Academic literature on the topic 'Archaebactérie'

Les besoins de l'industrie en nouveaux outils biotechnologiques, notamment des enzymes thermostables, ont conduit précédemment à l'isolement chez une " archaea " hyperthermophile " Thermococcus hydrothermalis " de plusieurs glycosyl-hydrolases, dont une pullulanase type II. L'identification et le séquençage du gène codant pour cette dernière a abouti au clonage et à l'expression du domaine catalytique de l'enzyme chez " E. Coli ". Ce domaine, désigné Th-ApuD2, correspond à une protéine de 88469 Da, composée de 770 acides aminés. Comme toute pullulanase type II, Th-ApuD2 est capable d'hydrolyser aussi bien les liaisons a-(1,6) du pullulane que les liaisons a-(1,4) de l'amylose. Par ailleurs, elle appartient à la famille 57 des glycosyl-hydrolases, une famille pour laquelle il existe très peu d'informations et aucune description de structure tridimentionnelle. Dans la présente étude, de manière à élucider les bases de la bi-fonctionnalité de Th-ApuD2 et d'enrichir les connaissances des enzymes de la famille GH57, une caractérisation biochimique approfondie a été conduite. L'étude de la spécificité de substrat et du mode ont permis de décrire Th-ApuD2 comme une exo-enzyme qui dégrade le pullulane ou l'amylose par l'extrémité réductrice. De plus, la caractérisation des modes d'inhibition de différentes molécules ainsi que la détermination des paramètres cinétiques d'hydrolyse d'une gamme variée de substrats ont conduit non seulement à prouver l'existence d'un site actif unique, responsable des deux activités hydrolytiques, mais aussi à proposer un modèle d'organisation de ce dernier. En ce qui concerne les deux activités hydroliques de Th-ApuD2, des expériences de mutagène basées sur la comparaison de la séquence de Th-ApuD2 avec d'autres protéines notamment des enzymes de la famille GH57, ont mis en évidence l'importance de trois résidus acides (E291, D313 et D394). L'absence d'activité mesurable des mutants Th-ApuD2-E291A et Th-ApuD2-D394A sur pullulane et amylose indique que ces deux résidus jouent des rôles essentiels dans le mécanisme catalytique
The industrial demands for new biotechnological tools expecially thermostables enzymes has previously led to the isolation of several glycosyl-hydrolases from the hyperthermophilic archaea "Thermococcus hydrothermalis", one of which was a pullulanase type II. The identification and sequencing of the gene encoding this enzyme has allowed the DNA encoding the catalytic domain to be cloned and expressed in "E. Coli". This domain designated Th-ApuD2, codes for a 88469 Da protein composed of 770 amino-acids. Like other pullulanases type II, Th-ApuD2 is able to hydrolyse both a-(1,6) likages in pullulan and a-(1,4) likages in amylose. The enzyme belongs to the glycosyl-hydrolase family 57, a poorly studied family for which no structural data is available. In this study, in order to investigate Th-ApuD2 bi-functionnality and to increase our general knowledge of family GH57 enzymes, we have performed a delaited biochemical characterization of Th-ApuD2. The study of substrat specificity and mode of action has allowed Th-ApuD2 to be classified as an exo-acting enzyme which degrades both pullulan and amylose from the reducing end. In addition, the identification of the inhibition modes of different molecules and the determination of the kinetic parameters of reactions involving a wide range of substrates have not only shown that a single active is responsible for both hydrolytic activities, but have facilitated the elaboration of a shematic model for the organisation of this site. With regard to the dual hydrolic activitiesof Th-ApuD2, mutagenesis experiments based on the sequence comparison with other proteins, including those from GH57, revealed the importance of three acidic residues (E291, D313 and D394). The absence of detectable activity in the presence of either pullulan or amylose suggest that E291 and D394 are essential for the catalytic mecanism

