Academic literature on the topic 'Astrocitai'

Introduction: Alzheimer's disease is the most common neurodegenerative disorder, characterized by the formation of amyloid plaques and the neurofibrillary tangles in the brain of an ill person, leading to neuronal damage and loss. Activation of astrocytes and astrogliosis occurs along with this process. Due to ethical limitations in working with human tissue, numerous transgenic animal models have been developed to study the pathogenesis of these processes. Early Ab deposition is observed in the cortex and the hippocampus. Aim: This study aimed to determine the difference in the presence of GFAP positive cells in the hippocampus between transgenic 5xFAD mice aged 36 weeks and their corresponding controls. Material and Methods: The 5xFAD mice model of Alzheimer's disease was used, characterized by early formation of amyloid plaques but without the presence of neurofibrillar tangles. Transgenic and control animals were sacrificed at 36 weeks of age. The visualization of GFAP-positive cells in the hippocampus of their brains was done by using immunohistochemistry and antibody for glial fibrillary acidic protein - GFAP, the major marker of astrocytes. Quantification of immuno-reactivity was done by using the Icy software system. Results: There was a statistically significant difference in the expression of GFAP in the dentate gyrus and the granular zone of the hippocampus between the transgenic and control group at 36 weeks of age, while the significant change in the CA1-3 regions was not observed between investigated groups. Conclusion: Obtained results confirm the involvement of astrogliosis in the pathophysiology of Alzheimer's disease and indicate an earlier occurrence of astrogliosis in the dentate gyrus and granular zone, in relation to other regions of the hippocampus, in the 36-week-old 5xFAD mice.

7 casi di astrocitoma subependimale a cellule giganti in pazienti affetti da sclerosi tuberosa sono stati studiati con TC e/o RM senza e con contrasto. Il comportamento delle lesioni alla TC e alla RM è stato messo a confronto al fine di analizzare le possibilità e i limiti delle due metodiche. La conclusione è stata che per il monitoraggio dei noduli subependimali in evoluzione e per il controllo dei pazienti portatori di astrocitoma subependimale a cellule giganti la RM è l'esame più utile.

Este artículo presenta los hallazgos clínico-patológicos de 3 pacientes preseniles, que murieron entre los 4 y 9 1/2 meses del inicio de una enfermedad subaguda, caracterizada clínicamente por el desarroll0 en forma progresivamente rápida, de deterioración mental, rigidez generalizada, hiperreflexia osteotendinosa y tremor de los dedos. Uno de los pacientes, que presentó además signo de Babinsky bilateral, mostró también sintomotoloqía de disfunción cerebelosa y en otro de ellos el examen clínico reveló la presencia de una ceguera de tipo cerebral. En los tres casos, el líquido céfalo raquídeo tuvo características normales; el electroencefalograma sugirió disfunción cerebral difusa y el pneumoencéfalograma mostró una moderada, pero generalizada dilatación del sistema ventricular. Al examen patológico, los tres cerebros aparecieron externamente negativos y las secciones coronales de ellos, sólo mostraron una dilatación moderada de los ventrículos laterales. Microscópicamente, se pudo observar una marcada hipertrofia e hiperplasia astrocitaria, presente en regiones del neo-cortex, neo-estriatum, núcleo anterior del tálamo óptico, hipotálamo y tubérculos cuadrigémínos pero, ausente o mínima en regiones del arquicortex, globus pallidum y otras porciones del tálamo óptico y tronco encefálico. Todas estas áreas, ya sea aquellas con cambios astrocitarios como las que no los mostraron, presentaron sin embargo, una degeneración neuronal inespecífica, de intensidad moderada y aproximadamente igual en todas ellas y así mismo revelaron discretas modificaciones en los axones, las vainas de mielina u otras estructuras neurales. En uno de los casos el grado de compromiso neuronal fue particularmente más intenso en la corteza occipital posiblemente condicionando la ceguera cortical que este paciente presentaba y en otro, una pérdida entre moderada y marcada de células granulares y de Purkinje de la corteza cerebelosa estaba relacionada posiblemente a la sintomatología cerebelosa que dicho paciente presentó. Este pattern de cambios hístolócicos, bien podría delinear una entidad específica dentro del grupo heterogéneo de casos actualmente incluídos en el síndrome de Creutzfeldt-Jakob y por otro lado sugeriría la posibilidad de que los cambios en los astrocitos observados, representen una reacción primaria o mejor una reacción a un efecto nocivo directo de los factores patogenéticos operantes en estos casos; más que un fenómeno secundario sea a los cambios neuronales o a los de otros componentes del sistema nervioso central.

Pastaruoju metu tyrimams dažniausiai naudojami žinduoliai, kadangi rezultatai šiek tiek atspindi žmogaus organizme vykstančius procesus. Šis darbas parengtas analizuojant besivystančias paukščio embriono sistemas: tai būdas, leidžiantis sutaupyti lėšų bei dėka trumpo embrioninio vystymosi laikotarpio suteikiantis galimybę operatyviam rezultatų gavimui. Iki šiol literatūroje neradome duomenų apie pirmojo raumens susitraukimo ypatybes, o šį procesą įtakojančios nervų sistemos vystymąsi apibūdina keletas hipotezių. Taigi darbo tikslas buvo išsiaiškinti pirmojo susitraukiančiojo raumens atsiradimo laiką, jo morfologiją (1) ir išanalizuoti ankstyvajame embriogenezės laikotarpyje kontraktilų aparatą įtakojančios nervų sistemos vystymosi ypatumus (2). Tyrimams naudojome kalakuto ir vištos embrionus – kadangi skirtingų porūšių skirtumai mums nebuvo svarbūs, palyginimas tarp minėtų paukščių embrionų neatliktas. Embrionai buvo stebimi in vivo, tyrimams in vitro atlikti buvo naudojami šie molekulinės biologijos metodai: paruoštų pjūvių dažymas histo- ir imunohistochemiškai, polimerazės grandininės reakcijos, ląstelių kultūrų auginimas ir Western blotas. Pirmasis aktyvus raumens susitraukimas kalakuto embrione atsiranda 19-22 Hamburgerio Hamiltono stadijoje, t.y., praėjus 116 val. nuo inkubacijos pradžios: porinis raumuo sudarytas iš keturių susiliejusių miomerų, yra 1 mm ilgio ir 0,1 mm pločio – šis iš dviejų ląstelių tipų sudarytas audinys atsakingas už pirmuosius aktyvius embriono... [toliau žr. visą tekstą]<br>The purpose of the study was to characterize the first contraction of an isolated muscle in turkey embryo and to determine whether at early stages of chicken brain development during neurogenesis, cells from the astrocytic lineage are present in relevant amounts, where they are located in the neural tube, and to what extend brain regional differences exist. MATERIAL AND METHODS. From the 3rd day of incubation on until the 6th day the embryos were continuously watched through a cellophane window in the eggshell. For histology the embryos were fixed in Bouin's fluid, then completely cut in serial sections of 5 microm thickness and stained according to Masson-Goldner's trichrome procedure plus resorcin-fuchsin. For gene expression analysis markers for stem cells, neurons and astrocytes were used. Immunohistochemistry was made against SMI 312 and GFAP antibodies and Western blot against GFAP as well. RESULTS. A paired muscle 1 mm long and 0.1 mm broad, derived by fusion of the four occipital myomeres, is responsible for the first individual contraction. The contraction produces a stretching in the neck region. The muscle named M. occipitalis primordialis consists of four end-to-end connected groups of mononucleated muscle cells. The muscle contains two types of cells according to the cell nuclei. The elastic rod-shaped notochord represents an endoskeleton. Immediately after contraction it brings the body of the embryo back into its former shape. We also demonstrate that specific... [to full text]

OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular más abundante en el sistema nervioso central (SNC) desempeñan un papel clave en la homeostasis, la neurotransmisión y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamación, es decir, el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas, o la neurodegeneración. El astrocito es extremadamente plástico, respondiendo a un amplio repertorio de estímulos fisiológicos o insultos patológicos con cambios morfológicos, migración, o cambios funcionales por modificación de su expresión génica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamación. En el primer bloque hemos estudiado el efecto de un factor trófico de especial importancia en el SNC, el Factor Básico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresión de genes inflamatorios astrocitarios. El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresión en el SNC adulto es muy alta, localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones patológicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. Así como las propiedades tróficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria está pobremente caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y CHF5074) los cuales, según estudios epidemiológicos, reducen la aparición de la enfermedad de Alzheimer, de modular la dinámica del citoesqueleto de actina astrocitario. METODOS/MODELOS: Modelo de inflamación (LPS o scratch-wound en cultivos primarios de astrocitos. Estudio expresion moléculas: RTPCR, Western Blot, inmunocitoquímica, ELISAS, GLISAS. Manipulación mecanística: inhibidores farmacológicos, sobreexpresión de proteínas mutantes dominantes negativos o constitutivamente activos. RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una manera bifásica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estadíos iniciales la expresión de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1 y de COX2 e inhibe la expresión de ICAM1 en estadíos más avanzados. Esta regulación es dependiente de las vías de señalización de ERK, JNK y FAK a través de la activación del receptor FGFR2 pero independiente del factor de trasncripción NF-kB. Mostramos también que el tratamiento de astrocitos con ibuprofeno y derivados produce un rápido cambio morfológico caracterizado por una retracción del soma y emisión de procesos dependiente de la modulación de las proteínas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana “clásica” de los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del R-Flurbiprofeno y CHF5074. CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos que el carácter bifásico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la inflamación pero evitando su cronificación. Además mostramos que los profenos son capaces de promover la aparición de fenómenos plásticos en astrocitos a través de la modulación de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estén implicados.<br>GENERAL GOAL: Astrocytes, the main celular type in the Central Nervous System, play important roles in the homeostasis , neurotransmission and also in neuroinflammation. Astrocyte is a plastic celular type, wich is able to respond to a variety of physiologic and pathologic stimuli with morphological, migrational changes and also adaptating its gene expression. The goal of this thesis has been to study the astrocytic plasticity in two different paradigms related to neuroinflammation. In the first part of this thesis we have studiedd the effect of FGF2, a groth factor wich enriched expression in astrocytes wich and is upregulated during inflammatory conditions. The role of FGF2 in neuroinflammation is not known. In the second part we have analyzed the hability of some non-steroidal-antiinflammatory drugs (NSAIDS), wich are known to reduce the incidence of Alzheimer Disease, like ibuprofen and R-Flurbiprofen, in modulating astrocyte cytoskeleton dynamics. MODEL/METHOD: Inflammation model (LPS-induced or scratch-wound induced neuroinflammation in primary rat astrocytes). RNA and protein detection: Real Time PCR, Western Blot, ELISA, G-LISA. Molecular manipulation by pharmacological inhibition or overexpression of protein mutants. RESULTS: FGF2 regulates inflammatory gene expression in primary astrocytes in a biphasic manner: it potentiates LPS-induced MCP1 and COX2 expression in the first hours of the inflammatory reaction, while it inhibits ICAM expression in the later phases. This effect is dependen ton ERK, JNK and FAK signalling pathways by means of the activation of the FGFR2 but independent on NF-kB transcription factor. We also show that treatment of astrocytes with ibuprofen and derivatives produces astrocyte stellation wich involves the modulation of Rho-GTPases RhoA, Rac1 and cdc42. This effect is not dependent on COX the classical target of NSAID. This stellate phenotype results in changes in the migratoy capacity of astrocytes. CONCLUSIONS: FGF2 is an inmunomodulatory molecule in the inflammatoy reaction of astrocytes. We speculate that it’s biphasic regulation of inflammatory gene expression enables the beneficial effects of inflammation inhibiting its cronification. In addition we have shown that profens promotes plastyc phenomenoms in astrocyte by regulating new targets, like Rho-GTPases, opening new perspectives in neurodegenerative disorders where astrocytes may play a role.

Tesis de Maestría en Ciencias de la Salud. Investigación científica original e inédita.<br>Las enfermedades crónicas no transmisibles (ECNTs) son consideradas un problema de salud pública. Su prevalencia en México alcanza el 75% de la población adulta y están fuertemente asociadas a la presencia de obesidad. Modificaciones en la cantidad de calorías y composición de la dieta han sido estrategias recomendadas para su prevención. Por lo tanto, los edulcorantes no calóricos se han convertido en una alternativa atractiva para tratar estas enfermedades, aunque recientemente, existe evidencia que sugiere que estos compuestos pueden tener efectos negativos en el metabolismo y homeostasis energético. El sistema endocanabinoide (SEC) es un importante regulador del metabolismo de la energía en el organismo. Sus efectos dependen de la activación de dos receptores localizados principalmente en el sistema nervioso central (SNC) conocidos como CB1 y CB2. El receptor CB1 se localiza principalmente en células del SNC, incluyendo los astrocitos, los cuales, son responsables del mantenimiento de las funciones neuronales, la homeostasis de energía en el tejido nervioso y regulación del intercambio de nutrientes entre el SNC la circulación sistémica. La modificación de la disponibilidad de glucosa a través de la suplementación de edulcorantes no calóricos provocan cambios en la expresión del receptor CB1 en tejido adiposo, alterando sus funciones, sin embargo, a pesar de que estos compuestos son utilizados indiscriminadamente a nivel mundial, los estudios que evalúen otros efectos fisiológicos son muy limitados. El objetivo de este trabajo fue determinar si el consumo crónico de edulcorantes calóricos y no calóricos altera la expresión de CB1 en tejido nervioso, específicamente en astrocitos. Para este fin, ratones adultos machos y hembras fueron suplementados con edulcorantes calóricos y no calóricos durante 6 semanas y los cambios en la expresión de CB1 fueron analizados por medio de inmunofluorescencia y western blot. Los resultados muestran una mayor expresión de CB1 en el cerebro completo y en astrocitos de los grupos suplementados con edulcorantes no calóricos, en comparación con el grupo sin suplementación. Estos datos nos indican que la ingesta frecuente de edulcorantes no calóricos, modifica las funciones del SEC en el tejido nervioso, lo que podría tener un efecto relevante en el metabolismo energético y las funciones neuronales.<br>UAEM, Proyecto 4320/2017/CI

