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Dissertations / Theses on the topic 'ARN polymérase'
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Fantapie, Séverine. "Caractérisation du rôle de la polymérase translésionnelle REV1 dans les cellules humaines." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA11T038.
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Motard, Julie. "Sélection de promoteurs ARN reconnus par l'ARN polymérase de Escherichia coli." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2007. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/3928.
Full textAbstract:
Les viroïdes sont de petits ARN circulaires simple brin qui infectent les plantes supérieures, causant ainsi d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Ces ARN ne sont pas encapsidés, ne possèdent pas de région codante et se répliquent de façon presque autonome par un mécanisme en cercle roulant. La seule étape du cycle de vie des viroïdes qui requiert la machinerie de l'hôte est la polymérisation de l'ARN. Par ailleurs, cette étape est certainement la moins bien connue, particulièrement chez le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Le but de ce travail est de découvrir des séquences importantes pour l'initiation de la réplication d'une molécule modèle d'ARN inspirée du PLMVd. Un protocole de sélection de promoteur en ARN a d'abord été mis au point. Dans ce type de protocole, des étapes pertinemment désignées s'enchaînent sous forme de cycles afin de sélectionner une molécule d'intérêt. Toutes les étapes constituant le complexe protocole ont été testées avec un témoin positif, basé sur une région minimale du PLMVd connue pour initier la réplication in vitro. Cette molécule a servi à la vérification et à l'optimisation individuelles des nombreuses étapes. Ce protocole amélioré a ensuite été utilisé pour sélectionner des molécules reconnues par l'ARNP d' E. coli à partir d'une population aléatoire d'ARN. Cette sélection a permis l'isolement de plusieurs variants qui ont rapidement montré des ressemblances en terme de séquence primaire au cours des cycles de sélection. En effet, sur trente positions aléatoires, une boite de six nucléotides (CAGACG) se retrouvant à divers endroits est apparue au quatrième cycle puis a été retrouvée presque intégralement dans toutes les séquences à partir du cinquième cycle. Une investigation sur cette boîte a mis en évidence une analogie avec une séquence retrouvée près du site d'initiation in vivo du PLMVd ainsi qu'avec des produits de sélection pour un promoteur ADN simple brin. Ceci semble pointer vers des éléments impliqués dans la réplication dépendante de l'ARN polymérase d'E. coli . L'effet de la boîte conservée CAGACG sur la réplication a été étudié. Le patron de réplication de molécules dont la boite a été modifiée (délétion ou modification) est distinct de celui de la molécule originale. Aussi, l'analyse de la séquence des petits ARN (pARN) produits lors de la réplication révèle l'implication des 6 nt pour fixer l'initiation de la polymérisation. En conclusion, ces résultats s'ajoutent aux évidences qui mèneront vers la découverte des séquences nécessaires à la réplication d'une molécule modèle d'ARN, autant in vitro (reconstitution d'un monde ARN) que in vivo (dans les viroïdes).
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Jourdain, Sabine. "Etude fonctionnelle de la sous-unité de 95kDa du facteur de transcription TFIIIC chez "Saccharomyces cerevisiae"." Paris 11, 2001. http://www.theses.fr/2001PA112306.
Full textAbstract:
Chez les organismes eucaryotes, le complexe ARN polymérase III synthétise les ARNs de transfert, l'ARN ribosomal 5S et d'autres petits ARNs. Lors de l'initiation de la transcription des gènes d'ARNt, le facteur TFIIIC se fixe d'abord au niveau des séquences promotrices intragéniques A et B. Puis il recrute le facteur TFIIIB en amont du site initiateur. Enfin, le facteur TFIIIB recrute l'ARN polymérase III et active le démarrage de la transcription. Le facteur TFIIIC contient six sous-unités organisées en deux domaines globulaires tA et tB, qui se lient respectivement aux boîtes promotrices A et B. Le domaine tB se lie fortement à la boîte B et permet l'ancrage du facteur TFIIIC à l'ADN. Le domaine TA se lie plus faiblement à la boîte A, et permet le recrutement du facteur TFIIIB. La sous-unité t95 (codée par le gène TFC1) est localisée au sein du domaine tA. Pour étudier son rôle, nous avons effectué la mutagenèse de la partie du gène TFC1 qui code pour une région très conservée de la protéine (domaines D et E). .In eukaryotic organisms, RNA polymerase III is responsible for synthesis of transfert RNAs, 5S ribosomal RNA and other small RNAs. Initiation of transcription involves a multistep assembly of transcription factors: TFIIIC binds first to intragenic promoter sequences, it then recruits TFIIIB which in turn recruits RNA polymerase III. TFIIIC is a six subunits factor organized in two large globular domains named tA and tB that respectively bind block A and block B tRNA genes promoter elements. TB-block B binding is very strong and is responsible for TFIIIC-DNA stable anchoring, while tA-block A binding is weak and allows TFIIIB recruitment. The t95 subunit (encoded by TFC1 gene) belongs to the tA domain. We performed mutagenesis of the TFC1 gene segment that encodes a well-conserved region of t95 protein. We obtained a punctual thermosensitive mutant (E447K) and we studied the biochemical properties of mutant TFIIIC factor containing the t95-E447K subunit. .
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Checroun, Claire. "Etude des mécanismes de reconnaissance des promoteurs par l'ARN polymérase EsigmaS chez Escherichia coli." Toulouse 3, 2004. http://www.theses.fr/2004TOU30089.
Full textAbstract:
Parmi les 7 facteurs sigma de l'ARN polymérase (ARNP) d'E. Coli, sS, responsable de l'induction des gènes à l'entrée en phase stationnaire et en réponse générale au stress, est le plus homologue au facteur s70. Les séquences optimales pour la reconnaissance par ces deux facteurs sont pratiquement identiques et de nombreux promoteurs sont reconnus à la fois par les deux formes d'ARNP. L'objectif de ce travail a été de comprendre comment fonctionne sS, et les bases de sa spécificité. Une approche par suppresseurs nous a permis d'identifier des résidus cruciaux pour l'initiation de la transcription par EsS, et l'analyse des variants obtenus nous a amené à proposer l'existence d'au moins deux mécanismes de reconnaissance dépendant de l'oragnisation intrinsèque des promoteurs. L'existence de ces deux mécanismes pourrait apporter un niveau de régulation supplémentaire de l'expression des gènes et permettre une expression différée et /ou plus moins forte selon le mécanisme mis en jeuThe sS subunit of the RNA polymerase of d'E. Coli is required for the induction of genes in response to stressful conditions and in poor conditions of growth. Its targets largely overlap with those of s70 but despite the fact that sS and s70 recognize almost identical consensus sequences, many promoters are specifically transcribed by EsS in vivo. The sequence elements involved in selectivity of transcription initiation by EsS or Es70 are still unclear. The order to better understand what makes a promoter sS-dependent. A suppressor approach has allowed us to identify positions involved in transcription initiation by EsS. A further analysis of the variants obtained has led us to propose that EsS can recognize promoters by at least two different mechanisms, according to the promoter organization. This dual behavior of sS could offer the cell an additional regulation level of gene expression
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Douet, Julien. "ADN ribosomique 5S chez Arabidopsis thaliana : dynamique chromatinienne et ARN polymérase IV." Phd thesis, Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00731526.
Full textAbstract:
Chez Arabidopsis thaliana, Les gènes d'ARN 5S sont regroupés en blocs situés dans l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. La transcription des gènes d'ARN 5S est régulée par des facteurs épigénétiques altérant notamment leur structure chromatinienne. Une étude a été menée durant les premières étapes du développement post-germinatif pour identifier les évènements et des facteurs conduisant à l'élaboration de telles structures. Nous avons pu observer une décompaction de l'ADNr 5S immédiatement suivie d'une recondensation. Ces phénomènes impliquent respectivement ROS 1 et l'ARN polymérase IV. L'étude des formes Pol IVa et Pol IVb nous indique que Pol IVb, en plus de son activité partenaire de Pol IVa, possède une action spécifique dédiée au locus d'ADNr 5S du chromosome 4. Cette nouvelle activité de Pol IVb, qui est indispensable au silencing et à la compaction de ce locus, semble indépendante de la voie classique de méthylation de l'ADN dépendante des ARN.
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Bussetta, Cécile. "Etudes structurales de la polymérase du virus de l'hépatite C." Aix-Marseille 2, 2007. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2007AIX22106.pdf.
Full textAbstract:
L’infection chronique par le Virus de l’Hépatite C (VHC) est à l’origine de la majorité des cirrhoses et cancers du foie. Les polymérases sont des cibles privilégiées pour des molécules antivirales. Tout d'abord, nous avons développé une méthode de recherche de nouveaux inhibiteurs à faible coût par criblage in silico. Puis, en absence de données structurales sur le complexe de réplication, j'ai construit des modèles, outils cruciaux pour la compréhension de données biochimiques. De plus, j'ai mis au point un protocole de cristallisation aboutissant à la résolution de la structure de la polymérase du VHC (VHCpol). Ceci constitue la base de l'obtention de structures de complexes avec des inhibiteurs ou substrats. En parallèle, nous avons mené la première étude structurale de VHCpol en solution par l'utilisation combinée du SAXS, de la cristallographie et de l'analyse des modes normaux. Ainsi, nous avons montré l'état dimérique et la flexibilité de VHCpol en solution au niveau atomiqueThe Hepatitis C virus (HCV) infection is responsible of acute and chronic hepatitis that may lead to cirrhosis and liver cancer. The HCV polymerase (HCV-pol) is an important target for antiviral therapies. First, we develop a screening method to search new inhibitors. Then, in absence of structural data on the replication complex, we report 3D models that are important for the interpretation of biochemical data. Moreover, I develop a crystallization protocol leading to the resolution of HCV-pol structure. It constitutes the base to obtain complexes structures with substrates or inhibitors. In parallel, we carry through the first structural analysis of HCV-pol in solution, using Small Angle X-ray Scattering (SAXS) in combination with X-ray crystallography and Normal Mode Analysis. We could thus assess the dimeric state, the conformation and the flexibility of HCV-pol at the atomic scale and propose a structural model of HCV-pol in solution
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Perreau-Morillon, Pauline. "Identification et caractérisation d'une protéine comme inhibiteur général de la transcription réalisée par l’ARN Polymérase III humaine." Thesis, Bordeaux 2, 2009. http://www.theses.fr/2009BOR21664.
Full text
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Bellecave, Pantxika. "Sélection et caractérisation d'aptamères inhibiteurs de l'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'hépatite C." Bordeaux 2, 2005. http://www.theses.fr/2005BOR21289.
Full textAbstract:
L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique. Le traitement actuel n'étant efficace que dans 50 % des cas, le développement de nouveaux traitements anti-VHC est nécessaire. L'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) du VHC est une cible de choix puisqu'elle est nécessaire à la réplication du virus. En utilisant une stratégie combinatoire (SELEX), nous avons sélectionné des aptamères ADN se fixant à la RdRp du VHC. Parmi ces aptamères, 3 présentaient un effet inhibiteur sur la réplication in vitro. Pour 2 d'entre eux, la capacité à se fixer et à inhiber la RdRp a été associée à leur région variable. Ces 2 aptamères, qui présentent des structures secondaires différentes, inhibent spécifiquement la RdRp du VHC par des mécanismes distincts : alors que l'un inhibe l'élongation de la synthèse d'ARN, l'autre agit principalement sur l'initiation. Leur effet sur la réplication dans un contexte cellulaire a aussi été étudié dans le système répliconHepatitis C (HCV) infection is a major health problem worldwide. The current therapy is not effective for half of treated patients thus, the development of new and specific drugs are urgently needed. Among the viral functions essential for viral replication, one of the most attractive targets for the development of drugs is the RNA dependant RNA polymerase (RdRp). Using a combinatorial approach (SELEX), DNA aptamers which bind specifically the HCV RdRp were selected. Three of these aptamers are able to inhibit the RNA synthesis in vitro. The binding and the inhibitory potential of 2 of these aptamers were associated with the random region. These aptamers, which display different secondary structures, inhibit specifically HCV RdRp by 2 distinct mechanisms : one is able to inhibit elongation whereas the other acts predominantly on initiation. The effect of the aptamers on HCV replication in a cellular context was studied with replicon system
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Bligny, Muriel. "Caractérisation d'une ARN polymérase d'origine nuléaire (NEP) dans les plastes d'épinard." Université Joseph Fourier (Grenoble), 1999. http://www.theses.fr/1999GRE10055.
Full textAbstract:
Nous avons aborde la caracterisation du systeme transcriptionnel plastidial nep grace a une approche in vitro utilisant le promoteur de l'operon plastidial rrn, pc, et des extraits plastidiaux contenant la nep. Dans un premier temps, nous avons verifie que le promoteur pc, utilise dans les chloroplastes d'epinard, est un promoteur nep. Nous avons ensuite separe et caracterise trois activites transcriptionnelles a partir d'extraits chloroplastiques d'epinard partiellement purifies, et en grande partie grace a la mise au point d'un systeme de transcription in vitro. La premiere correspond a la pep. La seconde, appelee nep-2, reconnait le promoteur pc in vitro et la troisieme, ou nep-1, pourrait etre une arnp de 110 kda de type phagique codee par un gene rpot. En ce qui concerne la nep-2, nous avons observe qu'elle n'est pas inhibee par la tagetitoxine tandis qu'elle l'est partiellement par la rifampicine a une concentration elevee d'une part, et d'autre part, qu'elle semble reconnaitre le promoteur t7. Nous en avons deduit que la nep-2 est probablement une arnp de type phagique. Le fait que la nep-1 pourrait elle aussi etre une arnp de type phagique resulte des observations suivantes : elle est reconnue par un anticorps dirige contre une proteine deduite d'un gene rpot, son poids moleculaire apparent est de 110-120 kda et le test alpa montre qu'elle a les proprietes d'une arnp. Ainsi, non pas une, mais deux arnps de type phagique pourraient partager la transcription du genome plastidial avec la pep ! enfin, nous avons demontre que cdf2 est un facteur d'initiation de la transcription conferant a la nep-2 la capacite de reconnaitre specifiquement le promoteur pc.
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Cerutti, Elena. "Nucleotide Excision Repair at the crossroad with transcription." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1057.
