de VG (87%) y, b) Cortical, principalmente en ovocitos sometidos a IVM (97%), donde se reanuda la meiosis incrementando el desarrollo meiótico con el tiempo de cultivo y predominando el estado MI (75%). Todos los ovocitos madurados in vivo mostraron patrón cortical y 94% de MII. Estos resultados sugieren que el AG se relocaliza durante la IVM de ovocitos de perra, lo que se relaciona con la progresión meiótica pero de manera no coordinada, siendo in vitro menos eficiente que in vivo<br>Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

La vía secretora se caracteriza por la acidificación progresiva de sus orgánulos, este gradiente es crucial para funciones tales como la modificación postraduccional de proteínas o el trafico de membranas. El principal responsable de generar y mantener este gradiente es la H+-ATPasa vacuolar (V-ATPase), que transporta protones desde el citosol hacía el interior del Golgi. Esta bomba está compuesta de dos dominios, el dominio V1 y el V0, a su vez ambos están formados por varias subunidades. Se ha descrito que las subunidades B y C del dominio V1 contienen dominios de unión a actina. Existen significantes similitudes entre los efectos subcelulares producidos por la despolimerización de actina y la inhibición farmacológica de la V-ATPasa: Alteración de transporte vesicular Golgi-Retículo endolplasmatico y Golgi-membrana plasmática, alcalinización del complejo de Golgi, dilatación de las cisternas de Golgi. Teniendo en cuenta que dos subunidades de la V-ATPasa tienen la capacidad de unirse a los microfilamentos de actina, nosotros hipotetizamos que estos podrían participar en la homeostasis del pH de Golgi a través de la regulación de la V-ATPasa, particularmente la actina podría estar manteniendo la asociación de los dominios V1 y V0. Generamos un constructo de la subunidad B conjugado con GFP (B2-GFP) que se incorporaba en el dominio V1. Observamos que este constructo se localizaba en los compartimentos distales del complejo de Golgi y que translocaba al citosol al despolimerizar la actina. Diferentes ensayos bioquímicos nos sirvieron para confirmar que la despolimerización de actina inducía la disociación de los dominios V1 y V0 de la V-ATPasa. Además, detectamos interacción entre la actina y las subunidades B y C. Finalmente, está descrito que la V-ATPasa se localiza en los dominios ricos en colesterol de la membrana plasmática y que el citoesqueleto de actina juega un papel importante en la organización de estos dominios, lo que observamos fue que la desorganización de los dominios ricos en colesterol inducía una subida del pH de Golgi. Con todo, concluimos que la actina regula el pH de Golgi a través del mantenimiento de la asociación de los dos dominios de la ATPasa gracias a su unión a las subunidades B y C además de su papel en el mantenimiento de los dominios ricos en colesterol.<br>We previously reported that agents that depolymerize actin filaments promote the alkalization of the Golgi stack and the trans-Golgi network. Vacuolar-type H-translocating ATPase (V-ATPase) is responsible of proton translocation and acidification of Golgi lumen. V-ATPase is a multisubunit complex composed of two domains (V1 and V0). Moreover, two subunits of V1 domain contain actin binding sides, subunit B and C. In this work we hypothesize that actin filaments could have a role in the maintaining of V1 and V0 domain association. We have generated a GFPtagged subunit B2 construct that is incorporated into the V1 domain, this construct localizes at distal Golgi compartments and translocate to cytosol upon actin depolymerization. Several biochemical assays confirmed that microfilaments distruption induces dissociation of V1-V0 domains. Moreover, we detected interaction between subunits B-C and actin filaments. Finally, V-ATPase is localized in lipid raft domains of plasma membrane and actin filaments participate in organization of these domains. We observed that lipid raft disorganization promotes an increase of intra-Golgi pH. Overall, we conclude that actin regulates the Golgi pH homeostasis maintaining the coupling of V1-V0 domains of V-ATPase through the binding of microfilaments to subunits B and C and preserving the integrity of lipid raft.