El tema de esta tesis ha sido el estudio de los mecanismos de neurodegeneración asociados al envejecimiento cerebral y el papel que desempeñan los astrocitos como neuroprotectores utilizando modelos animales in vitro e in vivo.<br/>Los astrocitos son las células más abundantes del sistema nervioso central y su función es muy importante, además de dar soporte trófico a las neuronas tienen una función anticitotóxica y modulan la actividad neuronal. El papel de los astrocitos y su activación en el envejecimiento es un proceso poco conocido. Un mayor conocimiento de esta célula glial puede ayudarnos a entender los cambios fisiopatológicos que conlleva el paso de los años en el cerebro humano. El envejeciemiento cerebral es un factor de riesgo de enfermedades neurodegenerativas y en esta tesis se ha estudiado especialmente la enfermedad de Alzheimer por su alta incidencia en la población de edad avanzada.<br/><br/>En esta tesis hemos establecido y caracterizado dos modelos para el estudio del envejecimiento de los astrocitos in vitro y hemos evaluado su capacidad neuroprotectora.<br/><br/>Primero hemos evaluado los cambios en el estrés oxidativo, la captación de glutamato y la expresión proteica en astrocitos corticales de rata en cultivos de 10 y 90 días in vitro (DIV). Observamos un aumento de estrés oxidativo e inflamación con generación de especies reactivas de oxígeno y una disminución de la actividad mitocondrial a los 90 DIV.<br/><br/>La expresión de las proteínas nitrosiladas, la Cu/Zn-superóxido dismutasa (SOD-1), la hemoxigenasa 1 (HO-1) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) aumenta en los astrocitos envejecidos. La captación de glutamato en los astrocitos de 90 DIV era mayor que en los astrocitos de 10 DIV probablemente debido a la regulación al alza del transportador glutamato/aspartato. Los astrocitos envejecidos tenían una menor capacidad de mantener la supervivencia neuronal. Estos hallazgos indican que los astrocitos pueden perder en parte su capacidad neuroprotectora durante el envejecimiento. <br/><br/>En nuestro segundo modelo hemos estudiado los cambios en la fosforilación de tau, el estrés oxidativo y la captación de glutamato en cultivos primarios de astrocitos de la corteza de ratones neonatos de senescencia acelerada SAMP8 comparados con los de ratones resistentes a la senescencia (SAMR1). Hemos demostrado un incremento de la hiperfosforilación de tau y de actividad de quinasa de Gsk3&#946; y Cdk5, que regulan la fosforilación de tau, en los astrocitos de SAMP8. La inhibición de Gsk3&#946; por litio o la de Cdk5 por roscovitina reducen la fosforilación de tau en Ser396. Además, hemos detectado un aumento de estrés oxidativo y una reducción en el potencial de membrana mitocondrial en los astrocitos de los ratones SAMP8. Los astrocitos SAMP8 muestran una disminución en la captación de glutamato comparada con la de los controles SAMR1. Interesantemente, la supervivencia de las neuronas SAMP8 y SAMR1 en cocultivo con astrocitos SAMP8 estaba reducida de manera significativa. Nuestros resultados sugieren que estas preparaciones in vitro son adecuadas para el estudio a nivel molecular y celular de los procesos subyacentes en el envejecimiento temprano de este modelo murino<br/><br/>Además hemos estudiado la función neurotrófica de los astrocitos observando si un aumento de su capacidad neurotrófica mejora la funcionalidad neuronal en el envejecimiento. <br/><br/>El factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) fue probado para observar sus efectos neurotróficos contra la atrofia neuronal que causa déficits cognitivos en la vejez. Las ratas envejecidas Fisher 344 con deficiencias en el laberinto de Morris recibieron inyecciones intrahippocampales de un vector lentiviral que codifica GDNF humano en los astrocitos o del mismo vector que codifica la proteína fluorescente verde humana como control. El GDNF secretado por los astrocitos mejoró la función de la neurona como se muestra por aumentos locales en la síntesis de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina y serotonina. El aprendizaje espacial y la prueba de memoria demostraron un aumento significativo en las capacidades cognitivas debido a la exposición de GDNF, mientras que las ratas control mantuvieron sus resultados al nivel del azar. Estos resultados confirman el amplio espectro de la acción neurotrófica del GDNF y abre nuevas posibilidades de terapia génica para reducir la neurodegeneración asociada al envejecimiento.<br/><br/>Por último hemos estudiado in vitro e in vivo si en un ambiente de estrés oxidativo, como se produce durante el envejecimiento, los astrocitos tienen una respuesta más elevada al péptido betamieloide.<br/><br/>La neurotoxicidad por el péptido betamieloide (A&#946;) está propuesto como el primer paso de una cascada de eventos perjudiciales para la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los efectos tóxicos del A&#946; sobre los astrocitos podrían contribuir a desarrollar cambios neurodegenerativos que conducen a la EA. Hemos estudiado los efectos de A&#946;42 sobre ls cultivos de los astrocitos humanos en la presencia o ausencia de los agentes prooxidantes como butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor de síntesis glutatión y FeSO4 que libera hierro redox activo. Condiciones prooxidantes potenciaron la toxicidad del A&#946;, que se demostraron por la generación de radicales libres, cambios inflamatorios y apoptosis en los astrocitos humanos. Un tratamiento similar fue ensayado en la rata in vivo. Una mezcla del A&#946;40 y A&#946;42 o sólo del A&#946;42 fue infundida intracerebroventricularmente durante 4 semanas. Otros grupos animales eran simultáneamente infundidos con BSO y Fe. Un análisis realizado 4 meses más tarde mostró un mayor deterioro cognitivo en el laberinto acuático de Morris con el tratamiento de A&#946; conjuntamente con los tratamientos con agentes prooxidantes. Agentes prooxidantes también potenciaron la patología del tejido cerebral, así los estudios histológicos mostraron una mayor reactividad astroglial, depósitos de A&#946; y daño oxidativo en las neuronas hipocámpicas sensibles a EA.<br><i>The subject of this thesis has been the study of neurodegeneration mechanisms associated with the aging brain and the role played by the astrocytes as neuroprotective using animal models in vitro and in vivo. <br/><br/>In the first study, we evaluate the neuroprotective capacity of astrocytes in an in vitro experimental model of aging.Changes in oxidative stress, glutamate uptake and protein expression were evaluated in rat cortical astrocytes cultured for 10 and 90 days in vitro (DIV). Aged astrocytes had a reduced ability to maintain neuronal survival. These findings indicate that astrocytes may partially loose their neuroprotective ability during aging. In the next study, we examine changes in tau phosphorylation, oxidative stress and glutamate uptake in primary cultures of cortical astrocytes from neonatal senescence-accelerated prone mice (SAMP8) and senescence-accelerated resistant mice (SAMR1). Our findings suggest that this in vitro preparation is suitable for studying the molecular and cellular processes underlying early aging in this murine model.In the next study glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) was assayed for its neurotrophic effects against the neuronal atrophy that causes cognitive deficits in old age. Aged Fisher 344 rats with impairment in the Morris water maze received intrahippocampal injections of either a lentiviral vector encoding human GDNF in astrocytes or the same vector encoding human green fluorescent protein as a control. Astrocyte-secreted GDNF enhanced neuron function as shown by local increases in synthesis of the neurotransmitters acetylcholine, dopamine and serotonin. Spatial learning and memory testing showed a significant gain in cognitive abilities due to GDNF exposure, whereas control-transduced rats kept their performance at the chance level. These results confirm the broad spectrum of the neurotrophic action of GDNF and open new gene therapy possibilities for reducing age-related neurodegeneration.<br/><br/>Finally we studied the effects of A&#946; on cultures of human astrocytes in the presence or absence of pro-oxidant agents. Pro-oxidant conditions potentiated A&#946; toxicity, as shown by the generation of free radicals, inflammatory changes and apoptosis. A similar treatment was assayed in rats in vivo. Pro-oxidant agents also potentiate brain tissue pathology. This was demonstrated in histological studies that showed highly increased astrocyte reactivity in AD-vulnerable areas, A&#946; deposits and oxidative damage of AD-sensitive hippocampal neurons. </i>