Full textAbstract:
L’intégrité de l’ADN est continuellement remise en question par divers agents endogènes et exogènes (p. ex., la lumière ultraviolette, la fumée de cigarette, la pollution de l’environnement, les dommages oxydatifs, etc.) qui causent des lésions de l’ADN qui interfèrent avec les fonctions cellulaires correctes. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) supprime les adduits d’ADN déformantes l’hélice tels que les lésions induites par les UV et il existe dans deux sous voies distinctes selon l’endroit où les lésions de l’ADN sont situées dans le génome. L’une de ces sous voies est directement liée à la transcription de l’ADN (TCR) par l’ARN Polymérase 2 (ARNP2). Dans la première partie de ce travail, nous avons démontré qu’un mécanisme NER entièrement compétent est également nécessaire pour la réparation de l’ADN ribosomique (ADNr), transcrite par ARN Polymérase 1 (ARNP1) et représentant 60 % de la transcription cellulaire totale. De plus, nous avons identifié et clarifié le mécanisme de deux protéines responsables du repositionnement nucléolaire dépendant des UV de l’ARNP1 et de l’ADNr observé pendant la réparation. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié la fonctionne moléculaire de la protéine XAB2 lors de la réparation NER et nous avons démontré son implication dans le processus TCR. De plus, nous avons également montré la présence de XAB2 dans un complexe d’épissage du pré-ARNm. Enfin, nous avons décrit l’impact de XAB2 sur la mobilité de l’ARNP2 lors des premières étapes de la réparation TCR, suggérant ainsi un rôle de XAB2 dans le processus de reconnaissance des lésionsThe integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process
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Devert, Anthony. "Etude des ARN Polymérases ARN-dépendantes impliquées dans le RNA silencing." Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22086.
Full textAbstract:
Ce travail de thèse porte sur l’étude des ARN polymérases ARN dépendant impliquées dans le RNA silencing chez Arabidopsis thaliana. Durant ma thèse, la recherche d'interacteurs des RDR, parmi des protéines impliquées dans le RNA silencing, a permis la détection d'interaction entre RDR6 et SDE3, RDR6 et SGS3, mais aussi entre SDE3 et SGS3 en Co-IP et BiFC. Une co-localisation de ces protéines a été observée lorsqu'elles sont produites transitoirement dans des cellules épidermales de N. benthamiana.Un crible d’une banque d’ADNc d’A. thaliana par double hybride de levure, a permis d’isoler des interacteurs potentiels de RDR6. Deux interacteurs potentiels, AtUAP56-1 et U2B’’, sont impliqués dans l’épissage des précurseurs des ARNm. Un effet sur le RNA silencing dans des mutants de l’épissage en 3’ des ARNm était connu et nous avons confirmé l’interaction entre RDR6 et AtUAP56-1 par BiFC. L’étude de lignées mutantes pour AtUAP56-1 a donc été initiée.Une étude biochimique de RDR6 et de RDR2 a été réalisée. Des formes recombinantes de RDR2 et RDR6 ont été produites de façon transitoire dans des feuilles de N. benthamiana, et une étude comparative de RDR2 et RDR6 a été réalisée. Les deux RDR sont actives sur des matrices ARN et ADN, et montrent in vitro une activité amorce-indépendante. De plus, nous avons détecté pour la première fois une activité amorce-dépendante de RDR6 et RDR2. Ces résultats apportent de nouvelles données biochimiques qui sont en accord avec les études menées in vivo et enrichissent les modèles actuels du RNA silencingThe aim of this work was to study RNA-dependent RNA polymerases involved in RNA silencing in Arabidopsis thaliana. During my thesis, the search for RDR interactors among proteins involved in RNA silencing allowed the detection of interactions between RDR6 and SDE3, RDR6 and SGS3, and also between SDE3 and SGS3 using Co-IP and BiFC. In addition, the co-localisation of these proteins was observed when produced transiently in epidermal cells of N. Benthamiana.A screen of an A. thaliana cDNA library by yeast two hybrid allowed us to identify some putative new RDR6 interactors. Two putative RDR6 interactors, AtUAP56 and U2B’’, are known to be involved in pre-miRNA splicing. Furthermore, a link between pre-mRNA 3’ splicing and RNA silencing was previously reported. We also confirmed the interaction between AtUAP56-1 and RDR6 by BiFC. An investigation of A. thaliana of AtUAP56-1 mutants has been initiated.Recombinant RDRs were produced transiently in N. Benthamiana, and a biochemical comparative study of RDR2 and RDR6 performed. We found that RDR2, like RDR6, has a de novo polymerase activity on DNA and RNA templates, and for both RDRs we also showed, for the first time, a primer-dependant synthesis of dsRNA from RNA template. These findings provide important new insights into our understanding of the molecular mechanisms of RNA silencing amplification in Arabidopsis
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Berger, Axel Bernhard. "Quantitative and functional analysis of chromosome dynamics : influence of the nucleolus on the regulation of gene expression." Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112226.
Full textAbstract:
Au sein du noyau des cellules eucaryotes, la chromatine, support de l’information génétique, n’est pas distribuée de façon aléatoire. Son organisation spatiale est étroitement liée aux métabolismes nucléaires, tels que la réplication de l’ADN, la réparation ou la transcription. J’ai étudié la protéine Hmo1, une protéine à boîte HMG de la levure. Grâce à un crible génétique, nous avons pu mettre en évidence que Hmo1 est connecté à l’ARN polymérase (Pol) I, aux gènes codant pour des protéines ribosomiques (RPG), ainsi que aux gènes impliqués dans la réponse aux stress. J’ai pu montrer que Hmo1 interagit physiquement avec la région transcrite de l’ADN ribosomique et avec des promoteurs de RPG. De plus, un mutant hmo1-delta perd la capacité de répression de la transcription des RPG après une inhibition de la voie TORC1. Ca indique que Hmo1 est impliquée dans la régulation de la transcription par la Pol I, ainsi que la régulation de l’expression des RPG par des voies de transduction du signal comme la voie TORC1. Hmo1 étant une protéine nucléolaire, nous avons émis l’hypothèse d’une transcription péri-nucléolaire des RPG chez la levure. Après analyse de plusieurs milliers de cellules, nous avons pu démontrer que, au sein d’une population cellulaire, les gènes sont confinés dans des sous-volumes nucléaires appelés ‘territoires géniques’. Ces derniers ne sont pas distribués de façon aléatoire, pour certains gènes au moins, peuvent être remodelés en fonction de l’activité transcriptionnelle. La localisation de gènes nécessaires à la biogenèse du ribosome, tels que les RPG, semble influencée par leur distance génétique au centromèreChromatin is distributed non-randomly within the cell nucleus. Its spatial organization has been demonstrated to be important for nuclear metabolism such as, DNA replication, reparation or transcription. I studied the budding yeast HMG-box protein Hmo1. A screen demonstrated that this chromatin-associated protein is genetically linked to the RNA polymerase (Pol) I, to genes coding for ribosomal proteins (RPGs) as well as to genes implicated in stress response. I could show that Hmo1 physically interacts with the rRNA coding gene transcribed by Pol I and with a subset of RPG promoters. Global expression analyses showed a clear dependence on Hmo1 for the expression of a sub-set of RPGs. An hmo1 deletion strain is also largely alleviated in repressing RPG transcription after TOR complex 1 inhibition. These results suggested that Hmo1 is implicated in Pol I transcription as well as RPG regulation. Since Hmo1 is a bona fide nucleolar factor, we wanted to test if Pol II transcribed RPGs associated with Hmo1 are localized in the proximity of the nucleolus. We first developed a new method allowing determination of gene localization probabilities with very high accuracy and with respect to the nucleolus. We could demonstrate by analyzing thousands of cells, that genes are confined into sub-nuclear volumes. These ‘gene territories’ show a locus specific size and can be remodeled upon transcriptional activation. Applying this new method to Pol II transcribed genes required for ribosome biogenesis, such as the RPGs, indicates that the localization of the gene on the chromatin fiber has important implications for its three dimensional positioning
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Thomen, Philippe. "Transcription par une ARN polymérase : mesures de forces à l'échelle de la molécule unique." Paris 6, 2002. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011391.
Full text
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Carradec, Quentin. "Mécanismes et fonctions de la voie d'ARN interférence induite par ARN double brin chez Paramecium tetraurelia." Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066161/document.
Full textAbstract:
Le cilié Paramecium tetraurelia est un modèle intéressant pour l'étude de la diversité et de l'évolution des voies d'ARN interférence (ARNi) chez les eucaryotes. L'une des voies d'ARNi végétatives peut être induite en nourrissant les paramécies de bactéries produisant un ARN double-brin (ARNdb) homologue à un gène donné, dont l'expression est inactivée de manière post-transcriptionnelle par la production de siARN de 23 nt. Un crible de mutagénèse a permis d'obtenir des mutants mendéliens déficients pour l'ARNi, dont les génomes ont été séquencés afin d'identifier sans a priori des gènes impliqués dans cette voie. 6 gènes ont été identifiés: un Dicer, deux ARN polymérases ARN-dépendantes (RDR1 et 2), une nucléotidyl-transférase (CID1) et deux gènes codant de nouvelles protéines (PDS1 et 2). Pour étudier leur rôle dans la biosynthèse ou l'action des siARN, ces derniers ont été séquencés à partir de cellules sauvages ou mutantes, nourries d'un ARNdb homologue à un gène non essentiel. L'analyse bio-informatique a montré que des siARN dits 'primaires' sont produits à partir de l'ARNdb bactérien, tandis que des siARN dits 'secondaires' sont produits à partir de la totalité de l'ARNm endogène ciblé, et sont majoritairement de polarité anti-sens. Alors que la production des siARN primaires dépend de tous les gènes étudiés, les résultats n'impliquent que RDR2 dans celle des siARN secondaires. Enfin, j'ai montré que certains clusters de siARN endogènes dépendent de RDR1 et de CID1, tandis que d'autres dépendent de RDR2. La paramécie produit également des siARN antisens aux ARN ribosomaux bactériens, suggérant de nouvelles hypothèses quant à la fonction naturelle de cette voieThe ciliate Paramecium tetraurelia is an interesting model to study the diversity and evolution of RNA interference (RNAi) pathways. One of the vegetative RNAi pathways is induced by feeding cells with bacteria producing double-stranded RNA (dsRNA) homologous to a given gene, which is then post-transcriptionally silenced through the production of 23-nt siRNAs. A forward genetic screen allowed us to obtain Mendelian mutants deficient in dsRNA-induced RNAi, and mutated genes were identified by whole-genome resequencing. 6 genes were identified: one Dicer, two RNA-dependent RNA polymerases (RDR1 et 2), one nucleotidyl-transferase (CID1) and two genes encoding novel poteins (PDS1 and 2). To study their roles in siRNA biosynthesis or action, we sequenced small RNAs from wild-type or mutants cells fed with a dsRNA homologous to a non-essential endogenous gene. Bioinformatic analyses showed that 'primary' siRNAs are produced from the bacterial dsRNA trigger, while 'secondary' siRNAs, predominantly of antisense polarity, are produced from the whole length of the targeted endogenous mRNA. While primary siRNA production requires all of the genes studied, the results only implicate RDR2 in the production of secondary siRNAs. Finally, I showed that some clusters of endogenous siRNAs depend on RDR1 and CID1, whereas others depend on RDR2. Paramecium was also shown to produce siRNAs that are antisense to bacterial ribosomal RNAs, suggesting new hypotheses about the possible natural functions of this pathway
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Imbert, Emmanuelle. "Interactions de dérivés phosphoryles du polystyrène avec les facteurs de transcription de l'ARN polymérase II." Paris 13, 1995. http://www.theses.fr/1995PA132003.
Full textAbstract:
Des travaux antérieurs ont montré que des dérivés phosphorylés du polystyrene présentent un caractere antigénique analogue à celui de l'ADN vis à vis d'anticorps anti-ADN du lupus érythémateux disseminé. Ces polymères, susceptibles d'interagir avec d'autres protéines de liaison a l'ADN, ont été étudiés pour leurs interactions avec les facteurs de transcription de l'ARN polymérase ii (ft-arn pol. II). Ces derniers se lient à l'ADN, et jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'expression des genes. Nous avons procèdé à la synthèse de polystyrène sulfamide d'éthanolaminé phosphoryle à différents taux. La caractérisation de ces résines par dosage acidimétrique, met en évidence la présence de groupements phosphomono- et diesters, dont les proportions varient avec le taux de phosphorylation. L'utilisation de simulation numérique basée sur la méthode Monte-Carlo, permet de modéliser la fonctionnalisation du polystyrène. Les simulations indiquent l'effet des proches voisins dans la réaction de phosphorylation, notamment l'impossibilité de substituer deux phosphodiesters adjacents sur la chaine macromoléculaire. Nous avons mis en évidence que les ft-arn pol. II contenus dans des extraits nucléaires de cellules HeLa, présentent des affinités variables pour les résines phosphorylées. Tous les FT-ARN pol. II présentent un maximum d'affinité pour un taux de phosphorylation voisin de 20%. De plus, nous avons montré que les FT-ARN pol. II désorbés des resines gardent leur activité biologique puisqu'ils sont capables d'initier la transcription in vitro. Enfin, nous avons déterminé par simulation numérique, la séquence probable du site d'interaction des FT-ARN pol. Ii sur le dérivé phosphoryle à 20%. Cette séquence correspond à la réplique synthétique de la position des phosphodiesters extrêmes du grand et du petit sillons, équivalent à un tour d'hélice d'ADN. Nous avons donc proposé un modèle d'intéraction des FT-ARN pol. II avec les séquences ADN-LIKE présentes sur les dérivés phosphoryles du polystyrène, lui permettant d'intéragir spécifiquement avec des protéines de liaison à l'ADN
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Swale, Christopher. "RNA binding and assembly of human influenza A virus polymerases." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV053/document.