El citoesqueleto de actina es imprescindible para el mantenimiento de la morfología celular, así como para realizar diversas funciones como la movilidad/migración y división celular. En términos generales, este componente del citoesqueleto está constituido por los filamentos de actina o microfilamentos (MFs) y por una serie de proteínas de unión y/o relacionadas con la actina, implicadas en la organización estructural de los MFs y en la regulación de la dinámica de polimerización/despolimerización de actina. Una forma sencilla y eficaz de interferir en la dinámica de actina es mediante el uso de toxinas de actina. En este trabajo se ha realizado un estudio exhaustivo de los efectos provocados por estas toxinas a nivel de la morfología celular, arquitectura y de salida de proteínas del aparato de Golgi, bien por depolimerización de los MFs (citocalasina D, latrunculina B, micalolide B o toxina botulínica C2) o bien por su polimerización aberrante o estabilización (jasplakinolide).<br/> <br/>El análisis de los efectos provocados por las distintas toxinas revela como éstos son dependientes del tipo celular, modo de acción de la toxina así como de la concentración y tiempo de exposición a esta. Hemos observado como los cambios de la morfología de las cisternas producto de la despolimerización de los MFs se correlacionan con variaciones en la homeostasis el pH de este orgánulo. Según lo cual, pensamos que los MFs participan en el diseño y mantenimiento de la forma aplanada de las cisternas del aparato de Golgi, probablemente regulando, en parte, la maquinaria molecular implicada en el mantenimiento de la homeostasis iónica de este orgánulo. Por otro lado, hemos observado como los MFs participan de forma variable en la salida del aparato de Golgi de cargo no asociado a balsas lipídicas con destino basolateral y apical. Sin embargo, son prescindibles en la salida de cargo asociado a balsas lipídicas con destino apical. <br/><br/>Paralelamente a estos resultados que implican a los MFs en la morfo-funcionalidad del aparato de Golgi, hemos desarrollado un modelo celular para generación de agresomas de actina filamentosa, los cuales han sido descritos en distintas enfermedades como el Alzheimer o el acoholismo crónico bajo el nombre de cuerpos de Hirano. En este sentido, el jasplakinolide es capaz de inducir la formación reversible de un agresoma de actina filamentosa similar al cuerpo de Hirano cuya degradación está mediada por los sistemas proteasomal y lisosomal/autofagia. Por último, describimos por primera vez in vitro la generación y coexistencia de dos agresomas originados por mecanismos diferentes sin que tenga lugar en ningún momento la mezcla de sus componentes moleculares.

Diacylglycerol (DAG) is required for the generation of transport carriers at the Golgi complex. Several enzymatic reactions have been found to contribute to the maintenance of DAG levels at this organelle. However, the specific metabolic pathways that, under physiological conditions, are regulated to produce the DAG required for the membrane trafficking at the Golgi complex are not known. In the first part of this work we worked on the hypothesis that phospholipid synthesis can control DAG levels at the Golgi complex for the generation of transport carriers at the Golgi complex. To study this, we altered phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol synthesis for a short period of time in CHO cells to evaluate the changes in DAG and its effects in membrane trafficking at the Golgi. We found that cellular DAG rapidly increased when PC synthesis was inhibited at the non-permissive temperature for the rate-limiting step of PC synthesis in CHO-MT58 cells. DAG also increased when choline and inositol were not supplied. The major phospholipid classes and triacylglycerol remained unaltered for both experimental approaches. The analysis of Golgi ultrastructure and membrane trafficking showed that 1) the accumulation of the budding vesicular profiles induced by propanolol was prevented by inhibition of PC synthesis, 2) the density of KDEL receptor-containing punctated structures at the endoplasmic reticulum-Golgi interface correlated with the amount of DAG, and 3) the post-Golgi transport of the yellow fluorescent temperature-sensitive G protein of stomatitis virus and the secretion of a secretory form of HRP were both reduced when DAG was lowered. We confirmed that DAG-consuming reactions of lipid synthesis were present in Golgi-enriched fractions. We conclude that phospholipid synthesis pathways play a significant role to regulate the DAG required in Golgi-dependent membrane trafficking. In the second part of this work we investigate the role of phospholipase Cγ1 (PLCγ1), a DAG-producing signalling enzyme, on the membrane traffic at the Golgi complex and in the maintenance of its structure in HeLa cells. We based our work on the effects of the silencing and overexpression of PLCγ1. We found that PLCγ1 is required for post-Golgi trafficking of transmembrane and soluble proteins, that the catalytic activity of PLCγ1 is necessary to maintain the morphology of the Golgi complex, in particular the trans-Golgi compartments, and that PLCγ1 contributes to DAG homeostasis at the Golgi, measured by the localization of the DAG-sensing construct C1-PKCθ-GFP to the Golgi complex. Finally we show that cargo arrival at the Golgi complex increases the DAG production and that PLCγ1 is required for this increase of DAG localized at the Golgi. Our results show for the first time that a physiologic event along the secretory pathway, such as cargo arrival at the Golgi complex, triggers DAG production at this organelle for membrane traffic. We also provide evidence for a pivotal role of PLCγ1 at the Golgi: PLCγ1 mediates the DAG production triggered by cargo arrival and is required for the Golgi structure and membrane traffic at the trans-Golgi compartment. The main conclusions of this work are that: 1- Metabolic pathways for the synthesis of phospholipids that consume DAG regulate its levels at the Golgi complex. 2.- Phospholipid synthesis controls the levels of DAG needed for both retrograde and anterograde trafficking at the Golgi complex. 3.- Cargo arrival at the Golgi complex promotes DAG production. 4.- PLCγ1 is involved in the production of DAG triggered by cargo arrival at the Golgi complex. 5.- PLCγ1 is needed for post-Golgi transport and maintenance of the structure of the Golgi complex.

