Academic literature on the topic 'Archaeon hyperthermophile'

La maturation du transcrit primaire des arnt implique toute une serie de modifications chimiques au niveau de certaines bases et/ou riboses. Mon travail de these traite de l'etude de la biosynthese de plusieurs nucleotides modifies au sein des arnt d'une archaebacterie hyperthermophile, pyrococcus furiosus dont la temperature optimale de croissance est de 100\c. En utilisant des extraits cellulaires de p. Furiosus et des precurseurs d'arnt obtenus par transcription in vitro de genes synthetiques d'arnt, nous avons mis en evidence l'activite in vitro de douze enzymes de modification. Nous avons demontre que de simples structures tige-boucle sont substrats pour la plupart des enzymes de modification agissant au sein de la boucle t- des arnt. Nous avons defini que la biosynthese de la 1-methyl inosine-57 implique deux etapes distinctes et ordonnees, la synthese de 1-methyl-adenosine-57 dependant de la s-adenosyl-l-methionine (sam), puis une desamination de la 1-methyl-adenosine en 1-methyl inosine. Nous avons clone et sequence le gene pftrm1. L'expression de pftrm1p, chez e. Coli confere aux cellules la propriete de catalyser in vivo la biosynthese de m 2 2g dans les arnt de la cellule hote, depourvue de cette activite enzymatique. His 6pftrm1p, fusionne a son extremite n-terminale a une queue polyhistidine catalyse la biosynthese in vitro de m 2 2g exclusivement a la position 26 des arnt-substrats via la formation de l'intermediaire m 2g26. His 6-pftrm1p est monomerique en solution et forme un complexe de stoechiometrie 1:1 avec un arnt-substrat. L'enzyme se dissocie de l'arnt entre les deux transferts de groupe methyle sur la guanosine-26. Nous avons determine les elements d'identite de l'arnt requis pour la biosynthese de m 2g26 et de m 2 2g26.

Kyoto University (京都大学)<br>0048<br>新制・課程博士<br>博士(工学)<br>甲第13852号<br>工博第2956号<br>新制||工||1436(附属図書館)<br>26068<br>UT51-2008-C768<br>京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻<br>(主査)教授 今中 忠行, 教授 青山 安宏, 教授 森 泰生<br>学位規則第4条第1項該当

Ces dernieres annees, les archaea hyperthermophiles (thermococcales) ont ete plus particulierement etudiees pour leurs enzymes thermostables. Cependant, les etudes genetiques de ces microorganismes sont limitees par le manque d'outils genetiques (marqueurs de selection, systeme de transformation, vecteurs de clonage) fonctionnant a hautes temperatures. La decouverte d'un plasmide cryptique (pgt5) de la souche isolee recemment d'une source hydrothermale profonde, pyrococcus abyssi, a permis d'entreprendre des recherches visant a developper un systeme de transformation et a construire un vecteur de clonage. Notre contribution dans ce projet, a consiste tout d'abord a mettre au point un milieu minimum permettant une croissance de p. Abyssi avec des rendements et des taux de croissance similaires a ceux obtenus sur milieu riche. Ce milieu est compose de 9 acides amines : histidine, threonine, arginine, tyrosine, methionine, valine, phenylalanine, isoleucine et leucine. Des cmi de 14 antibiotiques ont egalement ete determinees pour p. Abyssi, des souches proches et differentes thermococcales. De bonnes thermostabilites et de basses frequences de mutation spontanee ont permis de selectionner l'acide fusidique et la puromycine comme les antibiotiques les plus prometteurs dans la recherche de marqueurs de selection chez les thermococcales. De plus, meme si des mutants de resistance a la puromycine ont pu etre isoles, la recherche de mutants auxotrophes pour l'uracil s'est averee la plus prometteuse, l'auxotrophie etant liee a la resistance a l'acide 5-fluoroorotique (5-foa). Apres mutation spontanee, et/ou mutagenese aux uv ou a l'ethylmethanesulfonate (ems), 9 mutants stables de p. Abyssi ont ete isoles et leur auxotrophie a ete confirmee. Des mesures enzymatiques ont montre que ces mutations se situaient dans les genes pyre et/ou pyrf, successivement impliques dans la voie de biosynthese des pyrimidines. Des experiences de complementation d'un mutant e. Coli (pyre-) avec une banque genomique de p. Abyssi, nous ont permis de cloner et de sequencer un fragment de 965pb possedant une origine de replication majeure de 165 codons correspondant au gene pyre de p. Abyssi. Ce gene pourrait representer un marqueur de selection potentiel utile tout d'abord dans l'elaboration d'un systeme de transformation, puis dans la construction d'un vecteur de clonage base sur pgt5.