Full textAbstract:
Le virus de la grippe A est un virus à ARN négatif appartenant à la famille des Orthomyxoviriadea dont la réplication se produit dans le noyau des cellules infectées. L'organisation du génome est segmentée en huit segments d'ARNv de polarité négative, codant pour un minimum de 16 protéines virales différentes. Ces ARN viraux (ARNv) sont en complexe avec de nombreuses copies de nucléoprotéines et liés par leurs extrémités 5' et 3' au complexe hétérotrimérique de l'ARN-polymérase ARN-dépendante composé des sous unités PA, PB1 et PB2. Cet assemblage macromoléculaire (ARNv / polymérase / NP) nommée Ribonucléoprotéine (RNP) constitue une entité génomique indépendante. Dans le contexte de la RNP, l'ARN-polymérase assure à la fois la transcription et la réplication du génome ARNv. En assurant ces deux fonctions, l'ARN-polymérase joue un rôle majeur dans la réplication virale et constitue une cible antivirale privilégiée. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse se concentrent sur les éléments structuraux participants à l'assemblage de l'ARN polymérase et son interaction avec les avec les ARNv. Pour atteindre ces objectifs, notre laboratoire, en collaboration avec d'autres groupes, a mis en place un système d'expression en polyprotéines permettant d'exprimer la polymérase. Plus encore, cette méthode a aussi permis de reconstituer des complexes entre l'ARN-polymérase et des partenaires cellulaires, notamment RanBP5 qui appartient à la famille des importines-βInfluenza A virus is a negative-strand RNA virus belonging to the Orthomyxoviriadea family whose replication occurs in the nucleus of infected cells. The genome organisation of influenza virus is segmented in eight vRNA segments of negative polarity coding for at least 16 different viral proteins. Each vRNA is bound to multiple copies of nucleoprotein (NP) and to the heterotrimeric RNA-dependent RNA-polymerase complex (PA, PB1 and PB2) through its 5' and 3' extremities. This macromolecular assembly (vRNA/polymerase/NP) forms the ribonucleoprotein (RNP) particle, which acts as a separate genomic entity within the virion. The RNP complex is at the core of viral replication and in the context of RNPs, the polymerase performs both transcription and replication of the vRNA genome. As such, the polymerase constitutes a major antiviral drug target. The research work presented within this thesis focuses on the underlying determinants of the RNA polymerase assembly process and its interaction with its vRNA genome. To fulfill these goals, our lab, in collaboration with other groups, has set up a novel polyprotein expression system to express the polymerase but also to reconstitute polymerase and cellular partner complexes, notably RanBP5, which belongs to the importin-β family
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Egloff, Sylvain. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de la ribonucléoparticule 7SK chez les eucaryotes supérieurs." Toulouse 3, 2005. http://www.theses.fr/2005TOU30143.
Full textAbstract:
In eucaryotic cells, the positive transcription elongation factor b (P-TEFb) stimulates elongation of transcription by phosphorylating the carboxy-terminal domain of the largest subunit of RNA polymerase II (pol II), allowing synthesis of full-length messenger RNAs. 7SK small nuclear RNA (snRNA), together with HEXIM proteins, functions as a regulator of P-TEFb by inhibiting its protein kinase activity. 7SK snRNA interacts with both P-TEFb and HEXIM1 and thereby, sequesters P-TEFb into a large kinase-inactive complex. We identified the functionally important elements of human 7SK snRNA required for in vivo binding of HEXIM1 and P-TEFb. We demonstrated that binding of HEXIM1 is directed by an element located in the 5'-terminal hairpin of 7SK snRNA. In contrast, two distinct regions, the 5'-terminal hairpin and the short 3'-terminal hairpin, are required for recruitment of P-TEFb. A minimal 7SK snRNA, carrying all the elements important for binding of HEXIM and P-TEFb, can inhibit pol II transcription in HeLa cells. Thus, we identified all the elements of 7SK snRNA necessary for inhibition of transcription elongation by pol II in living cells. In HeLa cells, roughly half of P-TEFb is sequestered in an inactive state within the 7SK snRNA. However, this population of P-TEFb can be rapidly dissociated from 7SK upon treatment of cells with stress-inducing agents. We identified an internal hairpin region of 7SK snRNA that seems to be important for the release of P-TEFb from 7SK. Finally, we purified and identified new proteins that could be part of the 7SK ribonucleoparticle.
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Bouchoux, Céline. "Etude de Ctk1, une CTD kinase impliquée dans la transcription par l'ARN polymérase I chez saccharomyces cerevisiae." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066440.
Full text
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Hazoumé, Adonis. "Contribution à l’étude de l’ARN polymérase II de Plasmodium falciparum." Strasbourg 1, 2008. https://publication-theses.unistra.fr/restreint/theses_doctorat/2008/HAZOUME_Adonis_2008.pdf.
Full textAbstract:
L’ARN polymérase II de Plasmodium falciparum, parasite responsable de la forme la plus grave du paludisme, catalyse la transcription des gènes codant les protéines. Nous avons identifié, dans le génome de cet eucaryote apicomplexe, des séquences codant potentiellement les douze sous-unités de l’enzyme parasitaire. Ces séquences ont été clonées par reconstitution génique. Nous avons caractérisé génétiquement l’ARN polymérase II de Plasmodium falciparum en réalisant des tests de complémentation fonctionnelle des sous-unités de ce complexe enzymatique. Nos résultats indiquent que les sous-unités PfRPB4-5-7-9 et 12 codent des protéines capables de remplacer leurs homologues chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces sous-unités sont bien des orthologues des protéines de levure. De fait, nous avons construit des lignées de levures exprimant de façon stable des protéines de Plasmodium falciparum. Par ailleurs, Les sous-unités PfRPB3-6-8-10 et 11 ne complémentent pas. Nous avons construit des souches viables de levures dont le site de fixation de l’alpha-amanitine sur leur ARN polymérase II est «plasmodifié» ou «humanisé». Un crible de chimiothèque réalisé à l’aide de ces levures ne nous a pas permis d’identifier des molécules capables d’inhiber sélectivement les levures «plasmodifiées». Cependant nous avons mis au point un test cellulaire simple et dont la mise en oeuvre est aisée et permettra l’identification de molécules capables de bloquer l’activité transcriptionnelle de l’enzyme du parasite. De telles drogues constitueront le point de départ vers la mise au point d’une nouvelle classe d’antipaludiques. Enfin, des expériences de double hybride chez la levure ont permis de montrer que la sous-unité hRPB11a de l’ARN polymérase II humaine, contrairement à son homologue de levure, est capable former un homodimère. Ceci est confirmé par des profils de diffraction, à une résolution de 3,4 Å, de cristaux de hRPB11. Ces derniers résultats constituent une contribution importante aux efforts de la communauté scientifique pour l’élucidation de la structure tridimensionnelle de l’ARN polymérase II humaineThe parasite Plasmodium falciparum is the causative agent of the most burdensome form of human malaria. His RNA polymerase II (RNAPII) is responsible for transcription of protein coding genes. The sequencing of the full genome of the parasite enabled us to recover a complete set of genes sequences encoding the putative RNAPII subunits of the parasite. We have cloned those subunits by genetic reconstitution. We investigated the functional conservation of the Plasmodium RNAPII subunits using a genetic test in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The subunits PfRPB4-5-7-9 and 12 can complement defective yeast mutants. Those results demonstrate that those subunits are orthologs of yeast conterparts. We establish then some stable yeast strains expressing Plasmodium proteins. No interspecific complementation was observed for the subunits PfRPB3-6-8-10-11. We construct viable yeast strain where the residus implicated in the interaction of the mushrom toxin alpha-amanitin where substituted by their homologs in Plasmodium and human. We screen those strains with a chemical compounds library. We don’t find any drug enable to distinguish the modified strains from wild-type one. But this screen, consisting in a simple cellular test and easy to perform, could permit to identify drugs that inhibit the transcriptional activity of the parasite enzyme. Those chemical compounds will the fist step towards the discovery of a potential new class of antimalarials drugs. In this work, we also study the human RNA polymerase II (RNAPII) hRPB11a subunit. We performed an interaction analysis using the two hybrid-system in yeast. The results confirmed that hRPB11a was indeed capable of interacting with itself. We were able to crystallise the purified hRPB11a subunit. The X-ray diffraction patterns at 3,4 Å resolution allows to infer the structure of an homodimer of the hRPB11a protein
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Muniz, Lisa. "Bases moléculaires de l'assemblage de la snRNP 7SK séquestrant P-TEFb et de son désassemblage par la protéine Tat du VIH-1." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/2408/.
Full textAbstract:
Le facteur positif d'élongation de la transcription P-TEFb est un facteur de transcription général, requis non seulement pour une expression efficace de la majorité des gènes codant des protéines, mais également pour la production de transcrits viraux pleine taille à partir du génome du VIH-1 intégré dans le génome de la cellule hôte. Composé de la kinase CDK9 et d'une cycline T associée, le complexe P-TEFb stimule l'élongation de la transcription en phosphorylant l'ARN polymérase II (ARN pol II), l'enzyme responsable de la synthèse de tous les ARN messagers de la cellule. L'activité du complexe P-TEFb est régulée négativement par sa séquestration réversible et dynamique au sein de la petite particule ribonucléoprotéique nucléaire 7SK (snRNP 7SK) par le petit ARN nucléaire 7SK (snARN 7SK), en coopération avec la protéine HEXIM. La snRNP 7SK contient également les protéines LARP7 et MePCE qui sont associées stablement au snARN 7SK et le stabilisent. La transcription initiée à partir du promoteur LTR (Long Terminal Repeat) du génome du VIH-1 intégré est régulée principalement à l'étape d'élongation. La processivité de la transcription du génome viral dépend de la protéine virale Tat qui recrute P-TEFb au niveau de l'ARN pol II. En plus de son rôle dans le recrutement de P-TEFb, la protéine Tat entraîne le désassemblage de la snRNP 7SK pour augmenter le niveau de P-TEFb actif dans les cellules infectées. Mes travaux de thèse ont visé à mieux définir comment la snRNP 7SK est assemblée et comment la protéine Tat du VIH-1 est capable de la désassembler. Nous avons démontré que la structure en tige-boucle située à l'extrémité 5' du snARN 7SK contient deux motifs de liaison pour les protéines HEXIM ; in vivo, ces deux motifs recrutent deux protéines HEXIM de manière interdépendante. Nous avons ensuite montré que Tat et HEXIM se lient au snARN 7SK de manière mutuellement exclusive. Tat remplace efficacement HEXIM sur le snARN 7SK in vivo permettant ainsi le désassemblage de la snRNP 7SK/HEXIM/P-TEFb pour augmenter le niveau de P-TEFb actif. Enfin, nous avons identifié les éléments du snARN 7SK impliqués dans la liaison des proteins LARP7 et MePCESynthesis of mRNAs by RNA Pol II is tightly controlled at the step of transcription elongation by the positive transcription elongation factor b (P-TEFb) that is a cyclin-dependent kinase composed of Cdk9 and cyclin T. P-TEFb is a general transcription factor that is required for efficient expression of most protein-coding genes as well as for production of full-length transcripts from the integrated HIV-1 genome. In human cells, about half of P-TEFb forms a kinase-inactive ribonucleoprotein (RNP) with the 7SK snRNA and the HEXIM, LARP7, and MePCE proteins. While LARP7 and MePCE bind stably to and provide stability for 7SK snRNA, P-TEFb and HEXIM show a dynamic, transcription-dependent association with 7SK snRNA. Transcription initiated from the long terminal repeat (LTR) promoter of the integrated HIV-1 genome is controlled predominantly at the level of elongation. The processivity of HIV transcription depends on the viral transactivator Tat that recruits P-TEFb to the RNA Pol II. Besides tethering P-TEFb to the RNA pol II, Tat also promotes the disassembly of the 7SK/HEXIM/P-TEFb snRNP to increase the nuclear level of active P-TEFb in infected cells. I focused my research on trying to understand how the 7SK snRNP is assembled and how the HIV-1 Tat protein is able to disrupt it. We have demonstrated that the 5' hairpin of 7SK contains two binding sites for the HEXIM protein; under in vivo conditions these two HEXIM binding sites of 7SK snRNA recruit two copies of HEXIM in a tightly interdependent manner. We then showed that Tat and HEXIM bind to the 7SK snRNA in a mutually exclusive manner. Tat efficiently replaces HEXIM1 on the 7SK RNA in vivo and therefore, it promotes the disassembly of the 7SK/HEXIM/P-TEFb negative transcriptional regulatory RNP to increase the nuclear level of active P-TEFb. Finally, we have identified the 7SK snRNA elements involved in the binding of the LARP7 and MePCE proteins
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Albert, Benjamin. "Étude de l'organisation spatiale de la transcription des gènes d'ADN ribosomiques." Toulouse 3, 2011. http://thesesups.ups-tlse.fr/1630/.
Full textAbstract:
La production des ARN ribosomaux (ARNr) est une étape fondamentale dans la biogenèse des ribosomes et la croissance cellulaire. Elle représente près de 60% de l'activité transcriptionnelle. Cette activité a lieu au sein du nucléole qui est une structure dynamique variant de volume selon la croissance, et conservée dans le monde eucaryote. La production des ARNr et la formation du nucléole sont entièrement dépendantes de l'activité d'un unique complexe multiprotéique : l'ARN polymérase I (ARN pol I). Au cours de ma thèse nous avons étudié le fonctionnement de l'ARN pol I chez la levure de bière S. Cerevisiae à différents niveaux allant du rôle des sous unités composant ce complexe multiprotéiques, à sa matrice d'ADN jusqu'à l'influence des gènes d'ADNr dans l'organisation tridimensionnelle du génome. Concernant l'étude des sous-unités de l'ARN pol I, nous avons focalisé notre attention sur le rôle de deux protéines qui sont spécifiques de l'ARN Pol I, c'est à dire qui n'ont pas d'équivalent dans les autres ARN pol eucaryote. Il s'agit de Rpa34 et de Rpa49. Le travail de Beckouet et al. En 2007, auquel nous avons participé, a permis de montrer que ces protéines forment un hétérodimère essentiel pour le bon fonctionnement de l'ARN pol I. Par la suite, nos donnés nous ont permis de montrer l'existence de contacts entre les ARN pol I en cours de transcription qui seraient abolis en absence de ces deux sous unités spécifiques. Ces contacts seraient déterminants pour assurer le bon fonctionnement de l'ARN pol I au cours de l'élongation et l'intégrité du nucléole. D'autre part, pour améliorer notre compréhension de la transcription par l'ARN pol I, nous avons également étudié les gènes d'ADN ribosomiques constituant la matrice ADN de l'ARN pol I. Nous avons centré notre étude autour de la fonction d'une protéine HMG retrouvée sur ces régions. Ainsi, nous avons proposé que cette protéine Hmo1 serait un facteur d'élongation de l'ARN polymérase I conservé chez les eucaryotes qui permettrait de modifier la structure chromatinienne des gènes d'ADNr sous une forme favorable à la transcription. De plus, nous avons apporté de nouveaux éléments concernant la structure et la composition protéique des gènes d'ADNr qui ont été discutés dans une revue publiée au cours de cette thèse. Enfin, nous avons essayé de comprendre comment s'organise le chromosome qui contient ces régions les plus transcrites du génome, les gènes d'ADNr. Ainsi, nous avons étudié l'organisation du chromosome XII de levure S. Cerevisiae qui porte l'ensemble des répétitions des gènes d'ADNr. Pour comprendre et caractériser cette organisation, il a fallu prendre en compte la nature fondamentalement dynamique de l'architecture chromatinienne. En raison du caractère stochastique de ces mouvements, les paramètres appropriés à la description de la chromatine sont des grandeurs statistiques. Dans ce sens, grâce à des approches quantitatives d'analyse d'image, nous avons obtenu in vivo une carte de l'organisation spatiale du chromosome XII au sein du volume nucléaire. Ces donnés contribuent directement à la compréhension de l'organisation tri-dimensionnelle des génomes eucaryotes et renforcent l'idée que la physique des polymères est au centre des lois régissant cette organisation. Ce dernier point, a été spécifiquement détaillé dans une deuxième revue rédigée dans le cadre de cette thèsePol I is the most active and abundant RNA polymerase in eukaryotes. Its enormous transcriptional output can best be visualized using the DNA spread method previously developed by Miller et al. (1969), where the 35S rRNA genes (rDNA) adopt a "Christmas tree" conformation. Pol I activity is associated with the largest nuclear body, the nucleolus, where all earlier steps of ribosome biogenesis take place. In this work, we studied transcription by pol I at different level. At level of the organization of rDNA genes in the nuclear volume, and at molecular level, we studied both function of specific subunits of pol I and role of HMGB proteins on transcription of rDNA. In part, we studied spatial organization of chromosome XII which contains all rDNA genes. Focusing on chromosome XII, we could sample positions of loci distributed on chromosome arms, and extrapolate gene territories determination of the entire chromosome. We could show that the nucleolus is a major determinant of the organization of genome of S. Cerevisiae. Moreover, we have also speculated about spatial organization of rDNA gene in the nucleolus. We have also shown that the Rpa49 and Rpa34 Pol I subunits, which do not have counterparts in Pol II and Pol III complexes, are functionally conserved. Statistical analysis of Miller spreads in the absence of Rpa49 demonstrates a fourfold decrease in Pol I loading rate per gene and decreased contact between adjacent Pol I complexes. We have suggested that Rpa34 and Rpa49 Pol I-specific subunits are essential for nucleolar assembly and for the High polymerase loading rate associated with frequent contact between adjacent enzymes. Moreover, we shown that Pol I activation is achieved by a conserved Pol I transcription factor containing an HMG-B box motif, called HMG-P protein. We could identify three interchangeable HMG-P by heterospecific complementation assay in Saccharomyces cerevisiae, Hmo1 in budding yeast, UBF1, the major regulator of rRNAs transcription in human and a newly characterize fission yeast Sp-Hmo1. We have proposed that stimulation is achieved by maintaining active genes competent for productive elongation
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Harismendy, Olivier. "Etude de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae : approches par puces à ADN." Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077094.