El complejo de Golgi participa en el procesamiento, la distribución y el transporte de lípidos y proteínas hacia su destino final dentro de la célula. El transporte desde el Golgi está mediado por intermediarios de transporte (ITs), principalmente vesículas y túbulos. La formación de ITs se inicia con la gemación de la vesícula o el túbulo, a continuación se produce su elongación y finalmente tiene lugar su fisión. Este proceso requiere de una compleja maquinaria molecular en la que intervienen las llamadas proteínas de cubierta, proteínas motoras asociadas al citoesqueleto, y los lípidos de las membranas. Respecto al papel de los lípidos, éstos pueden actuar tanto en el reclutamiento de proteínas citosólicas que participan en la formación de los ITs, como dotando a la membrana de las propiedades físicas óptimas para su deformación en vesículas o túbulos. La curvatura de membrana está facilitada por lípidos con estructura cónica como el ácido lisofosfatídico (LPA), el ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG). El DAG cumple una doble función en la formación de ITs desde el Golgi: por una parte actúa en el reclutamiento y la activación de la proteína cinasa D (PKD), necesaria para la correcta fisión de vesículas desde la red trans-Golgi (TGN). Por otra parte ayuda a la formación de curvatura negativa. El DAG en el Golgi está estrechamente regulado por diferentes vías que controlan su formación y metabolismo. Una de estas vías está mediada por las llamadas fosfatasas del ácido fosfatídico (PAPs), que producen DAG a partir de defosforilar el PA. Existen dos familias de proteínas que actúan como fosfatasas del ácido fosfatídico. Las enzimas de la familia PAP1son citosólicas, su actividad catalítica es dependiente de Mg+2, se inhiben por N-etilmaleimida (NSF) y el PA es su único sustrato. Las enzimas PAP2 son proteínas transmembrana, independientes de Mg+2 e insensibles a NSF. Las PAP2 también se conocen como fosfatasas de lípidos fosfato (LPPs), ya que además del PA pueden también catalizar la defosforilación de otros lípidos como la ceramida-1-fosfato (C1P), la esfingosina-1-fosfato (S1P) y el ácido lisofosfatídico (LPA), aunque con diferentes afinidades (PA ~ LPA > C1P > S1P). La inhibición de las PAP por el agente farmacológico propanolol, indica que el DAG que proviene de esta vía es necesario para la formación de ITs desde el Golgi al retículo endoplasmático (RE). En esta tesis hemos demostrado que uno de los miembros de la familia PAP2, la enzima PAP2b, también conocida como LPP3, se localiza en diferentes compartimentos de la vía secretora, desde los sitios de salida del RE (ERES) hasta el complejo de Golgi. El silenciamiento de LPP3: (i) reduce la formación de túbulos desde el compartimento intermedio entre el RE y el Golgi (ERGIC) y el complejo de Golgi, y a su vez incrementa la longitud de aquéllos túbulos formados desde el Golgi; (ii) causa un retraso en el transporte dependiente de Rab6 de la subunidad B de la toxina Shiga desde el Golgi al RE, sin afectar al transporte anterógrado de RE a Golgi; y (iii) a nivel ultraestructural incrementa el número de perfiles vesiculares asociados a las cisternas del Golgi. El silenciamiento de la LPP3 también reduce la síntesis de novo de DAG y los niveles de DAG en el Golgi. Además, también hemos demostrado que la sobreexpresión de un mutante catalíticamente inactivo de la LPP3 reproduce los efectos observados tanto con el silenciamiento de la LPP3, como al inhibir la actividad catalítica de las PAP2 por el propanolol. De forma conjunta, nuestros resultados demuestran que la LPP3, a partir de regular la homeostasis de DAG, participa en la formación de ITs en diferentes compartimentos de la vía secretora, regulando el transporte retrógrado entre el RE y el Golgi.<br>The Golgi complex is involved in the processing, sorting and transport of membrane components (lipids and proteins) to appropriate subcellular destinations, and is also a membranous platform for signalling, metabolic and cytoskeleton proteins. Transport to and from the Golgi complex is mediated by transport carriers (vesicles and/or tubules), which are generated in sequential stages beginning with the formation of a bud, followed by its elongation, constriction and final fission. Lipids play an essential role in this process through different mechanisms: they can recruit cytosolic proteins, modulate protein functions and modify the architecture and physical properties of the membrane bilayer. Thus, membrane curvature is facilitated by conical lipid molecules such as lysophosphatidic acid (LPA), phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG). In previous results of our group we have demonstrated that the DAG produced by the phosphatidic acid phosphatase type 2 family of proteins (PAP2) is necessary for the retrograde transport from the Golgi to the endoplasmic reticulum (ER). In this thesis we have demonstrated that that the PAP2 family member lipid phosphate phosphatase 3 (LPP3, also known as PAP2b) localizes in compartments of the secretory pathway from ER export sites to the Golgi complex. The depletion of human LPP3: (i) reduces the number of tubules generated from the ER–Golgi intermediate compartment and the Golgi, with those formed from the Golgi being longer in LPP3-silenced cells than in control cells; (ii) impairs the Rab6-dependent retrograde transport of Shiga toxin subunit B from the Golgi to the ER, but not the anterograde transport of VSV-G or ssDsRed; and (iii) induces a high accumulation of Golgi-associated membrane buds. LPP3 depletion also reduces levels of de novo synthesized DAG and the Golgi-associated DAG contents. Remarkably, overexpression of a catalytically inactive form of LPP3 mimics the effects of LPP3 knockdown on Rab6-dependent retrograde transport. We conclude that LPP3 participates in the formation of retrograde transport carriers at the ER–Golgi interface, where it transitorily cycles, and during its route to the plasma membrane.

