Dissertations / Theses on the topic 'Astrocitai'

Pastaruoju metu tyrimams dažniausiai naudojami žinduoliai, kadangi rezultatai šiek tiek atspindi žmogaus organizme vykstančius procesus. Šis darbas parengtas analizuojant besivystančias paukščio embriono sistemas: tai būdas, leidžiantis sutaupyti lėšų bei dėka trumpo embrioninio vystymosi laikotarpio suteikiantis galimybę operatyviam rezultatų gavimui. Iki šiol literatūroje neradome duomenų apie pirmojo raumens susitraukimo ypatybes, o šį procesą įtakojančios nervų sistemos vystymąsi apibūdina keletas hipotezių. Taigi darbo tikslas buvo išsiaiškinti pirmojo susitraukiančiojo raumens atsiradimo laiką, jo morfologiją (1) ir išanalizuoti ankstyvajame embriogenezės laikotarpyje kontraktilų aparatą įtakojančios nervų sistemos vystymosi ypatumus (2). Tyrimams naudojome kalakuto ir vištos embrionus – kadangi skirtingų porūšių skirtumai mums nebuvo svarbūs, palyginimas tarp minėtų paukščių embrionų neatliktas. Embrionai buvo stebimi in vivo, tyrimams in vitro atlikti buvo naudojami šie molekulinės biologijos metodai: paruoštų pjūvių dažymas histo- ir imunohistochemiškai, polimerazės grandininės reakcijos, ląstelių kultūrų auginimas ir Western blotas. Pirmasis aktyvus raumens susitraukimas kalakuto embrione atsiranda 19-22 Hamburgerio Hamiltono stadijoje, t.y., praėjus 116 val. nuo inkubacijos pradžios: porinis raumuo sudarytas iš keturių susiliejusių miomerų, yra 1 mm ilgio ir 0,1 mm pločio – šis iš dviejų ląstelių tipų sudarytas audinys atsakingas už pirmuosius aktyvius embriono... [toliau žr. visą tekstą]<br>The purpose of the study was to characterize the first contraction of an isolated muscle in turkey embryo and to determine whether at early stages of chicken brain development during neurogenesis, cells from the astrocytic lineage are present in relevant amounts, where they are located in the neural tube, and to what extend brain regional differences exist. MATERIAL AND METHODS. From the 3rd day of incubation on until the 6th day the embryos were continuously watched through a cellophane window in the eggshell. For histology the embryos were fixed in Bouin's fluid, then completely cut in serial sections of 5 microm thickness and stained according to Masson-Goldner's trichrome procedure plus resorcin-fuchsin. For gene expression analysis markers for stem cells, neurons and astrocytes were used. Immunohistochemistry was made against SMI 312 and GFAP antibodies and Western blot against GFAP as well. RESULTS. A paired muscle 1 mm long and 0.1 mm broad, derived by fusion of the four occipital myomeres, is responsible for the first individual contraction. The contraction produces a stretching in the neck region. The muscle named M. occipitalis primordialis consists of four end-to-end connected groups of mononucleated muscle cells. The muscle contains two types of cells according to the cell nuclei. The elastic rod-shaped notochord represents an endoskeleton. Immediately after contraction it brings the body of the embryo back into its former shape. We also demonstrate that specific... [to full text]

OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular más abundante en el sistema nervioso central (SNC) desempeñan un papel clave en la homeostasis, la neurotransmisión y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamación, es decir, el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas, o la neurodegeneración. El astrocito es extremadamente plástico, respondiendo a un amplio repertorio de estímulos fisiológicos o insultos patológicos con cambios morfológicos, migración, o cambios funcionales por modificación de su expresión génica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamación. En el primer bloque hemos estudiado el efecto de un factor trófico de especial importancia en el SNC, el Factor Básico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresión de genes inflamatorios astrocitarios. El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresión en el SNC adulto es muy alta, localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones patológicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. Así como las propiedades tróficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria está pobremente caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y CHF5074) los cuales, según estudios epidemiológicos, reducen la aparición de la enfermedad de Alzheimer, de modular la dinámica del citoesqueleto de actina astrocitario. METODOS/MODELOS: Modelo de inflamación (LPS o scratch-wound en cultivos primarios de astrocitos. Estudio expresion moléculas: RTPCR, Western Blot, inmunocitoquímica, ELISAS, GLISAS. Manipulación mecanística: inhibidores farmacológicos, sobreexpresión de proteínas mutantes dominantes negativos o constitutivamente activos. RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una manera bifásica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estadíos iniciales la expresión de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1 y de COX2 e inhibe la expresión de ICAM1 en estadíos más avanzados. Esta regulación es dependiente de las vías de señalización de ERK, JNK y FAK a través de la activación del receptor FGFR2 pero independiente del factor de trasncripción NF-kB. Mostramos también que el tratamiento de astrocitos con ibuprofeno y derivados produce un rápido cambio morfológico caracterizado por una retracción del soma y emisión de procesos dependiente de la modulación de las proteínas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana “clásica” de los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del R-Flurbiprofeno y CHF5074. CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos que el carácter bifásico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la inflamación pero evitando su cronificación. Además mostramos que los profenos son capaces de promover la aparición de fenómenos plásticos en astrocitos a través de la modulación de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estén implicados.<br>GENERAL GOAL: Astrocytes, the main celular type in the Central Nervous System, play important roles in the homeostasis , neurotransmission and also in neuroinflammation. Astrocyte is a plastic celular type, wich is able to respond to a variety of physiologic and pathologic stimuli with morphological, migrational changes and also adaptating its gene expression. The goal of this thesis has been to study the astrocytic plasticity in two different paradigms related to neuroinflammation. In the first part of this thesis we have studiedd the effect of FGF2, a groth factor wich enriched expression in astrocytes wich and is upregulated during inflammatory conditions. The role of FGF2 in neuroinflammation is not known. In the second part we have analyzed the hability of some non-steroidal-antiinflammatory drugs (NSAIDS), wich are known to reduce the incidence of Alzheimer Disease, like ibuprofen and R-Flurbiprofen, in modulating astrocyte cytoskeleton dynamics. MODEL/METHOD: Inflammation model (LPS-induced or scratch-wound induced neuroinflammation in primary rat astrocytes). RNA and protein detection: Real Time PCR, Western Blot, ELISA, G-LISA. Molecular manipulation by pharmacological inhibition or overexpression of protein mutants. RESULTS: FGF2 regulates inflammatory gene expression in primary astrocytes in a biphasic manner: it potentiates LPS-induced MCP1 and COX2 expression in the first hours of the inflammatory reaction, while it inhibits ICAM expression in the later phases. This effect is dependen ton ERK, JNK and FAK signalling pathways by means of the activation of the FGFR2 but independent on NF-kB transcription factor. We also show that treatment of astrocytes with ibuprofen and derivatives produces astrocyte stellation wich involves the modulation of Rho-GTPases RhoA, Rac1 and cdc42. This effect is not dependent on COX the classical target of NSAID. This stellate phenotype results in changes in the migratoy capacity of astrocytes. CONCLUSIONS: FGF2 is an inmunomodulatory molecule in the inflammatoy reaction of astrocytes. We speculate that it’s biphasic regulation of inflammatory gene expression enables the beneficial effects of inflammation inhibiting its cronification. In addition we have shown that profens promotes plastyc phenomenoms in astrocyte by regulating new targets, like Rho-GTPases, opening new perspectives in neurodegenerative disorders where astrocytes may play a role.

Tesis de Maestría en Ciencias de la Salud. Investigación científica original e inédita.<br>Las enfermedades crónicas no transmisibles (ECNTs) son consideradas un problema de salud pública. Su prevalencia en México alcanza el 75% de la población adulta y están fuertemente asociadas a la presencia de obesidad. Modificaciones en la cantidad de calorías y composición de la dieta han sido estrategias recomendadas para su prevención. Por lo tanto, los edulcorantes no calóricos se han convertido en una alternativa atractiva para tratar estas enfermedades, aunque recientemente, existe evidencia que sugiere que estos compuestos pueden tener efectos negativos en el metabolismo y homeostasis energético. El sistema endocanabinoide (SEC) es un importante regulador del metabolismo de la energía en el organismo. Sus efectos dependen de la activación de dos receptores localizados principalmente en el sistema nervioso central (SNC) conocidos como CB1 y CB2. El receptor CB1 se localiza principalmente en células del SNC, incluyendo los astrocitos, los cuales, son responsables del mantenimiento de las funciones neuronales, la homeostasis de energía en el tejido nervioso y regulación del intercambio de nutrientes entre el SNC la circulación sistémica. La modificación de la disponibilidad de glucosa a través de la suplementación de edulcorantes no calóricos provocan cambios en la expresión del receptor CB1 en tejido adiposo, alterando sus funciones, sin embargo, a pesar de que estos compuestos son utilizados indiscriminadamente a nivel mundial, los estudios que evalúen otros efectos fisiológicos son muy limitados. El objetivo de este trabajo fue determinar si el consumo crónico de edulcorantes calóricos y no calóricos altera la expresión de CB1 en tejido nervioso, específicamente en astrocitos. Para este fin, ratones adultos machos y hembras fueron suplementados con edulcorantes calóricos y no calóricos durante 6 semanas y los cambios en la expresión de CB1 fueron analizados por medio de inmunofluorescencia y western blot. Los resultados muestran una mayor expresión de CB1 en el cerebro completo y en astrocitos de los grupos suplementados con edulcorantes no calóricos, en comparación con el grupo sin suplementación. Estos datos nos indican que la ingesta frecuente de edulcorantes no calóricos, modifica las funciones del SEC en el tejido nervioso, lo que podría tener un efecto relevante en el metabolismo energético y las funciones neuronales.<br>UAEM, Proyecto 4320/2017/CI

El tema de esta tesis ha sido el estudio de los mecanismos de neurodegeneración asociados al envejecimiento cerebral y el papel que desempeñan los astrocitos como neuroprotectores utilizando modelos animales in vitro e in vivo.<br/>Los astrocitos son las células más abundantes del sistema nervioso central y su función es muy importante, además de dar soporte trófico a las neuronas tienen una función anticitotóxica y modulan la actividad neuronal. El papel de los astrocitos y su activación en el envejecimiento es un proceso poco conocido. Un mayor conocimiento de esta célula glial puede ayudarnos a entender los cambios fisiopatológicos que conlleva el paso de los años en el cerebro humano. El envejeciemiento cerebral es un factor de riesgo de enfermedades neurodegenerativas y en esta tesis se ha estudiado especialmente la enfermedad de Alzheimer por su alta incidencia en la población de edad avanzada.<br/><br/>En esta tesis hemos establecido y caracterizado dos modelos para el estudio del envejecimiento de los astrocitos in vitro y hemos evaluado su capacidad neuroprotectora.<br/><br/>Primero hemos evaluado los cambios en el estrés oxidativo, la captación de glutamato y la expresión proteica en astrocitos corticales de rata en cultivos de 10 y 90 días in vitro (DIV). Observamos un aumento de estrés oxidativo e inflamación con generación de especies reactivas de oxígeno y una disminución de la actividad mitocondrial a los 90 DIV.<br/><br/>La expresión de las proteínas nitrosiladas, la Cu/Zn-superóxido dismutasa (SOD-1), la hemoxigenasa 1 (HO-1) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) aumenta en los astrocitos envejecidos. La captación de glutamato en los astrocitos de 90 DIV era mayor que en los astrocitos de 10 DIV probablemente debido a la regulación al alza del transportador glutamato/aspartato. Los astrocitos envejecidos tenían una menor capacidad de mantener la supervivencia neuronal. Estos hallazgos indican que los astrocitos pueden perder en parte su capacidad neuroprotectora durante el envejecimiento. <br/><br/>En nuestro segundo modelo hemos estudiado los cambios en la fosforilación de tau, el estrés oxidativo y la captación de glutamato en cultivos primarios de astrocitos de la corteza de ratones neonatos de senescencia acelerada SAMP8 comparados con los de ratones resistentes a la senescencia (SAMR1). Hemos demostrado un incremento de la hiperfosforilación de tau y de actividad de quinasa de Gsk3&#946; y Cdk5, que regulan la fosforilación de tau, en los astrocitos de SAMP8. La inhibición de Gsk3&#946; por litio o la de Cdk5 por roscovitina reducen la fosforilación de tau en Ser396. Además, hemos detectado un aumento de estrés oxidativo y una reducción en el potencial de membrana mitocondrial en los astrocitos de los ratones SAMP8. Los astrocitos SAMP8 muestran una disminución en la captación de glutamato comparada con la de los controles SAMR1. Interesantemente, la supervivencia de las neuronas SAMP8 y SAMR1 en cocultivo con astrocitos SAMP8 estaba reducida de manera significativa. Nuestros resultados sugieren que estas preparaciones in vitro son adecuadas para el estudio a nivel molecular y celular de los procesos subyacentes en el envejecimiento temprano de este modelo murino<br/><br/>Además hemos estudiado la función neurotrófica de los astrocitos observando si un aumento de su capacidad neurotrófica mejora la funcionalidad neuronal en el envejecimiento. <br/><br/>El factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) fue probado para observar sus efectos neurotróficos contra la atrofia neuronal que causa déficits cognitivos en la vejez. Las ratas envejecidas Fisher 344 con deficiencias en el laberinto de Morris recibieron inyecciones intrahippocampales de un vector lentiviral que codifica GDNF humano en los astrocitos o del mismo vector que codifica la proteína fluorescente verde humana como control. El GDNF secretado por los astrocitos mejoró la función de la neurona como se muestra por aumentos locales en la síntesis de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina y serotonina. El aprendizaje espacial y la prueba de memoria demostraron un aumento significativo en las capacidades cognitivas debido a la exposición de GDNF, mientras que las ratas control mantuvieron sus resultados al nivel del azar. Estos resultados confirman el amplio espectro de la acción neurotrófica del GDNF y abre nuevas posibilidades de terapia génica para reducir la neurodegeneración asociada al envejecimiento.<br/><br/>Por último hemos estudiado in vitro e in vivo si en un ambiente de estrés oxidativo, como se produce durante el envejecimiento, los astrocitos tienen una respuesta más elevada al péptido betamieloide.<br/><br/>La neurotoxicidad por el péptido betamieloide (A&#946;) está propuesto como el primer paso de una cascada de eventos perjudiciales para la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los efectos tóxicos del A&#946; sobre los astrocitos podrían contribuir a desarrollar cambios neurodegenerativos que conducen a la EA. Hemos estudiado los efectos de A&#946;42 sobre ls cultivos de los astrocitos humanos en la presencia o ausencia de los agentes prooxidantes como butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor de síntesis glutatión y FeSO4 que libera hierro redox activo. Condiciones prooxidantes potenciaron la toxicidad del A&#946;, que se demostraron por la generación de radicales libres, cambios inflamatorios y apoptosis en los astrocitos humanos. Un tratamiento similar fue ensayado en la rata in vivo. Una mezcla del A&#946;40 y A&#946;42 o sólo del A&#946;42 fue infundida intracerebroventricularmente durante 4 semanas. Otros grupos animales eran simultáneamente infundidos con BSO y Fe. Un análisis realizado 4 meses más tarde mostró un mayor deterioro cognitivo en el laberinto acuático de Morris con el tratamiento de A&#946; conjuntamente con los tratamientos con agentes prooxidantes. Agentes prooxidantes también potenciaron la patología del tejido cerebral, así los estudios histológicos mostraron una mayor reactividad astroglial, depósitos de A&#946; y daño oxidativo en las neuronas hipocámpicas sensibles a EA.<br><i>The subject of this thesis has been the study of neurodegeneration mechanisms associated with the aging brain and the role played by the astrocytes as neuroprotective using animal models in vitro and in vivo. <br/><br/>In the first study, we evaluate the neuroprotective capacity of astrocytes in an in vitro experimental model of aging.Changes in oxidative stress, glutamate uptake and protein expression were evaluated in rat cortical astrocytes cultured for 10 and 90 days in vitro (DIV). Aged astrocytes had a reduced ability to maintain neuronal survival. These findings indicate that astrocytes may partially loose their neuroprotective ability during aging. In the next study, we examine changes in tau phosphorylation, oxidative stress and glutamate uptake in primary cultures of cortical astrocytes from neonatal senescence-accelerated prone mice (SAMP8) and senescence-accelerated resistant mice (SAMR1). Our findings suggest that this in vitro preparation is suitable for studying the molecular and cellular processes underlying early aging in this murine model.In the next study glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) was assayed for its neurotrophic effects against the neuronal atrophy that causes cognitive deficits in old age. Aged Fisher 344 rats with impairment in the Morris water maze received intrahippocampal injections of either a lentiviral vector encoding human GDNF in astrocytes or the same vector encoding human green fluorescent protein as a control. Astrocyte-secreted GDNF enhanced neuron function as shown by local increases in synthesis of the neurotransmitters acetylcholine, dopamine and serotonin. Spatial learning and memory testing showed a significant gain in cognitive abilities due to GDNF exposure, whereas control-transduced rats kept their performance at the chance level. These results confirm the broad spectrum of the neurotrophic action of GDNF and open new gene therapy possibilities for reducing age-related neurodegeneration.<br/><br/>Finally we studied the effects of A&#946; on cultures of human astrocytes in the presence or absence of pro-oxidant agents. Pro-oxidant conditions potentiated A&#946; toxicity, as shown by the generation of free radicals, inflammatory changes and apoptosis. A similar treatment was assayed in rats in vivo. Pro-oxidant agents also potentiate brain tissue pathology. This was demonstrated in histological studies that showed highly increased astrocyte reactivity in AD-vulnerable areas, A&#946; deposits and oxidative damage of AD-sensitive hippocampal neurons. </i>

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario<br>Los astrocitos son el tipo celular más abundante de la glia en el Sistema Nervioso Central y cuando son expuestos a factores sanguíneos durante un daño cerebral, éstos se vuelven “reactivos”, cambiando su forma estrellada a una de tipo fibroblasto. Los astrocitos “reactivos” también proliferan y migran al sitio dañado para formar la cicatriz glial, constituyendo uno de los mayores impedimentos para que ocurra la regeneración neuronal. Se piensa que estos cambios morfológicos que sufren los astrocitos in vivo, podrían tener una relación con los gatillados in vitro por Thy-1, una glicoproteína neuronal muy abundante, que se une a la Integrina αVβ3 en la membrana de astrocitos provocando cambios dramáticos en la forma de estas células. Con estos antecedentes se planteó la hipótesis de que la estimulación sostenida de la Integrina αVβ3por Thy-1 provoca la migración y/o proliferación de astrocitos, activando vías de transducción de señales que involucran a las proteínas quinasa PI3-K y Erk, respectivamente. Para poner a prueba esta hipótesis, se utilizaron ensayos in vitro de cicatrización de herida, la cual consiste en la remoción de una porción de células desde una monocapa de astrocitos en cultivo de la línea celular de rata DI-TNC1 con punta de pipeta y el subsecuente monitoreo de la migración de éstos al área libre de células después de la estimulación con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Adicionalmente, se realizaron en paralelo, análisis de Inmunofluorescencia indirecta a diferentes tiempos para la visualización de estructuras de avance como filopodios y lamelipodios en los astrocitos del borde de la herida estimulados con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Para demostrar la participación de la enzima PI3-K, los ensayos de cicatrización de herida se realizaron en presencia de inhibidores específicos de esta quinasa como son LY294002 y Wortmanina y mediante técnica de Inmunoblot se determinaron los niveles de fosforilación de un sustrato de esta enzima, la proteína Akt, en los astrocitos estimulados con el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A. Para determinar si el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A inducía cambios en la proliferación y viabilidad de los astrocitos, se utilizaron técnicas de MTS y de exclusión de azul de tripán, así como también se analizó el ciclo proliferativo de éstas células por citometría de flujo. Los resultados demuestran que Thy-1: 1) Induce la migración de los astrocitos DI-TNC1 al sitio de la herida; 2) Induce una mayor formación de estructuras de avance y migración como filopodios y lamelipodios, en los astrocitos del borde de la herida; 3) No induce proliferación ni aumento de la viabilidad de los astrocitos como tampoco cambios significativos en el ciclo proliferativo de éstas células; y 4) La quinasa PI3-K está implicada en la migración de los astrocitos estimulados por Thy-1. En conjunto, estos datos sugieren que la interacción de Thy-1 con la Integrina αVβ3 en la membrana de los astrocitos estimula cambios morfológicos llevando a estas células a una mayor adhesión celular para luego inducir su migración. Cabe destacar que la secuencia de eventos observados in vitro en este trabajo es similar a lo que ocurre en el proceso de astrogliosis, en el cual luego de un daño cerebral, los astrocitos se tornan reactivos, migran al sitio dañado y producen la cicatrización de la herida<br>Financiamiento: FIRCA 1R03TW006024 - FONDECYT 1040390 - FONDECYT 1070699