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario<br>Los astrocitos son el tipo celular más abundante de la glia en el Sistema Nervioso Central y cuando son expuestos a factores sanguíneos durante un daño cerebral, éstos se vuelven “reactivos”, cambiando su forma estrellada a una de tipo fibroblasto. Los astrocitos “reactivos” también proliferan y migran al sitio dañado para formar la cicatriz glial, constituyendo uno de los mayores impedimentos para que ocurra la regeneración neuronal. Se piensa que estos cambios morfológicos que sufren los astrocitos in vivo, podrían tener una relación con los gatillados in vitro por Thy-1, una glicoproteína neuronal muy abundante, que se une a la Integrina αVβ3 en la membrana de astrocitos provocando cambios dramáticos en la forma de estas células. Con estos antecedentes se planteó la hipótesis de que la estimulación sostenida de la Integrina αVβ3por Thy-1 provoca la migración y/o proliferación de astrocitos, activando vías de transducción de señales que involucran a las proteínas quinasa PI3-K y Erk, respectivamente. Para poner a prueba esta hipótesis, se utilizaron ensayos in vitro de cicatrización de herida, la cual consiste en la remoción de una porción de células desde una monocapa de astrocitos en cultivo de la línea celular de rata DI-TNC1 con punta de pipeta y el subsecuente monitoreo de la migración de éstos al área libre de células después de la estimulación con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Adicionalmente, se realizaron en paralelo, análisis de Inmunofluorescencia indirecta a diferentes tiempos para la visualización de estructuras de avance como filopodios y lamelipodios en los astrocitos del borde de la herida estimulados con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Para demostrar la participación de la enzima PI3-K, los ensayos de cicatrización de herida se realizaron en presencia de inhibidores específicos de esta quinasa como son LY294002 y Wortmanina y mediante técnica de Inmunoblot se determinaron los niveles de fosforilación de un sustrato de esta enzima, la proteína Akt, en los astrocitos estimulados con el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A. Para determinar si el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A inducía cambios en la proliferación y viabilidad de los astrocitos, se utilizaron técnicas de MTS y de exclusión de azul de tripán, así como también se analizó el ciclo proliferativo de éstas células por citometría de flujo. Los resultados demuestran que Thy-1: 1) Induce la migración de los astrocitos DI-TNC1 al sitio de la herida; 2) Induce una mayor formación de estructuras de avance y migración como filopodios y lamelipodios, en los astrocitos del borde de la herida; 3) No induce proliferación ni aumento de la viabilidad de los astrocitos como tampoco cambios significativos en el ciclo proliferativo de éstas células; y 4) La quinasa PI3-K está implicada en la migración de los astrocitos estimulados por Thy-1. En conjunto, estos datos sugieren que la interacción de Thy-1 con la Integrina αVβ3 en la membrana de los astrocitos estimula cambios morfológicos llevando a estas células a una mayor adhesión celular para luego inducir su migración. Cabe destacar que la secuencia de eventos observados in vitro en este trabajo es similar a lo que ocurre en el proceso de astrogliosis, en el cual luego de un daño cerebral, los astrocitos se tornan reactivos, migran al sitio dañado y producen la cicatrización de la herida<br>Financiamiento: FIRCA 1R03TW006024 - FONDECYT 1040390 - FONDECYT 1070699

Doctor en Farmacología<br>Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento en el Repositorio Académico, hasta diciembre de 2016<br>Los astrocitos responden a un estímulo inflamatorio modificando su morfología y su patrón de expresión génica y participando en la formación de la cicatriz glial, en el caso de lesión traumática. La cicatriz glial se relaciona con la generación de un ambiente no permisivo para la regeneración axonal, el que contiene además moléculas responsables de la pobre reparación existente en el sistema nervioso central. Entre estas moléculas destacan los proteoglicanos de Condroitin sulfato secretado por los astrocitos que forman la cicatriz glial, la proteína Nogo presente en la membrana de los oligodendrocitos y, muy importantemente para este estudio, la glicoproteína Thy-1, presente en la superficie neuronal. Por muchos años, nuestro laboratorio ha estado enfocado en estudiar las funciones y modo de señalización de Thy-1, proteína anclada por un tallo glicosilfosfatidil inositol a la cara externa de la membrana plasmática. Evidencias indican que Thy-1 participa en la inhibición del crecimiento axonal y en mediar interacciones célula - célula. Hemos mostrado además que el efecto de Thy-1 ocurre por medio de dos receptores, la Integrina αvβ3 y Sindecán-4 presentes en los astrocitos de línea DITNC1. La interacción de Thy-1 con sus receptores por tiempos cortos induce un aumento de la adhesión de los astrocitos, mientras que la estimulación prolongada con Thy-1 induce la migración de estas células. La interacción de Thy-1 con sus receptores induce en los astrocitos la activación de cascadas transduccionales que llevan al aumento en la actividad, temporalmente diferenciado, de las GTPasas RhoA y Rac1 entre otros. Además Thy-1 induce la salida de ATP desde el astrocito que resulta en la activación del receptor P2X7 y la entrada de calcio extracelular. Se sabe que estas señales son necesarias para la adhesión de estas células; sin embargo, ¿Cómo sale el ATP de los astrocitos en respuesta a Thy-1? ¿Se requiere de este ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7 para la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1? Son preguntas que buscamos responder en este trabajo. Por otro lado, resultados de nuestro laboratorio muestran que, contrario a lo encontrado para los astrocitos DITNC1, astrocitos de cultivo primario no responden a Thy-1 y expresan niveles muy bajos de la Integrina β3. Además, se ha descrito que astrocitos primarios aumentan la expresión de esta Integrina en condiciones de daño por derrame cerebral. Dado que los astrocitos sufren cambios morfológicos y migran en condiciones proinflamatorias para reparar el daño, es posible que las diferentes respuestas observadas en los astrocitos primarios y los de línea celular frente al estímulo de Thy-1 se deban a los distintos niveles de integrina expresada por ambos tipo de células. Por lo tanto, en este estudio proponemos que la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1 requiere de la salida del ATP al espacio extracelular – por mecanismos aún por dilucidar – y de la activación del receptor P2X7. Además, que la baja expresión de la Integrina β3 no permite a los astrocitos de cultivo primario responder a Thy-1. Para estudiar la salida de ATP desde el astrocito y qué vías están involucradas se realizaron mediciones de ATP extracelular por técnicas de luminiscencia, incorporación de sondas fluorescentes a las células, medición de cinéticas de calcio intracelular, entre otras. Para evaluar los requerimientos en la migración inducida por Thy-1 se llevaron a cabo ensayos de cierre de herida y ensayos de polaridad celular. La participación de las distintas moléculas en los mecanismos estudiados se analizó con el uso de inhibidores farmacológicos, bloqueadores de canales o antagonistas de receptores, también se utilizó herramientas de modificación de la expresión génica de las moléculas estudiadas. Para monitorear la respuesta de los astrocitos primarios al estímulo de Thy-1, se realizó cultivos de astrocitos corticales, los que fueron tratados o no con citoquinas proinflamatorias como TNFα. Se analizó cambios de expresión de la Integrina β3 por Western Blot frente a este tratamiento. La respuesta migratoria de los astrocitos tratados con o sin TNFα, frente al estímulo de Thy-1 se realizó por ensayo de cierre de herida en distintas condiciones, como silenciando o sobreexpresando la Integrina β3. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que Thy-1 induce la salida de ATP, requiriendo la presencia de ambos sitios de interacción con sus receptores. Mutación en el sitio de unión a integrinas anula completamente la respuesta, mientras que la mutación en el sitio de unión a Sindecán-4 disminuye y retrasa la respuesta. Se demuestra en este trabajo que la salida de ATP ocurre a través de los hemicanales Conexina 43 y Panexina 1, abriéndose estos hemicanales por medio de un mecanismo que requiere de aumentos de calcio intracelular proveniente del retículo endoplásmico y que sale al citoplasma a través del receptor de IP3R. La salida de ATP es necesaria para el aumento en el área promedio de la adhesión focal y el aumento en el número de adhesiones focales por célula inducida por estimulaciones cortas con Thy-1. Estimulaciones prolongadas llevan a un aumento en la polaridad celular y en la migración de los astrocitos DITNC1, efecto que también requiere de la apertura de hemicanales, la presencia de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. La estimulación de los astrocitos con BzATP, agonista del receptor P2X7, a altas concentraciones estimula la migración celular, mientras que bajas concentraciones, por si solas, no provocan este efecto. Sin embargo, nuestros estudios muestran que frente a una estimulación concomitante de Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina y BzATP a bajas concentraciones es suficiente para inducir la migración de los astrocitos DITNC1 sugiriendo que el aumento extracelular de ATP requiere de la actividad del sitio de unión a Integrina de Thy-1. Estos resultados indican además que la activación del receptor P2X7 por ATP (o BzATP) y la ruta activada río debajo de la interacción de Thy-1 con probablemente Síndecan-4 (Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina posee sitio de unión a heparina intacto) son necesarias para inducir la migración de los astrocitos. Los astrocitos de cultivo primario cambiaron su fenotipo tras ser expuestos a la citoquina pro-inflamatoria TNFα, aumentando la expresión de las proteínas Integrina β3, GFAP y receptor P2X7, lo que permitió también a los astrocitos migrar en respuesta a Thy-1. Ensayos realizados con astrocitos primarios en que se sobre-expresa o silencia el gen codificante para la Integrina β3, demostraron que la respuesta a Thy-1 luego del tratamiento con agentes pro-inflamatorios, es dependiente de la expresión de dicha Integrina. Se demostró además que la migración de estos astrocitos inducida por Thy-1 también requiere de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. Estos datos aportan al entendimiento del papel que tienen los astrocitos en el desarrollo de una respuesta inflamatoria tras un daño al sistema nervioso central. Además, aportan antecedentes interesantes sobre cómo una interacción neurona – astrocito, a través de Thy-1 y sus receptores, regula la migración de los astrocitos modificando la señalización intracelular, la permeabilidad de la célula y generando un fenómeno de transactivación que induce cambios en el comportamiento celular. Comprender cómo cambia el comportamiento de los astrocitos frente a la interacción con Thy-1 es importante para generar oportunidades terapéuticas y posibles blancos farmacológicos para contrarrestar la inhibición del crecimiento axonal relacionada con esta interacción. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo aparecen numerosas preguntas nuevas, por ejemplo qué vías se relacionan con la apertura de los hemicanales y cómo estas rutas se conectan con cambios en la adhesividad y migración de los astrocitos. Importante será también comprender el papel que tiene Síndecan-4 en la liberación de ATP inducida por Thy-1 y en la respuesta de los astrocitos de cultivo primario a Thy-1 en un contexto inflamatorio. Finalmente, llevar este conocimiento obtenido en modelos celulares a un modelo animal con perspectivas de tratamiento sería un objetivo clave para reforzar esta investigación<br>Astrocytes respond to inflammatory stimuli by modifying their morphology and gene expression pattern, and participate in the formation of the glial scar in the case of a traumatic lesion. This glial scar represents a non-permissive environment for axonal regeneration that harbors many inhibitory molecules thought to be responsible for the poor capacity of neurons in the Central Nervous System to repair themselves. In this context, molecules like Chondroitin sulfate proteoglycans secreted by astrocytes, the Nogo protein present on the surface of oligodendrocytes and, importantly for our studies, the neuronal surface glycosyl phosphatidylinositol protein Thy-1, all are highly relevant. For many years, our laboratory has focused on the study of Thy-1 function and signaling. We have shown that Thy-1 inhibits axonal growth and engages in cell-cell interactions. We have also demonstrated that these effects are elicited through the interaction with two receptors present in DITNC1 astrocytes: αvβ3 Integrin and Syndecan-4. We have observed that short-term interaction of Thy-1 with these two receptors enhances astrocyte adhesion; however, following prolonged stimulation, Thy-1 induces astrocyte migration. Thy-1 interaction with its receptors induces the activation of signal transduction pathways in astrocytes that increase RhoA and Rac1 GTPase activity with different kinetics. Thy-1 also induces ATP release from the astrocytes, resulting in the activation of the P2X7 receptor and entry of extracellular calcium. We know that these signals are necessary for astrocyte adhesion. However, how ATP is released in response to Thy-1 remains to be determined. Also whether extracellular ATP and P2X7 receptor activation are required for DITNC1 astrocyte migration induced by Thy-1 is unknown. These and related questions we sought to answer with the studies described in this thesis. On the other hand, results from our laboratory have shown that, in contrast to DITNC1 cells, primary astrocytes in culture do not respond to Thy-1 and express very low levels of β3 integrin, which however increase under pro-inflammatory conditions, such as those produced in the brain by a stroke. Because astrocytes undergo morphological changes and migrate under these conditions in an attempt to limit and repair the damage, we hypothesized that the different responses observed in DITNC1 cells and primary astrocytes, after Thy-1 stimulation, are due to the different levels of integrin expression observed in the two types of cells. Therefore, in this study we propose that DITNC1 cell migration induced by Thy-1 requires ATP release into the extracellular space – by still