El complejo de Golgi (Golgi) es un orgánulo dinámico que modifica proteínas y lípidos sintetizados en el retículo endoplasmático (RE) y los clasifica para enviarlos a su destino final. Está formado por un conjunto de cisternas aplanadas y apiladas (stack), con una región central plana y otra lateral dilatada. Cada stack está polarizado, con una cara cis, que es donde se recibe la carga sintetizada, y una cara trans, que es donde se le da salida. Adyacente a esta zona hay la red trans-Golgi o TGN, que es donde se producen las últimas modificaciones y se distribuye la carga para su transporte. El Golgi interacciona con el citoesqueleto de actina y sus proteínas asociadas, ya que éstas se localizan en las membranas del Golgi tanto in vivo como in vitro. El ciotesqueleto de actina interviene en los procesos de fisión de membranas y en el mantenimiento de la estructura plana y contínua de las cisternas del Golgi. También está relacionado con el citoesqueleto de espectrina, una red submembranosa formada por la propia espectrina, la actina, la proteína 4.1, el intercambiador aniónico AE1 y la anquirina. Es responsable de la morfología de los eritrocitos, facilitando así su paso por los capilares. Se ha descrito un citoesqueleto de espectrina asociado al Golgi formado por varias isoformas como la βIII espectrina, la anquirina G119, el intercambiador aniónico AE2 y la proteína 4.1. No se sabe qué función realizan en el Golgi, pero se ha descrito que la espectrina está implicada en el transporte de la ATPasa Na+/K+ y del transportador de glutamato EAAT4. Con estos antecedentes nos planteamos la siguiente hipótesis: la βIII espectrina y la anquirina G119 son necesarias para el mantenimiento de la organización estructural del Golgi y para el transporte secretor asociado. Para demostrarla nos planteamos determinar su localización en el Golgi y su participación en el mantenimiento de la estructura del orgánulo, examinar su papel en el transporte secretor y estudiar el elemento responsable de su localización en el Golgi. Desarrollamos nuevos anticuerpos específicos contra la βIII espectrina y la anquirina G119 humanas pero sólo los de la βIII espectrina mostraban un marcaje en el Golgi. Por ello decidimos centrar todo el estudio en la βIII espectrina. Mediante estudios de colocalización con marcadores de las distintas regiones del Golgi determinamos que la βIII espectrina se encuentra enriquecida en los compartimentos distales (trans-Golgi y TGN). Mediante un ensayo enzimático que disminuía los niveles del fosfatidilinositol 4-fosfato [PI(4)P] del Golgi observamos que la localización de la βIII espectrina era dependiente de los niveles de este fosfoinosítido. Gracias a los ensayos de desplazamiento competitivo de la βIII espectrina determinamos que esta asociación era a través del dominio PH. También estudiamos la contribución de la dinámica de actina en la localización de la βIII espectrina mediante el uso de drogas anti-actina. La disrupción de la dinámica de actina no afecta a la localización de la βIII espectrina. Para estudiar el papel de la βIII espectrina en la estructura del Golgi y el transporte secretor, silenciamos la βIII espectrina mediante ARNs de interferencia o la microinyección de anticuerpos anti-βIII espectrina. En ambos casos observamos una fragmentación del Golgi. Usando varios ensayos de transporte, observamos que el transporte en la zona RE/Golgi y en el post-Golgi (transporte anterógrado) de proteínas solubles y transmembrana está alterado en ausencia de βIII espectrina. Sin embargo, el transporte retrógrado de la subunidad B de la toxina de Shigella no está alterado. Así pues, esta tesis expone que la βIII espectrina es el mayor componente esquelético de los compartimentos distales del Golgi, donde es necesaria para mantener la integridad estructural y la actividad secretora del Golgi, y que el PI(4)P es el determinante de membrana más relevante para la localización de la βIII espectrina.<br>A spectrin-based cytoskeleton is associated with endomembranes including the Golgi complex and cytoplasmic vesicles but its role remains poorly understood. Using new generated antibodies to specific peptide sequences of the human βIII spectrin, we here show its distribution in the Golgi complex, where it is enriched in the trans-Golgi and trans-Golgi network (TGN). The use of a drug-inducible enzymatic assay that deplete the Golgi-associated pool of PI4P as well as the expression of PH domains of Golgi proteins that specifically recognize this phosphoinositide both displaced βIII spectrin from the Golgi. However, the interference with actin dynamics using actin toxins did not affect the localization of βIII spectrin to Golgi membranes. Depletion of βIII spectrin using siRNA technology and the microinjection of anti-βIII spectrin antibodies into the cytoplasm lead to the fragmentation of the Golgi. At ultrastructural level, Golgi fragments showed swollen distal Golgi cisternae and vesicular structures. Using a variety of protein transport assays, we show that the ER-to-Golgi and post-Golgi protein transports were impaired in βIII spectrin-depleted cells. However, the internalization of the Shiga toxin subunit B to the ER was unaffected. We state that βIII spectrin constitutes a major skeletal component of distal Golgi compartments, where it is necessary to maintain its structural integrity and secretory activity, and unlike actin, PIP4 appears to be highly relevant for the association of βIII spectrin the Golgi complex.