Dans le but d'isoler une activite -glucosidase thermostable, un criblage enzymatique sur 269 micro-organismes thermophiles provenant de sources hydrothermales des fonds marins a ete realise et a permis de mettre en evidence 70 isolats presentant une activite amylolytique. Parmi les 70 positifs, seize archaea et deux bacteries ont ete selectionnes pour une caracterisation preliminaire. Les optimums de temperature de l'activite amylolytique, produite par ces souches, se situaient entre 60 et 95c, les optimums de ph entre 4,5 et 6,5. L'etude de la resistance a la denaturation thermique a montre que les 3 souches bi533, st552 et al662 possedaient un temps de demi-vie de pres d'une heure a 95c. La recherche des differents types d'activite amylolytique, leur production et leur localisation cellulaire ont permis de choisir une souche productrice d'activite -glucosidase. L'archeon hyperthermophile anaerobie thermococcus hydrothermalis al662, qui possede un materiel enzymatique complet pour l'hydrolyse de l'amidon, a ete retenu pour la suite de l'etude. Enzyme intracellulaire, la production d'-glucosidase de l'archeon al662 a ete optimisee avec le milieu bs contenant 4 g/l d'amidon, et maximisee avec les cultures en fermenteur, fournissant une activite de 16 u/l. La caracterisation de l'-glucosidase dans l'extrait brut a montre que l'enzyme avait une activite optimale a 110c et a ph 5,5 et presentait un temps de demi-vie de 2 h a 106c, en presence de 10% d'amidon. L'-glucosidase purifiee 261 fois a une masse molaire estimee a 57 kda par tamisage moleculaire. Comme l'-glucosidase de thermococcus hydrothermalis est capable de liberer du glucose en hydrolysant les liaisons -1,4 des oligosaccharides, l'enzyme a ete testee en synergie avec la termamyl 120l (novo nordisk) lors d'essais d'hydrolyse de l'amidon.

Les ADN topoisomérases sont des enzymes capables de moduler la torsion de la double hélice d’ADN afin de rendre compatible sa topologie avec les différents processus cellulaires impliquant l’ADN. Les hyperthermophiles possèdent au moins une topoisomérase particulière, la reverse gyrase qui est constituée à la fois d’un domaine topoisomérase IA etd’un domaine hélicase de type SF2. Mon sujet de thèse a eu pour objectif de déterminer principalement l’implication des ADN topoisomérases IA dans les différents processus cellulaires de Sulfolobus solfataricus. Ce crenarchaeon hyperthermophile possède, en plus, d’une ADN topoisomérase de type II (Topo VI), trois ADN-topoisomérases IA dont une « classique » (TopA) et deux reverse gyrases (TopR1 et TopR2). Notre approche a permis d’estimer, pour la première fois, le nombre de TopR1 et de TopR2 par cellule en fonction des différentes conditions testées. L’étude des variations quantitatives des ADN topoisomérases a clairement mis en évidence que TopR1 et TopR2 sont régulées différemment ce qui renforce l’hypothèse d’une spécialisation de leurs fonctions. Nous avons ainsi montré que TopR1 est responsable du maintien de l’homéostasie du surenroulement de l’ADN. Si la Topo VI de par son activité antagoniste est impliquée dansce même contrôle homéostatique, elle ne fait pas l’objet d’une régulation quantitative. De plus, nous avons mis en évidence que TopR1 était liée à la vie à haute température. Enfin, nos résultats suggèrent que TopR2 serait pour sa part impliquée dans la stabilité des génomes. L’identification des partenaires protéiques respectifs des quatre ADN topoisomérases de S. solfataricus permettra d’avoir une vision globale des réseaux de régulation permettant derésoudre les différentes des contraintes topologiques générées au cours de la vie de cet hyperthermophile<br>DNA topoisomerases act in all DNA metabolism processes to control the DNA topology. Hyperthermophiles possess at least a particular topoisomerase, the reverse gyrase composed of a DNA topoisomerase IA domain and a helicase SF2 domain within the same polypeptide. The general objective of my thesis was to determine the involvement of each DNA topoisomerase in different cellular processes of S. solfataricus. This hyperthermophilic crenarchaeon possesses in addition to a type II DNA topoisomerase (Topo VI), three DNA topoisomerases IA : a classical one (TopA) and two reverse gyrases (TopR1 and TopR2). Our experimental approach allowed to estimate for the first time the number of TopR1 and TopR2 per cell in relation to different conditions. The study of quantitative variations of each DNA topoisomerase clearly showed that TopR1 and TopR2 are differently regulated suggesting that they are involved in distinct cellular processes. Indeed, we showed that TopR1 is the main actor of the homeostatic control of the DNA supercoiling. If the Topo VI with its antogonistic activity is involved in this homeostatic control, there is no regulation at the level of protein quantity. In addition we evidenced that TopR1 is somehow linked to the life at high temperature. Our results suggest that TopR2 is involved in genome stability. The identification of the respective potential partners of the four DNA topoisomerases of S. solfataricus will allow to get a more detailed understanding of the DNA topology regulation during the hyperthermophilic life style