Full text
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Spiluttini, Béatrice. "Interaction du snARN U1 de l'épissage avec l'ARN polymérase II." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00814598.
Full textAbstract:
Les ARNs non codants sont des régulateurs de l'expression génétique à plusieurs niveaux. Chez la bactérie et chez la souris, des ARNs non codants (6S et B2) ont la propriété de se lier à l'ARN polymérase et d'inhiber son activité. Afin de déterminer si l'ARN polymérase II (RNAPII) humaine était associée à des ARNs non codants, une immunoprécipitation anti-RNAPII a été réalisée sur des cellules HeLa mitotiques. Les ARNs co-immunoprécipités ont été purifiés et marqués et l'ARN U1 s'est trouvé particulièrement enrichi par rapport au contrôle. Cette co-immunoprécipitation reflète l'association de la snRNP U1 avec la RNAPII. Pour vérifier cette association sur un site de transcription actif, des lignées ont été établies avec l'insertion en multiples copies d'un gène à un site unique, créant ainsi un unique super site de transcription visualisable par FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Deux lignées distinctes ont été créées, l'une avec un gène comportant un intron, l'autre avec le même gène où l'intron comporte trois mutations ponctuelles abolissant l'épissage. Alors que les snARNs U2, U4, U5 et U6 sont absents du site non épissé, l'ARN U1 est enrichi de la même façon indépendamment de l'épissage. La présence des protéines spécifiques de la snRNP U1 indique que la snRNP U1 est recrutée au complet au site de transcription. Ces résultats laissent supposer un rôle pour l'association RNAPII - U1snRNP dans l'épissage cotranscriptionnel.
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Da, Silva Daniel. "Caractérisation des deux isoformes de l’ARN Polymérase III Humaine." Thesis, Bordeaux 2, 2011. http://www.theses.fr/2011BOR21908/document.
Full textAbstract:
Chez les cellules eucaryotes, la transcription est réalisée par les ARN polymérases I, II et III. L’ARN polymérase III (Pol III) transcrit des petits ARNs non codants tels que les ARNt, l’ARN U6, l’ARNr 5S et certains microARN. Il a été montré précédemment que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de la Pol III était associée à la transformation tumorale. Au sein du laboratoire, nous avons décrit une nouvelle sous–unité de la Pol III, RPC32α, qui met en évidence l’existence de deux isoformes de la Pol III humaine : la Pol IIIα et la Pol IIIβ. La sous-unité RPC32β, présente dans la Pol III, est exprimée de façon ubiquitaire et parait comme essentielle pour la croissance cellulaire. La sous-unité RPC32α n’est pas essentielle pour la survie cellulaire et son expression est limitée aux cellules souches non différenciées et aux cellules tumorales. De plus, l’expression ectopique de RPC32α induit la transformation tumorale des cellules fibroblastes IMR90 et change totalement l’expression de nombreux transcrits Pol III mais aussi d’autres ARNm impliqués dans la tumorogenèse (Haurie et al., 2010). Les travaux décrits dans ce manuscrit ont eu pour but de mieux caractériser et comprendre les deux isoformes de la Pol III humaine. Nous avons purifié les Pol IIIα et Pol IIIβ afin d’identifier tous les composants protéiques des deux isoformes du complexe. Au cours de cette étude nous avons observé que des modifications post-traductionnelles de RPC32α semblaient jouer un rôle déterminant dans la capacité oncogénique de la Pol IIIα. Pour comprendre par quel mécanisme moléculaire les Pol IIIα et Pol III pouvaient influencer l’expression de transcrits Pol II, notamment lors de la transformation cellulaire induite par l’expression de RPC32α, nous avons étudié cette régulation lors de la surexpression des deux sous unités paralogues. Ainsi, nous avons mené des analyses ciblées révélant la régulation de certains gènes impliqués dans le développement, la différenciation et la tumorogenèse. Nous avons également essayé de décrire les changements d'expression des gènes au niveau globale en utilisant la technologie des puces à ADN. Cette approche innovante et puissante nous a permis d’obtenir une vision d’ensemble des transcrits Pol II différentiellement régulés lors de la surexpression de RPC32α et RPC32β Nous avons pu apprécier l’impact de la Pol III pour le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire, la survie de la cellule, la prolifération tumorale ou encore à la réponse immunitaire innée. Les résultats de cette étude qui demandent à être confirmés ouvrent des voies de recherches particulièrement intéressantes qui mériteront d’être approfondies dans le futurTranscription in eukaryotic nuclei is carried out by DNA-dependent RNA polymerases I, II, and III. Human RNA polymerase III (Pol III) transcribes small untranslated RNAs that include tRNAs, 5S RNA, U6 RNA, and some microRNAs. Increased Pol III transcription has been reported to accompany or cause cell transformation. In the laboratory, we described a Pol III subunit (RPC32β) that led to the demonstration of two human Pol III isoforms (Pol IIIα and Pol IIIβ). RPC32β-containing Pol IIIβ is ubiquitously expressed and essential for growth of human cells. RPC32α-containing Pol IIIα is dispensable for cell survival, with expression being restricted to undifferentiated ES cells and to tumor cells. In this regard, and most importantly, ectopic expression of RPC32α in fibroblast IMR90 enhances cell transformation and dramatically changes the expression of several tumor-related mRNAs and that of a subset of Pol III RNAs. These results identify a human Pol III isoform and isoform-specific functions in the regulation of cell growth, the differentiation and transformation. (Haurie et al., 2010).The work described in this manuscript enables identification and understanding the function of the two human Pol III isoforms. Pol IIIα and Pol IIIβ are purified in order to describe all the protein components of the two Pol III complex. During this study, we observed that post-translated modifications of RPC32α seem to have a crucial function in oncogenic capacity of Pol IIIα. To understand how Pol IIIα and Pol IIIβ can affect Pol II RNA expression, in particular during cell transformation induced by RPC32α, we studied this regulation during the overexpression of the two paralogue subunits. We performed focused analysis, this study revealed the regulation of certain genes involved in the development, the differentiation and the tumorigenesis. We also tried to describe global gene expression modification using microarray technology. This new and powerful approach enables to obtain a global view on mRNA regulation by overexpression of RPC32α and RPC32β. We observed the effect of Pol III on embryo development, cell differentiation, cell survival, tumor proliferation and on innate immune response. The results of this study need further confirmation pave the way for interesting projects which are worth going into detail for the future
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Gerlach, Piotr. "La structure et la fonction de la polymérase d'orthobunyavirus La Crosse." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV013/document.
Full textAbstract:
Les virus ne sont rien de plus que des particules composées de lipides et/ou de protéines qui encapsulent de l'information génétique composée d'ARN ou d'ADN. Au cours du cycle viral, les virus entrent dans la cellule hôte où ils dupliquent leur génome, puis forment de nouvelles particules virales qui ressortiront de la cellule pour se diffuser. Alors que pour produire leurs protéines virales les virus détournent la machinerie cellulaire, ils utilisent pour la plupart leur propre polymérase spécifique pour répliquer leur génome.Les Bunyaviridae sont une grande famille des virus à ARN simple brin segmenté de polarité négative. Les Arenaviridae et les Orthomyxoviridae sont les deux autres familles de ce type. Certains bunyavirus provoquent des maladies humaines graves, comme des fièvres hémorragiques, des encéphalites et des méningites. D'autres infectent des plantes et animaux, posant une menace économique sérieuse en agronomie.Les ARN polymérases ARN-dépendante de virus à ARN négatif segmenté sont des machineries multi-fonctionnelles, capables de répliquer le génome viral et de le transcrire en ARNs messagers. La réplication est effectuée de novo, en utilisant un intermédiaire d'ARN complémentaire de polarité positive, alors que la transcription est initiée par vol de coiffe d'ARN cellulaire. Chaque segment du génome viral est recouvert par des nucléoprotéines et fixé à la polymérase par ses extrémités 3' et 5' conservées. Le complexe ARN viral/nucléoprotéines/polymérase forme une ribonucléoprotéine, qui est l'unité fonctionnelle de la réplication/transcription.L'objectif de mon projet de thèse était la caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus La Crosse, également nommée protéine L. Ce projet était basé sur l'hypothèse que toutes les polymérases de virus à ARN négatif segmenté pourraient partager une organisation et un mode d'action similaire. Lors de la première année de ma thèse, j'ai tenté de caractériser le domaine C-terminal, que nous supposions être responsable de la fixation de coiffe. Au cours de la deuxième année, j'ai étendu mes recherches sur l'étude de l'interaction entre les extrémités de l'ARN viral et la protéine L (protéine entière et construction tronquée en C-terminal). Confronté à des difficultés pour établir des tests de réplication et de transcription in vitro, j'ai poursuivi mes recherches en troisième année avec l'étude d'interactions et de co-cristallisation entre polymérase et ARN viral. Cela a finalement conduit au résultat principal de ma thèse - la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X de la polymérase de virus de La Crosse en complexe avec les extrémités 3' et 5' de l‘ARN viral. La structure obtenue constitue une percée dans le domaine de bunyavirus. Elle révèle – à la différence de ce qui avait été initialement proposé – que les extrémités 3' et 5' de l'ARN se lient dans deux sites séparés et conservés. La liaison de l'extrémité 5' de l'ARN viral stabilise de façon allostérique l'un des motifs catalytiques du site actif de la polymérase. La structure révèle l'existence de deux tunnels séparés pour l'ARN produit et l'ARN matrice de sortir, ce qui suggère que le brin d'ARN naissant est séparé de la matrice et quitte la polymérase comme ARN simple brin. La proximité des tunnels d'entrée et de sortie de la matrice explique comment la polymérase peut se déplacer le long de l'ARN génomique avec une perturbation minimale de la ribonucléoprotéine.En parallèle de la structure de la polymérase du virus La Crosse, les structures des polymérases hétérotrimériques de la grippe A et B en complexe avec l'ARN viral ont également été déterminées au sein du groupe du Dr. Stephen Cusack. La comparaison de l'organisation des polymérases des deux familles et de la nature de leur liaison avec l'ARN viral montre que, malgré une homologie de séquence minimale, des similitudes structurelles sont frappantes. Cela suggère fortement la présence d'un ancêtre communViruses are not more than particles composed of lipids and/or proteins with genetic information – the viral RNA or DNA genome – embedded inside. In order to be efficient, once they enter the host cell they need to multiply this genetic information, package it into new viral particles and spread out from the cell. While in order to produce viral proteins viruses highjack cellular machinery, for replicating their genome most viruses use their own, specialized polymerases.Bunyaviridae is the largest viral family of segmented negative-strand RNA viruses, comprising also Arenaviridae and Orthomyxoviridae families. Some bunyaviruses are causative agents of severe human diseases including heamorrhagic fevers, encephalitis and meningitis. Others infect a variety of plants and animals posing a significant economic threat to the crop cultivation and cattle breeding.RNA-dependent RNA polymerases of segmented negative-strand RNA viruses are multifunctional machines, able to perform both de novo genome replication via positive-strand cRNA intermediate, and viral mRNA transcription using cap-snatched host-derived mRNA primer. Viral RNA genome of bunyaviruses, arenaviruses, and orthomyxoviruses is divided into three, two, and eight segments respectively. Each segment, coated by nucleoproteins and attached through its conserved 3′ and 5′ ends to the polymerase, constitutes an individual ribonucleoprotein particle – an autonomous RNA synthesis unit.The scope of the PhD project described in this thesis was the structural and functional characterization of the La Crosse orthobunyavirus polymerase, also named the L protein. It was based on the hypothesis that all polymerases of segmented negative-strand RNA viruses share a similar domain organization and mode of action. During the 1st year attempts were made to confirm and characterize a putative C-terminal cap-binding domain. During the 2nd year project was extended to study 3′ and 5′ vRNA ends interactions with the full length and C-terminus truncated L protein. Facing difficulties to establish replication and transcription assays in vitro, vRNA binding studies and co-crystallizastion were continued during the 3rd year. This finally led to the main achievement of the thesis – the x-ray structure of La Crosse orthobunyavirus polymerase in complex with vRNA. Obtained structure is a breakthrough in the bunyavirus field. It reveals – unlike it was initially believed – conserved, sequence specific and separate binding sites for 3′ and 5′ vRNA ends located within the polymerase. The 5′ vRNA end binding allosterically structures one of the conserved catalytic motifs within the polymerase active site. The structure sheds also some new light on bunyaviral replication and transcription mechanisms. There exist two distinct product and template exit channels, suggesting that the nascent RNA strand is separated from the template and leaves the polymerase as the single-strand RNA. Close proximity of the template entry and exit channels explains how the polymerase can translocate along the genomic template with minimal disruption of the RNP.In parallel to the La Crosse polymerase structure, structures of Influenza A and B heterotrimeric polymerases in complex with vRNA were also obtained in Stephen Cusack group. This gave a great opportunity to compare the domain organization and the nature of vRNA binding by viral polymerases belonging to Bunyaviriadae and Orthomyxoviridae families, and proved that despite minimal sequence homology the structural similarities are striking. This strongly suggests an evolutionary common ancestor, which can possibly be shared with non-segmented negative-strand RNA viruses as well
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Palancade, Benoît. "Propriétés de l'ARN polymérase II et de sa phosphatase FCP1 dans l'embryon précoce de Xénope." Paris 6, 2002. http://www.theses.fr/2002PA066284.