[EN] Previous results obtained in the research group where this thesis has been performed shown that the MNSV uses the cellular secretory pathway, through its membrane protein DGBp2 (p7B) to reach the cell periphery. Knowledge about signals/motifs of membrane proteins that facilitate or permit such transport was then rather scarce. In this work we determined the residues involved in the transport of a viral transmembrane protein through the early secretory pathway (DGBp2, MNSV p7B). The residues involved are located in both the Nt (cytosolic) and Ct region (luminal) being one of the first examples in plants of a luminal ER export signal. With this information we have proposed a model in which after insertion and correct folding of the protein in the ER membrane, the luminal Ct of p7B interacts through the K49 residue with a transmembrane adapter associated with the actin cytoskeleton for movement and concentration in the RE-cortical. Nt cytoplasmic seems to be necessary to associate with the COPII vesicle components. Moreover, we have deepened in the study of the interactome of the carmovirus MPs and we have identified through a two-hybrid assay (Y2H), three cellular proteins capable of interacting with three DGBp1 from three different carmovirus (MNSV, TCV and CarMV). These cellular factors are the 60S ribosomal protein P3 (RPP3A), the g subunit of the translation initiation factor 3 (eIF3g) and the transcription factor WRKY36. These interactions were confirmed by BiFC. Furthermore, mutagenesis assays showed that binding domain of these DGBp1 is a FNF conserved domain at the very Ct end. The fact that these three proteins interact with the same host factors suggest a possible mechanism common to most if not all carmoviruses. The unstructured Nt region of MNSV CP, as for other RNA viruses, generally is responsible for viral RNA binding so it is usually called R domain. By using substitution and deletion mutants, we have shown that this R domain (which in MNSV comprising the first 94 residues) is not involved only in the packaging and binding of the viral genome, but is also responsible of CP multifunctionality. By EMSA assays with deletion mutants we could determine that the R domain was essential for binding of RNA. It was further noted that within the R domain there was a conserved region between aa 60 to 91 region, which appears to play a role in both the genomic RNA binding and in vitro encapsidation of subgenomic RNAs. However, in packaging assays, it was observed that the R domain is essential for full genome encapsidation and that the region between residue 31 and 91 is required for both cell to cell and systemic movement. Finally, using PVX as an expression vector, we showed that MNSV CP can act as a suppressor of silencing most likely by sequestering sRNAs. With very few exceptions, plant viruses use the phloem to move from infection sites to distal parts of the plant. In order to know the phloem proteome of infected plants and to identify in the future potential host proteins that facilitate or hinder the systemic transport of viruses, in the last chapter we conducted a comparative proteomic analysis by 2D-DIGE between phloem of MNSV-infected and healthy melon plants. From a total of 1046 spots, 25 were detected having significant abundance changes between the two conditions. After mass spectrometric analysis, 22 spots corresponding to 19 protein, were identified (13 of which were overrepresented and 9 had decreased abundance). Many of the identified proteins were involved in cell death and control of redox homeostasis. Two of these 19 proteins were never described in phloem proteomic assays.<br>[ES] Resultados previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha realizado la presente Tesis habían puesto de manifiesto que el MNSV utiliza la ruta de secreción celular, a través de su proteína de membrana DGBp2 (p7B), para alcanzar la periferia celular. Hasta el momento de realizar la presente Tesis los conocimientos sobre las señales/motivos de las proteínas de membrana que facilitan o permiten dicho transporte eran más bien escasos. En este trabajo hemos determinado los residuos implicados en la salida de una proteína transmembrana viral en la ruta de secreción temprana (DGBp2, p7B MNSV). Los residuos implicados se encuentran tanto en la región Nt (citosólica) como en la Ct (luminal) siendo éste uno de los primeros ejemplos descritos en plantas de señal luminal de salida de RE. Con todos estos datos se ha propuesto un modelo en el que después de la inserción y correcto plegamiento de la proteína en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residuo K49 con un adaptador transmembrana asociado al citoesqueleto de actina para su movimiento y concentración en el RE cortical. El motivo Nt citoplasmático sería necesario para el ensamblaje de la vesícula COPII. Por