Dissertations / Theses on the topic 'Autolyse cellulaire'

Le comté, fromage à pâte pressée cuite, est aujourd'hui, le premier fromage français d'appellation d'origine contrôlée (AOC) par sa production annuelle. La maturation du lait avec ensemencement en lactocoques constitue la première étape de la fabrication. Elle est conduite par les fromagers avec beaucoup d'empirisme par manque de connaissances sur son rôle et son mode d'action. L'objectif de ce travail était de mettre en évidence et de comprendre le rôle des lactocoques au cours de la fabrication. Dans un premier temps, la diversité de souches sauvages de lactocoques, isolées de lait cru et de levains naturels, a été démontrée aux niveaux phénotypique et génotypique. L'étude de leur comportement sur le cycle thermique de type comte a permis de sélectionner des souches de propriétés différentes pour constituer un levain mésophile. Des mini-fabrications de type pate pressée cuite ont été réalisées avec ensemencement ou non de lactocoques pendant la maturation du lait. Elles ont permis de mettre en évidence l'influence des lactocoques sur la croissance des lactobacilles thermophiles (par la réduction de leur temps de latence) et, dans une moindre mesure, sur celle des streptocoques thermophiles, en début de pressage. La consommation (lactose puis glucose et galactose) et la production des sucres (galactose et glucose) se sont révélées plus rapides, voire plus précoces, avec une production concomitante de lactates pendant le pressage du fromage. Cette stimulation des levains thermophiles s'est traduite par une nette accélération de la cinétique d'acidification sous presse quel que soit le niveau de flore indigène du lait. En revanche, l'analyse de la protéolyse au cours de la fabrication n'a pu mettre en évidence aucune modification du lait pendant la maturation du lait ensemence en lactocoques, seule la stimulation de la croissance des lactobacilles thermophiles pendant le pressage semble pouvoir expliquer une augmentation de la protéolyse sous presse. Les investigations pour comprendre le mode d'action des lactocoques ont permis de confirmer que la durée de la maturation du lait module l'effet des lactocoques pendant la fabrication, que la lyse des lactocoques sous presse semble avoir lieu et influencer positivement la croissance des levains thermophiles sans l'expliquer en totalité. Par contre, si la capacité réductrice des lactocoques a été observée sur le lait au cours du cycle thermique type comte, il n'a pu être démontré qu'elle influençait la croissance des lactobacilles thermophiles.

Douze des 118 souches de Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus de la collection CNRZ présentent une phase lytique après induction avec la mitomycine C et contiennent des phages actifs. Les phages temperés correspondants ont été multipliés sur des souches indicatrices et comparés à 56 phages isolés comme lytiques. Toutes les souches lysogènes se caractérisent par des propriétés autolytiques, dans certaines conditions de cultures. Du point de vue morphologique, les 69 phages étudiés, temperés ou virulents, appartiennent tous au groupe B de la classification de Bradley (1967) ou a la famille des Siphoviridae de l'International Committee on Taxonomy of Viruses (Matthews, 1982). Les profils protéiques des virions sont de 2 types. Les ADN phagiques sont pour la plupart linéaires, avec des extrémités cohésives et leur taille varie de 35 a 50 kb. Ils présentent un polymorphisme de restriction important. De l'homologie existe entre tous les ADN phagiques, en particulier entre les ADN des phages tempers et ceux des phages virulents. L'étude des interactions phages-bactéries a montré que certaines des souches lysogènes sont sensibles aux surinfections par de nombreux phages et que ces souches remanient alors le génome des phages infectants. Les résultats obtenus suggèrent que les souches lysogènes de S. Salivarius subsp. Thermophilus pourraient jouer un rôle majeur dans la genèse des infections phagiques et dans l'évolution de la population phagique spécifique de ce streptocoque<br>Twelve of the 118 strains of Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus of the CNRZ collection exhibited a Iytic phase after mitomycin C induction and contained active phages. The corresponding temperate phages were multiplied on indicator strains and compared to 56 phages isolated as Iytic. All Iysogenic strains were characterized by autolytic properties in certain conditions of culture. Morphologically, the 69 temperate or virulent phages studied all belonged to Bradley's (1967) group B, or to the family of the Siphoviridae of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Matthews, 1982). There were 2 types of virion protein profiles. Most phage DNA were linear with cohesive ends, and size varied trom 35 to 50 kb. There was considerable restriction polymorphism. Homology existed among all phage DNA, in particular between the DNA of temperate phages and those of virulent phages. The study of phage-bacteria interactions showed that some Iysogenic strains were sensitive to superinfections by numerous phages and that in this case, these Iysogenic strains rearranged the genome of infecting phages. The results suggest that Iysogenic strains of S. Salivarius subsp thermophilus could play a major role in the genesis of phage infections and in the evolution of the phage population specific to this streptococcus