Full text
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Monod, Alexandre. "Etude structurale et fonctionnelle de l'ARN-polymérase du virus de la grippe." Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENV045/document.
Full textAbstract:
Le virus influenza de type A est un virus à ARN simple brin de polarité négative qui se réplique dans le noyau des cellules infectées. Son génome se compose de huit segments d'ARN viral (ARNv). Chaque segment est recouvert de multiples copies de nucléoprotéines virales (NP). Chacune des extrémités strictement conservées 3' et 5' des huit segments d'ARNv interagit avec une ARN-polymérase ARN-dépendante. Le complexe entre l'ARNv, NP et l'ARN-polymérase ARN-dépendante forme une particule appelée ribonucléoprotéine (RNP) constituant l'entité fonctionnelle pour la réplication du génome viral et sa transcription en ARN messagers. Dans le contexte de la RNP, ces deux processus sont assurés par l'ARN-polymérase ARN-dépendante formée de trois protéines (PA, PB1 et PB2). L'ARN-polymérase du virus influenza A fait l'objet de nombreuses études. Son étude structurale se heurte à la difficulté d'obtenir ce complexe hétérotrimérique sous forme soluble et en grande quantité, deux conditions qu'impose la biologie structurale. Ainsi, durant les huit dernières années, les données structurales à l'échelle atomique n'ont été obtenues que sur des domaines isolés de l'ARN-polymérase laissant l'essentiel de la structure de PB1 inconnue. Pour contourner ce problème, une nouvelle stratégie s'appuyant sur le système d'expression en cellules d'insecte infectées par baculovirus a été développée. Cette stratégie a permis la production d'une forme tronquée de l'ARN-polymérase du virus influenza de type A qui a été étudiée d'un point de vue structural et fonctionnel. Plusieurs reconstructions en trois dimensions ont été obtenues par microscopie électronique et une structure cristalline à faible résolution (7,7 Å) a pu être résolue. Les études fonctionnelles se sont axées sur les activités portées par l'hétérotrimère tronqué et un accent particulier a été mis sur l'étude des interactions avec l'ARN. Les informations sur les activités catalytiques obtenues in vitro ont mis en évidence un rôle clef de certains ions métalliques. Afin de connaitre l'environnement en ions métalliques et cibler leur rôle à l'échelle cellulaire, leur distribution dans la cellule infectée par le virus influenza A a été étudiée par microscopie rayons-X. Cet aspect de l'infection étant très peu documenté, cette étude s'inscrit dans une démarche originale et a offert l'opportunité d'intégrer les données biochimiques et biophysiques à l'échelle de la cellule entièreInfluenza A virus is a negative single stranded RNA virus that replicates in the nucleus of infected cells. Its genome contains eight single stranded negative-sense RNA segments (vRNA) covered by the viral nucleoprotein (NP). The highly conserved 3' and 5' ends of the vRNA are bound to the RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp) which consists of three subunits, PA, PB1 and PB2. The complex between vRNA, NP and the RdRp forms a particle called ribonucleoprotein (RNP). The RNP acts as an independent molecular machine for transcription and replication in the nucleus. Within the context of the RNP, these two processes are mediated by the RdRp. The influenza A RdRp complex has been remarkably intractable to structural analysis and in the last eight years, crystal structures of independent domains covering roughly half of the heterotrimeric RdRp have been determined. In addition, electron microscopy reconstructions have described the RdRp. Nonetheless, a complete model characterizing the RdRp as a whole is still lacking. To overcome this issue, a new strategy has been developed to obtain the RdRp heterotrimeric complex using the baculovirus infected cells expression system. This method has produced a truncated form of the flu A RdRp which has been studied from a structural and functional point of view. Several three-dimensional reconstructions by electron microscopy have been obtained and a crystal structure at low resolution (7,7 Å) has been solved. Functional studies focused on the activities carried by the truncated RdRp and a particular emphasis was placed on the study of the interactions with RNA. In vitro functional data showed highly metal ion-dependent activities. To know more about the subcellular metal context, metallic ions distribution in influenza A infected cells has been studied by X-ray microscopy giving the opportunity to integrate biochemical and biophysical data in the context of the whole cell
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Tavenet, Arounie. "Caractérisation de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112227/document.
Full textAbstract:
L’ARN polymérase III synthétise de nombreux petits ARN non traduits, dont les ARNt et l’ARNr 5S, essentiels à la croissance de toute cellule. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la régulation de la transcription par l’ARN polymérase III chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons détecté Sub1 sur les gènes de classe III in vivo. Nous avons également observé que Sub1 est capable de stimuler la transcription par l’ARN III reconstituée in vitro avec les facteurs TFIIIB et TFIIIC recombinants et avec l’ARN Pol III purifiée. Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l’initiation et la réinitiation facilitée. Des expériences supplémentaires nous montrent que la protéine interagit directement avec TFIIIB et TFIIIC. Enfin, nous avons pu constater que la délétion de Sub1 dans la levure conduit à une diminution de la transcription par l’ARN Pol III en phase exponentielle de croissance. Par la suite, nous avons cherché à déterminer quel lien pouvait exister entre l’activateur Sub1 et le répresseur Maf1 de la transcription par l’ARN Pol III. Enfin, nous avons également souhaité identifier d’autres éléments pouvant interagir avec la protéine Sub1 au cours de sa fonction de régulateurRNA polymerase III synthetizes many small untranslated RNA, including tRNA and 5S rRNA which are essential to cell growth. In this work, we took an interest in RNA polymerase III transcription regulation in the baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae. We have detected Sub1 on all class III genes in vivo. We also observed that Sub1 is able to stimulate RNA polymerase III transcription which has been reconstituted in vitro with TFIIIB et TFIIIC recombinants factors and purified RNA polymerase III. Sub1 stimulates two steps of RNA polymerase III transcription : initiation and facilitated reinitiation. Supplementary experiments established that Sub1 directly interacts with TFIIIB and TFIIIC transcription factors. Finally, we showed that Sub1 deletion in yeast leads to a decrease in RNA polymerase III transcription during exponential phase. Then, we tried to determine which link could exist between Sub1, the activator, and Maf1, the repressor of RNA polymerase III transcription. Furthermore, we attempted to identify other elements which could interact with Sub1 during transcription regulation
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Sourimant, Julien. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus respiratoire syncytial." Thesis, Versailles-St Quentin en Yvelines, 2015. http://www.theses.fr/2015VERS019V.
Full textAbstract:
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable desbronchopneumonies du jeune veau et des bronchiolites du nourrisson. Il n’existe pas devaccin ni d’antiviraux spécifiques pour l’homme. La réplication du génome et la transcriptiondes gènes viraux sont assurées par un ensemble de protéines virales constituant le complexeARN polymérase ARN-dépendant : la nucléoprotéine N, la phosphoprotéine P, le facteur detranscription M2-1 et la grosse sous-unité L. L’objectif principal de ma thèse était d’obtenirde nouvelles données structurales et fonctionnelles sur le complexe ARN-polymérase ARNdépendante(RdRp) du VRS, en particulier sur le couple P-L. Pour ceci j’ai tout d’aborddéveloppé un protocole de production et purification de la protéine L sous formerecombinante en cellules d’insecte. Ceci m’a permis ensuite de cartographier le sited’interaction de P avec L. J’ai ainsi mis en évidence que la protéine L interagit avec la partieC-terminale de la protéine P, au-niveau des résidus 216 à 239. Les données obtenuessuggèrent que ce domaine peut former un nouvel élément de reconnaissance moléculaire(« MoRE ») se structurant en hélice alpha lors de l’interaction avec la protéine L. De plus, lacartographie de ce domaine d’interaction m’a permis d’identifier entre les résidus 164 et 205de P une nouvelle région impliquée dans le recrutement de la protéine L aux corpsd’inclusions viraux. Ces nouvelles données ouvrent la voie à de nouvelles études structuralesde l’ARN-polymérase du VRS et nous permettent d’envisager de nouvelles stratégiesantivirales ciblant ce complexeRespiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of calves bronchopneumonia andinfants bronchiolitis. Neither vaccine nor antiviral treatments are currently available for use inhumans. Viral genome is replicated and transcribed by a set of viral proteins constituting theviral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex: the nucleoprotein (N), thephosphoprotein (P), the transcription factor (M2-1) and the large subunit (L). This workaimed to unveil new structural and functional data regarding the viral RdRp, especially the PLcouple. With this aim in view, I have first conceived a protocol to produce and purifyrecombinant L and P proteins expressed in insect cells. This tool enabled the fine mappingand characterization of the L binding domain of the RSV phosphoprotein. This highlightedthe interaction between the L protein and the C-terminal region of the P protein, especiallyresidues 216 to 239. Further data suggests that this area constitutes an alpha helix formingmolecular recognition element (« MoRE ») during P-L interaction. Furthermore, this studyunveiled a new region of the P protein encompassing residues 164 to 205, involved in therecruitment of L protein to viral inclusion bodies. These new results open the way toupcoming structural studies of RSV RdRp and allow us to define a new target for thedevelopment of antiviral drugs against RSV
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Ghavi-Helm, Yad. "Etude à grande échelle du rôle de TFIIS et de ses partenaires dans la transcription chez les eucaryotes." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00446842.
Full textAbstract:
Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au facteur de transcription TFIIS, un facteur d'élongation de l'ARN polymérase II impliqué dans la stimulation de l'activité de clivage intrinsèque de cette enzyme. L'étude de la localisation globale du facteur TFIIS sur le génome de Saccharomyces cerevisiae par ChIP-on-chip a révélé que TFIIS, en plus d'être présent sur les gènes de classe II (ie. transcrits par l'ARN polymérase II), est également présent sur l'ensemble des transcrits de classe III (ie. transcrits par l'ARN polymérase III), suggérant ainsi un rôle jusqu'alors inconnu de cette protéine dans la transcription par l'ARN polymérase III. Des expériences de génomique, de génétique et de biochimie nous ont permis de montrer que TFIIS est un facteur de transcription de l'ARN polymérase III impliqué dans le choix du site d'initiation de la transcription. Par la suite, j'ai souhaité poursuivre cette étude chez Mus musculus, afin de déterminer, entre autres, si le rôle de TFIIS dans la transcription par l'ARN polymérase III est conservé chez les eucaryotes pluricellulaires. Des expériences préliminaires révèlent que Tcea1, l'une des isoformes de TFIIS chez M. musculus, serait présent sur quelques gènes de classe II et III. Lors de ma thèse, j'ai également pris part à deux autres projets en cours dans le laboratoire. L'un a porté sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique coactivateur de la transcription par l'ARN polymérase II, dans la mise en place du complexe de préinitiation via le recrutement du facteur TFIIH. Le second projet a permis de montrer que l'ARN polymérase II agit comme un senseur de la disponibilité en nucléosides triphosphates dans la cellule.
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Prod'Homme-Gentil, Delphine. "Détection et étude de la localisation de l'ARN polymérase ARN-dépendante du virus de la mosai͏̈que jaune du navet (TYMV)." Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077157.
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El, Ayoubi Leyla. "Etude fonctionnelle des sous-unités hRPC62 et hRPC39 de l’ARN Polymérase III humaine." Thesis, Bordeaux, 2014. http://www.theses.fr/2014BORD0007.
Full textAbstract:
Dans les cellules eucaryotes, la transcription de l’ADN nucléaire est effectuée grâce à trois ARN Polymérases ADN dépendantes (Pol). La Pol I transcrit les ARN ribosomaux, la Pol II produit essentiellement des ARN messagers et des micro ARN alors que la Pol III transcrit des petits ARN non traduits impliqués dans une variété de processus cellulaires essentiels tels que la traduction, l’épissage ou la régulation de la transcription. L’ARN Polymérase III humaine est un complexe enzymatique constitué de 17 sous-unités dont la plupart sont apparentées à des sous-unités de la Pol I et/ou la Pol II. Une de ces sous-unités, hRPC32 est présente sous forme de deux paralogues α et β codés par deux gènes différents où hRPC32β est exprimée de façon ubiquitaire alors que hRPC32α est exprimée spécifiquement dans les cellules transformées ou non différenciées. Au sein de la Pol III, hRPC32α/β, hRPC62 et hRPC39 forment un sous-complexe ternaire stable dissociable de l’enzyme. Ces trois sous-unités sont spécifiques à la Pol III et sont impliquées dans l’étape d’initiation de la transcription. L’objectif de ce travail de thèse est d’éclaircir les mécanismes de fonctionnement du sous-complexe hRPC62-hRPC39-hRPC32α/β. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de cartographier les domaines d’interaction entre la sous-unité hRPC62 et les deux paralogues α et β de la sous-unité hRPC32. Ensuite, nous avons mené une analyse biochimique des activités enzymatiques des protéines recombinantes de hRPC62 et hRPC39. Cette analyse a montré que hRPC62 possède des homologies fonctionnelles avec TFIIEα, un facteur de transcription de l’ARN Polymérase II récemment décrit comme étant un homologue structural de la sous-unité hRPC62. Ces données supportent le modèle suggérant que certaines sous-unités des ARN Polymérases peuvent être considérées comme des facteurs de transcription recrutés de façon permanente à l’enzymeIn eukaryotes, nuclear transcription is carried out by DNA dependent RNA polymerases (Pol) I, II and III. Pol I transcribes ribosomal RNA’s, Pol II produces essentially messenger and micro RNA’s whereas Pol III transcribes small untranslated RNA’s involved in a variety of cellular processes such as translation, splicing or the regulation of transcription. Human Pol III is a multi-subunit enzyme composed of 17 subunits. The majority of these subunits are homologous or closely related to Pol II and/or Pol I subunits. However, five subunits are specific to Pol III with no counterparts in Pol I or Pol II. One of the Pol III specific subunits, hRPC32 has two paralogues, α and β, expressed from two different genes. hRPC32β is expressed ubiquitously while hRPC32α expression is specific to transformed or non-differentiated cells. Within the Pol III enzyme, hRPC32α or β associate with two other Pol III specific subunits, hRPC62 and hRPC39, to form stable ternary sub-complexes thought to be implicated in transcription initiation. The purpose of this work was to clarify the functional mechanism of hRPC32α/β-hRPC62-hRPC39 sub-complexes. In this study, we first mapped the protein-protein interaction of hRPC62 with hRPC32α and hRPC32β. Second, we performed a biochemical study of hRPC62 and hRPC39 enzymatic activities. This analysis showed that hRPC62 has functional homologies with TFIIEα, a Pol II transcription factor recently described as a structural homolog of hRPC62. These results support the model that certain RNA polymerase subunits can be considered as transcription factors that have been stably recruited to the enzyme
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Gajda, Anna Ewa. "Regulation of a gene transcription by RNA polymerase III in Saccharomyces cerevisiae : the role of evolutionarily conserved domains of the Maf1 protein, RNA polymerase III repressor." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112224.