otra parte se ha profundizado en el estudio del interactoma de las MPs de los carmovirus y se han identificado, mediante un ensayo de doble híbrido (Y2H), tres proteínas celulares capaces de interaccionar con tres DGBp1 procedentes de tres carmovirus diferentes (MNSV, TCV y CarMV). Estos factores celulares son la proteína P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunidad g del factor de iniciación de la traducción 3 (eIF3g) y el factor de transcripción WRKY36. Estas interacciones fueron confirmadas por BiFC. Además, mediante ensayos de mutagénesis se demostró que el dominio de unión de estas DGBp1 es un dominio Ct (FNF) conservado. El hecho de que estas tres proteínas interaccionen con los mismos factores sugiere un posible mecanismo común para todos o la mayor parte de los carmovirus. Las CPs virales constituyen el paradigma de la multifuncionalidad proteica y, además de su obvio papel estructural, intervienen en un gran número de procesos del ciclo viral, incluyendo el transporte del RNA viral. La región Nt desestructurada de la CP del MNSV, al igual que para otros virus de RNA, generalmente es la encargada de unir el RNA viral por lo que se le suele llamar dominio R. Mediante mutantes de deleción y sustitución se ha demostrado que este dominio R (que en el MNSV comprende los primeros 94 residuos) no interviene solo en la encapsidación y unión del genoma viral, sino que es la responsable de la multifuncionalidad de la CP. Mediante EMSAs con mutantes de deleción se pudo determinar que la región R es esencial para la unión del RNA. Además se observó que dentro del dominio R se encuentra una región conservada entre los aa 60 al 91, que parece desempeñar un papel tanto en la unión de RNA genómico in vitro como en la encapsidación de RNAs subgenómicos. Sin embargo, en ensayos de encapsidación se observó que todo el dominio R es esencial para la encapsidación del genoma completo y que la región comprendida entre el residuo 31 y el 91 es necesaria para el movimiento tanto célula a célula como sistémico. Finalmente, utilizando PVX como vector de expresión, se demostró que la CP del MNSV puede actuar como un supresor del silenciamiento mediante la unión a los sRNAs. Con objeto de conocer el proteoma del floema de plantas infectadas y poder en el futuro identificar posibles proteínas del huésped que faciliten o dificulten el transporte sistémico de los virus, en el último capítulo se llevó a cabo un análisis proteómico comparativo, mediante 2D-DIGE, entre floemas de plantas de melón infectadas con MNSV y plantas sanas. Se detectaron 1046 spots de los cuales 2 poseían cambios significativos entre las dos condiciones Dos de estas 19 proteínas no habían sido descritas previamente en ens<br>[CAT] Resultats previs obtinguts en el grup de recerca on s'ha realitzat la present Tesi havien posat de manifest que el MNSV utilitza la ruta de secreció cel·lular, a través de la seva proteïna de membrana DGBp2 (p7B), per arribar-hi a la perifèria cel·lular. Fins al moment de realitzar la present Tesi els coneixements sobre els senyals/motius de les proteïnes de membrana que faciliten o permeten aquest transport eren més aviat escassos. En aquest treball hem determinat els residus implicats en el transport d'una proteïna transmembrana viral a través de la ruta de secreció primerenca (DGBp2, p7B MNSV). Els residus implicats es troben tant a la regió Nt (citosòlica) com en la Ct (luminal) sent aquest un dels primers exemples descrits en plantes de senyal luminal de sortida de RE. Amb totes aquestes dades s'ha proposat un model en el qual després de la inserció i correcte plegament de la proteïna en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residu K49 amb un adaptador transmembrana associat al citoesquelet d'actina per al seu moviment i concentració en el RE cortical. El motiu Nt citoplasmàtic caldria per a l'acoblament de la vesícula COPII. D'altra banda s'ha aprofundit en l'estudi del interactoma de les MPs dels carmovirus i s'han identificat, mitjançant un assaig de doble híbrid (Y2H), tres proteïnes cel·lulars capaces d'interaccionar amb tres DGBp1 procedents de tres Carmovirus diferents (MNSV, TCV i CarMV). Aquests factors cel·lulars són la proteïna P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunitat g del factor d'iniciació de la traducció 3 (eIF3g) i el factor de transcripció WRKY36. Aquestes interaccions van ser confirmades per BiFC. A més, mitjançant assajos de mutagènesi es va demostrar que el domini d'unió d'aquestes DGBp1 és un domini Ct (FNF) conservat. El fet que aquestes tres proteïnes interaccionen amb els mateixos factors suggereix un possible mecanisme comú per a tots o la major part dels carmovirus. Les CPs virals constitueixen el paradigma de la multifuncionalitat proteica i, a més del seu obvi paper estructural, intervenen en un gran nombre de processos del