Cette étude a été entreprise dans le but de mieux comprendre, et donc de mieux maitriser la qualite organoleptique des vins veilllis sur lies, et eventuellement afin de trouver un moyen d'acélérer ce phénomène. On etudie l'evolution quantitative de l'azote total et soluble, de l'activite proteolytique et des substances volatiles liberees par les levures au cours de l'autolyse. Une etude qualitative et quantitative separee des composes volatils neutres, acides et souffres a ete effectuee en utilisant principalement la chromatographie en phase gazeuse et la spectrometrie de masse commes techniques de separation et d'identification. Dans le but de separer les phenolenes de vieillissement classique et d'autolyse, on utilise deux milieux synthetiques de compositions differentes dans lesquels les levures ont ete ajoutees. L'un est proche du mout et subit une fermentation prealable, alors que l'autre est proche d'un vin blanc sec et contient des levures ajoutees. Les influences d'un ajout d'autolysats obtenus par chauffage à 35° C ou par broyage ainsi que la quantité d'autolysat rajouté ont été systématiquement étudiées.

La diversité moléculaire de 220 souches de leuconostoc a été analysée par rapd. Cinq groupes ont été définis regroupant la majorité des souches étudiées. Cette technique a également permis de distinguer les souches de ln. Citreum. Des séquences d'adnr 16s et des hybridations in situ utilisant une sonde spécifique du genre leuconostoc (sauf ln. Fallax) ont permis i) d'établir une collection de souches correctement identifiées et ii) de confirmer la classification des souches aux profils rapd atypiques. Un test pcr, base sur des amorces spécifiques ciblant les régions variables des adnr 16s, a été développé. Il permet d'identifier rapidement et précisément les souches de ln. Mesenteroides, ln. Citreum, ln. Lactis et w. Paramesenteroides. Le comportement autolytique de 59 souches de leuconostoc a été étudié. Le taux d'autolyse est variable selon les souches et compris entre 7 et 44%. Deux bandes majeures correspondant aux peptidoglycane hydrolases (pgh) ont été détectées par SDS-PAGE renaturante. L'analyse de spécificité a révélé deux types de PGH : une glycosidase et une amidase (ou une peptidase). Le gène (lnmur) de ln citreum 22R, codant pour une PGH, a été clone et séquence. Lnmur a une masse moléculaire de 23,9 kDa et ne possède pas de séquence spécifique permettant son ancrage a son substrat. Une protéine chimère composée de lnmur et de la partie C-terminale de AcmA de L. Lactis a été construite. Cette enzyme est capable de complémenter une mutation de acmA chez l. Lactis.