Full textAbstract:
Dans l'environnement, la levure doit faire face à des conditions variées qui nécessitent une adaptation rapide du métabolisme cellulaire. Une des premières réponses est l'inhibition de la transcription par l'ARN polymérase III (Pol III). La protéine Maf1, le seul régulateur de la machinerie de la Pol III chez Saccharomyces cerevisiae (Sc), est conservée au cours de l'évolution. Les protéines Maf1 des Eucaryotes contiennent deux domaines A et BC phylogénétiquement conservés. Ce travail de thèse a cherché à identifier le rôle de ces domaines dans la fonction de la protéine ScMaf1. J'ai construit une banque de mutants de Maf1, identifié les changements dans leurs séquences ainsi que leurs phénotypes. En utilisant la technique du double-hybride, j'ai montré que les domaines A et BC interagissent physiquement et que l'extrémité N-terminale de 34 acides aminés du domaine A est le fragment minimal nécessaire à cette interaction. Grâce à un crible génétique, j'ai mis en évidence que les mutations du domaine BC (D250E et V260D-N344I) permettent de restaurer l'activité de Maf1 mutée dans le domaine A (K35E). Cette restauration est observable pour le phénotype, la répression efficace de la transcription par la Pol III, le niveau de phosphorylation et la localisation cellulaire de Mafl. La technique du double-hybride m'a permis aussi de montrer que la mutation K35E inactive partiellement l'interaction entre les domaines de Maf1 qui est restaurée par les mutations suppresseurs D250E et V260D-N344I. Les résultats permettent de conclure que : « la répression de la transcription par la Pol III requiert l'interaction physique des domaines de Maf1»Yeast cell encounters numerous environ mental situations that require a rapid and efficient adaptation of cellular melabolism to changing Iife conditions. One of the first responses is the inhibition of RNA polymerase III (Pol llI) transcription. The Maf1 protein, the unique negative regulator of the Pol III apparatus in Saccharomyces cerevisiae (Sc), is conserved through evolution. The family of eukaryotic Maf1 share highly conserved amino acid sequence with two easily recognizable regions called A and BC domains. The work performed during this PhD thesis concerns the role of these evolutionary conserved domains in the activity of ScMaf1. I have constructed a Iibrary of Maf1, identified and localized the mutations of corresponding Maf1 proteins and studied the phenotype. Using yeast two-hybrid system, I have found the A and BC domains interact physically and defined the minimal 34 aa fragment of the A domain involved in this interaction. Using genetic screen for internal suppressor mutations, I have identified that mutations localized in BC domain (D250E, V260D-N344I) recovered the activity of Maf1 mutated in A domain (K35E), as deduced from no defected growth, efficient Pol III repression, phosphorylation and cellular localization of identified suppressors. The identified K35E mutation disrupted physical interaction between Maf1 domains unless the presence of additional D250E or V260D-N344I suppressor mutations occurred. The Take Home message from the results obtained during my PhD thesis is that: "Full repression of Pol III requires the physical interaction between Maf1 domains"
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Morin, Benjamin. "Etude structurale et fonctionnelle de protéines de virus à ARN impliquées dans la réplication virale et la réponse cellulaire à l'infection." Aix-Marseille 2, 2009. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2009AIX22102.pdf.
Full textAbstract:
A l’heure actuelle, les études structurales et fonctionnelles sur les virus émergents se limitent à quelques virus dont l’impact sociétal est établi et prévisible. Pourtant, le monde des virus à ARN est très vaste, et présente des potentialités d’émergences en pleine augmentation. Au cours de mon doctorat, j’ai étudié 2 types de protéines impliquées dans la réplication de tels pathogènes viraux. La protéine L des virus à ARN négatif (ARN(‐)) est la polymérase indispensable à la transcription et à la réplication de leur génome. Du fait de la difficulté de production de ces protéines sous forme entière, très peu de données structurales et fonctionnelles sont disponibles. J’ai alors recherché des domaines solubles de ces protéines et résolu la première structure cristallographique d’un domaine d’une protéine L. J’ai ensuite démontré que celui‐ci est un domaine de type endonucléase présent dans l’ensemble des virus à ARN(‐) segmenté, et probablement impliqué dans la stabilisation des ARN messagers viraux. Ces résultats font alors de ce domaine une cible majeure pour la recherche d’antiviraux dirigée spécifiquement contre ces virus. Lors d’une infection virale, la cellule est capable de mettre en place des réponses antivirales, dont la voie de réponse à l’interféron (IFN) via l’oligoadénylate synthétase (OAS)/Ribonucléase L(RNase L). Cependant, les virus ont des moyens de se protéger contre la réponse cellulaire à l’infection. Les connaissances actuelles sur les domaines macro viraux suggèrent qu’ils pourraient interagir avec des 2’‐5’ oligoadénylates (2‐5As), effecteurs de cette voie de réponse à l’IFN. J’ai alors mis en place une méthode de production à grande échelle des 2‐5As, puis cristallisé le domaine macro nsp3 du virus Chikungunya en complexe avec un trimère de 2‐5A. Ces travaux ouvrent une voie de recherche sur les relations entre les virus et un des mécanismes de défense contre l’infection virale, la voie OAS/RNase LThe structural and functional studies of emergent viruses are restricted to few viruses whose overall impact is already established and predictable. Though, the RNA virus world is incredibly wide and increasingly presents new possibilities of emerging pathogens. During my PhD I studied 2 types of proteins involved in replication of these interesting viral pathogens. The L protein of negative strand RNA viruses ((‐)RNA) is the essential RNA polymerase for transcription and replication of the viral genome. Because of the difficulty of producing crystals of the entire protein, very few structural and functional data are available. I generated and studied soluble domains of these proteins and solved the first crystallographic structure of a L protein. I found that it harbors an endonuclease fold conserved in all segmented (‐)RNA viruses, with a putative role in stabilization of viral mRNAs. These results make this domain a suitable target for antiviral research specifically directed against these viruses. During a viral infection the cell is able of generate an antiviral response, the Interferon (IFN) response pathway, which occurs via oligoadenylate synthetase (OAS) /Ribonuclease L (RNase L) involvement. However, viruses use different ways to protect themselves from this cellular response. The actual knowledge on the conserved viral macro domains suggests that they could interact with 2’‐5‘ oligoadenylates (2‐5As), which are signalling molecules in the induction of the IFN response pathway. I developed a method to produce 2‐5As on a large scale. Then I crystallized the macro nsp3 domain of Chikunguya virus in complex with a 2‐5A trimer. These studies open perspectives of research about the relation between viruses and one of the defense mechanism against viral infection, that involving OAS and RNase L
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Reigadas, Sandrine. "L'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'Hépatite C (VHC) : expression et étude de son mécanisme d'action in vitro : recherche d'inhibiteurs." Bordeaux 2, 2002. http://www.theses.fr/2002BOR20942.
Full textAbstract:
Le virus de l'hépatite C(VHC) est l'agent étiologique de la plupart des cas d'hépatites non-A non-B post-transfusionnelles ou sporadiques. Les traitements actuels proposés étant inefficace dans 50 % des cas, le développement de traitements anti-VHC nouveaux et spécifiques est donc nécessaire. Parmi les fonctions virales essentielles à la réplication virale, une des cibles les plus attractives pour le développement d'anti-viraux est l'étape de synthèse de l'ARN génomique assurée par l'ARN polymérase dépendante (NS5B) codée par le génome du VHC. Afin d'étudier l'initiation de la synthèse d'ARN à partir du génome du VHC, nous avons utilisé des ARN transcrits in vitro correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN (-) et (+) comme matrices pour la synthèse d'ARN catalysée par la NS5B purifiée du VHC. Les résultats de ces expériences montrent que la capacité de synthèse de l'enzyme n'est pas la même suivant la matrice ARN utilisée, et que les 341 premiers nucléotides correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN (-) sont les plus efficacement copiés par l(enzyme. L'importance et la forte conservation de cette région ARN nous a encouragé à développer une stratégie antisens afin d'obtenir des séquences oligonucléotidiques qui pourraient bloquer ou ralentir la réplication de l'ARN viral. Parmi les ODN complémentaires de l'extrémité 3' de l'ARN (-) testés, 4 inhibent la synthèse d'ARN avec un IC50 inférieure à 1 uM. Cette inhibition est séquence spécifique et l'introduction d'une modification 2'-O-méthyl ou phosphoramidate abaisse l'IC50 nM et 30 nM respectivement) d'environ 12 fois pour l'un des 4 ODN inhibiteurs, l'ODN7. Nos résultats suggèrent que l'ODN7 inhibent la synthèse d'ARN en interférant avec des motifs structuraux important pour une initiation efficace de la synthèse d'ARN, présents à l'extrémité 3' de l'ARN(-).
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Esnault, Cyril. "Etude des interactions entre le médiateur et les facteurs généraux de la transcription par l’ARN polymérase II." Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112168.
Full textAbstract:
L’ARN polymérase II (Pol II) sert à la transcription de petits ARN non codants et à la transcription des ARN messagers. La première étape de l'activation de la transcription est la reconnaissance de régions de l'ADN par les activateurs spécifiques. Ceci permet le recrutement de coactivateurs, des facteurs généraux (GTF) et de Pol II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Au cours de ma thèse, nous nous sommes concentré sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique qui joue un rôle essentiel dans ce processus. Nous avons découvert une interaction génétique entre MED31 qui code pour la sous-unité la mieux conservée du Médiateur et DST1 qui code le facteur d'élongation TFIIS. De façon surprenante, notre étude a révélé un nouveau rôle pour TFIIS qui intervient au cours de l'initiation de la transcription en conjonction avec le Médiateur pour recruter Pol II sur la région promotrice des gènes. Ensuite, nous avons identifié une interaction directe entre Med11 et Rad3, des sous-unités de la tête du Médiateur et de TFIIH. Nous avons alors poursuivi notre étude sur cette interaction et sur celles entre Med11 et ses partenaires au sein du complexe: Med17 et Med22. Des mutants qui affectent ces interactions présentent des défauts de recrutement de TFIIH, de TFIIE et de Pol II ou déstabilisent l'association des modules de TFIIH. Nous avons également mis à jour le rôle du Médiateur sur la phosphorylation du CTD de Pol II via la stabilisation de TFIIK sur la région promotrice. L'ensemble de nos résultats révèle un rôle essentiel du Médiateur dans les recrutements des facteurs généraux au cours de l'initiation et suggère un assemblage branché pendant la formation du PICIn eukaryotes, RNA polymerase II (Pol II) is responsible for the transcription of coding genes and a large number of non-coding RNAs. The first step in transcription activation is the recognition of DNA motifs by activators that trigger the recruitment of co-activators, general transcription factors (GTFs) and ultimately Pol II to form a preinitiation complex (PIC). During my thesis, we focused our study on Mediator, a multiprotein complex that plays a critical role in this process. We found different interactions between the Mediator and transcription factors that inform how it could influence the transcription initiation. First, we discovered a genetic interaction between MED31 that encodes the most conserved Mediator subunit and DST1 that encode the elongation factor TFIIS. Surprisingly, we revealed a new role for TFIIS which acts in conjunction with Mediator during transcription initiation to recruit Pol II on promoter. Then, we identified a direct interaction between Med11 head Mediator subunit and Rad3 TFIIH subunit. We explored the significance of this interaction and those of Med11 with Med17 and Med22 head module subunits and found that impairing these interactions could differentially affect the recruitment of TFIIH, TFIIE and Pol II in PIC or destabilize the association of TFIIH modules. We also found that a med11 mutation that altered promoter occupancy by TFIIK kinase module of TFIIH reduced Pol II CTD serine 5 phosphorylation. We conclude that the Mediator head module plays a critical role in TFIIH, TFIIE and PolII recruitment in PIC. Altogether, these results suggest a branched assembly pathway in PIC formation
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Naderi, Kambiz. "Contribution à la détermination de la structure de la sous-unité RPB11 de l’ARN polymérase II humaine." Strasbourg, 2011. http://www.theses.fr/2011STRA6094.