Doctor en Farmacología<br>Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento en el Repositorio Académico, hasta diciembre de 2016<br>Los astrocitos responden a un estímulo inflamatorio modificando su morfología y su patrón de expresión génica y participando en la formación de la cicatriz glial, en el caso de lesión traumática. La cicatriz glial se relaciona con la generación de un ambiente no permisivo para la regeneración axonal, el que contiene además moléculas responsables de la pobre reparación existente en el sistema nervioso central. Entre estas moléculas destacan los proteoglicanos de Condroitin sulfato secretado por los astrocitos que forman la cicatriz glial, la proteína Nogo presente en la membrana de los oligodendrocitos y, muy importantemente para este estudio, la glicoproteína Thy-1, presente en la superficie neuronal. Por muchos años, nuestro laboratorio ha estado enfocado en estudiar las funciones y modo de señalización de Thy-1, proteína anclada por un tallo glicosilfosfatidil inositol a la cara externa de la membrana plasmática. Evidencias indican que Thy-1 participa en la inhibición del crecimiento axonal y en mediar interacciones célula - célula. Hemos mostrado además que el efecto de Thy-1 ocurre por medio de dos receptores, la Integrina αvβ3 y Sindecán-4 presentes en los astrocitos de línea DITNC1. La interacción de Thy-1 con sus receptores por tiempos cortos induce un aumento de la adhesión de los astrocitos, mientras que la estimulación prolongada con Thy-1 induce la migración de estas células. La interacción de Thy-1 con sus receptores induce en los astrocitos la activación de cascadas transduccionales que llevan al aumento en la actividad, temporalmente diferenciado, de las GTPasas RhoA y Rac1 entre otros. Además Thy-1 induce la salida de ATP desde el astrocito que resulta en la activación del receptor P2X7 y la entrada de calcio extracelular. Se sabe que estas señales son necesarias para la adhesión de estas células; sin embargo, ¿Cómo sale el ATP de los astrocitos en respuesta a Thy-1? ¿Se requiere de este ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7 para la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1? Son preguntas que buscamos responder en este trabajo. Por otro lado, resultados de nuestro laboratorio muestran que, contrario a lo encontrado para los astrocitos DITNC1, astrocitos de cultivo primario no responden a Thy-1 y expresan niveles muy bajos de la Integrina β3. Además, se ha descrito que astrocitos primarios aumentan la expresión de esta Integrina en condiciones de daño por derrame cerebral. Dado que los astrocitos sufren cambios morfológicos y migran en condiciones proinflamatorias para reparar el daño, es posible que las diferentes respuestas observadas en los astrocitos primarios y los de línea celular frente al estímulo de Thy-1 se deban a los distintos niveles de integrina expresada por ambos tipo de células. Por lo tanto, en este estudio proponemos que la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1 requiere de la salida del ATP al espacio extracelular – por mecanismos aún por dilucidar – y de la activación del receptor P2X7. Además, que la baja expresión de la Integrina β3 no permite a los astrocitos de cultivo primario responder a Thy-1. Para estudiar la salida de ATP desde el astrocito y qué vías están involucradas se realizaron mediciones de ATP extracelular por técnicas de luminiscencia, incorporación de sondas fluorescentes a las células, medición de cinéticas de calcio intracelular, entre otras. Para evaluar los requerimientos en la migración inducida por Thy-1 se llevaron a cabo ensayos de cierre de herida y ensayos de polaridad celular. La participación de las distintas moléculas en los mecanismos estudiados se analizó con el uso de inhibidores farmacológicos, bloqueadores de canales o antagonistas de receptores, también se utilizó herramientas de modificación de la expresión génica de las moléculas estudiadas. Para monitorear la respuesta de los astrocitos primarios al estímulo de Thy-1, se realizó cultivos de astrocitos corticales, los que fueron tratados o no con citoquinas proinflamatorias como TNFα. Se analizó cambios de expresión de la Integrina β3 por Western Blot frente a este tratamiento. La respuesta migratoria de los astrocitos tratados con o sin TNFα, frente al estímulo de Thy-1 se realizó por ensayo de cierre de herida en distintas condiciones, como silenciando o sobreexpresando la Integrina β3. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que Thy-1 induce la salida de ATP, requiriendo la presencia de ambos sitios de interacción con sus receptores. Mutación en el sitio de unión a integrinas anula completamente la respuesta, mientras que la mutación en el sitio de unión a Sindecán-4 disminuye y retrasa la respuesta. Se demuestra en este trabajo que la salida de ATP ocurre a través de los hemicanales Conexina 43 y Panexina 1, abriéndose estos hemicanales por medio de un mecanismo que requiere de aumentos de calcio intracelular proveniente del retículo endoplásmico y que sale al citoplasma a través del receptor de IP3R. La salida de ATP es necesaria para el aumento en el área promedio de la adhesión focal y el aumento en el número de adhesiones focales por célula inducida por estimulaciones cortas con Thy-1. Estimulaciones prolongadas llevan a un aumento en la polaridad celular y en la migración de los astrocitos DITNC1, efecto que también requiere de la apertura de hemicanales, la presencia de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. La estimulación de los astrocitos con BzATP, agonista del receptor P2X7, a altas concentraciones estimula la migración celular, mientras que bajas concentraciones, por si solas, no provocan este efecto. Sin embargo, nuestros estudios muestran que frente a una estimulación concomitante de Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina y BzATP a bajas concentraciones es suficiente para inducir la migración de los astrocitos DITNC1 sugiriendo que el aumento extracelular de ATP requiere de la actividad del sitio de unión a Integrina de Thy-1. Estos resultados indican además que la activación del receptor P2X7 por ATP (o BzATP) y la ruta activada río debajo de la interacción de Thy-1 con probablemente Síndecan-4 (Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina posee sitio de unión a heparina intacto) son necesarias para inducir la migración de los astrocitos. Los astrocitos de cultivo primario cambiaron su fenotipo tras ser expuestos a la citoquina pro-inflamatoria TNFα, aumentando la expresión de las proteínas Integrina β3, GFAP y receptor P2X7, lo que permitió también a los astrocitos migrar en respuesta a Thy-1. Ensayos realizados con astrocitos primarios en que se sobre-expresa o silencia el gen codificante para la Integrina β3, demostraron que la respuesta a Thy-1 luego del tratamiento con agentes pro-inflamatorios, es dependiente de la expresión de dicha Integrina. Se demostró además que la migración de estos astrocitos inducida por Thy-1 también requiere de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. Estos datos aportan al entendimiento del papel que tienen los astrocitos en el desarrollo de una respuesta inflamatoria tras un daño al sistema nervioso central. Además, aportan antecedentes interesantes sobre cómo una interacción neurona – astrocito, a través de Thy-1 y sus receptores, regula la migración de los astrocitos modificando la señalización intracelular, la permeabilidad de la célula y generando un fenómeno de transactivación que induce cambios en el comportamiento celular. Comprender cómo cambia el comportamiento de los astrocitos frente a la interacción con Thy-1 es importante para generar oportunidades terapéuticas y posibles blancos farmacológicos para contrarrestar la inhibición del crecimiento axonal relacionada con esta interacción. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo aparecen numerosas preguntas nuevas, por ejemplo qué vías se relacionan con la apertura de los hemicanales y cómo estas rutas se conectan con cambios en la adhesividad y migración de los astrocitos. Importante será también comprender el papel que tiene Síndecan-4 en la liberación de ATP inducida por Thy-1 y en la respuesta de los astrocitos de cultivo primario a Thy-1 en un contexto inflamatorio. Finalmente, llevar este conocimiento obtenido en modelos celulares a un modelo animal con perspectivas de tratamiento sería un objetivo clave para reforzar esta investigación<br>Astrocytes respond to inflammatory stimuli by modifying their morphology and gene expression pattern, and participate in the formation of the glial scar in the case of a traumatic lesion. This glial scar represents a non-permissive environment for axonal regeneration that harbors many inhibitory molecules thought to be responsible for the poor capacity of neurons in the Central Nervous System to repair themselves. In this context, molecules like Chondroitin sulfate proteoglycans secreted by astrocytes, the Nogo protein present on the surface of oligodendrocytes and, importantly for our studies, the neuronal surface glycosyl phosphatidylinositol protein Thy-1, all are highly relevant. For many years, our laboratory has focused on the study of Thy-1 function and signaling. We have shown that Thy-1 inhibits axonal growth and engages in cell-cell interactions. We have also demonstrated that these effects are elicited through the interaction with two receptors present in DITNC1 astrocytes: αvβ3 Integrin and Syndecan-4. We have observed that short-term interaction of Thy-1 with these two receptors enhances astrocyte adhesion; however, following prolonged stimulation, Thy-1 induces astrocyte migration. Thy-1 interaction with its receptors induces the activation of signal transduction pathways in astrocytes that increase RhoA and Rac1 GTPase activity with different kinetics. Thy-1 also induces ATP release from the astrocytes, resulting in the activation of the P2X7 receptor and entry of extracellular calcium. We know that these signals are necessary for astrocyte adhesion. However, how ATP is released in response to Thy-1 remains to be determined. Also whether extracellular ATP and P2X7 receptor activation are required for DITNC1 astrocyte migration induced by Thy-1 is unknown. These and related questions we sought to answer with the studies described in this thesis. On the other hand, results from our laboratory have shown that, in contrast to DITNC1 cells, primary astrocytes in culture do not respond to Thy-1 and express very low levels of β3 integrin, which however increase under pro-inflammatory conditions, such as those produced in the brain by a stroke. Because astrocytes undergo morphological changes and migrate under these conditions in an attempt to limit and repair the damage, we hypothesized that the different responses observed in DITNC1 cells and primary astrocytes, after Thy-1 stimulation, are due to the different levels of integrin expression observed in the two types of cells. Therefore, in this study we propose that DITNC1 cell migration induced by Thy-1 requires ATP release into the extracellular space – by still unknown mechanisms – and P2X7 receptor activation. Furthermore, we hypothesize that primary astrocytes do not respond to Thy-1 due to their low levels of β3 Integrin expression. In order to study ATP release from the astrocytes, and the signaling pathways involved, we measured extracellular ATP by luminescence techniques, and evaluated calcium kinetics by loading the cells with fluorescent probes, and follow fluorescent dye uptake. To assess the requirements of astrocyte migration induced by Thy-1, we performed wound healing and cell polarity assays. The participation of the different molecules in the mechanisms under study was analyzed by the use of pharmacological inhibitors, channel blockers or receptor antagonists. Also, expression of some of these molecules was modified using shRNA and siRNA or other approaches. Primary astrocyte responses to Thy-1 were monitored in cortical astrocytes treated or not treated with pro-inflammatory cytokines, such as TNFα. Then, changes in β3 Integrin expression were analyzed by Western Blotting, and astrocyte migration was evaluated using the wound healing assay under different conditions, including silencing or overexpression of β3 Integrin. The results shown in this study indicate that ATP release induced by Thy-1 required the interaction with both αvβ3 Integrin and Syndecan-4 receptors. Mutation of the integrin-binding site completely abolished the response, while mutation in the heparin-binding domain decreased and delayed ATP release. We further demonstrate that ATP release occurred through Connexin 43 and Pannexin 1 hemichannels, which are opened by a mechanism that required an increase in intracellular calcium stored in the endoplasmic reticulum. This calcium was released to the cytoplasm through IP3R receptor activation. ATP release was necessary for the increase of both average focal adhesion area and the number of focal adhesions per cell induced by stimulation for short periods with Thy-1. Prolonged stimulation induced DITNC1 cell polarization and migration, and both of these effects required the opening of hemichannels, the presence of extracellular ATP and P2X7 receptor activation. Treatment of astrocytes with BzATP, a P2X7 receptor agonist, stimulated cell migration at high concentrations. However, our study shows that DITNC1 astrocytes treated with low concentrations of BzATP, which did not induce cell migration, were able to migrate upon co-stimulation with a mutant form of Thy-1 lacking the integrin-binding site, but with an intact heparin-binding domain, suggesting that increases in extracellular ATP requires the integrin-binding site of Thy-1. These results also indicate that activation of the P2X7 receptor by ATP (or BzATP) and downstream signaling induced by Thy-1 through Syndecan-4, are necessary for astrocyte migration. Primary astrocytes changed their phenotype after treatment with TNFα, increased the expression of β3 Integrin, GFAP and P2X7 receptor, and migrated in response to Thy-1. Furthermore, experiments in which β3 Integrin was overexpressed or silenced indicated that after treatment with pro-inflammatory agents, the observed responses to Thy-1 depended on the expression of this integrin. Migration of TNFα-treated astrocytes induced by Thy-1 also required extracellular ATP and the activation of the P2X7receptor. These results improve our understanding of the role that astrocytes play during an inflammatory response after damage to the Central Nervous System. They also uncover mechanisms relevant to how neuron-astrocyte interactions, established via neuronal Thy-1 and its astrocytic receptors, regulates astrocyte migration, modifies intracellular signaling, cell permeability and generates changes in cell behavior. These results set the stage for future studies that will yield a deeper understanding of how astrocytes change their behavior after interacting with Thy-1. These insights may eventually help in generating therapeutic opportunities and pharmacological targets to counteract the inhibition of axonal growth ascribed to interaction with astrocytes. With our results, new questions arise. For example, which pathways are related to the opening of hemichannels? How do these pathways regulate changes in adhesion and migration of astrocytes? What role does Syndecan-4 play in ATP release induced by Thy-1? What is the role of Syndecan-4 in primary astrocytes stimulated with Thy-1 under inflammatory conditions? Finally, it would be very interesting to compare these results with the responses that are observed in animal models. In conjunction, these approaches may eventually help to define new approaches for the treatment of patients with post-trauma brain damage<br>Conicyt

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:14Z : No. of bitstreams: 1 000851655.pdf: 1706170 bytes, checksum: 990d3d441221c8d5284639c96fcf57c8 (MD5)<br>Os tumores cerebrais primários mais comuns são denominados gliomas. Eles são definidos patologicamente pela presença de características histológicas e imuno-histoquímicas que evidenciam diferenciação glial. De acordo com a suposta linhagem de origem, eles são classificados como astrocitomas, oligodendrogliomas ou ependimomas. Dentre eles, os astrocitomas são os mais comuns e agressivos. O tratamento atualmente utilizado inclui remoção cirúrgica seguida de quimioterapia com temozolamida (TMZ) e radioterapia, porém sua eficácia é muito baixa devido à alta resistência das células tumorais. Buscando encontrar genes associados com a elevada resistência dos astrocitomas, realizamos um estudo anterior de expressão gênica diferencial utilizando uma coleção de genes de reparo de DNA. Nesta análise foram identificados sete genes significantemente superexpressos em glioblastoma multiforme (GBM), o tipo mais agressivo de astrocitoma. Estes genes são: APEX1, BRCA2, BRIP1, EXO1, NEIL3, RAD54L e XRCC2. Através de RT-PCR quantitativo, avaliamos os níveis de expressão destes genes em um painel expandido de 54 casos clínicos de astrocitomas de diferentes graus de malignidade e em 5 linhagens celulares de GBM. Todos os genes analisados mostraram-se mais expressos nos astrocitomas, com exceção de RAD54L em amostras de astrocitoma de grau II. Além disso, a superexpressão dos 7 genes avaliada isoladamente não exerce influência direta na sobrevida dos pacientes. Evidenciou-se ainda a superexpressão mais acentuada de EXO1 e NEIL3, que foram selecionados para realização de ensaios funcionais de silenciamento, e avaliação do ciclo celular e taxas de apoptose/morte efetiva das células. Estes ensaios foram realizados com as linhagens celulares T98G e U138MG, que apresentaram maiores níveis de expressão destes genes. Nos ensaios funcionais, observamos que o silenciamento...<br>Gliomas are the most common type of primary brain cancers. They are pathologically defined by the presence of histological and immunehistochemical characteristics that evidence glial differentiation. According to the hypothetical cell of origin they are classified in: astrocytomas, oligodendrogliomas and ependimomas. Among them, astrocytomas are the more common and aggressive type. The treatment currently used for GBM includes surgical resection of tumor followed by chemotherapy with temozolamide (TMZ) and radiotherapy, but this protocol is still insufficient due to the high resistance of cancer cells. Searching for repair genes associated with the high resistance of astrocytomas, we developed a previous study of differential gene expression using a collection of DNA repair genes. In this analysis, we identified seven genes significantly overexpressed in glioblastoma multiforme (GBM), namely: APEX1, BRCA2, BRIP1, EXO1, NEIL3, RAD54L and XRCC2. Using quantitative RT-PCR, we evaluated the expression of these genes in an expanded panel of samples with 54 clinical cases of different grade astrocytomas and five GBM cell lines. All genes showed expression significantly higher in astrocytomas, except RAD54L in grade II astrocytomas. Moreover, the overexpression of this 7 genes evaluated individually doesn't exert direct influence upon patient's survival rate. Remarkably, EXO1 and NEIL3 showed the higher fold changes and were chosen for functional silencing assays. This experiments were performed with T98G and U138MG cell lines that showed the higher expression levels among the GBM cell lines analyzed. In the functional assays, we observed that the silencing of EXO1 or NEIL3 doesn't induce changes in the apoptosis and cell death rates and doesn't change the distribution of cells in cycle. Beyond this, the silencing of this two genes doesn't sentisizes cells to ionizing radiation.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Bioquímica<br>Los astrocitos colaboran con las neuronas en el normal desarrollo de sus actividades metabólicas, y más aún son capaces de participar activamente en su protección frente a estímulos potencialmente dañinos. Se ha demostrado, que la enzima glutatión-S-transferasa M2-2 (GSTM2-2) de astrocitos es capaz de conjugar glutatión con aminocromo, un producto de oxidación de la dopamina, y por ello es que se propone como hipótesis que la enzima Glutation-S-transferasa M2-2 producida por astrocitos les confiere protección, y protege neuronas tipo dopaminérgicas de los efectos tóxicos de aminocromo. Para validar esta hipótesis es que en primera instancia se determinó la capacidad de los astrocitos humanos U373MG (glioblastoma) de captar aminocromo mediante utilización de aminocromo tritiado, observándose una incorporación máxima a los 40 minutos, la que es parcialmente inhibida por tratamientos con exceso de dopamina, imipramina y nomifensina. Mediante western blot se determinó que la presencia del aminocromo en los cultivos celulares provoca un aumento en la cantidad proteína, además de detectarse aumento en la actividad enzimática, ambos cambios de manera dependiente de la concentración, en donde 100 μM de aminocromo aumenta 2,1 veces la cantidad de la enzima en 3 horas. Se detectó mediante western blot la presencia de la proteína GSTM2-2 en los medios condicionados de células U373MG, aumentando 2,7 veces al exponer las células a aminocromo 50 μM por 3 horas en relación al control sin aminocromo. La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y es susceptible a toxicidad inducida por aminocromo, determinada por citometría de flujo, por lo que se probaron los medios condicionados de las células U373MG que contenían la enzima GSTM2-2 sobre cultivos de SH-SY5Y, evidenciándose la capacidad de proteger a células SH-SY5Y de la muerte inducida por exposición a 10 μM de aminocromo, y dicha protección frente a la muerte celular es dependiente de la internalización de la proteína GSTM2-2 por parte de las células SH-SY5Y, tal como se demostró (i) por captación de 14C-GSTM2-2 liberado por células U373MG, proceso inhibido por un antisuero contra GSTM2-2, (ii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de U373MG tratados con antisuero contra GSTM2-2, (iii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de células U373MGsiGST6, que expresan un siRNA contra GSTM2-2. En conclusión, nuestros resultados demuestran que las células U373MG protegen las células SH-SY5Y contra la toxicidad inducida por aminocromo, por un mecanismo que involucraría la liberación de GSTM2-2 al medio condicionado y la subsecuente internalización de esta enzima por parte de las células SH-SY5Y. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo de protección de neuronas dopaminérgicas mediado por astrocitos<br>Astrocytes collaborate with neurons in the normal development of their metabolic activities, and to a greater extent, they are able to actively participate in their protection from potentially harmful stimuli. It has been shown that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 (GSTM2-2) from astrocytes is able to conjugate glutathione to aminochrome, an oxidation product of dopamine. Therefore the hypothesis proposed is that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 produced by astrocytes protect them, and also protects dopaminergic neurons from the toxic effects of aminochrome. To validate this hypothesis, we assessed the ability of human astrocytes U373MG (glioblastoma) to capture aminochrome by using tritiated aminochrome, reaching an incorporation peak at 40 minutes, which is partially inhibited by treatment with excess dopamine, imipramine and nomifensine. Using western blot, we determined that the presence of aminochrome in cell cultures causes an increase in the protein amount, besides the increasing enzymatic activity, both changes depending on the aminochrome concentration, with 100 μM aminochrome increasing 2.1 times the amount of the enzyme in 3 hours. The presence of protein GSTM2-2 was detected by western blot in conditioned media from U373MG cells, increasing 2.7 times after the exposure to 50 uM aminochrome for 3 hours compared to the control without aminochrome. The neuroblastoma cell line SH-SY5Y is susceptible to aminochrome-induced toxicity, determined by flow cytometry, then U373MG cells conditioned media containing the enzyme GSTM2-2 cultures were tested on SH-SY5Y, demonstrating the ability to protect SH-SY5Y against aminochrome-induced cells death, and that protection against cell death is dependent on internalization of the GSTM2-2 protein by SH-SY5Y cells. This internalization was demonstrated by (i) uptake of 14C-GSTM2-2 released by U373MG cells, process inhibited by an antiserum against GSTM2-2, (ii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media from U373MG treated with antiserum against GSTM2-2, (iii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media of U373MGsiGST6 cells expressing siRNA against GSTM2-2. In conclusion, our results demonstrate that U373MG cells protect SH-SY5Y cells against aminochrome-induced toxicity, by a mechanism which would involve the release of GSTM2-2 to the conditioned medium and subsequent internalization of this enzyme by SH-SY5Y cells. These results suggest a novel mechanism of protection of dopaminergic neurons mediated by astrocytes<br>Conicyt; Fondecyt