De nombreux phénomènes enzymatiques interviennent au cours de l'élevage des vins. Des expériences d'élevage en milieu modèle ont montré une libération de mannoprotéines et peptides pariétaux au cours de l'autolyse. La libération de ces derniers est favorisée par la présence de préparations enzymatiques industrielles. Les activités enzymatiques impliquées dans ce phénomène sont des protéases acides. Les peptides de bas poids moléculaire (0,5-3 kDa) libérés sont sapides et présents à des concentrations supérieures au seuil de perception. Neuf expérimentations d'élevage sur lies en vin rouge ont été réalisées au cours de ces travaux et quel que soit le protocole employé (quantité de lies, d'enzymes, moment de leur addition), l'analyse de la couleur, des polyphénols et la dégustation n'ont révélé aucune différence. L'absence d'effet des enzymes exogènes est en partie due à une inhibition totale des activités β-1,3-glucanase et protéases en moins de 30 jours. Une expérimentation en vin blanc réalisée en présence d'une quantité d'enzyme 10 fois supérieure à celle généralement utilisée a permis de mettre en évidence une libération plus importante de mannoprotéines et de peptides. Dans ces conditions particulières, l'addition de préparations à forte activité protéolytique contribue à modifier les caractéristiques organoleptiques de ce vin blanc. D'autre part, l'effet de préparations enzymatiques exogènes et d'activités purifiées issus d'A. Niger ou de T. Harzianum sur la clarification et la filtrabilité de vins blanc et rouge a été mesuré. Le rôle des pectinases et éventuellement d'autres activités secondaires issues d'A. Niger comme celui de la β-1,3-glucanase de T. Harzianum est prépondérant dans l'amélioration de ces phénomènes. La protéase ou d'autres activités secondaires issues de T. Harzianum sont également impliquées dans l'amélioration de la filtrabilité mais sans effet sur la sédimentation<br>Many enzymatic phenomena intervene during wine ageing. The autolysis experiments in synthetic medium showed the release of mannoproteins and parietal peptides. The release of the latter is enhanced by the presence of industrial enzymatic preparations. The enzymatic activities implied in this phenomenon are acid proteases. Peptides of low molecular weights (0,5-3 kDa) that are released have taste and are present at higher concentrations than their sensory treshold. Nine experiments of red wine aged on lees red were carried out during this work and whatever the protocol employed (quantity of lees or enzymes, positioning of their addition), the analysis of the color, polyphenols and tasting did not reveal any difference. The absence of effect of the exogenic enzymes is partly due to a total inhibition of the β-1,3-glucanase activities and proteases in less than 30 days. A white wine experimentation realized in the presence of a quantity of enzyme 10 times higher thanthat generally used made it possible to highlight a more important release of mannoproteins and peptides. Under these partcular conditions, the addition of preparations with strong proteolytic activity contributes to modify the organoleptic characteristics of this white wine. In addition, the effect of exogenic enzymatic preparations and purified activities from A. Niger or T. Harzianum on the clarification and the filterability of white and red wines was measured. The role of the pectinases and possibly of other secondary activities resulting from A. Niger or β -1,3-glucanase of T. Harzianum are dominating in the improvement of these phenomena. The protease of other secondary activities of T. Harzanium are also implied in the improvement of filterability but have no effects on sedimentation

Autolyse des levures au cours de leur vieillissement dans le champagne accompagnée par un enrichissement du vin en matières azotées. Certaines souches de levure s'autolysent plus facilement et permettent un vieillissement plus rapide du vin (saccharomyces cerevisiae, souche 001, par exemple). Accélération de l'autolyse si la préparation du levain se fait sur vin, en semi anaérobiose, en présence de phosphate diammonique et si les levures sont prélevées en phase stationnaire de croissance. Accélération du vieillissement des vins si des cellules agées ou des broyats de levures sont ajoutés au moment de la mise en bouteilles. Autolyse accélérée des levures, produite in vitro, en présence d'ethanol, met en évidence un appauvrissement en matières azotées, et un enrichissement en sucres des parois de levures et l'apparition d'une activité protéosique intracellulaire dosée à pH 3,7.

L'inhibition de clostridium acetobutylium atcc 824 par ses autobacteriocines a ete etudiee. Ces dernieres sont produites en fin de phase exponentielle de croissance et affectent la concentration cellulaire maximale et la vitesse de lyse en fin de culture. Les autobacteriocines ont ete purifiees et caracterisees. Il s'agit d'une amylase et d'une enzyme lytique. L'amylase est une endo--amylase a calcium qui n'est pas inhibitrice de croissance dans les conditions normales de culture en milieu liquide. L'enzyme lytique est une muramidase dont l'activite est strictement dependante de la non-acetylation du peptidoglycane. Elle possede une forte affinite pour les parois de c. Acetobutylicum debarrassees totalement ou en partie de leur proteines. L'autolysine impliquee dans l'autolyse cellulaire du microorganisme a ete purifiee et identifiee a la muramidase extracellulaire. L'etude de l'effet des cations sur l'autolyse cellulaire, conjugue a l'inhibition de l'activite autolytique par les acides lipoteichoiques purifies ont permis de proposer un mecanisme de regulation in vivo du systeme autolytique. Ce mecanisme est en accord avec les resultats obtenus lors de cultures discontinues et continues realises en presence d'exces de cations bivalents. De telles cultures qui conduisent a une faible concentration en autolysines extracellulaires permettent d'ameliorer les performances de la fermentation acetonobutylique