Full textAbstract:
L’ARN polymérase II (ARNP II) transcrit la quasi-totalité du génome nucléaire eucaryotique. L’ARNP II est un complexe constitué de 12 sous-unités. Une étape importante de son assemblage est la formation d’un hétérodimère entre les sous-unités RPB3 et RPB11. Nous avons examiné les interactions par double hybride entre les sous-unités RPB3 et RPB11, soit humaines, soit de levure, ainsi que l’effet de diverses mutations sur les interactions observées. Nous avons démontré que la protéine RPB11 humaine codée par le gène POLR2J1 forme un dimère stable, au contraire de son homologue de levure qui en est incapable. Nous avons constaté que les interactions observées ne sont pas sensibles aux mêmes mutations en particulier celles qui affectent un motif spécialement conservé nommé «motif alpha» que l’on retrouve jusque dans la sous-unité alpha de l’ARNP eubactérienne. Nous avons réussi à cristalliser cette protéine afin de contribuer à la détermination de la structure tridimensionnelle de l’ARNP II humaine. Nous avons caractérisé génétiquement l’ARNP II de Plasmodium falciparum en réalisant des tests de complémentation fonctionnelle des sous-unités de ce complexe enzymatique. Nos résultats indiquent que les sous-unités PfRPB4-5-7-9 et 12 codent des protéines capables de remplacer leurs homologues chez la levure Saccharomyces cerevisiae. De fait, nous avons construit des lignées de levures exprimant de façon stable des protéines de P. Falciparum. Par ailleurs, les sous-unités PfRPB3-6-8-10 et 11 ne complémentent pas. Nous avons aussi construit des souches viables de levures dont le site de fixation de l’alpha-amanitine sur leur ARNP II est «plasmodifié» ou «humanisé»The RNA polymerase II (RNAPII) enzyme transcribes nearly of the whole eukaryotic nuclear genome. Controling its activity as well as its coupling with other nuclear processes such as DNA reparation is especially critical to avoid tumorogenesis and cancer. RNAPII consists in complex of 12 subunits. Though its assembly process is still poorly characterized, the formation of an heterodimer between, RPB3 and RPB11 subunits seems to be a critical step. We have analyzed the interactions between the RBP3 and RPB11 subunits, either human or yeast, and the effect of various mutations of RPB11 on these interactions. We demonstrate that the POLR2J1 encoded human RPB11 isoform is able to dimerize in contrast to its yeast counterpart. Mutations affecting an peptidic motif known as the “α-motif”, that is found up to the alpha subunit of eubacterial RNA polymerase, affect RPB11 homodimeric and RPB3/RPB11 heterodimeric interactions differentally. In an effort to contribute to the resolution of the three-dimensional structure of the human RNAPII, we were able to cristallize this human RPB11 subunit. We performed a genetic characterization of the RNAPII of Plasmodium falciparum. After reconstitution and cloning 10 putative RNAPII subunits, we performed yeast genetic complementation assays. We demonstrated that five subunits were indeed functional in a yeast heterologous system (RPB4, 5, 7, 9 and 12), and five not (RPB3, 6, 8, 10 and 11). In addition, we engineered yeast cell lines whose RNAPII was modified so as to mimick either the human or the Plasmodium falciparum active sites
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Landrieux, Emilie. "Etude fonctionnelle de la sous-unité C37 de l'ARN polymérase III de la levure Saccharomyces cerevisiae." Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077108.
Full text
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Kandan-Kulangara, Febitha. "Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) and RNA interference (RNAI) during cell death." Doctoral thesis, Université Laval, 2013. http://hdl.handle.net/20.500.11794/25972.
Full textAbstract:
L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.
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Ben, ouirane Kaouther. "Apport des approches in silico aux études structure-fonction de la polymérase du virus de l'hépatite C." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS323.
Full textAbstract:
Le virus de l'hépatite C (HCV) est un virus à ARN qui synthétise ses nouveaux génomes dans les cellules hôtes infectées grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp), appelée NS5B. Cette polymérase a été pendant longtemps une cible majeure dans la recherche d'antiviraux contre l'hépatite C. Aujourd'hui, de nombreux antiviraux ont été approuvés dans le traitement de l’hépatite C ciblant différentes protéines virales, entre autre, NS5B. Le sofosbuvir qui cible le site actif de NS5B est un antiviral qui a démontré une efficacité extraordinaire dans le traitement anti-HCV.Durant ces dernières années, les recherches sur NS5B ont permis de caractériser cette protéine, à la fois structuralement et biochimiquement. La richesse des connaissances ainsi accumulées fait de NS5B un excellent modèle pour les RdRp des virus à ARN.Toutefois, peu d'études portent sur le mécanisme d’acheminement et de sélection des ribonucléotides au site actif de NS5B, et de façon générale, sur la description atomique du mécanisme de réplication assuré par NS5B, qui implique deux dications magnésium pour la catalyse comme chez toutes les polymérases de cette famille.Durant ce travail, nous avons exploité les données structurales issues de complexes ternaires (NS5B+RNA+nucleotide) obtenus en 2015 par cristallographie à l'échelle atomique. Nous avons utilisé ces structures pour mener des études de modélisation moléculaire, essentiellement par dynamique moléculaire afin d’aborder la question de l'acheminement des nucléotides vers le site actif de NS5B.Nous avons eu recours à la fois à des méthodes de dynamiques moléculaires classiques et des méthodes de dynamiques moléculaires dites biaisées telles que différentes méthodes de dynamiques moléculaires dirigées (SMD et TMD) et la dynamique moléculaire accélérée (aMD).Nos résultats indiquent que l’acheminement du nucléotide au site actif associé à un magnésium Mg(B) est contrôlé tout au long du tunnel par différents éléments de NS5B. Initialement, le nucléotide se lie à une région proche de la boucle qui surplombe le tunnel lui permettant, grâce aux interactions qu’il établit avec sa partie triphosphate, de s’orienter base en avant. Ensuite, le nucléotide atteint un point de contrôle formé essentiellement par le motif F3 (R158) et le motif F1(E143). Le nucléotide reste lié à ce site jusqu’à l’arrivée du second dication magnésium (Mg(A)) qui provoque des réarrangements structuraux, notamment au niveau du motif F3, entrainant l’avancée du nucléotide vers le site actif. Une fois ce point de contrôle passé, le nucléotide interroge alors la base du brin d’ADN matrice sans s’insérer entièrement dans le site actif.Nos simulations ont clairement établi que les dernières étapes d’entrée du nucléotide sont finement régulées par l’arrivée du second dication magnésium qui a donc un rôle de coordinateur en plus de son rôle connu dans la catalyse.Ce mécanisme d’entrée semble être spécifique aux RdRp virales et permet de comprendre pourquoi les analogues de nucléotides peuvent être aussi efficaces contre les virus à ARNThe hepatitis C virus is an RNA virus that synthesises its new genomes in the infected host cells thanks to an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) termed NS5B. This polymerase has been a prime target for antiviral therapy. Numerous direct antiviral drugs are now approved in the HCV treatment and allow very high rates of treatment success. These drugs target among others the HCV NS5B RdRp with the sofosbuvir being one of the most successful drugs.Tremendous efforts have been made in the past decades to characterize NS5B, in particular structurally and biochemically. However, there is little information about the molecular mechanisms of NS5B ribonucleotides entry and selection and in general on the atomistic details of the RNA replication mechanism, although the involvement of two magnesium dications in catalysis is well established in this family of polymerases. Since 2015, structures of ternary complexes of NS5B have been resolved by crystallography offering very valuable details about the binding of nucleotides at the NS5B active site.In this work, we took advantage of these structural data to address the ribonucleotides entry and to further explore the nucleotide addition cycle in NS5B using molecular modelling and molecular dynamics simulations. We used both conventional molecular dynamics techniques and biased simulations that enhance sampling such as Steered Molecular Dynamics (SMD), Targeted Molecular Dynamics (TMD) or accelerated Molecular dynamics (aMD).Based on our modelling results, we found that the access to the active site through the nucleotides tunnel is checked by successive NS5B elements. First, the entering ribonucleotide together with an associated magnesium Mg(B) binds next to a loop that overhangs the nucleotide tunnel and interactions with its triphosphate moiety orient it base-first towards the active site. Second, the ribonucleotide encounters a checkpoint constituted by the residues of motif F3(R158) and motif F1(E143) where it is blocked until the arrival of a second magnesium ion, the Mg(A). This allowed the motif F3 to undergo small structural rearrangements leading to the advancement of the nucleotide towards the active site to interrogate the RNA template base prior to the complete nucleotide insertion into the active site.Our simulations pointed out that these dynamics are finely regulated by the second magnesium dication, thus coordinating the entry of the correct magnesium-bound nucleotide with shuttling of the second magnesium necessary for the two-metal ion catalysis. This entry mechanism is specific to viral RdRps and may explain why modified ribonucleotides can be so successful as drugs against RNA viruses
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Sabourin-Félix, Marianne. "Développement et application d'un outil bio-informatique pour cartographier la machinerie de l'ARN polymérase I chez les mammifères." Master's thesis, Université Laval, 2018. http://hdl.handle.net/20.500.11794/29846.
Full textAbstract:
L’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage haut débit (ChIP-seq) est une technique permettant de visualiser les interactions entre l’ADN et les protéines. Toutefois, en pratique, la résolution de cette technique laisse à désirer. En étudiant les gènes de l’ARN ribosomique (ADNr), nous avons observé que le facteur majeur limitant la résolution découle du recouvrement inégal des séquences de chaque locus. Cette inégalité est superposée à la distribution réelle de la séquence d’ADN immunoprécipitée entrainant un profil de liaison protéique aberrant. Un logiciel de déconvolution a été développé afin de corriger la couverture inégale des données ChIP-seq en les normalisant par rapport aux données de l’input (Whole Cell Extract). Lorsqu’appliqué sur les données de l’ADNr, cet outil s’est avéré très utile en fournissant un profil de liaison détaillé de la chromatine et des facteurs de transcription le long de ce gène. D’autre part, des études de localisation des sites d’interactions protéiques d’UBF, un facteur de transcription associé à l’ADNr, à la grandeur du génome couplé à des expériences de DNase-seq et de microarray ont permis de mettre en lumière les rôles potentiels d’UBF dans les régions non ribosomiques. En conclusion, nous avons développé un outil permettant la normalisation par déconvolution de données de séquençage haut-débit qui permet d’augmenter la résolution du profil de liaison protéique sur l’ADNr en plus d’identifier les rôles potentiels d’UBF à l’échelle du génome.Chromatin immunoprecipitation followed by massively parallel sequencing (ChIP-seq) is a technique that allows to visualize interactions between DNA and proteins. However in practice, the resolution of this technique leaves much to be desired. During our studies of the ribosomal RNA genes (rDNA), we observed that one major factor limiting resolution results from the unequal recovery of sequence data across any given locus. This inequality is superimposed on the actual distribution of immunoprecipitated DNA sequences resulting in aberrant protein binding profiles. A software was developed to correct the unequal coverage of ChIP-seq data by normalizing to the input (Whole Cell Extract) with a deconvolution protocol. When applied on the rDNA, this approach has been especially useful in providing a detailed map of chromatin and transcription factor distribution across the gene. On the other hand, genome-wide localization of protein interaction sites for UBF, a transcription factor associated to rDNA, coupled with DNase-seq and microarray experiments shed light on the potential roles of UBF in non-ribosomal regions. In conclusion, we developed a tool allowing the normalization by deconvolution of high-throughput sequencing data that allows to increase the resolution of protein binding profiles on the rDNA. In addition we identified the potential roles of UBF at genome scale.
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Pflieger, Aude. "Etude des interactions de PTF (Proximal sequence element-binding Transcription Factor) et de leurs foctions au sein de la transcription par L'ARN polymérase III humaine." Bordeaux 2, 2006. http://www.theses.fr/2006BOR21389.
Full textAbstract:
Afin d'étudier la structure et la fonction du complexe PTF au sein du système basal de transcription par l'ARN polymérase III humaine mais aussi afin d'élargir les connaissances à l'extérieur de ce système et mettre en évidence des régulateurs de la transcription par l'ARN polymérase III, j'ai entrepris par double-hybride l'étude des partenaires d'interactions des sous-unités de ce complexe. J'ai montré in vitro une interaction enttre les sous-unités PTFα et PTF β ainsi qu'entre les protéines PTFα et Brf2. J'ai mis en avant un régulateur potentiel de la transcription par l'ARN polymérase III. Un modèle de régulation faisant intervenir cette protéine posé au laboratoire semble se confirmer. Les résultats obtenus sont très encourageants et importants étant donné que nous savons que lors de la transformation cellulaire la transcription par l'ARN polymérase III est dérégulée. Cependant des expériences compléùentaires sont nécessaires à la confirmation de ce modèleIn order to study the structure and the function of the complex PTF within the human RNA polymerase III transcription basal system but also in order to widen knowledge outside this system and to highlight regulators of the RNA polymerase III transcription, I undertook by double-hybrid the study of the interaction partners of the complex sub-units. I showed in vitro an interaction between sub-units PTFα and PTFβ and between proteins PTFα and Brf2. I proposed a potential regulator of the RNA polmerase III transcription. A model of regulation utilizing this protein posed at the laboratory seems to be confirmed. The results obtained are very encouraging and important since we know that during cellular transformation the RNA polymerase III transcription is down-regulated. However complementary experiments are necessary to confirm this model
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Zlatev, Ivan. "Synthèse et étude d'analogues de dinucléosides phosphoramidates - inhibiteurs de la polymérase NS5B du Virus de l’Hépatite C." Montpellier 2, 2008. http://www.theses.fr/2008MON20129.
Full textAbstract:
Avec plus de 3 % de la population mondiale actuellement infectée, l'hépatite C est une des plus graves maladies infectieuses. La recherche et la mise au point de nouvelles molécules, capables de traiter ou de conduire à l'éradication de cette maladie, sont donc d'une grande importance. Nous présentons dans ce manuscrit le développement et la synthèse de deux séries de dinucléosides phosphoramidates de type 2'-O-méthylguanosin-3'-yl-cytidin-5'-yle et de type 2'-O-méthylguanosin-3'-yl-3'-désoxycytidin-5'-yle, utilisés comme inhibiteurs de la polymérase NS5B du VHC. Ces composés ont été évalués in vitro sur une polymérase purifiée et en culture cellulaire contenant un réplicon sub-génomique du virus. Ils ont montré un modeste caractère inhibiteur de la réplication du VHCWith more than 3% of the world's population chronically infected, hepatitis C is nowadays one of the leading infectious diseases. The research and development of novel antiviral molecules is hence of great importance. We describe in this manuscript the development and the synthesis of two major series of phosphoramidate dinucleosides 2'-O-methylguanosin-3'-yl-cytidin-5'-yle and 2'-O-methylguanosin-3'-yl-3'-désoxycytidin-5'-yle, used as HCV polymerase inhibitors. The target compounds were evaluated in vitro on a purified recombinant NS5B polymerase and in cells containing a HCV sub-genomic replica. Tested compounds exhibited modest inhibitory activity towards HCV replication
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Van, Herreweghe-Argentieri Elodie. "Régulation de l'élongation de la transcription par les ribonucléoparticules contenant l'ARN 7SK." Toulouse 3, 2008. http://thesesups.ups-tlse.fr/297/.