cicle viral, incloent el transport de l'RNA viral. La regió Nt desestructurada de la CP del MNSV, igual que per altres virus de RNA, generalment és l'encarregada d'unir l'RNA viral pel que se li sol cridar domini R. Mitjançant mutants de deleció i substitució s'ha demostrat que aquest domini R (que en el MNSV comprèn els primers 94 residus) no intervé només a la encapsidación i unió del genoma viral, sinó que és la responsable de la multifuncionalitat de la CP. Mitjançant EMSAs amb mutants de deleció es va poder determinar que el domini R essencial per a la unió de l'RNA. A més es va observar que dins del domini R es troba una regió conservada entre els aa 60 al 91, que sembla tenir un paper tant en la unió de RNA genòmic in vitro com en l'encapsidació de RNAs subgenómicos. No obstant això, en assajos d'encapsidació es va observar que tot el domini R és essencial per a l'encapsidació del genoma complet i que la regió compresa entre el residu 31 i el 91 és essencial per al moviment tant cèl·lula a cèl·lula com sistèmic. Finalment, utilitzant PVX com a vector d'expressió, es va demostrar que la CP del MNSV pot actuar com un supressor de silenciament mitjançant la unió als sRNAs. Amb l'objecte de conèixer el proteoma del floema de plantes infectades i poder en el futur identificar possibles proteïnes de l'hoste que facilitin o dificultin el transport sistèmic dels virus, en l'últim capítol es va dur a terme una anàlisi proteòmic comparatiu, mitjançant 2D-DIGE, entre floemas de plantes de meló infectades amb MNSV i plantes sanes. Es van detectar 1046 espots dels quals 25 tenien canvis significatius entre les dues condicions. Després de sotmetre les proteïnes a una anàlisi d'espectrometria de masses , es van identificar 19 proteïnes que corresponien a 22 espots Dues<br>Serra Soriano, M. (2016). Relación estructura-función de las proteínas virales implicadas en el movimiento de los carmovirus y su interacción con factores celulares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61634<br>TESIS

La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie de surcharge lysosomale caractérisée par des atteintes neurologiques. Cette maladie génétique rare est causée par la déficience en a-N-acétylglucosaminidase (NAGLU), une enzyme nécessaire pour la dégradation des héparanes sulfates (HS). La dégradation incomplète des HS cause l’accumulation de saccharides d’HS dans les lysosomes et à la surface des cellules. Mais la cascade physiopathologique induite par ces saccharides n’est pour l’instant pas connue. D’une part, ces recherches fournissent des preuves que la communication avec l’environnement des cellules neurales déficientes en NAGLU est altérée. En effet, l’intégrine ß1 et ses effecteurs sont suractivés et recrutés au niveau des plaques d’adhérence dans des astrocytes déficients. Les comportements cellulaires dépendants des intégrines, tels que la polarisation et la migration, sont également altérés. Ces phénotypes sont restaurés par l’apport de l’enzyme déficiente. Cette restauration indique que l’accumulation de saccharides d’HS provoque l’activation de la signalisation des intégrines, et perturbe la polarisation et la migration des cellules neurales. L’ajout de saccharides d’HS purifiés sur des cellules neurales normales confirme que les saccharides d’HS extracellulaires activent des composants des plaques d’adhérence. D’autre part, l’étude d’un modèle cellulaire humain, dont l’expression de NAGLU a été inhibée par shRNA, a montré que l’accumulation de vésicules de stockage caractéristiques de la maladie est causée, entre autre, par une déformation de l’appareil de Golgi et la surexpression de GM130. Ces phénotypes sont également observés dans les neurones atteints. Ils s’accompagnent d’une augmentation de la stabilité et de la nucléation des microtubules, au niveau de l’appareil de Golgi. Les défauts de communication entre la cellule malade et son environnement semblent donc modifier la dynamique et la structure cellulaire. Nous présumons que les mécanismes physiopathologiques déchiffrés en culture sont reliés à la neuropathologie de la MPSIIIB. En perturbant la perception de l’environnement cellulaire, la polarité, la migration, et la pousse neuritique, les saccharides d’HS accumulés dans les tissus cérébraux malades, affectent probablement divers mécanismes clefs de la maturation corticale<br>Mucopolysaccharidosis type IIIB (Sanfilippo B disease) is a lysosomal storage disease characterized by severe neurological manifestations in children. This rare monogenic disease is caused by a-N­acetylglucosaminidase (NAGLU) deficiency, a lysosomal hydrolase necessary for heparan sulfate (HS) degradation. This deficiency leads to the accumulation of HS saccharides. Mechanisms mediating HS saccharides deleterious effects on brain cells are not well understood. This research provides evidences