La principale partie de ce travail porte sur l'étude du facteur SigD de C. Difficile et de son implication dans la régulation de l'autolyse, de la mobilité et de la production de ses deux facteurs majeurs de virulence, les toxines A et B. Nous avons pu montrer, par inactivation du gène sigD, que SigD régule positivement la mobilité de C. Difficile mais n'affecte pas, ou peu son autolyse. Le régulon global de SigD a été ensuite déterminé par une analyse transcriptonique en microarrays. Parmi les gènes sous-exprimés chez le mutant du gène sigD, nous retrouvons les gènes flagellaires tardifs, les gènes des toxines A et B et le gène de leur régulateur TcdR. Nous avons pu identifier des promoteurs SigD-dépendants notamment en amont des gènes de la flagelline FliC, de l'anti-SigD FlgM et deTcdR. De plus, nous avons prouvé que SigD se lie avec l'ARN polymérase pour démarrer la transcription de tcdR, dont il est un régulateur direct. Par ailleurs, nous avons identifié une séquence consensus propre au régulateur SigD chez C. Difficile. Enfin, nous avons déterminé le rôle antagoniste de FlgM, l'anti-SigD, dans la répression des gènes SigD dépendants. SigD s'avère être un régulateur positif et direct de la mobilité et de la synthèse des toxines chez C. Difficile. Une partie complémentaire du travail s'intéresse aux autolysines Acd et Cwp19 de C. Difficile. Des mutants simples des gènes acd et cwp19 ont permis de montrer que seule Cwp19 intervient dans l'autolyse de C. Difficile en présence du TritonX-100. Cette autolysine est impliquée dans la lyse à long terme chez C. Difficile. Un double mutant acd-cwp19 semble avoir le même profil autolytique que le simple mutant cwp19. La glucosaminidase Acd ne semble donc pas avoir une implication majeure dans l'autolyse de C. Difficile. Des analyses complémentaires en cours de réalisation permettront de déterminer l'activité enzymatique de l'autolysine Cwp19<br>The main part of this work focuses on the characterization of the C. Difficile SigD factor and its role in the regulation of autolysis, motility and production of the two major virulence factors, toxins A and B. After the inactivation of sigD, we show that SigD factor positively controls C. Difficile motility whereas its contribution to the autolysis, if any, is modest. The global regulon of SigD was then determined by transcriptonic analysis using microarrays. Among the down-regulated genes in the sigD mutant strain, we find the late flagellar genes, the genes encoding toxins A and B and the gene encoding their regulator TcdR. We could identify SigD-dependent promoters upstream many genes including those encoding the flagellin FliC, the anti-SigD FlgM, and TcdR. In addition, we proved that SigD binds with RNA polymerase to initiate the transcription of tcdR. Furthermore, we identified a specific SigD-dependent consensus sequence in C. Difficile. Finally, we determined the antagonistic role of FlgM, the anti-SigD, in the repression of SigD-dependent genes. We prove that SigD is a positive and direct regulator of motility and toxin synthesis in C. Difficile. Another part of the work focuses on the autolysins Cwp19 and Acd of C. Difficile. Single mutants for acd and cwp19 genes showed that only Cwp-19 is involved in the long-term lysis of C. Difficile. A double-mutant acd-cwp19 seems to have the same autolytic profile as cwp19 single mutant. The glucosaminidase Acd does not seem to have a major involvement in autolysis of C. Difficile. Additional analyzes are in progress to determine the enzymatic activity of the Cwp19 autolysin