Full textAbstract:
Chez les eucaryotes, la synthèse des ARN messagers (ARNm) par l'ARN polymérase II nécessite l'action du facteur positif d'élongation de la transcription P-TEFb. Ce facteur, composé de la protéine kinase cdk9 et de la cycline T1, permet l'élongation des ARNm par phosphorylation de l'ARN polymérase II. Dans les cellules HeLa, 50% du facteur P-TEFb sont associés à un complexe ribonucléoprotéique contenant le petit ARN nucléaire 7SK et une protéine HEXIM. Au sein de ce complexe, l'activité kinase de P-TEFb est abolie. Cette interaction est donc un mécanisme central dans le contrôle de l'activité de P-TEFb. Jusqu'à présent, P-TEFb et HEXIM étaient les seuls partenaires protéiques connus de l'ARN 7SK. Des expériences menées au sein de notre équipe ont permis d'identifier de nouveaux partenaires in vitro de l'ARN 7SK. Nous avons également pu confirmer que l'ARN 7SK interagit in vivo avec les protéines hnRNP A1, hnRNP A2/B1, hnRNP R/Q et RHA. Toutes ces protéines appartiennent à un complexe différent de celui contenant HEXIM et P-TEFb. Il existe donc en réalité plusieurs ribonucléoparticules contenant l'ARN 7SK. Ces particules sont en équilibre dynamique entre elles et peuvent s'échanger, par exemple lors d'un stress cellulaire, dans le sens d'une libération accrue du facteur P-TEFb. La liaison des protéines hnRNP à l'ARN 7SK est essentielle pour le relargage de P-TEFb en réponse à un stress et participe donc activement à la régulation de l'activité de P-TEFb. Ces données ouvrent de nouvelles pistes dans la compréhension des mécanismes cellulaires qui entrent en jeu dans la régulation de l'activité de P-TEFb, élément crucial dans le contrôle global de l'équilibre entre croissance et différenciation cellulaireIn eukaryotic cells, messenger RNA synthesis by RNA polymerase II requires activity of the positive transcription elongation factor P-TEFb. This factor, composed of cyclin-dependent kinase 9 (cdk9) and cyclin T1, allows transcription elongation of cellular messenger RNA by RNA polymerase II phosphorylation. In HeLa cells, 50% of P-TEFb is included into a ribonucleoprotein complex in addition to the small nuclear 7SK RNA and the HEXIM protein. When P-TEFb is involved in this complex, its kinase activity is abolished. Therefore , the interaction between P-TEFb, 7SK and HEXIM is a major control mechanism of P-TEFb activity. Until now, P-TEFb and HEXIM were the only identified partner of 7SK RNA. Our experiments allowed us to identify new proteins in vitro associated with 7SK. In addition, the in vivo binding of hnRNP A1, hnRNP A2/B1, hnRNP R/Q and RHA to 7SK has also been confirmed. These proteins are part of a complex different of the HEXIM/P-TEFb particule. 7SK is indeed found in several distinct ribonucleoparticules. These particles reside in a dynamic equilibrium and can be exchanged, for example under cellular stress, in favour of a release of free P-TEFb. So, hnRNP proteins binding to 7SK is an essential factor for P-TEFb release under stress and plays an active role in P-TEFb activity regulation. These data enable us to provide new clues in the understanding of the regulation of P-TEFb, which is a major actor in global control of cell growth and differentiation
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Devaux, Sara. "Recherche de facteurs impliqués dans le contrôle de l'expression des gènes d'antigènes de surface chez Trypanosoma brucei." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2007. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210740.
Full textAbstract:
Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface. Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome.
Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée.
Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines.
Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.
Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Bischler, Nicolas. "Etude structure-fonction des sous-unités spécifiques de l'ARN polymérase I de S. Cerevisiae par microscopie électronique et analyse d'images." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2001. http://www.theses.fr/2001STR13169.
Full text
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Canet, Sylvain. "Implication de la sous-unité RpoS de l'ARN polymérase dans la régulation de l'expression de malT en fonction du pH extracellulaire chez Escherichia coli." Lyon 1, 2005. http://www.theses.fr/2005LYO10169.
Full textAbstract:
Dans la nature, les bactéries entériques comme Escherichia coli sont soumises aux variations de nombreux paramètres de l'environnement comme la pénurie en nutriments, l'osmolarité, la température ou bien encore le pH extracellulaire (pHo). Chez E. Coli, plusieurs gènes ont une expression qui varie en fonction du pHo. Parmi ces gènes figurent les gènes du régulon maltose. En nous appuyant sur ce système modèle, nous avons mis en évidence le rôle de sigmaS (RpoS), une sous-unité de l'ARN polymérase, dans l'expression en fonction du pHo de l'activateur du régulon maltose MalT. Nous avons montré que la compétition entre les facteurs sigma70 et sigmaS pour l'accès au cœur de l'ARN polymérase serait partiellement responsable de la régulation de malT en fonction du pHo. De plus, le rôle du complexe CRP-AMPc dans la pHo-régulation de malT a également été confirmé et le mécanisme assurant cette régulation implique RpoS et le complexe CRP-AMPc. Ce mécanisme pourrait être de portée générale et concerner d'autres gènes régulés en fonction du pHo
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Darrière, Tommy. "Etude de l'ARN polymérase I et du rôle de ses sous-unités spécifiques chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30293/document.
Full textAbstract:
Dans les cellules eucaryotes, il existe 3 ARN Polymérases nucléaires (Pol I, II et III), chacune ayant une fonction de synthèse d'ARN qui lui est propre. L'ARN polymérase I (Pol I) est responsable de la synthèse du précurseur des grands ARN ribosomiques (ARNr), ce qui correspond à une activité de transcription massive dans la cellule. Des données structurales sur cette enzyme de 14 sous-unités sont disponibles. Ceci permet une meilleure compréhension de son mode de fonctionnement, et a confirmé que l'ARN Pol I possède 3 sous-unités spécifiques, aussi appelées "Built-in Transcription Factors", responsables d'activités régulatrices. Deux d'entres elles, Rpa49 / Rpa34, forment un hétérodimère structuralement proche des facteurs de transcription TFIIF et TFIIE de la Pol II, impliqués tant dans l'initiation que dans l'élongation de la transcription. La dernière, Rpa12, est connue pour avoir un rôle dans la stabilité de l'ARN Pol I et l'activité de clivage du transcrit de la polymérase en cours de pause (via son extrémité C-terminale), comme son homologue TFIIS, facteur de transcription de l'ARN Pol II. Nous avons effectué des études génétiques sur des mutants de l'ARN Pol I dépourvus de la sous-unité Rpa49 (rpa49Δ). Cette délétion est viable mais entraîne des problèmes d'initiation et élongation. Nous étudions dans ce travail le clonage et la caractérisation de "suppresseurs" extragéniques correspondant à des mutations ponctuelles de trois sous-unité de la Pol I qui rétablissent une synthèse d'ARNr en l'absence de la sous-unité Rpa49. Toutes ces mutations suppressives identifiées ont été localisées premièrement dans les deux grandes sous-unités Rpa190 et Rpa135, structuralement très proches de Rpa12, mais également au sein même de Rpa12, indiquant une possible interaction entre les sous-unités Rpa49 et Rpa12 ou la région autour. Notamment, un élément spécifique de l'ARN Pol I dans Rpa190, le "DNA Mimicking Loop", est structuralement très proche de la région où l'on trouve ces mutations suppresseur. Les caractérisations génétiques, structurales, mais aussi biochimiques et fonctionnelles de ces suppresseurs nous permettent de proposer des hypothèses sur les rôles de Rpa49 et de Rpa12, mais aussi de cette petite région de Rpa190, en l'initiation de la transcription, ce qui n'a jamais été mis en évidence auparavantIn eukaryotes cells, there are 3 nuclear RNA Polymerases (Pol I, II and III), each having a particular RNA synthesis function. The RNA Polymerase I (Pol I) produces a single transcript: the precursor of the large ribosomal RNA (rRNA), which correspond to a massive transcription activity in the cell. Structural data of this 14-subunits enzyme is now available. This allows a better understanding of its operating mode, and confirmed that the Pol I has 3 specific subunits, also called "Built-in transcription factors", capable of regulatory activities. Two of them, Rpa49/Rpa34, are forming a heterodimer structurally related to the Pol II transcription factors TFIIF and TFIIE, implicated in both initiation and elongation of the transcription. The last one, Rpa12, is known to have a role in Pol I stability and the cleavage activity of the paused Pol I (via its C-terminus part), like its homologous TFIIS in the Pol II. We performed extensive genetic studies of Pol I mutants lacking one of these subunits: Rpa49 (rpa49Δ). This depletion is viable, but results in initiation and elongation problems. Here, we report the cloning and characterization of extragenic suppressors mapping point mutations in three subunits of Pol I restoring efficient Pol I activities in absence of Rpa49. All suppressor mutations identified were structurally mapped firstly in the two largest subunits Rpa190 and Rpa135 very closed to Rpa12, and then in Rpa12 itself, indicating a possible interplay between the Rpa49 and Rpa12 subunits, and the area around. Notably, a RNA pol I specific element in Rpa190, called "DNA Mimicking Loop", is structurally very closed to the region in which we find all of our suppressor mutations. The genetic, structural but also biochemical and functional characterizations of these suppressors allow us to propose roles of these Rpa49 and Rpa12 subunits, but also of the small area of Rpa190, which has never been highlighted before
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Cavallini, Bruno. "Mise en évidence, purification, et clonage du gène, d'un facteur général de transcription de l'ARN polymérase B." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1990. http://www.theses.fr/1990STR13159.
Full textAbstract:
La compréhension des mécanismes de régulation de l'expression des gènes codant pour les protéines chez les eucaryotes passe par l'identification et la caractérisation des séquences d'ADN promotrices et des diverses protéines qui s'y lient. On distingue les séquences modulatrices et celles constituant le promoteur minimal. Ces dernières sont responsables du positionnement précis du site d'initiation de la transcription et de l'établissement d'un niveau basal de transcription. On reconnait 2 éléments de séquence dans les promoteurs minimaux des gènes de classe B. Un élément initiateur, et la séquence 5'-TATAAA-3' encore appelée TATA-box. Cette séquence placée 30 paires de bases en amont des sites d'initiation interagit avec le facteur général de transcription BTF1 (TFIID). Cette interaction est la 1ère étape de l'assemblage du complexe d'initiation, qui comprend outre BTF1, l'ADN, l'ARN polymérase B, et au moins 4 autres facteurs généraux de transcription. BTF1 est le seul facteur général de transcription à interagir de manière spécifique avec l'ADN, il joue un rôle clé dans l'établissement de la transcription basale et dans les phénomènes de transactivation. Il s'est révélé impossible de purifier le facteur BTF1 à partir de cellules d'eucaryotes supérieurs. Utilisant un test de transcription in vitro, nous avons mis en évidence le facteur TATA-box de S. Cerevisiae, BTF1Y. Puis nous l'avons caractérisé et purifié par fractionnement chromatographique. C'est un polypeptide de 27 kDa semblable au facteur BTF1 humain dans ses caractéristiques de liaison aux séquences TATA-box et d'initiation de la transcription. Nous avons cloné le gène l'encodant. Ce gène situé sur le chromosome VIII de S. Cerevisiae est unique et essentiel. Il code pour un polypeptide de 240 résidus, à caractère fortement basique, et qui ne montre aucune homologie avec une quelconque protéine connue. Nous avons remarqué un domaine dupliqué en tandem dans la partie COOH terminale de la protéine. Entre ces 2 régions répétées, une zone est susceptible d'adopter une conformation en hélice α qui présenterait sur une face une majorité de résidus basiques (Lys, Arg). L'importance de ces éléments structuraux est encore incertaine. Le clonage du gène codant BTF1Y a ouvert la voie au clonage du gène humain homologue. La protéine BTF1Y surexprimée dans E. Coli est d'ores et déjà disponible pour l'analyse détaillée de ses propriétés biochimiques et de son rôle dans les mécanismes d'initiation de la transcription des gènes de classe B.
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Touzain, Fabrice. "Recherche des sites de régulation de la transcription dans des génomes bactériens." Thesis, Nancy 1, 2007. http://www.theses.fr/2007NAN10097.
Full textAbstract:
Nombre de programmes ont été développés pour identifier des sites de fixation de facteurs de transcription. La plupart ne sont pas capables d’inférer des motifs composés de deux mots en autorisant une variation de leur espacement, caractéristiques des sites de fixation des sous-unités s de l’ARN polymérase (SFFS). Cette thèse vise à l’élaboration d’un algorithme prenant en compte toutes les connaissances biologiques structurelles de ces sites en vue de leur prédiction fiable. Nous présentons une nouvelle approche, SIGffRid (pour SIGma Factor Finder using R’MES to select Input Data), pour l’identification des SFFS qui compare deux génomes bactériens phylogénétiquement apparentés. La méthode analyse des paires de régions promotrices de gènes orthologues. Elle utilise la sur-représentation statistiquement dans les génomes complets comme critère de sélection des boîtes -35 et -10 potentielles. Des motifs composites conservés sont alors groupés en utilisant des paires de courtes graines, en autorisant la variabilité de l’espacement qui les sépare. Les motifs sont ensuite étendus suivant des considérations statistiques. Les plus significatifs sont retenus. Cet algorithme a été applique´ avec succès à la paire de génomes bactériens apparentés de Streptomyces coelicolor A3(2) et Streptomyces avermitilis. Nous démontrons que notre approche, combinant des critères statistiques et biologiques, parvient à prédire des SFFS, et abordons les améliorations envisagéesMany programs have been developed to identify transcription factor binding sites. Most of them are not able to infer two-word motifs with variable spacer lengths, characteristics of RNA polymerase Sigma (s) Factor Binding Sites (SFBSs). The aim of this thesis is to design an algorithm taking into account the biological structural observations about these sites, in order to their relevant prediction. We describe a new approach, SIGffRid (SIGma Factor binding sites Finder using R’MES to select Input Data), to identify SFBSs by comparing two related bacterial genomes. The method performs a simultaneous analysis of pairs of promoter regions of orthologous genes. SIGffRid uses a prior identification of over-represented patterns in whole genomes as selection criteria for potential -35 and -10 boxes. These patterns are then grouped using pairs of short seeds, allowing a variable-length spacer between them. This is followed by motif extension guided by statistical considerations. Finally, statitically feasible and relevant motifs are selected. We applied our method to the pair of related bacterial genomes of Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces avermitilis. We demonstrate that our approach combining statistical and biological criteria was successful to predict SFBSs, and envisage ameliorations