that neural cell sensing of environment is altered in MPSIIIB cells. Integrins and focal adhesion components are over-recruited and over-activated in deficient mouse astrocytes. Consistently, integrin-dependant cell behavior such as cell polarization and directed migration were defective in affected astrocytes and neural stem cells. HS saccharide clearance, by NAGLU gene transfer, rescues a normal phenotype suggesting that HS saccharides induce focal adhesion formation. Addition of purified HS saccharides on normal astrocytes confirms that extracellular HS saccharides can activate the recruitment of focal adhesion components and provides an in vitro assay to decipher the saccharide code of HS. Otherwise, investigations performed on HeLa cell model, in which NAGLU expression was inhibited by shRNA, showed that accumulation of intracellular storage vesicles, a hallmark of the disease, is due over expression of a cis-Golgi protein. This affects the Golgi morphology and microtubule nucleation and stability. It seems that alterations of environment cell sensing and downstream signaling also modify the dynamic and the structure of cells. We assume that mechanisms deciphered in cell cultures are related to MPSIIIB neuropathology. By affecting cell perception of environmental cues, cell polarity, cell migration and neurite outgrowth, HS saccharides, which accumulate in brain tissues defective for a HS degradation enzyme, likely affect various processes important for accurate cortical maturation

Tesis (Doctora en Neurociencias) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016<br>Las proteínas G heterotriméricas juegan un rol central en la regulación del tráfico intracelular. Particularmente, las subunidades Gβγ se han develado como componentes centrales de la vía de traducción de señales que también involucra a las fosfolipasas C beta (PLC ), proteínas quinasa C (PKC) y a la proteína quinasa D1 (PKD1), cuya función principal sería regular el transporte entre el aparato de Golgi y la membrana plasmática. Fue a raíz de la participación de las PLC que se nos decidimos a estudiar el rol de los otros miembros de la familia de proteínas G, las subunidades  , encontrando que la G q juega un papel esencial en la regulación de la fisión de membranas en el aparato de Golgi.<br>Fil: Coria, Andrea Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.<br>Fil: Díaz Añel, Alberto Marcelo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales; Argentina.<br>Fil: Díaz Añel, Alberto Marcelo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina.<br>Fil: Valdez Taubas, Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.<br>Fil: Valdez Taubas, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.<br>Fil: Quiroga, Santiago. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.<br>Fil: Quiroga, Santiago. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.

Tesina (Grado en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET-U.N.C. 2018. 46 h.; ils. col.; grfs.; tabls. Contiene Referencia Bibliográfica.<br>Las neuronas son células altamente polarizadas de las cuales se extienden varias dendritas cortas y gruesas, y un axón funcionalmente distintivo largo, delgado y muy ramificado, que se diferencian no solo en su morfología, sino también en las proteínas de membrana y organelas. En las neuronas piramidales, el Aparato de Golgi tiene una distribución polarizada que juega un importante rol en el desarrollo y mante nimiento de la polaridad neuronal. Además, se complementa con estaciones de Golgi satelitales (GOPs por sus siglas en inglés Golgi outpost) en las dendritas, los cuales juegan un papel crucial en la plasticidad neuronal y en el desarrollo del árbol dendrítico. Sin embargo, siguen existiendo muchas pre- guntas sobre los mecanismos que regulan la distribución espacial del Aparato de Golgi. Map6D1 es una proteína cuya expresión está altamente regulada en neuronas diferenciadas y contiene dos dominios funcionales importantes: un dominio amino terminal que puede interactuar con las membranas del Aparato de Golgi a través de la palmitoilación de residuos cisteína, y un dominio Mn que tiene la habili dad de interactuar con los microtúbulos. En neuronas en cultivo, Map6D1 se localiza en el Aparato de Golgi somático y en los GOPs de los compartimentos dendríticos. Nuestras observaciones sugieren que Map6D1 puede actuar como un regulador de la organización y posicionamiento del Aparato de Golgi en neuronas piramidales, un fenómeno que puede ser de gran importancia para generar y mantener la forma del árbol dendrítico y la polaridad neuronal. En este trabajo nos proponemos a analizar la participa ción de MAP6d1 en la regulación de la organización, estructura y dinámica del Aparato de Golgi en neuronas en desarrollo en cultivo, y su influencia en la formación y mantenimiento de la polaridad neuronal.