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario<br>El objetivo de este trabajo fue demostrar que la glutatión transferasa M2-2 humana (GST M2-2), protege a los astrocitos de los efectos tóxicos del aminocromo, ya que en estudios in vitro utilizando la enzima recombinante, se demostró que esta enzima conjuga aminocromo con glutation reducido (GSH), formando un metabolito resistente a agentes oxidativos biológicos, bloqueando de esta forma los efectos neurotoxicos generados por aminocromo. GST M2-2 está presente en la sustancia nigra y en astrocitos. Para demostrar la función protectora de esta enzima, se infectó la línea celular de astrocitos humanos U373MG con retrovirus (Gammaretroviridae), los cuales llevan en su genoma un plasmidio con los RNA interferentes (siRNA), necesarios para generar una disminución total o parcial de la expresión de esta enzima. Se utilizaron tres siRNA, los cuales van dirigidos a distintas zonas del RNAm, con el fin de producir secuencias erróneas que impidan la síntesis de la proteína funcional. De los tres interferentes utilizados, todos ellos generaron una disminución de la expresión de la enzima GST M2-2 en diferente magnitud, uno de ellos, el denominado arbitrariamente siGST 6, logró una disminución de la expresión de la enzima de un 82%, siendo éste el mayor nivel alcanzado. Para los ensayos de toxicidad se sintetizó y purificó aminocromo y se agregó a la línea celular de astrocitos humanos U373MG. Se realizó una curva de toxicidad utilizando diferentes concentraciones de aminocromo, (0, 50, 100, 200, 300 y 500 uM) y se evaluó su toxicidad tanto en la línea celular U373MG wild type como en la línea celular U373MG infectada con los distintos interferentes. Los resultados sugieren que la línea celular U373MG wild type es más resistente a los efectos tóxicos generados por aminocromo, debido principalmente a la presencia de la enzima GST M2-2. En aquellas células infectadas con los interferentes se produjo una mayor mortalidad, directamente proporcional al grado de inhibición de la enzima GST M2-2, lo que demuestra y comprueba que esta enzima conjuga aminocromo y bloquea los efectos tóxicos de este<br>Proyecto FONDECYT 1061083 y Beca Fogarty Internacional Research Collaboration Award (FIRCA), RCA R03 TW07044-1

La enfermedad de Alzheimer es la forma mas común de demencia en edades avanzadas, la cual afecta a 40 millones de personas alrededor del mundo. Es una enfermedad compleja que afecta no solo a neuronas, sino también a astrocitos. La Apolipoproteína E4 (ApoE4) ha sido descrita como el factor de riesgo genético más importante de la forma esporádica de la enfermedad y además, los astrocitos son los principales secretores de esta. La investigación sobre los mecanismos patogénicos causados por esta apolipoproteína está centrada en su rol extracelular. Por el contrario, nosotros analizamos las desregulaciones intracelulares que causa la ApoE4. En nuestro estudio, nos centramos en 2 principales procesos fisiológicos alterados en la enfermedad de Alzheimer: la señalización de calcio y las funciones mitocondriales. Utilizamos como modelo celular, astrocitos inmortalizados que expresan la forma humana ApoE3 (no asociada a ninguna patología) o la ApoE4. Utilizando indicadores de calcio fluorescentes y la técnica de Imagen de Calcio, determinamos que los astrocitos ApoE4 tienen alteraciones de la homeostasis de calcio, ya que presentan menores niveles de calcio intracelular basal pero mayores señales de calcio inducidas por estímulos purinérgicos en comparación con los astrocitos ApoE3. Una mayor actividad de la V-ATPasa y por lo tanto, una mayor entrada de calcio al lisosoma en los astrocitos ApoE4 explica estas alteraciones. Además, la salida de calcio lisosomal después de la activación de receptores purinérgicos es seguida por una mayor movilización de calcio del retículo endoplásmico en los astrocitos ApoE4 comparados con los ApoE3. La entrada de calcio extracelular es similar en ambos tipos celulares. Nuestros estudios también demuestran que la falta de lipoproteínas en el medio extracelular aumenta la magnitud de las respuestas de calcio inducidas por receptores purinérgicos en los astrocitos ApoE3, ya que la entrada de calcio extracelular amplifica la liberación del calcio lisosomal en estas células. Esta característica se pierde en las células ApoE4, en las cuales la magnitud de las respuestas de calcio no se ve afectada por las lipoproteínas extracelulares. Por otro lado, describimos alteraciones en las dinámicas mitocondriales determinadas por microscopia a tiempo real y el marcaje fluorescente de mitocondrias. En particular, las mitocondrias de células ApoE4 no realizan fisión después de la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, mientras que las mitocondrias de los astrocitos ApoE3 si la realizan. Asimismo, los astrocitos ApoE4 tienen un incremento en la movilidad mitocondrial, una reducción de Parkina, proteína involucrada en la mitofagia y una reducción del ADN mitocondrial en comparación con los astrocitos ApoE3. En resumen, demostramos por primera vez que la ApoE4 endógena altera la señalización del calcio y las funciones mitocondriales en astrocitos. Teniendo en cuenta que la ApoE4 se expresa a lo largo de toda la vida de los individuos, estas alteraciones astrocíticas podrían aparecer en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Para avanzar en la detección de estas primeras etapas de la patología, y ya que las proteínas del líquido cefalorraquídeo reflejan las funcionalidad de las células cerebrales, nosotros hemos identificado un grupo de proteínas astrocíticas presentes en este líquido relacionadas con la enfermedad de Alzheimer y que proponemos como firma funcional astrocítica. Esta firma esta compuesta de las proteínas S100B, ApoE, prostaglandina D2 sintetasa, cistatina 3, proteína integral de membrana 2C y clusterina. En general, la ApoE4 endógena altera las funciones de los astrocitos, un fenómeno que puede contribuir a la enfermedad de Alzheimer, además de a su detección a través de biomarcadores del líquido cefalorraquídeo.<br>Alzheimer’s disease is the most common form of dementia in advanced ages affecting more than 40 million people around the world. It is a complex disease that affects not only neurons but also astrocytes. Apolipoprotein E4 (ApoE4) has been described as the most important genetic risk factor for the sporadic form of the disease and interestingly, astrocytes are its main secretors. The research about its pathogenic mechanisms has mainly focused on its extracellular role. On the contrary, we analysed the dysregulations that endogenous intracellular ApoE4 causes on astrocytes. We focused on 2 principal physiological processes altered in Alzheimer’s disease: calcium signalling and mitochondrial functions. As cellular model, we used immortalized astrocytes that express human ApoE3 (non-associated with any pathology) or ApoE4. Using fluorescent calcium indicators and the technique of Calcium Imaging, we determined that ApoE4 astrocytes have altered calcium homeostasis as they have lower basal intracellular calcium levels but higher purinergic-induced calcium signals compared to ApoE3 astrocytes. A high V-ATPase activity, and hence, higher lysosomal calcium uptake in ApoE4 astrocytes explains these alterations. Moreover, lysosomal calcium release after purinergic receptor activation is followed by higher endoplasmic reticulum (ER) calcium mobilization in ApoE4 than in ApoE3 astrocytes. Extracellular calcium entry is similar in both cell types. Our studies also demonstrated that the lack of lipoproteins in the extracellular medium upregulates the magnitude of purinergic-elicited calcium responses in ApoE3 astrocytes, as extracellular calcium entry amplifies lysosomal calcium release. This feature is missing in ApoE4 astrocytes being the magnitude of calcium responses unaffected by extracellular lipoproteins. On the other hand, we described alterations in mitochondrial dynamics determined by real-time microscopy and fluorescent mitochondria labelling. In particular, ApoE4 cell mitochondria do not perform fission after inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation whereas ApoE3 astrocyte mitochondria perform it. In addition, ApoE4 astrocytes have increased mitochondrial motility, reduction of Parkin, a protein involved in mitophagy, and reduction in mitochondrial DNA content compared to ApoE3 astrocytes. In summary, we demonstrated, for the first time, that endogenous ApoE4 alters calcium signalling and mitochondrial functions in astrocytes. Taking into account that ApoE is expressed throughout the life of individuals, these astrocytic alterations might appear in the early stages of the Alzheimer’s disease. In order to advance in the detection of such early phases of the pathology, and since cerebrospinal fluid proteins reflect the cellular function of brain cells, we next identified a group of astrocytic proteins present in the cerebrospinal fluid related to Alzheimer’s disease that we propose as a functional astrocytic signature for early stages of the disease. This signature is composed of S100B, ApoE, prostaglandin D2 synthetase, cystatin 3, integral membrane protein 2C and clusterin. Overall, endogenous ApoE4 alters astrocyte functions, a phenomenon that can contribute to Alzheimer’s disease, but also, to its detection through cerebrospinal fluid biomarkers.

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas<br>Made available in DSpace on 2018-08-08T19:23:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zago_GabrielaMariotoni_M.pdf: 5451987 bytes, checksum: 84e15c6e492816ce6e4cc4c92760e544 (MD5) Previous issue date: 2007<br>Resumo: A barreira hematoencefálica (BHE) é a principal estrutura controladora da manutenção da homeostase do SNC. A perda da integridade da BHE em respostas inflamatórias do SNC, desencadeada por agentes neurotóxicos, têm sido associadas ao desenvolvimento de sinais neurológicos. O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) produz sinais e sintomas excitatórios em humanos e sua ação neurotóxica sugere habilidade potencial em alterar a permeabilidade da BHE. Nesse trabalho, o PNV foi utilizado como ferramenta para avaliar a susceptibilidade da BHE em diferentes regiões anatômicas cerebrais de ratos. Após injeção sistêmica do PNV (0.85 mg/Kg in 0.5 ml), os ratos anestesiados foram perfundidos 1, 2 e 5 h após a injeção, com solução fixadora à qual foi adicionado traçador extracelular eletron-opaco. Córtex motor fronto-parietal, substância cinzenta periaquedutal, núcleos da base e amigdala foram dissecados e processados para microscopia eletrônica de transmissão. O estado funcional da BHE foi avaliado considerando evidências do vedamento da barreira (edema vasogênico e extravasamento do traçador) e a resposta de elementos do tecido circunjacente (astrócitos, terminais sinápticos, populações de células). Além disso, foi investigada a expressão das proteínas GFAP, o principal filamento intermediário dos astrócitos, proteína S100, uma família de proteínas ligantes de cálcio e as citocinas pró-inflamatórias, IFN-? e TNF-a, através de marcação imunohistoquímica, no hipocampo e cerebelo. Logo após a administração do PNV, os animais mostraram sinais indicativos de envolvimento do SNC, SNP e SNA. Nossos resultados mostraram que todas as regiões analisadas apresentaram sinais morfológicos de reação defensiva, tais como migração de micróglia perivascular reativa, pés-vasculares astrocitário edemaciados e macrófagos ativos circulantes. Entretanto, apenas o córtex motor fronto-parietal mostrou número significante de vasos afetados em relação aos controles e às outras áreas anatômicas (1 h p.i.). Nos grupos controle, uma expressão basal de GFAP e S100B foi mantida inalterada durante os períodos de observação, enquanto nenhuma produção fisiológica das proteínas TNFa e INF? ocorreu. Por outro lado, a análise dos grupos tratados com PNV mostrou que, variavelmente, todas as proteínas investigadas aumentaram sua expressão no cerebelo e hipocampo ao longo do tempo após a injeção do veneno. O aumento da GFAP no cerebelo foi mais precoce e mais forte do que no hipocampo. Essa gliose mais evidente no cerebelo, provavelmente justifica estudos prévios, onde o extravasamento do traçador foi menor nessa região do que hipocampo, demonstrando assim, uma maior resistência da BHE do cerebelo. Outros mecanismos moleculares envolvidos poderiam ser a expressão de citocinas pró-inflamatórias TNFa e INF?, cuja modulação diferente em hipocampo e cerebelo de animais tratados com PNV, poderia também ter papel nas diferenças de permeabilidade da BHE vistas em ambas as áreas após PNV. Nosso trabalho dá suporte à hipótese de que os sinais e sintomas apresentados pelos animais durante o intervalo de tempo, após a injeção de PNV e o sacrifício, refletem alterações fisiológicas em curso, que por sua vez se revela ao nível histológico e ultraestrutural no desigual envolvimento da BHE nas diferente regiões cerebrais analisadas. Os vasos do córtex motor fronto parietal foram mais afetados pelo PNV, do que as demais regiões, confirmando a existência de diferenças regionais na capacidade do tecido local de mediar eventos requeridos para que ocorram as alterações da permeabilidade da BHE e para a invasão de populações celulares. O veneno de Phoneutria nigriventer representa uma importante substância natural, cuja complexa composição pode ser explorada em relação à ação de drogas que agem no SNC<br>Abstract: The blood¿brain barrier (BBB) is of pivotal importance to maintain homeostasis of the CNS, as it closely regulates the composition of the interstitial fluid in the brain. The loss of BBB integrity in CNS inflammatory responses triggered by neurotoxic agents has been associated with the development of neurological signs. Phoneutria nigriventer armed spider venom (PNV) produces excitatory signals and symptoms in humans, and its recognized neurotoxic action suggests a potential ability to alter BBB permeability. In this work, the PNV was used as tool to analyzing the BBB susceptibility of different rat brain anatomic regions. After PNV systemic injection (0.85 mg/ Kg in 0.5 ml) the rats were perfused at 1, 2 and 5 h post-injection (p.i.) with fixative solution to which had been added an electro-opaque extracellular tracer. Frontal-Parietal Motor Cortex, Periaqueductal Gray Matter, Base Nucleus and Amygdala were dissected and processed for routine transmission electron microscopy. The functional state of the BBB was evaluated considering evidences of the tightness of the barrier (vasogenic edema and tracer extravasation) and the response of elements of circumjacent tissue (astrocytes, synaptic endings, cells population). Besides, it was investigated the expression of the GFAP, the major intermediate filament of astrocytes, S100 protein, a family of calcium-binding proteins, and IFN-? and TNF-a pro-inflammatory cytokines, through imunohistochemistry labeling, in the hippocampus and cerebellum. Soon after PNV dministration the animals showed clinical signs indicative of peripheral, autonomic and central nervous system involvement. Our findings showed that all regions analyzed presented morphological signs of defensive reaction, such as migrating reactive perivascular microglia, swollen astrocytes end-feet and circulating active macrophages. However, only FPMC showed significant number of affected vessels in relation to controls and the other anatomic areas (1 h p.i.). A basal expression of GFAP and S100 was maintained unaltered along the periods of observation, whereas none physiologic production of TNFa and INF? proteins has occurred in control groups. In contrast, analysis of the PNV-treated groups showed that all investigated proteins variably enhanced its expression along the time-course after venom injection in cerebellum and hippocampus. The increase of GFAP in cerebellum is more precocious and stronger than in hippocampus. A more prominent reactive gliosis by cerebellum over hippocampus would be supposedly one of the molecular events underlying the previous findings showing to be cerebellum BBB more resistant to leakage than hippocampus. Other possible molecular mechanism involved would be the expression of proinflammatory TNFa and INF? cytokines, whose different modulation in cerebellum and hippocampus of PNV-treated animals could be also involved in differences of permeation of BBB seen in both areas. Our study further support the idea that the symptomatic interval after systemic P. nigriventer spider venom injection is characterized by sequential physiologic changes that are reflected in histological and ultrastructural preparations and reveal that BBB impairment is unequal in different anatomical brain areas. The Fronto-Parietal Motor Cortex vessels are more targeted for PNV, confirming the existence of regional differences in the capacity of the local tissue of mediating the events required for the changes of BBB permeability and for cell invasion. Phoneutria nigriventer venom represents an important natural substance, whose complex composition should be explored in terms of CNS acting drugs<br>Mestrado<br>Farmacologia<br>Mestre em Farmacologia

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-07T06:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emirandetti_Amanda_M.pdf: 4129268 bytes, checksum: 6b46598f867a92cb0663cb6e4cabb3ae (MD5) Previous issue date: 2006<br>Resumo: Astrócitos são elementos fundamentais para o funcionamento normal do sistema nervoso central (SNC). Estas células exibem inúmeras funções, podendo modular a excitabilidade neural e a transmissão de impulsos nervosos através de seus processos lamelares finos que se localizam nas adjacências das sinapses. Todavia, astrócitos também podem desempenhar funções na integridade da fisiologia do sistema nervoso (SN) após uma lesão. A astrogliose após lesão nervosa é caracterizada pela hiperplasia e hipertrofia do corpo celular e dos processos astrocitários, os quais bloqueiam a regeneração axonal. No entanto, a reatividade astrocitária também possui aspectos positivos, como a produção de fatores neurotróficos. Apesar de a plasticidade sináptica após lesão seja um fenômeno conhecido, os mecanismos envolvidos em tal evento ainda permanecem desconhecidos. Nesse sentido, células gliais, especialmente astrócitos, podem exibir importantes papéis nos processos de mudança do SN, influenciando a retração dos terminais sinápticos tanto quanto promovendo um ambiente peri-sináptico propício, afetando o reestabelecimento dos botões que foram retraídos. Nesse trabalho, estudou-se a resposta astrocitária após a axotomia em camundongos das linhagens C57BL/6J, Balb/cJ e A/J, utilizando-se técnicas de imunofluorescência, microscopia eletrônica de transmissão e cultura celular. Nesse sentido, foram apresentadas evidências de que camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6J, Balb/cJ e A/J exibem diferentes intensidades de reatividade astrocitária após lesão periférica in vivo, sendo estas diferenças significativas entre A/J (3,87 ± 0,07, média ± erro padrão, GFAP e 3,76 ± 0,16, ezrina) e C57BL/6J (2,35 ± 0,024, p<0,0001; GFAP e 2,69 ± 0,26, ezrina, p<0,001). Ainda, astrócitos derivados de córtices de camundongos cultivados in vitro exibiram diferença significativa na imunomarcação com anti-GFAP e anti-ezrina entre as linhagens A/J (22,60 ± 1,63, média ± erro padrão, GFAP e 18,47 ± 1,31, ezrina) e C57BL/6J (13.22 ± 1,80; p<0,001, GFAP, 13,95 ± 1,16, ezrina p<0,05). Adicionalmente, a astrogliose nas adjacências dos motoneurônios axotomizados foi menor em animais C57BL/6J quando comparado com A/J, sugerindo que a diferença da reatividade astrocitária possui influência direta na sinaptogênese in vitro. Ainda, a análise estrutural quantitativa indicou maior retração sináptica nas linhagens A/J e Balb/cJ em relação ao C57BL/6J, uma semana após a transecção do nervo isquiático. Nossos resultados demonstram que o aumento da astrogliose pode influenciar o grau de plasticidade sináptica na medula espinhal, que possivelmente influencia a regeneração axonal dos motoneurônios lesionados<br>Abstract: Astrocytes are of major importance for normal functioning of the central nervous system (CNS). These cells have been shown to play a large number of different functions in the brain. They can modulate the neural excitability and signal transmission by their thin lamellar process surrounding synapses. Moreover, astrocytes play a major role in preserving and restoring structural and physiological integrity following injury to the CNS. Astrogliosis is characterized by hyperplasia and hypertrophy of cell bodies and processes, which has been considered to block axonal regeneration, but reactiveness of glial cells at the lesion site has also positive aspects, such as the production of neurotrophic factors. Although synaptic plasticity is a widespread phenomenon, the underlying mechanisms leading to its occurrence are virtually unknown. In this sense, glial cells, especially astrocytes, may have a role in network changes of the nervous system, influencing the retraction of boutons as well as providing a proper perisynaptic environment, thereby affecting the replacement of inputs. In the present work, we have studied the astrocytic response after axotomy in C57BL/6J, Balb/cJ and A/J mice, using immunofluorescence, transmission electron microscopy and cell cultures techniques. In this sense, we present evidence that A/J, Balb/cJ and C57BL/6J isogenic mice display different astrocyte reactivity after a peripheral lesion in vivo (A/J; 3.87 ± 0.07- GFAP and 3.76 ± 0.16 ¿ezrin / C57BL/6J; 2.35 ± 0.024 - GFAP, p<0.0001 and 2.69 ± 0.26 - ezrin, p<0.001). Further, astrocytes from mice cortices were isolated and expanded in vitro, showing a significant difference in GFAP and ezrin labeling between AJ (22.60 ± 1.63 - GFAP and 18.47 ± 1.31 - ezrin) and C57BL/6J mice (13.22 ± 1.80 ¿ GFAP, p<0.001 and 13.95 ± 1.16 ¿ ezrin, p<0.05). Also, astrogliosis surrounding axotomized motoneurons C57BL/6J is lower than A/J mice and such a difference has a direct influence on in vitro synaptogenesis. Indeed, ultrastructural quantitative analysis showed more intense synaptic detachment in A/J and Balb/cJ strains after sciatic nerve transection than in C57BL/6J mice. Our findings demonstrate that an increased astrogliosis influences the degree of synaptic plasticity in the spinal cord, which may in turn contribute to the axonal regeneration of lesioned motoneurons<br>Mestrado<br>Anatomia<br>Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira<br>Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-09T22:49:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_KarinadeBrito_D.pdf: 8050913 bytes, checksum: f9c7d621391d6f3f99413a9c27749530 (MD5) Previous issue date: 2007<br>Resumo: Durante o curso da encefalomielite autoimmune experimental ocorre uma grave redução das funções motoras e sensitivas. Esses eventos têm sido classicamente atribuídos ao processo desmielinizante da doença. Em ratos, os sinais clínicos da doença desaparecem 5 dias após completa tetraplegia, indicando que o processo desmielinizante não é a única causa da rápida evolução da doença. Assim sendo, investigamos as alterações sinaptológicas e o processo inflamatório induzidos pela encefalomielite autoimune experimental (EAE) em motoneurônios medulares e sua relação com o surto e remissão da doença. Para esse estudo, foram utilizados ratos Lewis, fêmeas de 7 semanas. Os animais foram induzidos à EAE por meio de dose única de proteína básica de mielina emulsificada com adjuvante completo de Freund e sacrificados no 13º dia após indução (surto grau 3) e no 26º dia (remissão da doença). Também, para investigar a possibilidade de que o tratamento com acetato de glatirâmer, uma droga imunomoduladora baseada na estrutura de aminoácidos da proteína básica de mielina, interfira no processo de plasticidade sináptica, os animais foram induzidos à EAE, tratados com AG diariamente e sacrificados após 2 semanas. Os grupos experimentais foram divididos em: estudo da aposição sináptica durante surto e remissão da doença e tratamento dos animais induzidos à EAE com AG. Assim, os espécimes foram processados para análise através de imunohistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. Nossos resultados indicaram que os componentes gliais (astrócitos e microglia), estimulados pela inflamação, desempenham papel ativo no processo de retração sináptica em motoneurônios alfa. Apresentamos evidências de que a eliminação de terminais sinápticos contribui para a perda da função motora observada no curso da doença e que o imunomodulador AG não só possui efeito antiinflamatório, mas também influencia diretamente na plasticidade de elementos neurais no microambiente medular. Reforçam, também, que um processo agudo de inflamação pode colaborar diretamente para a recuperação e sobrevivência neuronal, uma vez que as células inflamatórias produzem citocinas e fatores neurotróficos no microambiente medular<br>Abstract: During the course of experimental autoimmune encephalomyelitis, a massive loss of motor and sensitive function occurs, which has been classically attributed to the demyelination process. In rats, the clinical signs disappear within 5 days following complete tetraplegia, indicating that demyelination might not be the only cause for the rapid evolution of the disease. The immunomodulador glatiramer acetate (GA) has been shown significantly reduce the seriousness of the symptoms during the exacerbation of the disease. However, little is known about its effects on the spinal motoneurons and on their afferents. The present work investigated the occurrence of experimental autoimmune encephalomyelitis-induced changes of the synaptic covering of spinal motoneurons during exacerbation and after remission and investigated whether GA has a direct influence on synapse plasticity and on the deafferentiation of motoneurons during the course of EAE in rats. Lewis rats were subjected to EAE associated with GA or placebo treatment. The animals were sacrificed after fifteen days of treatment. For the both cases the spinal cords was processed for immunohistochemical analysis (IH) and electron transmission microscopy. The terminals were typed with transmission electron microscopy as C-, F- and Stype. Immunohistochemical analysis of synaptophysin, glial fibrillary acidic protein and the microglia/macrophage marker F4/80 were also used in order to draw a correlation between the synaptic changes and the glial reaction. The ultrastructural analysis showed that, during exacerbation, there was a strong retraction of both F- and S-type terminals. In this sense, both the covering as well as the length of the remaining terminals suffered great reductions. However, the retracted terminals rapidly returned to apposition, although the mean length remained shorter. A certain level of sprouting may have occurred as, after remission, the number of F-terminals was greater than in the control group. The immunohistochemical analysis showed that the peak of synaptic loss was coincident with an increased macro- and microglial reaction. Interestingly, although the GA treatment preserved synaptophysin labelling, it did not significantly reduce the glial reaction, indicating that inflammatory activity was still present. Our results suggest that the major changes occurring in the spinal cord network during the time course of the disease may contribute significantly to the origin of the clinical signs as well as help to explain their rapid recovery and that the immunomodulator GA has a direct influence on the stability of nerve terminals in the spinal cord, which in turn may contribute to its neuroprotective effects during the course of multiple sclerosis<br>Doutorado<br>Anatomia<br>Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-23Bitstream added on 2014-06-13T19:36:21Z : No. of bitstreams: 1 godoy_gs_me_jabo.pdf: 837932 bytes, checksum: 779e6f97dccb483745e767a59be1738c (MD5)<br>Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)<br>Os astrócitos são células nervosas que participam da patogenia de diversas neuropatias que acometem os animais domésticos. Nas aves, a principal doença neurológica é a Encefalomalácia Nutricional causada pela deficiência de vitamina E. Com o objetivo de se estudar o comportamento do astrócitos, pelo exame imunoistoquímico, na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus, foi realizada a tentativa de indução desta doença. Utilizou-se para isto rações contendo deficiência de vitamina E no suplemento vitamínico-mineral e fontes de gordura oxidadas. Nos experimentos realizados não se obteve sucesso na indução da Encefalomalácia Nutricional, porém, em casos naturais reavaliados, constatou-se que os astrócitos participam na patogenia apresentando astrogliose e astrocitose nas áreas lesionadas e ao redor de vasos sangüíneos (barreira hemato-encefálica). Portanto, conclui-se que os astrócitos participam na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus e que, a etiologia da doença não é atribuída somente à deficiência de vitamina E na dieta.<br>The astrocytes are nervous cells which participate in the pathogenesis of various neuropathies of domestic animais. In poultry; the main neurologic disorder is Nutricional Encephalomalacia, caused by vitamin E deficiency. With the aim to study the behavior of astrocytes in the Nutricional Encephalomalacia pathogenesis in Gallus gallus domesticus, by immunohistochemistry, a trial of induction of the disorder was realized. Low vitamin E and oxidized oi! rations were prepared. There was no success in the experimental induction of Nutricional Encephalomalacia, however, in re-evaluated naturally occurring cases, it could be observed that astrocytes undergo astrogliosis and astocytosis in the lesioned area and around blood vessels (hemato-encephalic barrier). Altogether, it may be concluded that astrocytes participate in the pathogenesis of the poultry's Nutricional Encephalomalacia, and that the disorder is not only caused by diets with the lack of vitamin E.