L'autophagie est un processus d'autodigestion qui se produit dans toutes les cellules eucaryotes et conduit à la dégradation d'éléments du cytoplasme (organites, macromolécules) par le lysosome. Ce mécanisme, qui se produit de manière basale, permet le renouvellement du contenu cytoplasmique mais également la survie cellulaire lorsqu'il est induit par différents stress (carence nutritionnelle, hypoxie…). L'autophagie est alors impliquée dans diverses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer car sa dérégulation peut grandement perturber l'homéostasie cellulaire. Le but de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine nucléaire et cytoplasmique BAT3 dans l'autophagie et d'étudier son mécanisme de régulation. Cette protéine de 150 kDa, également appelée BAG6 ou Scythe, est composée de nombreux domaines protéiques (UBL, Prolin-rich, NLS, BAG) qui lui permettent d'interagir avec de multiples partenaires. Sa fonction majeure réside dans le contrôle qualité du cytoplasme mais BAT3 est aussi impliquée dans l'immunité ou l'apoptose. Ce travail identifie la protéine BAT3 comme essentiel pour l'autophagie basale et induite. Nous montrons que son mécanisme d'action passe par la régulation de la localisation de l'acétyltransférase p300 et l'acétylation de ces substrats : p53 et une protéine de la machinerie de l'autophagie : ATG7. En effet, BAT3 (i) limite la présence de p300 dans le cytosol en (ii) maintenant un faible et régulable niveau d'acétylation d'ATG7 et (iii) permet l'acétylation de p53 dans le noyau au cours de la carence nutritionnelle, événement indispensable à l'induction de l'autophagie<br>Autophagy, literally meaning self-eating, is a highly evolutionary conserved process in eukaryotes in which parts of the cytoplasm (organelles, macromolecules) are degraded by lysosomes. Basal autophagy is a quality control mechanism allowing the renewal of the cytoplasm but autophagy is also induced by cellular stress (starvation, hypoxia…) to improve cell survival. Autophagy has been implicated in several physiopathologies such as cancer or neurodegenerative diseases. Deregulations of autophagy may profoundly affect homeostasis.The purpose of my thesis is to explore the role of the nucleo-cytoplasmic shuttling protein BAT3 in autophagy and the mechanism of BAT3-dependent autophagy.Also known as BAG6 or Scythe, this 150 kDa protein is composed of various domain (UBL, Prolin-Rich, NLS, BAG) by which BAT3 interacts with multiple partners. The major of role BAT3 seems to be the protein quality control but BAT3 is also implicated in immunity and apoptosis. Our work demonstrates that the protein BAT3 is essential for basal and starvation-induced autophagy. We show that BAT3 regulation of autophagy is mediated by the modulation of p300 acetyltransferase intracellular localization and acetylation of two subtrates: p53 and the autophagy-related protein ATG7. Indeed, Bat3 allows: (i) the limitation of p300 into cytosol resulting in (ii) the maintenance of a low level of ATG7 acetylation and (iii) the increase of the starvation-induced p53 autophagy leading to the induction of autophagy