unknown mechanisms – and P2X7 receptor activation. Furthermore, we hypothesize that primary astrocytes do not respond to Thy-1 due to their low levels of β3 Integrin expression. In order to study ATP release from the astrocytes, and the signaling pathways involved, we measured extracellular ATP by luminescence techniques, and evaluated calcium kinetics by loading the cells with fluorescent probes, and follow fluorescent dye uptake. To assess the requirements of astrocyte migration induced by Thy-1, we performed wound healing and cell polarity assays. The participation of the different molecules in the mechanisms under study was analyzed by the use of pharmacological inhibitors, channel blockers or receptor antagonists. Also, expression of some of these molecules was modified using shRNA and siRNA or other approaches. Primary astrocyte responses to Thy-1 were monitored in cortical astrocytes treated or not treated with pro-inflammatory cytokines, such as TNFα. Then, changes in β3 Integrin expression were analyzed by Western Blotting, and astrocyte migration was evaluated using the wound healing assay under different conditions, including silencing or overexpression of β3 Integrin. The results shown in this study indicate that ATP release induced by Thy-1 required the interaction with both αvβ3 Integrin and Syndecan-4 receptors. Mutation of the integrin-binding site completely abolished the response, while mutation in the heparin-binding domain decreased and delayed ATP release. We further demonstrate that ATP release occurred through Connexin 43 and Pannexin 1 hemichannels, which are opened by a mechanism that required an increase in intracellular calcium stored in the endoplasmic reticulum. This calcium was released to the cytoplasm through IP3R receptor activation. ATP release was necessary for the increase of both average focal adhesion area and the number of focal adhesions per cell induced by stimulation for short periods with Thy-1. Prolonged stimulation induced DITNC1 cell polarization and migration, and both of these effects required the opening of hemichannels, the presence of extracellular ATP and P2X7 receptor activation. Treatment of astrocytes with BzATP, a P2X7 receptor agonist, stimulated cell migration at high concentrations. However, our study shows that DITNC1 astrocytes treated with low concentrations of BzATP, which did not induce cell migration, were able to migrate upon co-stimulation with a mutant form of Thy-1 lacking the integrin-binding site, but with an intact heparin-binding domain, suggesting that increases in extracellular ATP requires the integrin-binding site of Thy-1. These results also indicate that activation of the P2X7 receptor by ATP (or BzATP) and downstream signaling induced by Thy-1 through Syndecan-4, are necessary for astrocyte migration. Primary astrocytes changed their phenotype after treatment with TNFα, increased the expression of β3 Integrin, GFAP and P2X7 receptor, and migrated in response to Thy-1. Furthermore, experiments in which β3 Integrin was overexpressed or silenced indicated that after treatment with pro-inflammatory agents, the observed responses to Thy-1 depended on the expression of this integrin. Migration of TNFα-treated astrocytes induced by Thy-1 also required extracellular ATP and the activation of the P2X7receptor. These results improve our understanding of the role that astrocytes play during an inflammatory response after damage to the Central Nervous System. They also uncover mechanisms relevant to how neuron-astrocyte interactions, established via neuronal Thy-1 and its astrocytic receptors, regulates astrocyte migration, modifies intracellular signaling, cell permeability and generates changes in cell behavior. These results set the stage for future studies that will yield a deeper understanding of how astrocytes change their behavior after interacting with Thy-1. These insights may eventually help in generating therapeutic opportunities and pharmacological targets to counteract the inhibition of axonal growth ascribed to interaction with astrocytes. With our results, new questions arise. For example, which pathways are related to the opening of hemichannels? How do these pathways regulate changes in adhesion and migration of astrocytes? What role does Syndecan-4 play in ATP release induced by Thy-1? What is the role of Syndecan-4 in primary astrocytes stimulated with Thy-1 under inflammatory conditions? Finally, it would be very interesting to compare these results with the responses that are observed in animal models. In conjunction, these approaches may eventually help to define new approaches for the treatment of patients with post-trauma brain damage<br>Conicyt

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:14Z : No. of bitstreams: 1 000851655.pdf: 1706170 bytes, checksum: 990d3d441221c8d5284639c96fcf57c8 (MD5)<br>Os tumores cerebrais primários mais comuns são denominados gliomas. Eles são definidos patologicamente pela presença de características histológicas e imuno-histoquímicas que evidenciam diferenciação glial. De acordo com a suposta linhagem de origem, eles são classificados como astrocitomas, oligodendrogliomas ou ependimomas. Dentre eles, os astrocitomas são os mais comuns e agressivos. O tratamento atualmente utilizado inclui remoção cirúrgica seguida de quimioterapia com temozolamida (TMZ) e radioterapia, porém sua eficácia é muito baixa devido à alta resistência das células tumorais. Buscando encontrar genes associados com a elevada resistência dos astrocitomas, realizamos um estudo anterior de expressão gênica diferencial utilizando uma coleção de genes de reparo de DNA. Nesta análise foram identificados sete genes significantemente superexpressos em glioblastoma multiforme (GBM), o tipo mais agressivo de astrocitoma. Estes genes são: APEX1, BRCA2, BRIP1, EXO1, NEIL3, RAD54L e XRCC2. Através de RT-PCR quantitativo, avaliamos os níveis de expressão destes genes em um painel expandido de 54 casos clínicos de astrocitomas de diferentes graus de malignidade e em 5 linhagens celulares de GBM. Todos os genes analisados mostraram-se mais expressos nos astrocitomas, com exceção de RAD54L em amostras de astrocitoma de grau II. Além disso, a superexpressão dos 7 genes avaliada isoladamente não exerce influência direta na sobrevida dos pacientes. Evidenciou-se ainda a superexpressão mais acentuada de EXO1 e NEIL3, que foram selecionados para realização de ensaios funcionais de silenciamento, e avaliação do ciclo celular e taxas de apoptose/morte efetiva das células. Estes ensaios foram realizados com as linhagens celulares T98G e U138MG, que apresentaram maiores níveis de expressão destes genes. Nos ensaios funcionais, observamos que o silenciamento...<br>Gliomas are the most common type of primary brain cancers. They are pathologically defined by the presence of histological and immunehistochemical characteristics that evidence glial differentiation. According to the hypothetical cell of origin they are classified in: astrocytomas, oligodendrogliomas and ependimomas. Among them, astrocytomas are the more common and aggressive type. The treatment currently used for GBM includes surgical resection of tumor followed by chemotherapy with temozolamide (TMZ) and radiotherapy, but this protocol is still insufficient due to the high resistance of cancer cells. Searching for repair genes associated with the high resistance of astrocytomas, we developed a previous study of differential gene expression using a collection of DNA repair genes. In this analysis, we identified seven genes significantly overexpressed in glioblastoma multiforme (GBM), namely: APEX1, BRCA2, BRIP1, EXO1, NEIL3, RAD54L and XRCC2. Using quantitative RT-PCR, we evaluated the expression of these genes in an expanded panel of samples with 54 clinical cases of different grade astrocytomas and five GBM cell lines. All genes showed expression significantly higher in astrocytomas, except RAD54L in grade II astrocytomas. Moreover, the overexpression of this 7 genes evaluated individually doesn't exert direct influence upon patient's survival rate. Remarkably, EXO1 and NEIL3 showed the higher fold changes and were chosen for functional silencing assays. This experiments were performed with T98G and U138MG cell lines that showed the higher expression levels among the GBM cell lines analyzed. In the functional assays, we observed that the silencing of EXO1 or NEIL3 doesn't induce changes in the apoptosis and cell death rates and doesn't change the distribution of cells in cycle. Beyond this, the silencing of this two genes doesn't sentisizes cells to ionizing radiation.