Cada cop més evidencies suggereixen que els astròcits participen en les altes funcions cerebrals, controlant des de la transmissió sinàptica fins a les ones cerebrals globals i els processos d’aprenentatge i memòria. Diferents mecanismes han sigut proposats com a responsables d’aquests processos mediats per astròcits, entre ells, l’alliberació de gliotransmissors a partir de les senyals de calci així com la de lactat semblen els principals efectors. L’existència d’aquest control de les funcions cerebrals per part dels astròcits suggereix que aquestes cèl·lules poden regular les funcions cerebrals en resposta a experiència tan com les neurones, constituint el fenomen de plasticitat astrocitària. En neurones s’ha demostrat que el conegut factor de transcripció CREB, coordina les plasticitats sinàptica i intrínseca. El fet que, en astròcits, l’activació de CREB també està regulada per activitat cerebral, situa aquest factor de transcripció com a la diana ideal per promoure canvis dependents d’activitat en astròcits. En aquesta tesi hem analitzat l’efecte de l’activació de la transcripció depenent de CREB en astròcits, centrant-nos en l’excitabilitat del calci i en el metabolisme d’aquestes cèl·lules. Hem demostrat que l’activació de la transcripció depenent de CREB redueix les senyals citosòliques de calci a través del mitocondri a la vegada que augmenta l’alliberació de lactat, dos canvis que poden tenir impacte en la transmissió sinàptica. Una altra contribució important d’aquest estudi es l’anàlisi molecular dels mitocondris dels astròcits, que ha revelat que aquestes cèl·lules poden utilitzar metabòlits que no són glucosa, com ara àcids grassos, per respondre a les necessitats metabòliques energètiques. Els nostres resultats estableixen el CREB en astròcits con un eix de la plasticitat astrocitària i revelen la interacció entre la plasticitat i el metabolisme energètic en astròcits. Aquests descobriments constitueixen un avenç mecanístic i conceptual en el coneixement de la biologia dels astròcits i com aquestes cèl·lules poden controlar l’aprenentatge i la memòria.<br>An increasing body of evidence suggests that astrocytes participate in higher-brain functions, controlling from synaptic transmission to global brain waves and learning and memory processes. Different mechanisms have been proposed to mediate these astrocyte-dependent processes, astrocytic lactate release and calcium-dependent gliotransmission being the main known effectors. The existence of control of brain functions by astrocytes suggests that astrocytes may shape brain functions in response to experience as much as neurons, thus constituting the phenomenon of astrocyte plasticity. In neurons, the transcription factor CREB is the best known coordinator of synaptic and intrinsic plasticity. The fact that, in astrocytes, CREB activation is also activity-dependent, positions CREB as an ideal target to promote plasticity-related changes in astrocytes, too. In this thesis, we have analyzed the effect of the activation of CREB-dependent transcription in astrocytes, specifically regarding calcium signals and metabolism. We have demonstrated that activation of CREB-dependent transcription reduces cytosolic calcium events via mitochondria and increases in lactate release, which may have impact on synaptic transmission. An important contribution of the study is the molecular analysis of astrocytic mitochondria, which has revealed that astrocytes may use fuels other than glucose such as fatty acids to meet basic energy metabolic demands. Taken together, our results establish astrocytic CREB as a hub in astrocyte-plasticity and shed light on the interplay between plasticity and energy metabolism in astrocytes; these findings constitute a conceptual and mechanistic advance in the knowledge of astrocytic biology and how these cells may control learning and memory.

Para avaliar a encefalopatia em gatos infectados experimentalmente pelo vírus da imunodeficiência dos felinos, foram obtidas amostras de encéfalo após necropsia de nove gatos previamente inoculados pelo subtipo B do vírus e monitorados por quatro anos. As amostras foram fixadas em formalina 10% para coloração em Hematoxilina-eosina, e em metacarn para avaliação análise imunohistoquímica. Através da técnica de imunohistoquímica, as lâminas de encéfalo foram incubadas com anticorpos específicos para os antígenos Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e Vimentina para marcação de astrócitos e com anticorpos para a proteína p24 do capsídeo viral do FIV. Nas lâminas marcadas para GFAP foram observados astrócitos em substância branca e cinzenta em quantidade moderada, sugerindo astrocitose reativa. Houve marcação mais evidente da região subpial e em alguns animais das regiões perivasculares. A marcação para vimentina mostrou raras células distribuídas pelo neurópilo e forte marcação de astrócitos na região subependimária nos ventrículos laterais e IV ventrículo, o que pode indicar um aumento da proliferação e migração de células tronco. Também foram observadas alterações como: nódulos gliais, vacuolização da substância branca, satelitose e focos de calcificação de meninge. A satelitose indica a presença de processo degenerativo em desenvolvimento. A marcação para a proteína p24 confirmou a presença de células microgliais infectadas. Raros astrócitos com marcação citoplasmática foram vistos em apenas um animal. Curiosamente, houve marcação dos neurônios da camada granulosa do cerebelo. Esta técnica deve ser mais bem explorada para o uso em diagnóstico post mortem. Esses resultados sugerem que os animais infectados experimentalmente pelo FIV subtipo B apresentam alterações microscópicas mesmo na ausência de sinais clínicos neurológicos.<br>To evaluate the encephalopathy in cats experimentally infected with feline immunodeficiency vírus, were obtained brain samples from autopsies of nine cats previously inoculated with subtype B virus and monitored for four years. The samples were fixed in 10% formalin for hematoxylin-eosin staining, and in metacarn for immunohistochemical analysis. Throuh the immunohistochemistry technique, the brain slides were incubated with antibodies against the glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin to mark astrocytes and against the viral capsid protein p24 of FIV. On the GFAP marked slides, astrocytes were observed in gray and white matter in moderate amounts, suggesting reactive astrocytosis. There was evident reactivity in the subpial area and in some animals, around blood vessels. The markup for vimentin showed rare cells distributed throughout the neuropil, and strong labeling of astrocytes in the subependymal region of the lateral ventricules and fourth ventricule, which may indicate an increased rate of proliferation and migration of stem cells. The histopathological changes observed were: glial nodules, white matter vacuolization, sattelitosis and foci of meningial calcification. The sattelitosis indicates the presence of degenerative process in developing. The use of antibodies against the protein p24 confirmend the presence of infected microglia in the brain of infected animals. Rare astrocytes with cytoplasmic staining were seen in only one animal. Interestling, there was labeling of neurons in the granular layer of the cerebellum. This technique should be further exploited for use in post-mortem diagnosis. These results suggest that animals experimentally infected with FIV subtype B show microscopic changes in the absence of clinical neurologic signs.

La adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (X-ALD, de sus siglas en inglés) es una enfermedad rara causada por mutaciones en el transportador peroxisomal ABCD1, presentando dos formas de manifestación clínica de neurodegeneración: demielinización aguda y letal en el cerebro de niños con la forma cerebral de X-ALD (CCALD), y degeneración crónica de los tractos de la médula espinal y neuropatía periférica en adultos con adrenomielopatía (AMN). Las alteraciones psiquiátricas son un signo temprano de CCALD y coexisten con la neurodegeneración periférica de la médula espinal en AMN, poniendo de manifiesto la patología cerebral. Teniendo en cuenta que la X-ALD es una condición genética quisimos determinar si las alteraciones psiquiátricas observadas pueden ser debidas, al menos en parte, a la formación aberrante de circuitos cerebrales durante el desarrollo y no a la neurodegeneración. Con este objetivo, usamos una aproximación de arriba hacia abajo, partiendo de datos de transcriptomas de pacientes, donde hemos buscado vías de neurodesarrollo desreguladas, hasta modelos murinos de X-ALD in vitro basados en el silenciamiento de los genes Abcd1 y Abcd2 para diseccionar la compartimentalización entre neuronas y astrocitos. Se presentan cuatro resultados principales. Primero, existen vías de neurodesarrollo desreguladas en CCALD, AMN y en los cultivos neuronales deficientes en ABCD, asociado con alteración en los procesos de neuritogénesis, espinogénesis, y axonogénesis. Segundo, un crecimiento aberrante de las espinas sinápticas es en parte debido a alteraciones en la vía canoníca de señalización Wnt puesto que la espinogénesis se recupera parcialmente mediante la activación de la vía de señalización Wnt tras la inhibición farmacológica de GSK-3. Tercero, la síntesis de colesterol y la localización del mismo se encuentran cambiadas en los astrocitos deficientes en ABCD. Cuarto, el silenciamiento de los transportadores ABCD causa alteraciones metabólicas en astrocitos incluyendo disminución de la oxidación de ácidos grasos, incremento del ratio NAD+/NADH, depleción de ATP, y disminución de la cantidad total de glutatión sugiriendo el deterioro conjunto de la defensa antioxidante y la bioenergética. Quinto, los astrocitos X-ALD presentan una señalización de calcio mediada por agonistas alterada y estrés del retículo endoplamático. Concluimos que i) la X-ALD presenta un componente de neurodesarrollo que puede explicar los síntomas psiquiátricos, y quizá contribuir a la progresión de la forma CCALD, y a la conversión de la AMN en una forma cerebral de la enfermedad, y ii) la deregulacion metabólica y de la excitabilidad en astrocitos apoya la disfunción global de los astrocitos que puede poner en peligro el papel computacional y homeostático de los astrocitos en los circuitos cerebrales.<br>X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare disease caused by mutations in the peroxisomal ABCD1 transporter, with two major clinical manifestations of neurodegeneration: acute and lethal brain demyelination in the child cerebral X-ALD (CCALD), and chronic degeneration of spinal-cord tracts and peripheral neuropathy in the adult adrenomyeloneuropathy (AMN). Psychiatric alterations are an early sign of CCALD and coexist with spinal-cord and peripheral neurodegeneration in AMN, revealing concomitant brain pathology. Since X-ALD is a genetic condition, we sought to determine whether psychiatric alterations could be due, at least in part, to abnormal formation of brain circuits during brain development and not to neurodegeneration. To this end, we used a top-down approach, moving from patient transcriptome data, where we searched for dysregulated neurodevelopmental pathways, to in vitro murine models of X-ALD based on Abcd1/Abcd2 silencing to dissect out astrocyte versus neurons compartmentalization. There are four major findings. First, developmental pathways are dysregulated in CCALD, CAMN and in ABCD-null neuronal cultures, associated with altered neuritogenesis, spinogenesis, and axonogenesis. Second, aberrant spine growth is in part due to alterations in canonical Wnt signalling alteration since the spinogenesis is partially rescued by activation of WNT pathways by pharmacological GSK-3 inhibition. Third, cholesterol synthesis and localization is changed in ABCD-null astrocytes. Four, silencing of ABCD transporters causes metabolic alterations in astrocytes including fatty acid oxidation impairment, increase of the ratio NAD+/NADH, ATP depletion, decreases in total glutathione, suggesting joint impairment of antioxidant defense and bioenergetics. Fifth, X-ALD astrocytes present altered agonist-induced calcium signaling and ER stress. We conclude that i) X-ALD has a neurodevelopmental component that may account for psychiatric symptoms, and perhaps contribute to the progression of CCALD, and to the conversion of AMN into a cerebral condition, and ii) metabolic and excitability dysregulation in astrocytes support global astrocytic dysfunction that may jeopardize computational and homeostatic role of astrocytes in neural circuits.

Orientador: Maria Alice da Cruz Höfling<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-23T19:45:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stavale_LeilaMiguel_M.pdf: 25008584 bytes, checksum: 8754f8fc3865217986eb0137679176e9 (MD5) Previous issue date: 2013<br>Resumo: O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), também conhecida como aranha armadeira, é uma mistura complexa de peptídeos com ação neurotóxica em alguns canais iônicos. No sistema nervoso central (SNC) alguns peptídeos do PNV causam permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) e interferem na liberação de neurotransmissores. A BHE, embora essencial para a manutenção da homeostase do SNC, pode representar uma barreira muito restritiva para o acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. O entendimento dos mecanismos associados à disfunção da BHE é relevante do ponto de vista científico e médico. O objetivo do estudo foi investigar alguns mecanismos envolvidos na neurotoxicidade do veneno da Phoneutria nigriventer em ratos Wistar (Rattus norvegicus). Para esse fim, o efeito vasogênico causado pela neurotoxicidade do veneno no cérebro, foi examinado através da avaliação da expressão de aquaporina 4 (AQP4), uma proteína formadora dos canais de água e abundantemente localizada nos pés astrocitários perivasculares e relacionada com o aparecimento de edema no cérebro. A análise da expressão da proteína foi feita por imunohistoquímica e western blotting e a expressão de RNAm por PCR em tempo real no cerebelo e hipocampo de animais neonatos (14 dias) e adultos (8 semanas). Os resultados obtidos mostraram aumento da expressão de AQP4 e seu RNAm nos animais envenenados, que entretanto foi variável em função do tempo de envenenamento (2, 5 ou 24 h), da região do cerebelo ou hipocampo examinada e da idade dos animais. Os resultados mostraram também intensa marcação anti-AQP4 ao redor de vasos com edema perivascular ou não, como também entre os corpos neuronais e seus prolongamentos. Concluímos que a AQP4 tem papel nas alterações de volume dos astrócitos perivasculares e na formação e resolução do edema ao redor da BHE causado pelo PNV. A dinâmica da expressão da AQP4 no cerebelo e hipocampo em função do tempo, região e idade dos animais sugere a existência de fatores intrínsicos que modulam diferencialmente a funcionalidade da BHE em função do microambiente local. A compreensão dos mecanismos envolvidos no envenenamento por PNV pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para a intervenção clínica, bem como pode ser relevante para o entendimento dos mecanismos relacionados ao funcionamento da BHE e de proteínas envolvidas na formação de canais de água, como a AQP4<br>Abstract: The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), also known as armed-spider, is a complex mixture of ion channels-acting peptides which exhibit neurotoxic action. In the central nervous system (CNS), PNV-containing peptides cause permeabilization of the blood-brain barrier (BBB) and interfere with neurotransmitter release. The BBB, although essential for the maintenance of homeostasis of the CNS, may represent a very restrictive barrier for the access of therapeutic drugs into the neural microenvironment. The understanding of BBB impairment-associated mechanisms are of scientific and medical importance. The aim of this study was to investigate some of the mechanisms involved in the neurotoxicity caused by Phoneutria nigriventer venom in Wistar rats (Rattus norvegicus). To this end, the vasogenic effect caused by the venom neurotoxicity in the brain was examined by evaluating the expression of aquaporin 4 (AQP4), a water channel forming protein abundantly expressed in perivascular astrocytic endfeet processes and associated to the formation and resolution of edema in the brain. The analysis of AQP4 expression was assessed in the cerebellum and hippocampus of neonate (14 day-old) and adult rats (8 week-old) through immunohistochemistry and western blotting, and the expression of mRNA by Real Time-PCR. The results showed increases of AQP4 expression and its mRNA in the envenomed animals, which though showed time- (2, 5 or 24h), regional- (regions of the cerebellum and hippocampus examined) and age-associated differences. Marked anti-AQP4 labeling was found around vessels with or without edema and among the neuron bodies and their processes. We conclude that AQP4 has a role in the volume alterations of the perivascular astrocytes and in the formation and resolution of edema around the BBB induced by PNV. The variability of the dynamics of AQP4 expression in the cerebellum and hippocampus in function of the time, region and animals age suggests the existence of intrinsic factors that modulate the BBB functionality depending on the molecular biology dynamics of the local microenvironment. The understanding of the mechanisms involved in the envenomation by PNV can contribute to the development of useful tools for clinical intervention, and may be relevant for understanding the mechanisms related to the functioning of the BBB and proteins involved in the formation of water channels, such as AQP4<br>Mestrado<br>Histologia<br>Mestra em Biologia Celular e Estrutural

El estudio de los astrocitos se ha vuelto muy relevante en el ámbito de las neurociencias desde el descubrimiento, a principios de los años 90, de que aquellas “células de soporte” podían responder a la actividad sináptica. Actualmente, está aceptado que los astrocitos poseen la capacidad de modular la transmisión sináptica a través de la liberación de moléculas que actúan tanto en el terminal pre-sináptico como en el post-sináptico, los llamados gliotransmisores. Sin embargo, todavía quedan muchas cuestiones por resolver sobre el papel que juega esta población de células gliales en la fisiología cerebral. En el presente trabajo, hemos estudiado un campo ampliamente explorado en neuronas pero poco conocido en astrocitos: la transcripción dependiente de CREB. Este factor de transcripción expresado en todos los tipos celulares integra respuestas de todo tipo de estímulos y, por tanto, regula numerosos procesos tanto fisiológicos como patológicos. En neuronas, CREB es un factor clave en los mecanismos de plasticidad sináptica, que son la base para la adquisición de nuevas memorias, y también participa en los procesos neuroprotectores desencadenados por numerosas patologías cerebrales. Dado que los astrocitos participan tanto en procesos de regulación de la actividad sináptica como en neuroprotección, nuestro estudio pretende determinar en qué medida estas funciones están reguladas por CREB. Para ello hemos caracterizado, en cultivos primarios de astrocitos, los mecanismos moleculares de la activación de CREB tras la estimulación con los transmisores ATP y NE, y hemos estudiado los programas genéticos inducidos por la activación de CREB a través de diferentes vías de señalización. Finalmente, hemos determinado el papel protector del CREB astrocitario en un modelo murino de daño cerebral agudo. Los principales hallazgos de esta tesis son: (i) una nueva vía de señalización que activa CREB en astrocitos, (ii) la asociación de los programas transcripcionales de CREB con el metabolismo oxidativo, la homeostasis y la comunicación celular, (iii) el papel neuroprotector del CREB astrocitario en un modelo de daño cerebral a través de un incremento de la supervivencia neuronal y regeneración axonal, un descenso de la inflamación y un rescate energético a través de la estimulación de vías metabólicas mitocondriales.<br>The study of astrocytes has become highly relevant in the realm of neurosciences since the discovery in the early 90’s that those “supportive cells” can respond to synaptic activity. Nowadays, it is accepted that astrocytes have the ability to modulate synaptic transmission through the release of molecules that act at both pre-synaptic and post-synaptic sites, the so-called gliotransmitters. However, there are still many questions to be solved about the role of this glial cell population in brain physiology. In the present work, we studied a field that has been largely explored in neurons, but that is poorly known in astrocytes: the CREB-dependent transcription. This widely-expressed transcription factor integrates the cellular responses of multiple stimuli, thus regulating numerous physiological and pathological functions. In neurons, CREB is a key player in the mechanisms that underlie synaptic plasticity, which is the molecular basis of memory acquisition, and it is involved in neuroprotective processes triggered by several brain disorders. Given the fact that astrocytes also play a role in synaptic activity and neuroprotection, we ought to know whether those functions are regulated by astrocytic CREB. Thus, we studied the molecular mechanisms of CREB activation in cell cultures upon stimulation with the transmitters ATP and NE and characterized the transcriptional programs triggered by CREB activation through different signalling pathways. Finally, we determine the protective roles of astrocytic CREB in a mouse model of traumatic brain injury. The main findings of this thesis are: (i) a novel signalling pathway for CREB activation in astrocytes, (ii) the functional association of CREB-dependent transcriptional programs with oxidative metabolism, homeostasis and intercellular communication, and (iii) the neuroprotective roles of astrocytic CREB in a model of traumatic brain injury, through an increase in neuronal survival and axonal regeneration, a decrease in inflammation and a rescue of bioenergetic failure by increasing the mitochondrial metabolic pathways.