Un appareillage simple et efficace a été mis au point pour la culture de bactéries méthanogènes. Grâce à ce système, la nutrition soufrée et azotée de Methanobacterium (Mb. ) ivanovi et de Mb. Thermoautotrophicum souche delta H a été étudiée. En présence de mercapto-2-éthanol, agent réducteur non métabolisé, il a été montré que, en plus du sulfure, Mb. Ivanovi utilise le soufre élémentaire, la cystéine, et la méthionine comme source de soufre et que Mb. Thermoautotrophicum utilise le soufre élémentaire et la cystéine. Les autres composés testés n'ont aucun effet (sulfate) ou inhibent (sulfite, thiosulfate et dithionite) la croissance et la méthanogénèse des deux souches. En ce qui concerne la nutrition azotée, outre l'ammoniaque, (i) seule la glutamine est utilisée comme source d'azote chez Mb. Ivanovi, (ii) la glutamine et l'urée sont utilisées comme sources Irazote chez Mb. Thermoautotrophicum. Les autres composés testés n'ont aucun effet (nitrate chez la souche delta H) ou inhibent (nitrite) la croissance et la méthanogénèse des deux souches. La mesure des activités glutamine synthétase (GS), glutamate synthase (GOGAT) et alanine déshydrogénase (ADH) chez les deux souches suggèrent l'existence d'une voie GS-GOGAT pour l'assimilation de l'ammoniaque. A des concentrations élevées d'ammoniaque l'ADH pourrait jouer un rôle. Par contre, la glutamate déshydrogénase n'a pas été détectée chez ces méthanogènes. La GS de Mb. Ivanovi a été purifiée à homogénéité. C'est un dodécamère d'environ 600. 000 daltons composé d'un seul type de sous-unité, thermostable et insensible à l'oxygène. Son pI est de 4,6. Son activité n'est pas régulée par un système d'adénylation mais elle est sensible à une inhibition allostérique. Aucune réaction croisée n'a été détectée entre la GS de Mb. Ivanovi et des anticorps contre la GS d'Escherichia coli, d'Anabaena 7120 ou de Bacillus megaterium. Des mutants de 141 ivanovi auxotrophes pour la glutamine ont été caractérisés. Ces mutants ont une activité GS fortement diminuée par rapport à celle de la souche sauvage. En utilisant la technique de Southern, de l'homologie a été mise en évidence entre les gènes de structure de la nitrogénase (nifHDK) de K. Pneumoniae et d'Anabaena et l'ADN de Mb. Ivanovi et Mb. Thermoautotrophicum. De plus, de l'homologie avec le gène de structure de la GS (glnA) d'Anabaena a été détectée dans l'ADN de Mb. Ivanovi.

Le travail présenté dans ce mémoire porte sur l'étude de trois enzymes atypiques de la machinerie de la synthèse des protéines chez les archaebactéries et certaines bactéries pathogènes. Les nucléotides responsables de la spécificité de lysylation de l'ARNtLys par la lysyl-ARNt synthétase de classe I de la bactérie pathogène Borrelia burgdorferi ont, dans un premier temps, été déterminés. La conservation des éléments d'identités principaux, situés au niveau de la boucle anticodon de l'ARNt a ensuite été étudiée pour les LysRS de classe I issus d'archaebactéries et d'autres bactéries. La corrélation entre les études phylogénétiques et les résultats biochimiques ont permis de proposer une voie d'évolution de la LysRS de classe I. La spécificité d'aminoacylation par la prolyl-ARNt synthétase de l'archaebactérie méthanogène Methaocaldococcus jannaschii a ensuite été étudiée. Il a été proposé que la ProRS de cet organisme serait capable de produire a la fois le Pro-ARNtPro et le Cys-ARNtCys pour palier au manque de CysRS canonique dans cet organisme Nous avons terminé notre étude de protéines atypiques de la machinerie de la synthèse des protéines dans les archaebactéries par l'identification chez M. Jannaschii d'un gène codant pour une nouvelle famille de Peptidyl-ARNt hydrolase. Cette activité est essentielle chez les bactéries car elle permet le recyclage des ARNt dans la synthèse protéique. Cette nouvelle classe de Pth (baptisée Pth2) est présente chez les archaebactéries ainsi que dans les eukaryotes. La déletion du gène de type bactérien (pth) et de type archaebactérien (pth2) n'a pas entrainé de phénotype léthal chez la levure indiquant que, pour cet organisme, l'activité n'est pas essentielle ou bien supportée par un troisième gène encore inconnu
The work presented in this thesis focuses on three examples of non-canonical proteins from the protein synthesis machinery in archaea and in pathogenic bacteria. The nucleotides involved in the specific recognition of tRNALys transcript by Borrelia burgdorferi class I lysyl-tRNA synthetase were determined. The conservation of the main identity elements situated in the anticodon loop of the tRNA was then studied for class I LysRS systems from archaea and other bacteria. Correlation of the phylogenetic and biochemical analyses allowed the prediction of an evolutionary scenario for the class I LysRS. The specific recognition of the aminoacid by the archaeal Methanocladococcus jannaschii prolyl-tRNA synthetase was then studied. The ProRS from this organism was proposed to be able to produce both Pro-tRNAPro and Cys-tRNACys. The dual specificity of the ProRS was suggested to account for the lack of a canonical CysRS in three methanogenic archaea including M. Jannaschii. We show here that, in vitro, the M. Jannaschii ProRS is in fact, mischarging cysteine onto tRNAPro and is unable to produce Cys-tRNACys