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Bioquímica<br>Los astrocitos colaboran con las neuronas en el normal desarrollo de sus actividades metabólicas, y más aún son capaces de participar activamente en su protección frente a estímulos potencialmente dañinos. Se ha demostrado, que la enzima glutatión-S-transferasa M2-2 (GSTM2-2) de astrocitos es capaz de conjugar glutatión con aminocromo, un producto de oxidación de la dopamina, y por ello es que se propone como hipótesis que la enzima Glutation-S-transferasa M2-2 producida por astrocitos les confiere protección, y protege neuronas tipo dopaminérgicas de los efectos tóxicos de aminocromo. Para validar esta hipótesis es que en primera instancia se determinó la capacidad de los astrocitos humanos U373MG (glioblastoma) de captar aminocromo mediante utilización de aminocromo tritiado, observándose una incorporación máxima a los 40 minutos, la que es parcialmente inhibida por tratamientos con exceso de dopamina, imipramina y nomifensina. Mediante western blot se determinó que la presencia del aminocromo en los cultivos celulares provoca un aumento en la cantidad proteína, además de detectarse aumento en la actividad enzimática, ambos cambios de manera dependiente de la concentración, en donde 100 μM de aminocromo aumenta 2,1 veces la cantidad de la enzima en 3 horas. Se detectó mediante western blot la presencia de la proteína GSTM2-2 en los medios condicionados de células U373MG, aumentando 2,7 veces al exponer las células a aminocromo 50 μM por 3 horas en relación al control sin aminocromo. La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y es susceptible a toxicidad inducida por aminocromo, determinada por citometría de flujo, por lo que se probaron los medios condicionados de las células U373MG que contenían la enzima GSTM2-2 sobre cultivos de SH-SY5Y, evidenciándose la capacidad de proteger a células SH-SY5Y de la muerte inducida por exposición a 10 μM de aminocromo, y dicha protección frente a la muerte celular es dependiente de la internalización de la proteína GSTM2-2 por parte de las células SH-SY5Y, tal como se demostró (i) por captación de 14C-GSTM2-2 liberado por células U373MG, proceso inhibido por un antisuero contra GSTM2-2, (ii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de U373MG tratados con antisuero contra GSTM2-2, (iii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de células U373MGsiGST6, que expresan un siRNA contra GSTM2-2. En conclusión, nuestros resultados demuestran que las células U373MG protegen las células SH-SY5Y contra la toxicidad inducida por aminocromo, por un mecanismo que involucraría la liberación de GSTM2-2 al medio condicionado y la subsecuente internalización de esta enzima por parte de las células SH-SY5Y. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo de protección de neuronas dopaminérgicas mediado por astrocitos<br>Astrocytes collaborate with neurons in the normal development of their metabolic activities, and to a greater extent, they are able to actively participate in their protection from potentially harmful stimuli. It has been shown that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 (GSTM2-2) from astrocytes is able to conjugate glutathione to aminochrome, an oxidation product of dopamine. Therefore the hypothesis proposed is that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 produced by astrocytes protect them, and also protects dopaminergic neurons from the toxic effects of aminochrome. To validate this hypothesis, we assessed the ability of human astrocytes U373MG (glioblastoma) to capture aminochrome by using tritiated aminochrome, reaching an incorporation peak at 40 minutes, which is partially inhibited by treatment with excess dopamine, imipramine and nomifensine. Using western blot, we determined that the presence of aminochrome in cell cultures causes an increase in the protein amount, besides the increasing enzymatic activity, both changes depending on the aminochrome concentration, with 100 μM aminochrome increasing 2.1 times the amount of the enzyme in 3 hours. The presence of protein GSTM2-2 was detected by western blot in conditioned media from U373MG cells, increasing 2.7 times after the exposure to 50 uM aminochrome for 3 hours compared to the control without aminochrome. The neuroblastoma cell line SH-SY5Y is susceptible to aminochrome-induced toxicity, determined by flow cytometry, then U373MG cells conditioned media containing the enzyme GSTM2-2 cultures were tested on SH-SY5Y, demonstrating the ability to protect SH-SY5Y against aminochrome-induced cells death, and that protection against cell death is dependent on internalization of the GSTM2-2 protein by SH-SY5Y cells. This internalization was demonstrated by (i) uptake of 14C-GSTM2-2 released by U373MG cells, process inhibited by an antiserum against GSTM2-2, (ii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media from U373MG treated with antiserum against GSTM2-2, (iii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media of U373MGsiGST6 cells expressing siRNA against GSTM2-2. In conclusion, our results demonstrate that U373MG cells protect SH-SY5Y cells against aminochrome-induced toxicity, by a mechanism which would involve the release of GSTM2-2 to the conditioned medium and subsequent internalization of this enzyme by SH-SY5Y cells. These results suggest a novel mechanism of protection of dopaminergic neurons mediated by astrocytes<br>Conicyt; Fondecyt

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario<br>El objetivo de este trabajo fue demostrar que la glutatión transferasa M2-2 humana (GST M2-2), protege a los astrocitos de los efectos tóxicos del aminocromo, ya que en estudios in vitro utilizando la enzima recombinante, se demostró que esta enzima conjuga aminocromo con glutation reducido (GSH), formando un metabolito resistente a agentes oxidativos biológicos, bloqueando de esta forma los efectos neurotoxicos generados por aminocromo. GST M2-2 está presente en la sustancia nigra y en astrocitos. Para demostrar la función protectora de esta enzima, se infectó la línea celular de astrocitos humanos U373MG con retrovirus (Gammaretroviridae), los cuales llevan en su genoma un plasmidio con los RNA interferentes (siRNA), necesarios para generar una disminución total o parcial de la expresión de esta enzima. Se utilizaron tres siRNA, los cuales van dirigidos a distintas zonas del RNAm, con el fin de producir secuencias erróneas que impidan la síntesis de la proteína funcional. De los tres interferentes utilizados, todos ellos generaron una disminución de la expresión de la enzima GST M2-2 en diferente magnitud, uno de ellos, el denominado arbitrariamente siGST 6, logró una disminución de la expresión de la enzima de un 82%, siendo éste el mayor nivel alcanzado. Para los ensayos de toxicidad se sintetizó y purificó aminocromo y se agregó a la línea celular de astrocitos humanos U373MG. Se realizó una curva de toxicidad utilizando diferentes concentraciones de aminocromo, (0, 50, 100, 200, 300 y 500 uM) y se evaluó su toxicidad tanto en la línea celular U373MG wild type como en la línea celular U373MG infectada con los distintos interferentes. Los resultados sugieren que la línea celular U373MG wild type es más resistente a los efectos tóxicos generados por aminocromo, debido principalmente a la presencia de la enzima GST M2-2. En aquellas células infectadas con los interferentes se produjo una mayor mortalidad, directamente proporcional al grado de inhibición de la enzima GST M2-2, lo que demuestra y comprueba que esta enzima conjuga aminocromo y bloquea los efectos tóxicos de este<br>Proyecto FONDECYT 1061083 y Beca Fogarty Internacional Research Collaboration Award (FIRCA), RCA R03 TW07044-1