Gli studi degli ultimi quarant’anni hanno evidenziato che gli astrociti, cellule non neuronali del Sistema Nervoso Centrale, pur essendo definite cellule non eccitabili, sono attivamente coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi cerebrale e nel controllo della trasmissione sinaptica. I meccanismi alla base della funzionalità degli astrociti, ed in particolare i segnali mediati da variazioni della concentrazione di calcio intracellulare stanno emergendo come potenziale bersaglio per lo sviluppo di applicazioni tecnologiche in neuroscienze. Fra i materiali a base di carbonio, il grafene ed i suoi derivati hanno suscitato un notevole interesse nel campo biomedico, in virtù delle proprietà meccaniche, elettriche e di biocompatibilità. Il presente lavoro riporta lo studio dell'interazione di materiali a base di ossido di grafene con cellule astrogliali e si propone di indagare l'effetto della stimolazione elettrica operata mediante differenti dispositivi ITO-GO (ossido di indio stagno-ossido di grafene) sui segnali di [Ca2+]i in astrociti primari neocorticali di ratto. I risultati dimostrano che i substrati a base di GO e la loro funzionalizzazione con molecole alifatiche promuovono l’adesione astrogliale. Inoltre, la stimolazione elettrica extracellulare induce differenti risposte di [Ca2+]i in astrociti a seconda del dispositivo utilizzato: i)risposte oscillatorie rapide, tipiche dell’aumento di [Ca2+]i mediato dal rilascio di calcio dagli stores citoplasmatici erano osservate in astrociti su ITO e ITO-rGO. ii)Le cellule su dispositivi ITO-GO mostravano risposte a lento incremento di [Ca2+]i, caratteristiche dell’influsso di calcio extracellulare, la cui dinamica sembra dipendere dallo spessore del GO. La possibilità qui presentata di modulare selettivamente i [Ca2+]i astrogliali, utilizzando diversi dispositivi ITO-GO, pone le basi per un potenziale sviluppo di dispositivi biomedici rivolte agli astrociti e dirette alla diagnosi e terapia di disfunzioni cerebrali.

Gli astrociti, cellule non eccitabili del cervello, dapprima considerate solo cellule di supporto all’attività neuronale, hanno un ruolo centrale nella fisiologia cerebrale mantenendo l’omeostasi di ioni, acqua e neurotrasmettitori, e modulando anche l’attività neuronale, attraverso il rilascio di neurotrasmettitori. La disfunzione degli astrociti può concorrere alla patogenesi di neuropatologie acute e croniche come Ischemia o Malattia di Alzheimer. Gli astrociti svolgono li loro funzioni tramite canali ionici, trasportatori e canali per l’acqua e comunicando attraverso segnali di calcio intracellulare. Considerata l’importanza emersa degli astrociti, è fondamentale provvedere alla scoperta dei meccanismi molecolari e funzionali alla base della loro attività. Tuttavia, le metodologie allo stato dell’arte per lo studio della fisiologia astro gliale, sono state sviluppate principalmente per studiare i neuroni. Questo dato potrebbe aver limitato la capacità di comprensione dei suddetti fenomeni. In questo contesto, lo studio di cellule in vitro potrebbe avere grande rilevanza nell’avanzamento della conoscenza dei principi biofisici e molecolari che regolano l’attività degli astrociti. Tuttavia, le proprietà morfologiche e funzionali delle cellule astrogliali in vitro, sono molto diverse da quelle osservate in vivo. In quest’ottica, questo lavoro di tesi è stato focalizzato sullo studio di materiali nanostrutturati e dispositivi bioelettronici, che consentissero di differenziare gli astrociti in vitro e/o di generare strumenti innovativi per lo studio e la modulazione della funzione astrogliale. Studi di biocompatibilità tramite i test di vitalità cellulare, immunofluorescenza e Western Blot, degli astrociti su interfacce nanostrutturate, costituite da idrotalciti, nanofili di silicio e ossido di grafene o da loro derivati, sono stati ricavati dati di notevole importanza per sviluppare dispositivi utili allo studio e alla modulazione della fisiologia astrogliale.

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling<br>Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-14T00:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_CatarinaRaposoDias_D.pdf: 35688895 bytes, checksum: dc0574f3ff57450c0d5ff8840699f5e9 (MD5) Previous issue date: 2009<br>Resumo: Venenos animais são fontes de substâncias neuroativas, algumas capazes de provocar paralisia e convulsão em mamíferos, com visível ação no sistema nervoso central (SNC). O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) é composto por neurotoxinas que causam, experimentalmente, permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE). A BHE é uma entidade tanto física, quanto molecular, composta pelos microvasos sanguíneos cerebrais, pelos pés astrocitários e pericitos adjacentes engajados no controle do tráfego de moléculas na interface sangue-cérebro. A BHE, embora imprescindível à manutenção da homeostase no SNC, pode representar um obstáculo ao acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. Nossa proposta foi investigar a ação sistêmica do PNV após 15 min, 2 e 5 h da injeção i.v. em ratos Wistar adultos através de: (1) alterações na expressão das proteínas juncionais, de efluxo e transportador de glicose da BHE; (2) alterações na expressão da proteína conexina-43 (constituinte das junções comunicantes) e da proteína fosfatase pPP2A, uma vez que a fosforilação de resíduos de tirosina das proteínas juncionais tem papel no controle da integridade paracelular; (3) ativação de vias neuronais e sua modulação pelo óxido nítrico (NO). (4) Reação inflamatória e gliose reativa de astrócitos in vivo e in vitro e sua possível modulação pelo NO, (5) Purificação e identificação de toxinas do PNV com ação na BHE. A expressão das proteínas juncionais encontrava-se diminuída aos 15 min e 2 h, porém às 5 h pós-PNV a expressão das proteínas investigadas estava total ou parcialmente recuperada, sugerindo ser esse um dos mecanismos de abertura da BHE. Igualmente, a expressão da proteína de efluxo aumentou indicando mecanismo de clearance do agente tóxico. A expressão da conexina-43, e da pPP2A estavam aumentadas aos 15 min e diminuída às 5 h da injeção do PNV, mostrando não só que as comunicações célula-célula e o mecanismo de adesão célulacélula foram afetados, mas também que as alterações podem ser transitórias. Ademais, vias neuronais foram ativadas em áreas motoras e em núcleos do hipotálamo o que explicaria o comprometimento motor (convulsão, paralisia) e os sinais neurovegetativos (sialorréia, hipertensão, estresse respiratório, edema pulmonar, anúria) vistos em animais envenenados. Muitas dessas vias apontam modulação nitrérgica dos sinais tóxicos do envenenamento, uma vez que a inibição da síntese de NO pelo 7- nitroindazol (7-NI) diminuiu a ativação neuronal em algumas áreas e exacerbou em outras. Os astrócitos incubados com PNV, corroborando com estudos in vivo, expressaram citocinas pró-inflamatórias e apresentaram gliose reativa, porém a inibição da síntese do NO atenuou esses efeitos, confirmando que o NO tem um importante papel nos efeitos do PNV. Toxinas F8a-1 e F10a-1, purificadas do PNV, foram identificadas como responsáveis pela permeabilização da BHE, embora não esteja excluída a contribuição de outros componentes. O entendimento da ação do PNV e de suas toxinas no tecido neural e na BHE pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para uso clínico e em pesquisa.<br>Abstract: Animal venoms are source of neuroactive substances, some of them able to provoke paralysis and convulsion in mammals, indicating action on the central nervous system (CNS). The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV) is composed of neurotoxins that cause, experimentally, blood-brain barrier (BBB) permeabilization. The BBB is both a physical and molecular entity, constituted by the cerebral microvessels and surrounding astrocytic end-feet and pericytes, all involved in the control of the traffic of molecules at the blood-brain interface. Even so the BBB presence is essential for the maintenance of CNS homeostasis; it also represents an obstacle for the therapeutical drugs access into the neural microenvironment. Our proposal was to investigate acute changes (15 min, 2 and 5 h) after PNV i.v. injection in adult Wistar rats through evaluation of the: (1) alterations in the expression of the BBB-junctional proteins, -efflux proteins, and -glucose transporter; (2) alterations in the expression of connexin-43 protein (gap junctions constituent) and protein phosphatase 2A (pPP2A, since phosphorylation of tyrosine residues from junctional proteins plays a role in controlling junctional integrity); (3) activation of neuronal pathways and its modulation by the nitric oxide (NO). (4) In vivo and in vitro astrocytes inflammatory reaction and reactive gliosis after incubation with PNV and its possible modulation by NO. (5) Purification and determination of BBB-acting from toxins PNV. The expression of the junctional proteins was diminished at 15 min and 2 h post-PNV exposure; however at 5 h the expression of most of the proteins investigated was total or partially recovered, suggesting that this might be one of the BBB opening mechanisms. Similarly, the venom increased the efflux protein expression, indicating ongoing clearance of toxic agents from the neural tissue. The expression of both connexin-43 and pPP2A increased after 15 min and diminished after 5 h of PNV injection, showing not only that cell-cell communication and cell-cell adhesion mechanism were affected, but that these alterations were transitory. Activated neuronal pathways have been observed in brain motor areas and hypothalamic nucleus, explaining the motor impairment (convulsion, paralysis) and neurovegetative signs (salivation, hypertension, respiratory stress, pulmonary edema, anuria) observed in the envenomed animals. Many of these neuronal pathways point to a nitrergic modulation of the envenomed toxic signs, since that NO synthesis inhibition by 7-nitroindazol (7-NI) decreased the neuronal activation in some areas and enhanced in others. The astrocytes incubated with PNV, in agreement with in vivo studies, expressed pro-inflammatory cytokines and presented reactive gliosis, however the pretreatment with 7- NI attenuated these effects, confirming that NO have an important role in the PNV effects. The F8a-1 and F10a-1 toxins, fractionated from the crude PNV, were identified as responsible by BBB permeabilization; despite, other venom components contribution can not be discarded. The understanding of the action of the venom of Phoneutria nigriventer and its toxins in the neural tissue and BBB can contribute for the development of useful tools for clinical and research purposes.<br>Doutorado<br>Biologia Celular<br>Doutor em Biologia Celular e Estrutural

En els últims anys, diversos treballs han demostrat que els astròcits participen activament en el desenvolupament i la plasticitat del sistema nerviós central, així com en la modulació de la neurotransmissió. Característicament, la majoria de les accions descrites dels astròcits sobre la fisiologia i la patologia neuronal són mitjançades per secreció vesicular. En el aquest treball s’han identificat les molècules implicades en l’exocitosi de cèl•lules astroglials. Malgrat que alguns components són comuns amb les neurones, altres com sintaxina 4, VAMP3 i SNAP23 s’expressen de forma específica en les cèl•lules astroglials. Tractaments activadors o de maduració diferencialment regulen l’expressió de diferents isoformes de proteïnes exocítiques en cèl•lules glials in vitro. Així, l’activació amb citocines proinflamatòries augmenta l’expressió d’algunes SNAREs i els seus reguladors en glia, com sintaxina4 i munc18b. La correlació entre els nivells d’expressió d’aquestes proteïnes exocítiques i l’augment de la secreció de mediadors d’activació i inflamació suggereix un important paper d’aquestes molècules en la secreció de cèl•lules activades. Amb l’objectiu d’estudiar la secreció regulada per calci en astròcits madurs s’ha obtingut un fenotip madur glial in vitro mitjançant l’activació de la via del AMPc. L’anàlisi global amb "gene set enrichment analysis" del transcriptoma astrocitari ha demostrat que l’increment en els nivells intracel•lulars d’AMPc reprimeix la immaduresa i activació dels astròcits i promou la seva maduració. Aquesta maduració dependent de la via del AMPc augmenta l’expressió de proteïnes exocítiques, com per exemple VAMP2, així com la via de secreció regulada per calci dels pèptids ANP i SgII. Finalment, mitjançant assajos de pèrdua de funció, es demostra un paper d’aquestes proteïnes en la secreció de pèptids glials. Aquests resultats suggereixen que diferents molècules d’exocitosi mitjancen diferents processos de secreció glials. Per altra banda, en aquesta tesi s’ha identificat un nou component de la via de secreció astroglial, tant in vitro com in vivo, la SgIII. En cèl•lules neuroendocrines SgIII actua com un receptor de direccionament a grànuls secretors. En cèl•lules astroglials SgIII presenta una forma molecular i una dinàmica de secreció diferencial a cèl•lules neuroendocrines. A més, hem demostrat una notable sobreexpressió d’aquesta proteïna en astròcits reactius en lesions traumàtiques, la qual cosa suggereix una participació de SgIII en els mecanismes de protecció o dany cerebral en lesions del sistema nerviós central.<br>In recent years, several studies have demonstrated that astrocytes influences neuronal development, function and plasticity through vesicular transmitter release. However, secretory pathways and the involved molecular mechanisms in astroglial cells are poorly known. In this study, we showed that a variety of SNARE and Munc18 isoforms were expressed by cultured astrocytes, with syntaxin-4, Munc18c, SNAP-23 and VAMP-3 being the most abundant variants. Exocytotic protein expression was differentially regulated by activating and differentiating agents. Specifically, proteins controlling Ca2+-dependent secretion in neuroendocrine cells were up-regulated after long-term 8Br-cAMP administration in astrocytes, but not by proinflammatory cytokines. We also analyzed the global transcriptome of cultured astroglial cells incubated with activators of cAMP pathways. cAMP analogs strongly upregulated genes involved in typical functions of mature astrocytes, whereas they downregulated a considerable number of proliferating and immaturity-related transcripts. Gene Set Enrichment Analysis and evaluation in situ of gene expression in astrocytes in different states showed that cAMP signaling conferred a mature and in vivo–like transcriptional profile to cultured astrocytes. Moreover, 8Br-cAMP treatment greatly increased the cellular content of exocytotic proteins such as VAMP-2 and stimulated Ca2+-dependent secretion of secretogranin-2 and ANP. Regulation of both exocytotic protein expression and Ca2+-dependent peptide secretion in astrocytes by differentiating and activating agents suggested that glial secretory pathways were adjusted in different physiological states. In this thesis, we showed the expression, transcriptional regulation, trafficking and release of the secretory pathway component SgIII in astroglial cells. In endocrine cells, SgIII is a key sorting receptor for peptide hormones while astrocytes produced and released a non-processed form. Moreover, SgIII expression was specifically upregulated in reactive astrocytes after perforating brain injury. These results showed that SgIII is a reliable component of the astrocyte secretory pathway and suggest important roles for glial SgIII in the glia–neuron communication.

La funció transcripcional de la proteïna d’unió als elements de resposta a l’AMP cíclic (CREB) és modulada per la família dels coactivadors transcripcionals regulats per CREB (CRTCs). Totes les isoformes de CRTC (CRTC1, CRTC2 i CRTC3) són presents al cervell, tot i que la seva expressió, regulació i funció específica en els diferents tipus cel·lulars del cervell encara són desconegudes. En aquesta tesi doctoral he investigat el patró d’expressió, els mecanismes de regulació i la funció transcripcional de les isoformes CRTC1 i CRTC2 en neurones i astròcits del còrtex cerebral de ratolí. Analitzant el cervell adult del model de ratolí Crtc2-LacZ reporter, demostro que CRTC2 s’expressa tant en neurones com en cèl·lules glials, incloent la micròglia i els astròcits. L’expressió de CRTC1 és elevada en neurones, mentre que CRTC2 es troba abundantment en astròcits. Els estudis realitzats amb tractaments farmacològics també indiquen una regulació diferencial de CRTC1 i CRTC2 en cultius neuronals i astrocitàris. En neurones, l’activitat sinàptica indueix la desfosforilació i activació de CRTC1 mitjançant la proteïna fosfatasa (PP) 2B/calcineurina, mentre que la desfosforilació de CRTC2 ve regulada per la PP1. En astròcits, la desfosforilació de CRTC1 també és modulada per la PP2B/calcineurina, però la desfosforilació de CRTC2 és independent de la PP2B/calcineurina, la PP1 i la PP2A. Després d’un increment en l’activitat neuronal, CRTC1 és desfosforilat i translocat a nucli, on interacciona amb CREB promovent la transcripció gènica. D’altra banda, encara que l’activitat neuronal també afavoreixi la translocació de CRTC2 a nucli, aquest no afecta la transcripció gènica dependent de CREB en neurones corticals. De fet, en ratolins knockout condicionals per Crtc2 (Crtc2 cKO), la deleció específica de CRTC2 en neurones no comporta alteracions fenotípiques. Contràriament, en astròcits, CRTC2 transloca a nucli on s’uneix específicament a la regió promotora de gens dependents de CREB per potenciar la transcripció gènica induïda per activitat. En conjunt, aquests resultats indiquen que les isoformes de CRTC presenten una expressió, uns mecanismes de regulació i una funció transcripcional diferencial en neurones i astròcits del còrtex cerebral.<br>La función transcripcional de la proteína de unión a los elementos de respuesta a AMP cíclico (CREB) es modulada por la familia de coactivadores transcripcionales regulados por CREB (CRTCs). Todas las isoformas de CRTC (CRTC1, CRTC2 y CRTC3), están presentes en cerebro, aunque su expresión, regulación y función específica en los diferentes tipos celulares del cerebro son aún desconocidas. En esta tesis doctoral he investigado el patrón de expresión, los mecanismos de regulación y la función transcripcional de las isoformas CRTC1 y CRTC2 en neuronas y astrocitos del córtex cerebral de ratón. Analizando el cerebro adulto del modelo de ratón Crtc2-LacZ reportero, demuestro que CRTC2 se expresa tanto en neuronas como en células gliales, incluyendo la microglía y los astrocitos. La expresión de CRTC1 es elevada en neuronas, mientras que CRTC2 se encuentra abundantemente en astrocitos. Los estudios realizados con tratamientos farmacológicos también indican una regulación diferencial de CRTC1 y CRTC2 en cultivos neuronal y astrocitarios. En neuronas, la actividad sináptica induce la desfosforilación y activación de CRTC1 mediante la proteína fosfatasa (PP) 2B/calcineurina, mientras que la desfosforilación de CRTC2 viene regulada por la PP1. En astrocitos, la desfosforilación de CRTC1 también es modulada por la PP2B/calcineurina, aunque la desfosforilación de CRTC2 es independiente de la PP2B/calcineurina, la PP1 y la PP2A. Después de un incremento en la actividad neuronal, CRTC1 es desfosforilado y translocado a núcleo, donde interacciona con CREB promoviendo la transcripción génica. Por otro lado, aunque la actividad neuronal también favorece la translocación de CRTC2 a núcleo, éste no afecta la transcripción génica dependiente de CREB en neuronas corticales. De hecho, en ratones knockout condicionales por Crtc2 (Crtc2 cKO), la deleción específica de CRTC2 en neuronas no comporta alteraciones fenotípicas. Contrariamente, en astrocitos, CRTC2 transloca a núcleo donde se une específicamente a la región promotora de genes dependientes de CREB para potenciar su transcripción génica inducida por actividad. En conjunto, estos resultados indican que las isoformas de CRTC presentan una expresión, unos mecanismos de regulación y una función transcripcional diferencial en neuronas y astrocitos de la corteza cerebral.<br>The transcriptional function of the cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-response element binding protein (CREB) is modulated by the family of CREB regulated transcription coactivators (CRTCs). CRTC isoforms (CRTC1, CRTC2 and CRTC3) are present in the brain, but their specific expression, regulation and function in the distinct cell types of the brain remain largely unclear. In this doctoral thesis, I have investigated the expression pattern, regulatory mechanisms and transcriptional function of the CRTC1 and CRTC2 isoforms in neurons and astrocytes of the mouse cerebral cortex. Using novel Crtc2-LacZ reporter mice, I show that CRTC2 is expressed in the adult mouse brain in both neurons and glial cells, including microglia and astrocytes. CRTC1 is abundant in neurons, whereas CRTC2 is highly expressed in cultured astrocytes. Pharmacological analyses reveal differential regulation of CRTC1 and CRTC2 in cultured neurons and astrocytes. In neurons, synaptic activity induces CRTC1 dephosphorylation and activation through protein phosphatase (PP) 2B/calcineurin while CRTC2 dephosphorylation is mediated by PP1. In astrocytes, CRTC1 dephosphorylation is regulated by PP2B/calcineurin, whereas CRTC2 dephosphorylation is independent of PP2B/calcineurin, PP1 and PP2A activities. In agreement, CRTC1 is dephosphorylated upon neuronal activity and translocated to the nucleus where interacts with CREB to enhance gene transcription. CRTC2 is also translocated to the nucleus after neuronal stimulation without affecting CREB-mediated transcription in cortical neurons. In fact, neuronal CRTC2 deletion does not result in global phenotypic alterations in neuron-specific Crtc2 conditional knockout (cKO) mice. By contrast, CRTC2 is translocated to nucleus and recruited to specific CREB target gene promoters to mediate activity-induced transcription in astrocytes. These results indicate differential expression, regulatory mechanisms and transcriptional roles of CRTC isoforms in neurons and astrocytes of the cerebral cortex.<br>Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