Les archées sont principalement connues pour leur capacité à croître et survivre dans des conditions extrêmes de température, pression, pH, etc. qui sont hostiles à l’homme. Néanmoins, il est désormais clair que les archées sont aussi présentes de manière ubiquitaire dans divers environnements. L’étude détaillée des différents aspects de la biologie de ces microorganismes a amené à des découvertes pour le moins inattendues comme celle de la virosphère associée aux archées qui est unique. En effet, plusieurs virus infectant les archées ont été isolés et présentent une incroyable diversité tant au niveau morphologique que génomique et ne ressemblent aucunement aux virus connus de bactéries ou d’eucaryotes. Récemment, l’analyse en détails du cycle viral a mis à jour de nouveaux mécanismes d’interactions avec la cellule hôte. Au cours de mes travaux de thèse, nous nous sommes intéressés aux systèmes virus-hôtes présents dans les milieux hyperthermiques et acidophiles en sélectionnant les virus fusiforme et filamenteux SSV1 et SIRV2 en tant que modèles d’étude. Tout d’abord, nous avons défini une nouvelle classification des virus fusiformes en basée sur l’analyse comparative des protéines structurales et des génomes viraux. L’ensemble des virus considérés forme un réseau global malgré le fait qu’ils ont été isolés dans des environnements distincts ; qu’ils infectent des hôtes qui sont distant phylogénétiquement parlant et que certains de leurs virions présentent une certaine pléomorphicité. Ensuite, la caractérisation en détails de l’architecture des virions fusiformes de SSV1 a révélé qu’ils étaient enveloppés, composés de protéines de capside glycosylées et contenaient le complexe nucléoprotéique. Finalement, nous nous sommes concentrés sur la manière dont les virus d’archées interagissent avec la cellule hôte. Alors que les virions de SIRV2 semblent utiliser une stratégie pour l’entrée qui est similaire aux bactériophages dits flagellotrophiques ; on observe que les virions de SSV1 emploient un mécanisme de sortie qui rappelle le bourgeonnement des virus eucaryotes enveloppés. L’ensemble de ces recherches participent à une meilleure compréhension de la biologie des archées ainsi que de leurs virus et permettent de définir des cibles intéressantes pour de futures études<br>Although, archaea were initially regarded as exotic microorganisms capable of growing in conditions which are hostile to humans, it became clear that they are ubiquitous and abundant in various environments. Detailed studies focusing on different aspects of archaeal biology have led to many unexpected discoveries, including the unique virosphere associated with archaea. Indeed, highly diverse viruses characterized by uncommon virion shapes and mysterious genomic contents have been isolated that typically do not resemble viruses of either bacteria or eukaryotes. Recent analysis of the sequential events of the viral cycle resulted in major breakthroughs in the field. In the framework of my PhD studies, I have focused on two model hyperthermo-acidophilic virus-host systems, the spindle-shaped SSV1 and rod-shaped SIRV2, both infecting organisms of the genus Sulfolobus. Initially, we defined structure-based lineages for all known spindle-shaped viruses isolated from highly divergent hosts and residing in very different environments. Then, we provided insights into the architecture of spindle-shaped viruses by showing that SSV1 virions are composed of glycosylated structural proteins and contain a lipid envelope. Finally, we focused on virus-host interplay. Whereas SIRV2 virions appear to use a similar entry strategy as flagellotrophic bacteriophages, SSV1 virions employ an exit mechanism reminiscent of the budding of eukaryotic enveloped viruses. Collectively, these studies shed light on the biology of archaeal viruses and help to define interesting targets that should be the focus of intensive research in the next future

Kyoto University (京都大学)<br>0048<br>新制・課程博士<br>博士(農学)<br>甲第19034号<br>農博第2112号<br>新制||農||1031(附属図書館)<br>学位論文||H27||N4916(農学部図書室)<br>31985<br>京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻<br>(主査)教授 左子 芳彦, 教授 澤山 茂樹, 准教授 吉田 天士<br>学位規則第4条第1項該当