La enfermedad de Alzheimer es la forma mas común de demencia en edades avanzadas, la cual afecta a 40 millones de personas alrededor del mundo. Es una enfermedad compleja que afecta no solo a neuronas, sino también a astrocitos. La Apolipoproteína E4 (ApoE4) ha sido descrita como el factor de riesgo genético más importante de la forma esporádica de la enfermedad y además, los astrocitos son los principales secretores de esta. La investigación sobre los mecanismos patogénicos causados por esta apolipoproteína está centrada en su rol extracelular. Por el contrario, nosotros analizamos las desregulaciones intracelulares que causa la ApoE4. En nuestro estudio, nos centramos en 2 principales procesos fisiológicos alterados en la enfermedad de Alzheimer: la señalización de calcio y las funciones mitocondriales. Utilizamos como modelo celular, astrocitos inmortalizados que expresan la forma humana ApoE3 (no asociada a ninguna patología) o la ApoE4. Utilizando indicadores de calcio fluorescentes y la técnica de Imagen de Calcio, determinamos que los astrocitos ApoE4 tienen alteraciones de la homeostasis de calcio, ya que presentan menores niveles de calcio intracelular basal pero mayores señales de calcio inducidas por estímulos purinérgicos en comparación con los astrocitos ApoE3. Una mayor actividad de la V-ATPasa y por lo tanto, una mayor entrada de calcio al lisosoma en los astrocitos ApoE4 explica estas alteraciones. Además, la salida de calcio lisosomal después de la activación de receptores purinérgicos es seguida por una mayor movilización de calcio del retículo endoplásmico en los astrocitos ApoE4 comparados con los ApoE3. La entrada de calcio extracelular es similar en ambos tipos celulares. Nuestros estudios también demuestran que la falta de lipoproteínas en el medio extracelular aumenta la magnitud de las respuestas de calcio inducidas por receptores purinérgicos en los astrocitos ApoE3, ya que la entrada de calcio extracelular amplifica la liberación del calcio lisosomal en estas células. Esta característica se pierde en las células ApoE4, en las cuales la magnitud de las respuestas de calcio no se ve afectada por las lipoproteínas extracelulares. Por otro lado, describimos alteraciones en las dinámicas mitocondriales determinadas por microscopia a tiempo real y el marcaje fluorescente de mitocondrias. En particular, las mitocondrias de células ApoE4 no realizan fisión después de la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, mientras que las mitocondrias de los astrocitos ApoE3 si la realizan. Asimismo, los astrocitos ApoE4 tienen un incremento en la movilidad mitocondrial, una reducción de Parkina, proteína involucrada en la mitofagia y una reducción del ADN mitocondrial en comparación con los astrocitos ApoE3. En resumen, demostramos por primera vez que la ApoE4 endógena altera la señalización del calcio y las funciones mitocondriales en astrocitos. Teniendo en cuenta que la ApoE4 se expresa a lo largo de toda la vida de los individuos, estas alteraciones astrocíticas podrían aparecer en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Para avanzar en la detección de estas primeras etapas de la patología, y ya que las proteínas del líquido cefalorraquídeo reflejan las funcionalidad de las células cerebrales, nosotros hemos identificado un grupo de proteínas astrocíticas presentes en este líquido relacionadas con la enfermedad de Alzheimer y que proponemos como firma funcional astrocítica. Esta firma esta compuesta de las proteínas S100B, ApoE, prostaglandina D2 sintetasa, cistatina 3, proteína integral de membrana 2C y clusterina. En general, la ApoE4 endógena altera las funciones de los astrocitos, un fenómeno que puede contribuir a la enfermedad de Alzheimer, además de a su detección a través de biomarcadores del líquido cefalorraquídeo.<br>Alzheimer’s disease is the most common form of dementia in advanced ages affecting more than 40 million people around the world. It is a complex disease that affects not only neurons but also astrocytes. Apolipoprotein E4 (ApoE4) has been described as the most important genetic risk factor for the sporadic form of the disease and interestingly, astrocytes are its main secretors. The research about its pathogenic mechanisms has mainly focused on its extracellular role. On the contrary, we analysed the dysregulations that endogenous intracellular ApoE4 causes on astrocytes. We focused on 2 principal physiological processes altered in Alzheimer’s disease: calcium signalling and mitochondrial functions. As cellular model, we used immortalized astrocytes that express human ApoE3 (non-associated with any pathology) or ApoE4. Using fluorescent calcium indicators and the technique of Calcium Imaging, we determined that ApoE4 astrocytes have altered calcium homeostasis as they have lower basal intracellular calcium levels but higher purinergic-induced calcium signals compared to ApoE3 astrocytes. A high V-ATPase activity, and hence, higher lysosomal calcium uptake in ApoE4 astrocytes explains these alterations. Moreover, lysosomal calcium release after purinergic receptor activation is followed by higher endoplasmic reticulum (ER) calcium mobilization in ApoE4 than in ApoE3 astrocytes. Extracellular calcium entry is similar in both cell types. Our studies also demonstrated that the lack of lipoproteins in the extracellular medium upregulates the magnitude of purinergic-elicited calcium responses in ApoE3 astrocytes, as extracellular calcium entry amplifies lysosomal calcium release. This feature is missing in ApoE4 astrocytes being the magnitude of calcium responses unaffected by extracellular lipoproteins. On the other hand, we described alterations in mitochondrial dynamics determined by real-time microscopy and fluorescent mitochondria labelling. In particular, ApoE4 cell mitochondria do not perform fission after inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation whereas ApoE3 astrocyte mitochondria perform it. In addition, ApoE4 astrocytes have increased mitochondrial motility, reduction of Parkin, a protein involved in mitophagy, and reduction in mitochondrial DNA content compared to ApoE3 astrocytes. In summary, we demonstrated, for the first time, that endogenous ApoE4 alters calcium signalling and mitochondrial functions in astrocytes. Taking into account that ApoE is expressed throughout the life of individuals, these astrocytic alterations might appear in the early stages of the Alzheimer’s disease. In order to advance in the detection of such early phases of the pathology, and since cerebrospinal fluid proteins reflect the cellular function of brain cells, we next identified a group of astrocytic proteins present in the cerebrospinal fluid related to Alzheimer’s disease that we propose as a functional astrocytic signature for early stages of the disease. This signature is composed of S100B, ApoE, prostaglandin D2 synthetase, cystatin 3, integral membrane protein 2C and clusterin. Overall, endogenous ApoE4 alters astrocyte functions, a phenomenon that can contribute to Alzheimer’s disease, but also, to its detection through cerebrospinal fluid biomarkers.