La Leucoencefalopatía Megalencefálica con Quistes Subcorticales (MLC) es un tipo raro de leucodistrofia vacuolizante, que presenta como principales características clínicas macrocefalia, deterioro de las funciones motoras, epilepsia y retraso mental medio. Sin embargo, el diagnóstico de MLC se confirma mediante imágenes de resonancia magnética, donde el encéfalo se presenta atrofiado e hinchado, muestra una sustancia blanca anormalmente difusa y hay presencia de quistes subcorticales. Desde el punto de vista fisiopatológico, una biopsia obtenida de un paciente de MLC muestra la presencia de numerosas vacuolas situadas en las láminas más externas de la mielina. Se ha encontrado un primer gen responsable de la enfermedad en el 75% de los pacientes afectados, denominado MLC1. Se han descrito alrededor de 60 mutaciones, aunque existen pacientes que manifiestan las características clínicas de la enfermedad pero no presentan mutaciones en MLC1 ni presentan ligamiento con su locus, sugiriendo que existe al menos otro gen involucrado en la enfermedad. En el 25% de pacientes restantes, la enfermedad se manifiesta de dos maneras diferentes: en un caso, los enfermos presentan las mismas características clínicas que los pacientes con mutaciones en MLC1; y en el otro, presentan síntomas transitorios y los pacientes mejoran, llegando incluso a que la enfermedad remitiera. El gen MLC1 codifica para una proteína transmembrana que lleva el mismo nombre. Su función es todavía desconocida. Aunque muestra un bajo grado de homología con el canal de potasio Kv1.1 no se ha podido detectar actividad de canal iónico en diferentes sistemas heterólogos. No obstante, dicha homología, su confinamiento en la membrana plasmática y el fenotipo característico vacuolizante de los pacientes sugieren que la proteína podría estar mediando la translocación de iones a través de la superficie celular. El total desconocimiento del rol preciso de la proteína MLC1 ha imposibilitado el entendimiento del mecanismo patofisiológico de la enfermedad, y por ello, no se ha podido desarrollar ningún tratamiento efectivo para los pacientes afectados. Es por ello que nuestro grupo quiso apostar por estrategias innovadoras (combinación de bioquímica y genética) para poder encontrar otros genes responsables de la enfermedad. Usando técnicas de purificación por afinidad combinada con métodos de proteómica cuantitativa encontramos a GlialCAM como una proteína que estaba asociada con MLC1. Es por eso que decidimos estudiar (en colaboración) si los pacientes que no tenían mutaciones en MLC1 podían presentar mutaciones en GLIALCAM. Tras el análisis de 40 de estos pacientes encontramos que cuando los enfermos tenían las características clínicas típicas de MLC presentaban dos mutaciones en GLIALCAM (herencia recesiva); mientras que en el caso de aquellos que mejoraban a lo largo del tiempo, éstos solo presentaban una mutación (herencia dominante), demostrando que GLIALCAM es el segundo gen de MLC. En este estudio también se ha podido determinar que mutaciones dominantes en GLIALCAM podían también causar otras enfermedades como la macrocefalia familiar benigna y la macrocefalia con retraso mental, con o sin autismo. Estudios bioquímicos posteriores han permitido avanzar en el entendimiento de la relación que existe entre MLC1 y GlialCAM. Así se ha demostrado que GlialCAM actúa como una molécula escolta, necesaria para localizar específicamente a MLC1 en uniones celulares. De esta forma pudimos descubrir que las mutaciones en GLIALCAM provocaban un defecto en el tráfico de la proteína debido a una deficiente oligomerización. Como consecuencia, estas mutaciones provocaban la deslocalización de los complejos de MLC1-GlialCAM en las uniones astrocitarias. De forma interesante, GlialCAM permite estabilizar la proteína MLC1, sugiriendo nuevas aproximaciones terapéuticas para los pacientes afectos con MLC. Tras el descubrimiento de GlialCAM como segundo gen de MLC gracias a la aproximación proteómica, y tras comprobar que no todo GlialCAM estaba asociado a MLC1, nos planteamos volver a realizar estudios de proteómica para intentar encontrar posibles proteínas que pudiesen estar interaccionando con GlialCAM. De esta manera encontramos que el canal de cloruro ClC-2, estaba asociado con GlialCAM, y pudimos comprobar que GlialCAM también actuaba como molécula escolta para localizar específicamente a ClC-2 en las uniones entre células. Además, también era capaz de modificar sus propiedades de canal, así como aumentar su función, demostrándose interacción directa entre ambas proteínas. Igualmente que para el caso de MLC1, las mutaciones encontradas en GLIALCAM fallaban en la capacidad de concentrar a ClC-2 en las uniones astrocitarias. Por tanto, la función de GlialCAM podría ser necesaria para agrupar tanto a MLC1 como a ClC-2 en tales uniones, particularmente en los pies terminales astrocitarios, donde podrían estar llevando a cabo su función. ClC-2 podría ser necesario para desarrollar un flujo de Cl- transcelular o para compensar gradientes electroquímicos iónicos que pueden estar ocurriendo en dichas uniones durante cambios en la osmolaridad. El descubrimiento de GlialCAM como una subunidad auxiliar de ClC-2 incrementa la compleja regulación de este canal y proporciona nuevas ideas acerca del papel que ClC-2 puede estar desempeñando en las células gliales así como se sugiere que pueda estar involucrado en la fisiopatología de MLC.<br>Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a leukodystrophy characterized by early-onset macrocephaly and delayed-onset neurological deterioration. Recessive MLC1 mutations are observed in 75% of patients with MLC. Genetic-linkage studies failed to identify another gene. We have showed that some patients without MLC1 mutations display the classical phenotype; others improve or become normal but retain macrocephaly. To find another MLC-related gene, we used quantitative proteomic analysis of affinity-purified MLC1 as an alternative approach and found that GlialCAM, an IgG-like cell adhesion molecule, is a direct MLC1-binding partner. Analysis of 40 MLC patients without MLC1 mutations revealed multiple different GLIALCAM mutations. Patients with the classical phenotype had two mutations, and patients with the improving phenotype had one mutation. In addition, patients with dominant GLIALCAM mutations, could also had macrocephaly and mental retardation with or without autism. Therefore, we found that GLIALCAM is the second gene found to be mutated in MLC. Furthermore, we demonstrated that GlialCAM functions as an MLC1 beta-subunit, needed for proper localization of MLC1 in cell-cell junctions. We also demonstrated that MLC1 and GlialCAM form homo- and hetero-complexes and that MLC-causing mutations in GLIALCAM mainly reduce the formation of GlialCAM homo-complexes, leading to a defect in the trafficking of GlialCAM alone to cell junctions. GLIALCAM mutations also affect the trafficking of its associated molecule MLC1, explaining why GLIALCAM and MLC1 mutations lead to the same disease: MLC. In this thesis, we also identify GlialCAM as a chloride channel ClC-2 binding partner. GlialCAM and ClC-2 colocalize in Bergmann glia, in astrocyteastrocyte junctions at astrocytic end-feet around blood vessels, and in myelinated fiber tracts. GlialCAM targets ClC-2 to cell junctions, increases ClC- 2 mediated currents, and changes its functional properties. Disease-causing GLIALCAM mutations abolish the targeting of the channel to cell junctions. Hence, we describes the first auxiliary subunit of ClC-2 and suggests that ClC-2 may play a role in the pathology of MLC disease.

La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb quists subcorticals, també anomenada MLC, és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel•lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. En la present tesi s’han generat i estudiat diferents models animals i cel•lulars per a l’estudi de la malaltia. En primer lloc, s’ha generat i s’ha caracteritzat un model de ratolí knock-out per a Mlc1. Gràcies a aquest model s’ha observat que la proteïna MLC1 és únicament astrocitària i que la proteïna GlialCAM no es independent de MLC1, ja que en absència d’aquesta es troba deslocalitzada en el cerebel. També s’ha pogut descriure per primer cop la implicació del canal de Cl- ClC-2 en la fisiopatologia, ja que els seus nivells de proteïna disminuixen en el cerebel i el canal es troba gairebé inactiu en els oligodendròcits de l’animal knock-out. Les característiques fenotípiques que presenta el model de ratolí equivalen a les característiques observades en els pacients en fases inicials de la malaltia, ja que l’animal tot i que mostra presència de vacuoles no presenta deteriorament motor i macrocefàlia aparent. També s’ha generat un model de peix zebra knock-out per a zmlc1. Aquest model presenta avantatges respecte el ratolí, com per exemple el baix cost o l’aplicació de tècniques genètiques a gran escala. Aquest model ha permés observar de nou que realment GlialCAM necessita a MLC1 per a la seva correcta localització. També s’ha observat que l’ortòleg zGlialCAMa conserva la seva funció de entre espécies ja que també es capaç de modificar les corrents de ClC-2. Aquests resultats obtinguts amb els models s’han pogut comparar amb el cervell d’una pacient. Aquest cervell demostra que MLC1 és necessària per a la correcta localització de GlialCAM en la regió del cerebel. Per altra banda, s’han desenvolupat diferents models cel•lulars. Primerament s’han estudiat els astròcits del ratolí knock-out. Aquestes cel•lules mancades de MLC1 també presenten vacuoles per tot el citoplasma, però no mostren canvis en la localització ni en els nivells de proteïna de GlialCAM i ClC-2. Aquest fet juntament amb altres estudis del grup van fer pensar si la condició necessària per a que es veguessin afectades aquestes proteïnes estaria relacionada amb el procés del sifoneig de K+. Estudis realitzats en astròcits de rata demostren que en condicions d’un alt contingut de K+, com per exemple durant una alta activitat neuronal, GlialCAM i ClC-2 és localitzen juntament a les membranes cel•lular i ClC-2 canvia les seves propietat de canal. Paral•lelament, estudis realitzats en oligodendròcits de rata també demostren que aquest fet també succeix en aquest tipus cel•lular.<br>Megalencefalic leukoencephalopathy with subcortical cysts, also known as MLC, is a rare type of leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. In this work we have developed two different models to study the physiopathology. The results show that GlialCAM affected by the absence of MLC1. It has been also demonstrated that ClC-2 is implicated in the disease.These results were compared with a patient brian and has been shown that MLC1 is important for the correct location of GlialCAM in the cerbellum. Have also been developed a different cellular models. The results with this models show that GlialCAM and ClC-2 could have a functional role in the process of potassium siphoning.

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira<br>Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-12T20:59:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanon_RenataGraciele_D.pdf: 7966608 bytes, checksum: 79a55fb4c6226868859fa3daefc0adb2 (MD5) Previous issue date: 2009<br>Resumo: O complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) é uma molécula originalmente do Sistema Imunológico. A presença desses elementos no Sistema Nervoso Central (SNC) parece estar relacionada a diferentes funções, apresentando papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e sendo fundamental no processo de eliminação sináptica após uma lesão nervosa no adulto. No intuito de investigarmos os processos de plasticidade sináptica e reatividade glial no microambiente da medula espinal foram utilizados dois imunomoduladores empregados no tratamento da Esclerose Múltipla, o interferon beta (IFN beta) e o acetato de glatirâmer (AG). O IFN beta, potencialmente capaz de influenciar a expressão de MHC I, foi utilizado in vivo, juntamente com axotomia periférica e in vitro, enquanto o AG foi utilizado para testes in vitro. Para tanto, camundongos C57BL/6J foram tratados com 10.000 UI de IFN beta durante 2 semanas, antes e depois da transecção unilateral do nervo isquiático. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinais lombares processadas para imunohistoquímica (anti-MHC I, sinaptofisina, GFAP - glial fibrillary acidc protein, ezrina e iba1), hibridação in situ (sondas para GFAP e microglobulina beta-2), Western blotting (GFAP e MHC I) e microscopia eletrônica de transmissão. Grupos axotomizados, placebo e não tratado foram utilizados como controles. Adicionalmente ao estudo in vivo, foram estabelecidas culturas purificadas de astrócitos para o tratamento com diferentes doses de IFN beta (0, 100, 500 ou 1000 UI/ml) ou AG (0, 1.2, 2.5 ou 5.0µg/ml) durante 5 dias. As culturas tratadas com IFN beta foram submetidas à imunohistoquímica para MHC I, ezrina, GFAP, enquanto nas culturas tratadas com AG foi realizado o estudo para verificar a reatividade e proliferação através da marcação anti-GFAP e DAPI (para identificação dos núcleos das células). In vivo, os resultados mostraram um aumento do RNAm e da expressão protéica para MHC I após axotomia, sendo que este incremento foi maior no grupo tratado com INF. Observou-se a intensificação da expressão das proteínas que expressam a reatividade astrocitária, GFAP e ezrina, concomitantemente à diminuição da imunomarcação para sinaptofisina, especialmente no grupo tratado. O tratamento realizado não influenciou a reatividade da microglia. A análise do material in vitro também mostrou, após o tratamento com IFN beta, um aumento da expressão de MHC I e GFAP, bem como de ezrina. As doses que mais estimularam a elevação da expressão dos marcadores estudados foram as de 500 e 1000 UI/ml. Dado que não ocorreu para o tratamento com o acetato de glatirâmer. Assim, o tratamento com AG não alterou o nível de reatividade astrocitária, apesar de estimular a proliferação celular. A ultraestrutura das sinapses mostrou uma intensa retração dos terminais pré-sinápticos em contato com os motoneurônios alfa, induzida pela axotomia mais o tratamento com IFN beta. Em conjunto, esses resultados reforçam a importância da expressão de moléculas de MHC I em resposta à lesão nervosa e seu papel como mecanismo de comunicação entre neurônio e glia, além de reafirmar que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica.<br>Abstract: The class I main histocompatibility complex (MHC I) is a molecule originally restricted to Immune System. The presence of such element in the Central Nervous System (CNS) may indicate other functions, including an important role in the synaptic refinement during the development of the CNS as well as in the synaptic elimination process after a peripheral nerve injury in the adult. To investigate the synaptic plasticity and glial reactivity in the spinal cord, two immunomodulators, widely used for treating Multiple Sclerosis, were applied, namely the Interferon beta (IFN beta) and the glatiramer acetate (GA). The IFN beta was used in order to upregulate the MHC I expression in vivo, after a peripheral axotomy, and also in vitro. GA treatment was only used for in vitro experiments. C57BL/6J mice were injected with 10,000 IU of IFN beta for 2 weeks, before and after the nerve transection. The animals were sacrificed and the lumbar spinal cords were processed for immunohistochemistry (MHC I, synapthophysin, GFAP, ezrin and Iba-1 antisera), in situ hybridization (beta 2 immunoglobulin, a component of the MHC I molecule, and GFAP), Western blotting (GFAP and MHC I) and transmission electron microscopy. Placebo and non-treated axotomized groups were used as controls. Additionally to the in vivo study, primary cultures of astrocytes were established and treated during five consecutive days with different doses of IFN beta (0, 100 IU, 500 IU and 1000 IU/ml). In this case, some cultures were treated with GA (0, 1.2, 2,5 and 5.0 µg/ml). INF treated cultures were processed for immunocitochemistry (MHC I, GFAP and ezrin antisera). GA treated cultures were evaluated with anti-GFAP antibody and cell proliferation was accessed with DAPI staining. In vivo, the results showed an upregulation of MHC I mRNA and protein expression after axotomy, that was stronger in the IFN treated group. We observed a greater GFAP and ezrin expression, coupled with a decrease of synapthophysin immunoreactivity. Such alterations were more evident in the IFN treated group. Interestingly, the IFN beta treatment did not interfere in the microglial reactivity. The in vitro analysis also showed a sharp upregulation of MHC I, GFAP and ezrin, mostly when the cultures were subjected to 500 and 1000 IU/ml of IFN beta. Regarding the GA treatment, the results showed that treatment did not change the level of astroglial reactivity despite stimulating cellular proliferation. The ultrastructural analysis of synapses showed a larger pruning of presynaptic terminals in contact with alpha motoneurons, induced by axotomy plus IFN beta treatment. Together, our results reinforce the importance of the MHC I expression as a response to nerve injury and its role as a communication mechanism between neurons and surrounding glial cells. Furthermore, the present data confirm that astrocytes are active elements during the synaptic plasticity process.<br>Doutorado<br>Anatomia<br>Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Alice da Cruz-Höfling<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia<br>Made available in DSpace on 2018-08-27T16:36:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_EdileneSiqueira_M.pdf: 11448561 bytes, checksum: 00aace7be2d8fec579aea2fd4166f813 (MD5) Previous issue date: 2015<br>Resumo: Neste trabalho investigamos a permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) pela peçonha da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) através da via transcelular no cerebelo de ratos. As cavéolas foram analisadas nas células endoteliais pela expressão de proteínas associadas à sua formação (caveolina-1, Cav-1 e dinamina-2, Din2) e internalização (caveolina-1 fosforilada, pCav-1 e quinase da família Src, SKF), e nos astrócitos com avaliação da caveolina-3 (Cav-3) e da conexina-43 (Cx43) (formadora de junções comunicantes). A ação do PNV sobre o endotélio também foi avaliada pela ativação (acoplamento) ou inativação (desacoplamento) da enzima eNOS, produtora de óxido nítrico (NO). As estruturas que compõe a BHE foram avaliadas através de microscopia eletrônica de transmissão. Inicialmente, o estudo de Cav-1 contemplou sua localização, expressão gênica e proteica após o envenenamento em diferentes idades, ratos neonatos eram mais suceptíveis ao envenenamento do que ratos adultos. Após PNV, a imunomarcação para Cav-1 foi mais evidente na camada granular e molecular e em neurônios de Purkinje. A expressão Cav-1 e Din2 (foramdoras das vesículas e seu gargalo, respectivamente) aumentou em períodos de envenenamento agudo (1 h), de recuperação (5 h) e na ausência de sinais clínicos (24 h); em contrapartida SKF e pCav-1 envolvidas na internalização caveolar foram superexpressas em períodos opostos (às 2 h e 72 h). O PNV induziu aumento da metaloproteinase-9 da matriz (MMP9), importante mediadora de quebra da BHE e aumentou a formação e o tráfego de vesículas no endótelio após envenenamento. A análise de eNOS revelou desacoplamento (aumento de monômeros) nos períodos de envenenamento agudo (1-2 h) com progressivo retorno e super-expressão de dímeros (re-acoplamento) às 72 h; essas alterações foram relacionadas à ação do PNV sobre os níveis intracelulares de cálcio investigado pelo aumento na expressão de calmodulina e confimado pela localização de calbindina-D28. Os dados revelam a interferência do PNV sobre a homeostase endotelial e função vascular ao afetar o sistema eNOS/NO, importante controlador do tônus vascular. Nos astrócitos, as cavéolas são formadas por Cav-3 e sua superexpressão é associada a doenças neurológicas. O PNV aumentou significativamente os níveis basais de Cav-3 em astrócitos GFAP positivos (astrogliose reativa) em períodos de aumento de Cx43 (às 1, 5 e 24 h), e na vigência de edema citotóxico nos pés astrocitários e alterações nos contatos sinápticos axo-dendríticos e axo-somáticos. Em conjunto os resultados revelam que: (a) a quebra da via transcelular da BHE pelo PNV tem aumento da endocitose via cavéolas; (b) componentes da unidade neurovascular, como endotélio, astrócitos e neurônios estão intimamente envolvidos; (c) no endotélio, os efeitos são mediados pelo sistema eNOS/NO; (d) a SKF ativa o sistema endocítico e de transporte vesicular; (e) nos astrócitos, a dinamica expressão de Cx43 e Cav-3 e o retorno aos níveis basais em paralelo com a ausência de sinais de intoxicação nos animais (72 h) dá evidências de que ambas as proteínas interagem na resposta astrocitária. Os dados permitem sugerir que a presença de peptídeos neurotóxicos no veneno de Phoneutria nigriventer estão no centro dos efeitos aqui relatados<br>Abstract: In this work, we investigated the blood-brain barrier (BBB) permeabilization induced by Phoneutria nigriventer venom (PNV) in the transcellular route of rats¿ cerebellum. Caveolae was analyzed in endothelial cells accessing the expression of proteins involved in caveolae formation (caveolin-1, Cav-1 and dynamin-2, Dyn2) and internalization (phosphorylated Caveolin-1, pCav-1 and Src kinase family, SKF), in astrocytes caveolae role were evaluated with caveolin-3 (Cav-3) and connexin-43 (Cx43) (gap-junction main protein). PNV action on the endothelium was also investigated through activation (coupling) or inactivation (uncoupling) of eNOS enzyme, responsible for nitric oxide (NO) production. BBB components were evaluated using transmission electron microcopy. Initially, Cav-1 study addressed its localization along with Cav-1 protein and gene expression after envenoming in different age animals, neonate rats were more susceptible to envenoming than adult rats. After PNV, Cav-1 labeling was intense in granular and molecular layers and in Purkinje neurons. Cav-1 and Dyn2 (responsible for caveolae vesicles formation and scission, respectively) expression increased in periods of acute envenomation (1 h), recovery (5 h) and in the absence of clinical signals (24 h); in opposition SKF and pCav-1 involved in caveolae internalization were overexpress in opposite periods (at 2 h and 72 h). PNV induced increases in matrix metaloproteinases-9 (MMP9) an important BBB breakdown mediator, and increases in vesicles formation and traffic in the endothelium after envenoming. The study of eNOS activity revealed uncoupling (increasing in eNOS monomers) in acute periods after envenomation (1 h and 2 h) and progressive return followed by overexpression of dimers (re-coupling) at 72 h; those alterations were related to PNV action on calcium intracellular levels confirmed by Calmodulin increased expression and confirmed using Calbindin-D28 localization. Data revealed PNV interference on endothelial homeostasis and vascular function once affects the eNOS/NO system, an important vascular tonus controller. In astrocytes, caveolae are formed by Cav-3 and its overexpression is related to neurological disorders. PNV increased the basal levels of Cav-3 in GFAP-positive astrocytes (reactive astrogliosis) in the same periods as increased Cx43 (at 1, 5 e 24 h), during cytotoxic edema in astrocytes end-feet and alterations in axo-dendrites and axo-somatic synaptic contacts. Together, the results revealed that: (a) the BBB breakdown in transcellular route by PNV involves upregulation of caveolae endocytosis (b) the neurovascular unit components such as the endothelium, astrocytes and neurons are intimal involved (c) in the endothelium the effects are mediated by the eNOS/NO system and (d) SKF activates endocytic system and vesicular transport; (e) in the astrocytes, Cx43 and Cav-3 dynamic expression and their return to basal level in parallel with the absence of toxic signals in the animals (72 h) provides evidence that both protein interacts in astrocytes response. The data allows us to suggest that the neurotoxic peptides presented in Phoneutria nigriventer venom are in the center of the effects reported here<br>Mestrado<br>Biologia Tecidual<br>Mestra em Biologia Celular e Estrutural

La soca de ratolins amb senescència accelerada SAMP8 és utilitzada habitualment com a model de senescència; i el seu ús per a l’estudi de la malaltia d’Alzheimer s’ha estès degut a la manifestació espontània dels seus trets histopatològics distintius. En estudis recents es va identificar la presència de grànuls amiloides a l’hipocamp dels ratolins SAMP8. Aquests clústers de grànuls augmenten amb l’edat i s’estenen al llarg de l’hipocamp. A més a més, les característiques morfològiques dels grànuls amiloides són molt similars als grànuls tenyits amb Periodic Acid Schiff (PAS), descrits anteriorment en els SAMP8 i en ratolins envellits d’altres soques. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la composició, l’origen i el desenvolupament dels grànuls que apareixen amb l’edat a l’hipocamp dels ratolins senescents SAMP8 amb la finalitat d’aportar nova informació sobre la neuropatologia d’aquests ratolins per al seu ús com a model de la malaltia d’Alzheimer. En aquest treball s’ha identificat la correspondència entre els grànuls amiloides i els grànuls PAS de l’hipocamp d’aquests animals. Aquests grànuls són el resultat d’un procés degeneratiu present en els astròcits i que pot afectar també zones properes, i estan formats per fragments membranosos provinents de l’acumulació de restes d’estructures i orgànuls, com els mitocondris. A més a més, s’ha identificat la presència d’un neo-epítop en el nucli dels grànuls que és, almenys parcialment, de naturalesa glucídica. Aquest neo-epítop és reconegut per anticossos IgM contaminants presents en anticossos comercials produïts en ascites de ratolí o sèrum de ratolí i conill. Aquestes IgM contaminants són probablement anticossos naturals, i algunes IgM hemaglutinen de forma positiva i específica els eritròcits humans de tipus A. La presència tant del neo-epítop com de les IgMs han estat la causa de falses tincions positives que han generat interpretacions errònies del significat fisiopatològic dels grànuls. És el cas, per exemple, de la presència de β-amiloide o la proteïna tau en aquestes estructures. Finalment, les lesions cerebrals de pacients associades a malalties neurodegeneratives i a l’envelliment no corresponen als clústers de grànuls de l’hipocamp d’aquests ratolins, tot i que seria interessant estudiar la presència del neo-epítop en aquestes condicions fisiopatològiques.<br>SAMP8 mice present an accelerated senescence and are usually used as a model of aging. Because this strain of mice spontaneously expresses several histopathological features of Alzheimer’s disease (AD), it has been recently used as a model for studying this disease. Alterations in the expression of β-amyloid (Aβ) peptides, tau hyperphosphorilation, an increase of oxidative stress and gliosis suggest that SAMP8 mice could be a relevant model for studying the first stages of sporadic AD and its relation to aging. Recent studies in our group identified the presence of Aβ clustered granules in the hippocampus of SAMP8 mice when immunohistochemical stainings were performed with antibodies directed against Aβ peptides. These clustered granules increase in number and extension with age, and they spread throughout the hippocampus. The features of Aβ clustered granules are very similar to the granules stained with Periodic Acid Schiff (PAS) already described in SAMP8 mice, as well as in aged mice of other strains. On the other hand, human brain lesions present in aging and other neurodegenerative diseases, such as AD, may vary their chemical composition with time, suffering substantial alterations in the principal components and the addition of secondary components. The main objective of this thesis is to study the composition, origin and development of the granules that appear with age in the hippocampus of SAMP8 mice, with the aim of further describing the neuropathology of these animals and provide new information for using them as a murine model of AD. Therefore, in this thesis we studied the composition and order of appearance of the constituents of the hippocampal granules of SAMP8 mice, and the possible coincidence between Aβ and PAS granules. The morphology, ultrastructure, cellular origin and formation process of these structures has been also ascertained; and a comparison between these structures and human brain lesions of neurodegenerative diseases have been performed. The results obtained in this thesis allowed reaching several conclusions. The pathological clustered granules of the hippocampus of aged SAMP8 mice correspond to the PAS granules described in aged mice of several mouse strains. These granules are the result of a degenerative process located in astrocytes that could affect the surrounding neuropil. In the granules formation process, several abnormal membranous structures and cellular organelles, like mitochondria, produce membranous waste that finally accummulates forming the core of the granules. On the other hand, a neo-epitope absent before the granules formation appears in the membranous residues. This neo-epitope is located in the nucleus of the mature granules and contains at least some structures of glycosidic nature. The neo-epitope is recognized by contaminant IgM antibodies present in a wide range of commercial antibodies produced in mouse ascites or mouse and rabbit sera, which are probably natural antibodies, and some of these IgMs haemmagglutinate A-type human erythrocytes, but not B and O subtypes. The neo-epitope could be considered an A-like epitope because monoclonal antibodies anti-A-type human erythrocytes do not recognize it. Both the neo-epitope presence in the granular structures and the IgMs contained in commercial antibodies have been the cause of false-positive stainings, and as a result, they have generated misunderstandings about the composition and physiopathological significance of the hippocampal granules of aged mice, as is the case of Aβ peptides and tau protein, which are not contained in these granules. Finally, human brain lesions described to date in patients of neurodegenerative diseases or aged individuals do not correspond to the clustered pathological granules present in the hippocampus of aged mice. The study of the presence of the neo-epitope in diseased human brain could be interesting in the understanding of the neuropathology of aging and neurodegenerative diseases.

La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel·lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. Recentment s’ha descrit mutacions en ClC-2 associades a un tipus de leucodistròfia vacuolitzant. L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna GlialCAM i ClC-2 i així aprofundir en el coneixement de en el seu paper en les cèl·lules glials així com en la fisiopatologia de les leucoencefalopaties vacuolitzants. Per a realizar aquest objectiu es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la caracterització bioquímica i funcional de noves mutacions en GLIALCAM associades a MLC. S’ha obtingut una classificació de les mutacions en GLIALCAM en funció del defecte que presentaven. S’ha descrit mutacions defectives en la expressió proteica, defectives en la homooligomerització i en el tràfic a les unions cel·lulars, defectives únicament en el tràfic cel·lular, mutacions sensibles a la manca de MLC1 i mutacions defectives en la internalització de la proteïna. Paral·lelament es va aprofundir en la relació bioquímica entre GlialCAM i ClC-2 a partir de l’estudi bioquímic i funcional de mutacions en CLCN2 associades a leucoencefalopaties vacuolitzants. S’ha observat que GlialCAM augmenta la funció del canal ClC-2 a través de la modificació del gating del canal i de la estabilització de ClC-2 a la membrana plasmàtica però no sembla que millori la sortida de ClC-2 del reticle endoplasmàtic. A més, aquesta estabilització requereix de la formació d’homocomplexes de GlialCAM. Per últim, es va generar i caracteritzar un model knock-down de la proteïna ClC-2 per aprofundir el paper de ClC-2 en els astròcits. Així com també es va avançar en la relació bioquímica i funcional entre GlialCAM i ClC-2 en la fisiologia astrocitària. S’ha descrit que en astròcits en cultiu en condicions d’alta concentració de K+, similar al que succeiria en situacions d’alta activitat neuronal, ClC-2 es transloca de l’aparell de Golgi a les membranes cel·lulars, modificant les seves propietats funcionals per l’efecte de GlialCAM. En canvi, en astròcits deficients de MLC1, ClC-2 es troba retinguda citoplasmàticament. Aquest fet, indicaria que aquestes proteïnes podrien tenir un paper en el procés de sifoneig del K+, i per tant, la deslocalització de ClC-2 podria donar lloc a un desordre en l’homeòstasi d’aigua i ions.<br>Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcortical Cysts (MLC) is a rare type of vacuolating leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. Recently, mutations in ClC-2 have been associated with a rare type of vacuolating leukodystrophy. The principal aim of this study is to advance in the knowledge of GlialCAM and ClC-2 in the glial cells and into the pathogenesis of vacuolating leukodistrophies. To accomplish the study, the group performed a biochemical and funcional characterization of new mutations in GLIALCAM associated with MLC. We suggest that the HEPACAM mutations described up to now can be classified in several groups. Some mutations can affect GlialCAM protein expression, affect its ability to cis-homooligomerize and consequently reduce their localization in cell–cell junctions. Some mutations can affect specifically only transinteractions between GlialCAM molecules or may be unstable without MLC1 and finally some mutations affect the protein internalization. Parallel progress was made in the biochemical relationship between GlialCAM and ClC-2 from biochemical and functional studies of mutations in CLCN2 associated with vacuolating leukodystrophies. GlialCAM has been observed to increase ClC-2 function by the modification of its gating and the stabilization of ClC-2 in the plasma membrane. In addition, the stabilization requires a previous formation of GlialCAM’s homocomplexes. Finally, a knock-down model of the CLC-2 protein was generated and characterized to deepen the role of CLC -2 astrocytes. As well as progress was made in biochemistry and functional relationship between CLC -2 and GlialCAM in the astrocitic physiology. It has been reported that astrocytes cultured in conditions of high concentrations of K + , similar to what happens in situations of high neuronal activity , CLC -2 translocates from the Golgi apparatus to the cell membrane , changing the its functional properties for the purpose of GlialCAM . However, in MLC1 deficient astrocytes, CLC -2 is retained intracellularly. This would indicate that these proteins could play a role in the potassium siphoning, and therefore the relocation of CLC -2 could lead to disorder in the homeostasis of water and ions.

Главно маслинасто једро је највећи део доњег маслинастог комплекса. На пресеку главно маслинасто једро има изглед наборане врећице са дном које гледа ка спољашњој површини продужене мождине и отвором који је окренут унутра и дорзално. Главно маслинасто једро је укључено у просторну и временску организацију покрета и моторног учења, учења које је повезано са вежбањем, просуђивања времена интервала и брзине покретних стимулуса и когнитивних операција у простору. Популацију неурона главног маслинастог једра чине мултиполарни (90%) и интернеурони (10%). Дендритска арборизација неурона главног маслинастог једра је веома комплексна и различитог је облика (сферична или асиметрична), а правац пружања дендрита може да буде радијалан или кружан. Структурну и функционалну потпору неуронима пружају глијалне ћелије (астроцити, олигодендроцити и микроглија). Глијалне ћелије окружују неуроне и окупирају међунеуронске просторе где одржавају микросредину погодну за активност и виталност неурона. Старење представља природан и временски зависан процес који је карактерисан прогресивном појавом иреверзибилних промена у ћелијама, што резултира опадањем саморегулаторних способности јединке. У току старења, долази до нарушавања природног окружења неурона и глијалних ћелија што се одражава на њихов број, величину и изглед тела, дендритску крошњу и синаптичку организацију. Циљеви: Циљеви истраживања су да се утврди да ли се параметри морфологије неурона и глијалних ћелија разликују између старосних група, као и да се квантитативном анализом провери могућност класификације неурона и глијалних ћелија према квалитативном опису. Материјал и методе: Узорак студије је чинило 30 обостраних исечака главног маслинастог једра подељених у три старосне групе (други период сазревања (36-60 год.), рани период старења (61-75 год.) и касни период старења (76-90 год.)). Извршена је хистолошка обрада узорака Голџијевом методом импрегнације а микроскопске слике резова су дигитализоване а затим трансформисане у бинарне и скелетонизоване слике. Квалитативно су процењиване особине слика неурона (259) и глијалних ћелија (419) а квантитативна анализа величине, облика, гранања, дужине и сложености испитиваних ћелија спроведена је израчунавањем 22 (геометријска, компјутациона и фрактална) параметра. Резултати: Квалитативном проценом уочене су разлике у изгледу тела и неуронског поља, дендритске крошње, правца пружања дендрита, и распореда неурона у главном маслинастом једру. Квалитативна процена глијалних ћелија омогућила је њихов опис према врстама (астроцити, олигодендроцити и микроглија). Квантитативно испитивање геометријских параметара је показало да се неурони и глијалне ћелије не могу класификовати према величини. Неурони треће старосне групе имају мање вредности параметара који квантификују сложеност тела, неуронског поља и дендритске крошње, као и параметре дужине неурона. Површина тела, параметри дужине глијалне ћелије и сложеност глијалне крошње астроцита, значајно су мањи у узорку треће старосне групе, у поређењу са првом и другом. Олигодендроцити прве и друге старосне групе имају веће параметре који дефинишу величину и дужину ћелија, а мање вредности фракталне димензије сложености (тела, глијалног поља и глијалне крошње), од треће старосне групе. Закључци: Касни период старења нервног система резултирао је појавом регресивних промена на неуронима. Астроцити већ у раном периоду старења подлежу атрофичним променама на нивоу тела, глијалног поља и наставака, док олигодендроцити у касном периоду старења задржавају сложеност у грађи.<br>Glavno maslinasto jedro je najveći deo donjeg maslinastog kompleksa. Na preseku glavno maslinasto jedro ima izgled naborane vrećice sa dnom koje gleda ka spoljašnjoj površini produžene moždine i otvorom koji je okrenut unutra i dorzalno. Glavno maslinasto jedro je uključeno u prostornu i vremensku organizaciju pokreta i motornog učenja, učenja koje je povezano sa vežbanjem, prosuđivanja vremena intervala i brzine pokretnih stimulusa i kognitivnih operacija u prostoru. Populaciju neurona glavnog maslinastog jedra čine multipolarni (90%) i interneuroni (10%). Dendritska arborizacija neurona glavnog maslinastog jedra je veoma kompleksna i različitog je oblika (sferična ili asimetrična), a pravac pružanja dendrita može da bude radijalan ili kružan. Strukturnu i funkcionalnu potporu neuronima pružaju glijalne ćelije (astrociti, oligodendrociti i mikroglija). Glijalne ćelije okružuju neurone i okupiraju međuneuronske prostore gde održavaju mikrosredinu pogodnu za aktivnost i vitalnost neurona. Starenje predstavlja prirodan i vremenski zavisan proces koji je karakterisan progresivnom pojavom ireverzibilnih promena u ćelijama, što rezultira opadanjem samoregulatornih sposobnosti jedinke. U toku starenja, dolazi do narušavanja prirodnog okruženja neurona i glijalnih ćelija što se odražava na njihov broj, veličinu i izgled tela, dendritsku krošnju i sinaptičku organizaciju. Ciljevi: Ciljevi istraživanja su da se utvrdi da li se parametri morfologije neurona i glijalnih ćelija razlikuju između starosnih grupa, kao i da se kvantitativnom analizom proveri mogućnost klasifikacije neurona i glijalnih ćelija prema kvalitativnom opisu. Materijal i metode: Uzorak studije je činilo 30 obostranih isečaka glavnog maslinastog jedra podeljenih u tri starosne grupe (drugi period sazrevanja (36-60 god.), rani period starenja (61-75 god.) i kasni period starenja (76-90 god.)). Izvršena je histološka obrada uzoraka Goldžijevom metodom impregnacije a mikroskopske slike rezova su digitalizovane a zatim transformisane u binarne i skeletonizovane slike. Kvalitativno su procenjivane osobine slika neurona (259) i glijalnih ćelija (419) a kvantitativna analiza veličine, oblika, grananja, dužine i složenosti ispitivanih ćelija sprovedena je izračunavanjem 22 (geometrijska, kompjutaciona i fraktalna) parametra. Rezultati: Kvalitativnom procenom uočene su razlike u izgledu tela i neuronskog polja, dendritske krošnje, pravca pružanja dendrita, i rasporeda neurona u glavnom maslinastom jedru. Kvalitativna procena glijalnih ćelija omogućila je njihov opis prema vrstama (astrociti, oligodendrociti i mikroglija). Kvantitativno ispitivanje geometrijskih parametara je pokazalo da se neuroni i glijalne ćelije ne mogu klasifikovati prema veličini. Neuroni treće starosne grupe imaju manje vrednosti parametara koji kvantifikuju složenost tela, neuronskog polja i dendritske krošnje, kao i parametre dužine neurona. Površina tela, parametri dužine glijalne ćelije i složenost glijalne krošnje astrocita, značajno su manji u uzorku treće starosne grupe, u poređenju sa prvom i drugom. Oligodendrociti prve i druge starosne grupe imaju veće parametre koji definišu veličinu i dužinu ćelija, a manje vrednosti fraktalne dimenzije složenosti (tela, glijalnog polja i glijalne krošnje), od treće starosne grupe. Zaključci: Kasni period starenja nervnog sistema rezultirao je pojavom regresivnih promena na neuronima. Astrociti već u ranom periodu starenja podležu atrofičnim promenama na nivou tela, glijalnog polja i nastavaka, dok oligodendrociti u kasnom periodu starenja zadržavaju složenost u građi.<br>The principal olivary nucleus is the largest part of the inferior olivary complex. On the cross-section, the principal olivary nucleus has the appearance of a folded bag with a bottom looking to the outer surface of the medulla oblongata and hilum that is turned inward and dorsally. The principal olivary nucleus is involved in spatial and temporal organization of movement and motor learning, learning which is related to exercise, coordination of interval time with speed of stimuli and cognitive operations. Neuronal population of principal olivary nucleus is consists of multipolar neurons (90%) and interneurons (10%). Dendritic arborization of olivary neurons is very complex with a spherical and asymmetrical shape and radial or circular dendrites. Structural and functional support for neurons is provided by the glial cells (astrocytes, oligodendrocytes and microglia). Glial cells surround neurons and occupy interneuronal spaces where they maintain a suitable microenvironment for the neuronal activity and vitality. Aging is a physiological and time-dependent process characterized by the progressive irreversible changes of the cells, resulting in a decrease in self-regulatory capabilities. During aging, the natural environment of neurons and glial cells is affected, which reflects on their number, size and body structure, the dendritic arborization, and synaptic organization. Aims: The aims of the research were to determine whether the morphology of neurons and glial cells differ between age groups and to quantitatively analyze the possibility of classification of neurons and glial cells according to their qualitative description. Material and methods: The study sample consisted of 30 two-sided sections of the principal olivary nucleus divided into a three age groups (the second period of maturation (36-60 years), early aging (61-75 years) and late aging (76-90 years)). Histological preparation of samples (by Golgi&#39;s method of impregnation) was performed and the microscopic images were digitized and then transformed into a binary and skeletonized forms. Neurons (259) and glial cells (419) were qualitatively evaluated and the quantitative analysis of the size, shape, branching, length and complexity was carried out by calculating 22 (geometric, computer and fractal) parameters. Results: Qualitative estimation revealed the differences in the appearance of the neuronal body and neuronal field, dendritic arborisation, direction of dendrites and position of neurons inside the principal olivary neucleus. A qualitative evaluation of glial cells enabled description of their types (astrocytes, oligodendrocytes and microglia). Quantitative testing of geometric parameters has shown that neurons and glial cells cannot be classified according to their size. Neurons from third age group have lesser values of parameters that quantify the body complexity, the neuronal field, and the dendritic arborization, as well as parameters of the neuronal length. The body area, parameters of the astrocytes length and the astrocyte arborization complexity, are significantly lower in the sample of the third age group, in compared with the first and the second. Oligodendrocytes of the first and second age group have larger parameters that define the cell length, and lower values of the fractal dimension of body, glial field and glial arborization complexity, from the third age group. Conclusions: Late aging period of the nervous system resulted in a regressive changes on neurons. During the early aging period astrocytes undergo to atrophic changes of body, glial filed and processes, while the oligodendrocytes in the late period of aging retain their structure complexity.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016.<br>Una relación en el nivel elevado y aberrante en la deiminación post traduccional ha sido demostrado en estudios relacionados a la esclerosis múltiple (MS) (Bates et al, 2002; Kim et al, 2003) y más recientemente en el nervio óptico de pacientes con glaucoma con alta presión intraocular (Bhattacharya et al., 2006) y en pacientes con glaucoma con presión intraocular normal (Cafaro et al, 2010). La esclerosis múltiple es vista como una enfermedad autoinmune y algunos componentes de la autoinmunidad también han sido relacionados con el glaucoma (Tezel & Wax, 2007). Nosotros intentamos demostrar que el nivel de expresión de la enzima deiminasa de la peptidyl arginina 2 (PAD2) es más elevado en los astrocitos a diferencia de otras células como respuesta a una variedad de parámetros fisicoquímicos. Nuestro trabajo preliminar demuestra que la elevación de la presión ambiental es uno de esos parámetros (Algeciras et al, 2008). También hemos demostrado que la elevación en el nivel de PAD2 está asociada con una elevación en el nivel de parámetros bioquímicos relacionados con la activación de astrocitos (Govindarajan et al, 2009). En mi tesis yo evaluaré diferentes estrategias para intentar elevar los niveles de PAD2 y consecuentemente la deiminación, así como intentaré también llegar a un estimado cuantitativo de activación bioquímica. Finalmente, utilizaré anticuerpos y diferentes técnicas para tratar de demostrar que los astrocitos pueden ser capaces de expresar moléculas importantes en la presentación antigénica y potencialmente estar capacitados, bajos condiciones de activación, para actuar como células presentadores de antígeno y activar a los linfocitos T. Nuestra 3 hipótesis es que la elevación en la deiminación post traduccional en el nervio óptico de pacientes con glaucoma o en el tejido cerebral de pacientes con esclerosis múltiple puede desencadenar una cascada lenta y progresiva: la modificación de las proteínas de la mielina por la deiminación post traduccional genera productos auto catalíticos que activan a los astrocitos. Cuando los astrocitos son activados, pueden obtener habilidades de células presentadoras de antígenos y así iniciar una reacción con participación de diferentes componentes inmunológicos que contribuye a la muerte de las neuronas en ciertas enfermedades neurodegenerativas.<br>Algeciras, Mabel Enriquez. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.<br>Bhattacharya, Sanjoy K. Universidad de Miami. Departamento de Oftalmología. Bascom Palmer Eye. Institute; Estados Unidos de Norteamérica.<br>Serra, Horacio Marcelo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.<br>Iribarren, Pablo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.<br>Quiroga, Santiago. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.<br>Radrizzani, Martín. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Neurología y Citogenética Molecular; Argentina.

Tesina (Grado en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Centro de Biología Celular y Molecular - CEBICEM- Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas - IIByT-CONICET- Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales-Universidad Nacional de Córdoba. 2020 . 37 h. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica.<br>Los astrocitos constituyen una población abundante y heterogénea de células gliales, que participan en una gran variedad de funciones complejas y esenciales. Cuando los astrocitos reaccionan ante una lesión o patología se producen cambios, entre los cuales se destacan el aumento en la expresión de la proteína GFAP, la proliferación y la liberación de numerosos mediadores entre los cuales se incluye a neurotrofina BDNF. La astrogliosis es una característica distintiva de la epilepsia y del status epilepticus (SE) y los cambios que ocurren en estas células pueden predisponer y/o facilitar la muerte neuronal. Si bien, esto sugiere que los astrocitos reactivos promueven la excitotoxidad existen numerosas evidencias que demuestran que estas células tienen un rol neuroprotector luego del SE. El objetivo de este trabajo es evaluar los parámetros principales que caracterizan a la gliosis reactiva y la viabilidad celular luego de someter a astrocitos obtenidos de diferentes áreas cerebrales a un SE in vitro. Por ello se evaluó la supervivencia, expresión de GFAP, proliferación y expresión de BDNF de astrocitos en cultivo obtenidos de corteza cerebral (CX), cuerpo estriado (ST) e hipocampo (Hipo) luego de someterlos a SE. Nuestros resultados demuestran que la sobrevida de los astrocitos se ve afectada de igual manera en todas las áreas, mientras que la expresión de GFAP se vio incrementada en CX y ST, pero no en HIPO. En cuanto a la proliferación, se observó que la tasa de proliferación varía entre astrocitos de diferentes áreas del cerebro pero no cambia luego del SE y tampoco se altera la expresión de BDNF y su receptor TrkB.t . En suma, nuestros resultados junto con estudios previos de nuestro laboratorio indican que el SE in vitro inducido con el buffer libre de Mg2+ tiene un impacto moderado sobre los astrocitos, y que la activación de estas células dependería de la presencia de neuronas hiperactivadas.<br>Fil: Silva, Gabriela Vanina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Escuela de Biología, Argentina

Doctor en Ciencias Mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias.<br>El estrés oxidativo y la desregulación de la señalización de calcio son señales importantes en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA). El factor de transcripción STAT3 tiene un rol crucial en el desarrollo y mantención del sistema nervioso. Recientemente, la pérdida de la actividad transcripcional de STAT3 ha sido ligada a la EA. En este trabajo, tratamos astrocitos primarios con los oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), los cuales muestran una potente actividad sinaptotóxica, y estudiamos los efectos de los mediadores presentes en el medio condicionado de astrocitos tratados con AβOs (MCA+AβOs) en la depleción nuclear de STAT3 fosforilado en el residuo 727 (pSer-STAT3) en las neuronas. El tratamiento de los cultivos neuronales ricos en astrocitos con 0,5 μM de AβOs indujo en las neuronas una disminución significativa de pSer-STAT3, pero no de fosfotirosina 705-STAT3, la otra forma fosforilada de STAT3. Esta disminución no ocurrió en cultivos neuronales pobres en astrocitos revelando un rol fundamental de los astrocitos en esta respuesta. Para probar si los mediadores, liberados por los astrocitos en respuesta a los AβOs, induce la depleción nuclear de pSer-STAT3, cultivos neuronales pobres en astrocitos fueron tratados con MCA+AβOs, lo que causó depleción nuclear de pSer-STAT3 pero no modificó los niveles totales de STAT3. El uso de catalasa y hemoglobina extracelular previno la depleción nuclear de pSer-STAT3 causada por el MCA+AβOs, indicando que posiblemente el peróxido de hidrógeno y el óxido nítrico son los mediadores liberados por los astrocitos involucrados en esta respuesta. Además, el MCA+AβOs indujo un aumento significativo de la espresión y la secreción de la citoquina pro-inflamamtoria IL-6. El MCA+AβOs aumentó el tono oxidativo neuronal y generó en las neuronas señales de calcio mediadas por el receptor de ryanodina, que son esenciales para la depleción nuclear de pSer-STAT3. Usando adenovirus, se demostró que la inhibición de calcineurina abolió la depleción nuclear de pSer-STAT3 inducida por el MCA+AβOs: También se demostró que la activación de calcineurina produjo un leve aumento de la depleción nuclear y mayor defosforilación de pSer-STAT3 en las neuronas, revelando que si bien calcineurina participa en la depleción nuclear de pSer-STAT3, no es el único componente involucrado en el proceso. En suma, el MCA+AβOs generó una disminución significativa de los niveles de ARNm de genes de sobrevivencia Bcl-2 y survivina y un aumento de la razón pro-apoptótica Bax/Bcl-2. No obstante, el MCA+AβOs no promovió la apoptosis por si solo. El MCA+AβOs sensibilizó a la neuronas hacia la muerte apoptótica pero solo en presencia de NMDA a concentraciones excitotóxicas. Esta es la primera descripción que el MCA+AβOs promueve señales de calcio neuronales que regulan la distribución nuclear de pSer-STAT3 en las neuronas. En esta tesis se propone que los AβOs inducen la producción de peróxido de hidrógeno, óxido nitric e IL-6, lo cual aumenta el tono oxidativo neuronal, generando una señal de calcio que activa la fosfatasa calcineurina, la cual causa (en parte) la depleción nuclear de pSer-STAT3 y la pérdida de la actividad transcripcional protectora de STAT3.<br>Oxidative stress and dysregulation of calcium signaling are pivotal signs in a variety of neurodegenerative diseases, including Alzheimer´s disease (AD). The transcription factor STAT3 has a crucial role in the development and maintenance of the central nervous system. Recently, the loss of transcriptional activity of STAT3 has been linked to AD. In this work, we treated astrocytes with amyloid beta peptide oligomers (AβOs), which display potent synaptotoxic activity, and studied the nature and effects of astrocyte-conditioned medium treated with AβOs on the nuclear depletion of neuronal serine-727-phosphorylated STAT3 (pSer-STAT3). Treatment of mixed neuron-astrocyte cultures with 0.5 μM AβOs induced in neurons a significant decrease of nuclear pSer-STAT3, but not of phosphotyrosine-705 STAT3, the other form of STAT3 phosphorylation. This decrease did not occur in astrocyte-poor neuronal cultures revealing a pivotal role for astrocytes in this response. To test if mediators released by astrocytes in response to AβOs induce pSer-STAT3 nuclear depletion, we used conditioned medium derived from AβOs-treated astrocyte cultures (ACM+AβOs). Treatment of astrocyte-poor neuronal cultures with ACM+AβOs caused pSer-STAT3 nuclear depletion but did not modify overall STAT3 levels. Extracellular catalase and haemoglobin prevented the pSerSTAT3 nuclear depletion caused by AβOs, indicating that reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide could mediate this response. Besides, ACM+AβOs produced an increase of production and secretion of the pro-inflamamtory cytokine IL-6. Also, ACM+AβOs increased the neuronal oxidative tone and calcium signals in neurons, leading to a ryanodine-sensitive intracellular calcium signal that proved to be essential for pSer-STAT3 nuclear depletion. Using adenoviruses we showed that calcineurin inhibition abolished the nuclear depletion of pSer-STAT3 induced by ACM+AβOs and that calcineurin activation produced just a mild increase of the nuclear depletion of pSer-STAT3 in neurons, revealing that calcineurin participate in nuclear depletion of pSer-STAT3, however, it is not the only component involved in the process. In addition, ACM+AβOs generated decreased Bcl-2 and Survivin transcription and significantly increased Bax/Bcl-2 ratio but ACM+AβOs did not execute apoptosis itself. ACM+AβOs sensibilized neurons to apoptotic death when it was incubated in presence of NMDA at an excitotoxic concentration. This is the first description that ACM+AβOs and neuronal calcium signals jointly regulate pSer-STAT3 nuclear distribution in neurons. We propose that AβOs induce hydrogen peroxide, nitric oxide and IL-6 production, which by increasing the neuronal oxidative tone, generate a calcium signal that activates the phosphatase calcineurin, which cause (in part) pSer-STAT3 nuclear depletion and loss of STAT3 protective transcriptional activity.<br>-Beca CONICYT doctorado nacional N°21130445 y extensión de beca doctoral. -Proyecto Anillo ACT-1114 del Programa de investigación asociativa de CONICYT (PIA, adjudicado por el Dr. Marco Tulio Núñez) -Proyecto FONDECYT 1150736 (adjudicado por la Dra. Andrea Paula-Lima) -Proyecto FONDECYT 1130068 (adjudicado por el Dr. Marco Tulio Núñez) -Becas CONICYT de asistencia a congresos N°81140457 (2014) y N°81150376 (2015) También quiero agradecer a las siguientes instituciones internacionales que gracias a sus becas me permitieron asistir a diferentes cursos de neurociencia y a congresos internacionales de alto nivel: -International Society for Neurochemistry (ISN) por el financiamiento completo para asistir al curso “3rd ISN Latin American School of Advanced Neurochemistry” (Montevideo, Uruguay, 2014) y la beca para asistir al congreso “26th ISN-ESN biennal meeting” en Paris, Francia (2017). -International Brain Research Organization (IBRO) por el financiamiento completo para asistir al curso “IBRO-USCRC 10th Canadian School of Neuroscience” (Montreal, Canadá, 2016) y al congreso “10th Annual Canadian Neuroscience Meeting” en Toronto (2016) y por la beca para asistir al congreso “13th Conference Alzheimer and Parkinson Disease” en Viena, Austria (2017). -Francais Société des Neurosciences-IBRO quienes financiaron mi viaje a Bordeaux, Francia para asistir al congreso “NeuroFrance 2017” y buscar postdoc. -Grass Foundation, IBRO LATP y USCRC y a Society for Neuroscience quienes financiaron mi beca completa para participar en el curso: “Latinoamerican Training program 2018” en Valparaíso, Chile y quienes financiarán mi participación en el congreso Society for Neuroscience 2019 en Chicago, EEUU.<br>Diciembre 2019

Trabalho final de mestrado integrado em Medicina área científica de Farmacologia, apresentado á Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra<br>O abuso de metanfetamina tornou-se uma epidemia à escala global, sendo um importante problema de saúde pública. Assim, é imperativo caracterizar melhor o perfil neurotoxicológico da metanfetamina de forma a propor novas estratégias para o tratamento da dependência desta droga. Objectivos: Neste artigo de revisão propõe-se uma abordagem da gliose que se pensa estar na base das alterações metabólicas e estruturais no cérebro de consumidores adultos de metanfetamina e ex-consumidores. Estudos pré-clínicos que olharam especificamente para as alterações gliais induzidas pela metanfetamina foram também revistos. Descrição da revisão: Os estudos efectuados por imagiologia cerebral (Ressonância Magnética) em cérebros de humanos adultos em abstinência de metanfetamina mostraram volumes estriatais aumentados bem como alterações na matéria branca, no córtex parietal, hipocampo e tálamo compatíveis com gliose. Consistentemente, estudos efectuados com recurso a Tomografia por Emissão de Positrões demonstraram alterações no metabolismo cerebral da glicose em consumidores em abstinência de metanfetamina no córtex parietal e frontal, neocórtex, tálamo e estriado. Este facto é sugestivo de reactividade das células da glia. No entanto, autópsias de consumidores de metanfetamina mostraram resultados inconsistentes com os anteriores, já que demonstraram que a reactividade das células gliais era rara. Estudos pré-clínicos em roedores mostraram consistentemente alterações no cérebro exposto de forma aguda e crónica a metanfetamina, com particular relevância para a reactividade das células gliais devida a toxicidade provocada por esta droga. Conclusões: Os resultados obtidos em estudos em modelos pré-clínicos sobre a toxicidade da metanfetamina suscitaram estudos sobre alterações idênticas no cérebro humano. Estudos de imagiologia cerebral mostraram alterações no cérebro de consumidores adultos de metanfetamina, particularmente no estriado, na substância branca, córtex parietal e hipocampo que foram interpretadas maioritariamente como sendo devidas a gliose reactiva. Contudo, um estudo post-mortem não estava em consonância com os resultados anteriores. Como ainda permanecem muitas questões e os estudos clínicos tinham algumas limitações (amostra pequena, heterogeneidade entre grupos, consumo de outras drogas, entre outros), mais estudos in-vivo e post-mortem em consumidores de metanfetamina afiguram-se necessários. É também fundamental avaliar o impacto das estratégias terapêuticas na dependência à metanfetamina nas células gliais<br>Methamphetamine abuse has become a global epidemic and is an important public health issue. For that matter, it is imperative to discover ways to prevent methamphetamine-induced toxicity in order to propose new strategies for the treatment of this drug dependence. Aims: In this review we propose an approach of gliosis thought to be the basis of structural and metabolic changes in the brain of adult methamphetamine abusers and former abusers. Preclinical studies that looked specifically for glial changes induced by methamphetamine have also been reviewed. Discussion: Studies performed by brain imaging (Magnetic Resonance Imaging) in adult former methamphetamine abusers brain showed increased striatal volumes as well as changes in white matter, parietal cortex, hippocampus and thalamus, consistent with gliosis. Consistently, studies using Positron Emission Tomography showed changes in glucose brain metabolism in parietal and frontal cortex, neocortex, thalamus and striatum of abstinent methamphetamine abusers. This fact suggests glial cells reactivity. However, when comparing the previous studies with those of methamphetamine abusers autopsies, the results were inconsistent since they showed rare glial reactivity. Preclinical studies in rodents have consistently shown changes in the brain exposed to acute and chronically to methamphetamine, with particular relevance to the reactivity of glial cells due to toxicity caused by this drug. Conclusions: Preclinical studies results of methamphetamine toxicity evoked new studies about similar alterations in the human brain Cerebral neuroimaging studies showed brain modifications in methamphetamine abusers, particularly in the striatum, white matter, parietal cortex and hippocampus which were interpreted mostly as being due to reactive gliosis. However, a post mortem study was not in consonance with former results. Because many questions still remain and the trials had a few limitations (small size of sample, sex-heterogeneity in groups, exposure to other drugs, among others), more in vivo and post mortem studies of methamphetamine abusers are indispensable. It is also of particular interest to evaluate the impact of therapeutic strategies on glial cells on methamphetamine dependence

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014<br>Há muitos mais astrócitos do que neurónios no cérebro. Os astrócitos envolvem as dendrites, os axónios e as sinapses, estando por isso localizados em regiões centrais à transmissão da informação. Em vez de gerarem ou propagarem potenciais de acção (como acontece com os neurónios), os astrócitos possuem uma forma de sinalização dependente de flutuações dos níveis de cálcio no citosol. Este mecanismo, que ocorre espontaneamente, mas que também pode ser despoletado pela actividade neuronal, envolve a produção de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e a consequente activação dos seus receptores (IP3R), presentes no retículo endoplasmático (reservatório de cálcio intracelular). A família de receptores de IP3 é composta por três isoformas, mas dados experimentais sugerem que apenas uma dessas isoformas, a de tipo 2, seja expressa em astrócitos e não há evidência de que exista em neurónios. Sabe-se agora que os astrócitos também possuem toda a maquinaria necessária à libertação vesicular de transmissores químicos (gliotransmissores), através de exocitose dependente de cálcio. Apesar das inúmeras evidências sugerindo a interacção dos astrócitos com os terminais pré e pós sinápticos que estiveram na génese do conceito de sinapse tripartida, a importância dos transientes de cálcio nos astrócitos e da libertação de gliotransmissores é, ainda, muito controversa. Um primeiro objectivo dos meus estudos de Doutoramento relacionou-se com a investigação das possíveis contribuições da sinalização nos astrócitos para a função cerebral. Colocou-se como hipótese subjacente a estas experiências que a sinalização de cálcio nos astrócitos modularia a plasticidade sináptica e a dinâmica das redes neuronais. A ser esse o caso, da abolição das elevações de cálcio nos astrócitos através da eliminação dos receptores IP3 de tipo 2, esperar-se-ia uma alteração nas respostas fisiológicas que afectasse a capacidade dos animais realizarem tarefas comportamentais complexas. Nesta tese apresento evidências experimentais de que a sinalização nos astrócitos é necessária para a plasticidade dos circuitos neuronais, contribuindo, nomeadamente, para a retenção de memórias e recordações. Aqui se mostra, também, através de um projecto de colaboração, que a libertação vesicular de gliotransmissores pode afectar as oscilações da rede neuronal, em particular as de frequência rápida- oscilações gama. Pensa-se que as oscilações gama sejam cruciais para as capacidades cognitivas e a sua destabilização é frequentemente observada em doenças do sistema nervoso central, como a esquizofrenia e o autismo. Evidências anteriores sugerem que o controlo inibitório dos neurónios principais através dos interneurónios de disparo rápido que expressam parvalbumina (PV) é, também, fundamental para a existência de ritmos gama normais. Estas células são particularmente sensíveis ao stress oxidativo durante o seu período de maturação, que em ratinhos acontece na segunda semana após o nascimento. Em particular, manipulações que normalmente causam alterações reversíveis no fenótipo dos interneurónios parvalbuminérgicos em ratinhos adultos, desencadeiam alterações permanentes quando realizadas durante o período perinatal. É o caso da activação da via da IL6/Nox2, desencadeada pela exposição repetitiva ao antagonista dos receptores NMDA, quetamina, o que, por sua vez, conduz a uma diminuição da expressão de PV e da enzima que sintetiza o neurotransmissor inibitório GABA, GAD67. Neste trabalho investiguei, também, se essa vulnerabilidade poderia constituir um substrato para alterações celulares e sinápticas que pudessem conduzir a alterações permanentes das redes e sistemas. Os resultados obtidos mostraram que a diminuição dos marcadores inibitórios, desencadeada pela exposição à quetamina durante a segunda semana pós-natal, estava correlacionada com uma diminuição da excitabilidade dos neurónios parvalbuminérgicos e a consequente desregulação da sua capacidade de controlo inibitório sobre os neurónios principais. Mais, as alterações sinápticas iniciadas pela quetamina durante a infância foram suficientes para induzir alterações significativas na dinâmica da rede neuronal, em particular nas oscilações gama, em fase ulterior de desenvolvimento. Devido à curta semivida da quetamina, este trabalho sugere que a destabilização temporária dos receptores NMDA durante a maturação dos neurónios parvalbuminérgicos possa estar na génese das alterações observadas em diversas doenças neuropsiquiátricas. Dados obtidos recentemente no nosso laboratório sugerem que, à semelhança do que acontece com o bloqueio farmacológico dos receptores NMDA, a eliminação do receptor metabótropico de glutamato mGluR5 em neurónios parvalbuminérgicos (PV-mGluR5) também conduzia à diminuição da expressão de PV e GAD67 em várias regiões cerebrais, incluindo o hipocampo. No presente trabalho verifiquei que tal efeito era acompanhado de uma redução funcional das projecções inibitórias para as células piramidais, sem que tal comprometesse significativamente a plasticidade sináptica no hipocampo. Investigações futuras poderão clarificar se a atenuação da expressão de PV e GAD67 observada no mutante PV-mGluR5 se reflecte na dinâmica da rede neuronal e quais os mecanismos de sinalização que contribuem para tal efeito. Apesar do mecanismo patofisiológico referido anteriormente ser desencadeado pela libertação de IL-6, e de estarem documentados muitos outros efeitos nefastos produzidos por esta citoquina na função cerebral, também lhe foram atribuídas diversas acções neuroprotectores. Estas acções paradoxais motivaram o meu interesse em estudar como é que um mediador inflamatório como a IL-6 poderia ter efeitos benéficos no cérebro. A indicação prévia de que a IL-6 aumentaria a expressão de receptores A1 da adenosina nos astrócitos, levou-me a participar num trabalho de colaboração em que se investigou se os efeitos benéficos da IL-6 poderiam ser devidos à amplificação das acções mediadas pelos receptores A1 da adenosina expressos nos neurónios, cujos efeitos neuroprotectores são sobejamente conhecidos. Os dados obtidos mostraram que os efeitos benéficos da IL-6 eram, pelo menos em parte, indirectos, confirmando a hipótese de que esta citoquina eleva a expressão de receptores A1 em neurónios, potenciando por esta via as suas acções na transmissão sináptica e na neuroprotecção.<br>Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/18046/2004/ e SFRH/BD/21589/2005); School of Behavioral Cognitive Neurosciences (BCN)