L’étude du système autolytique de Staphylococcus lugdunensis a donné lieu à la description de l’autolysine bifonctionnelle AtlL. Cette enzyme est constituée de deux domaines catalytiques (l’un à activité N-acétylmuramyl-L-alanine amidase et l’autre à activité N-acétylglucosaminidase) reliés par trois domaines répétés (AtlLR1-AtlLR3). Afin d’étudier les rôles de cette autolysine, un mutant délété pour le gène atlL a été construit. Ce mutant présente un défaut de séparation cellulaire, une paroi rugueuse ainsi qu’une sensibilité diminuée à la lyse induite par le triton X-100. De plus, nous avons montré qu’il était plus résistant que la souche parentale à la lyse et à la mort induites par la pénicilline et les glycopeptides. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence qu’AtlL était impliquée dans la virulence de S. Lugdunensis puisque cette autolysine joue un rôle dans la formation de biofilm et que la souche mutante présente une virulence atténuée comparativement à la souche sauvage dans le modèle d’infection du nématode de Caenorhabditis elegans. Enfin, en séquençant des fragments au sein des domaines répétés d’atlL, un polymorphisme a été mis en évidence ; atlLR2 et atlLR3 ont alors été intégrés dans un schéma de Multi-Virulence-Locus Sequence Typing élaboré comme un outil épidémiologique pour le suivi des infections à S. Lugdunensis et la caractérisation de lignées phylogénétiques chez cette espèce de staphylocoque à coagulase négative de virulence inhabituelle<br>The study of the Staphylococcus lugdunensis autolytic system has led to the description of the bifunctional AtlL autolysin. This enzyme displays two enzymatic domains (an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and an N-acetylglucosaminidase) connected by three repeated domains (AtlLR1-AtlLR3). To investigate the roles of this autolysin, a ΔatlL mutant was constructed. This mutant is defective in cell separation, has a rough outer cell surface and a decreased susceptibility to lysis induced by Triton X-100. Moreover, this mutant appears to be more resistant to penicillin- and glycopeptides-induced cell lysis and death. Furthermore, we highlighted that AtlL is involved in S. Lugdunensis virulence as this autolysin plays a role in biofilm formation and as the mutant strain shows attenuated virulence using the Caenorhabditis elegans nematode model. Finally, by sequencing fragments in atlL repeated domains, a polymorphism was identified; atlLR2 atlLR3 were then included into a Multi-Locus-Sequence Typing Virulence scheme developed to study short term epidemiology and further characterize lineage of this rare but highly pathogen, S. Lugdunensis

L'autophagie est une voie majeure de dégradation et de recyclage des constituants cytoplasmiques. C'est également un mécanisme de l'immunité innée et adaptative. Au cours de l'infection par le VIH-1, l'autophagie est déclenchée dans les lymphocytes T CD4 non infectés après contact avec les glycoprotéines d'enveloppe virale (Env). Cette autophagie participe alors à l'induction de l'apoptose dans ces cellules, mécanisme connu pour être responsable de la disparition des lymphocytes T CD4 au cours de l'infection, et donc de l'évolution vers la phase SIDA. Nos travaux ont permis de montrer que l'activité fusogénique de gp41 est responsable de l'induction d'autophagie et de la mort des lymphocytes T CD4 non infectés après leur contact avec Env. De façon tout à fait surprenante, il apparaît que l'autophagie est bloquée dans les lymphocytes T CD4 productivement infectés par le VIH-1 (souches X4 ou R5). Par contre, les macrophages, autre population cellulaire ciblée par ce virus, ne présentent aucun signe d'autophagie en réponse à la fixation de Env (souches X4 ou R5), alors qu'elle est induite dans les macrophages infectés par ces mêmes virus. Enfin, les derniers résultats nous ont permis de mettre en évidence une phase d'autophagie plus précoce, intervenant dans les deux heures suivant le contact avec Env. L'étude des acteurs impliqués dans l'induction de cette première phase a montré qu'elle était indépendante de la fusion membranaire induite par gp41, ainsi que de la liaison de Env aux récepteurs CD4 et CXCR4. Cette première phase d'autophagie est également présente dans les premières étapes d'infection des lymphocytes T CD4 par du virus libre, et est nécessaire à la réplication du VIH-1. Le VIH-1 adopte donc une stratégie d'exploitation du mécanisme autophagique afin d'optimiser sa réplication, mais également la propagation de l'infection<br>Autophagy is a major catabolic pathway involved in the degradation and recycling of cytoplasmic components. It is also a mechanism of adaptive and innate immunity. During HIV-1 infection, autophagy is induced in uninfected CD4 T lymphocytes after contact with cells expressing HIV-1 envelope glycoproteins (Env, gp120/gp41). This process is a pre-requisite to their apoptosis. Thus, autophagy is implicated in the depletion of CD4 T lymphocytes during HIV-1 infection, mechanism leading to AIDS. The results obtained during my PhD have shown that the fusogenic function of gp41 is responsible for the induction of autophagy in the uninfected CD4 T lymphocytes. Surprisingly, this process is blocked in productively HIV-1-infected CD4 T lymphocytes (X4 or R5 strains). In contrast, uninfected macrophages, a preserved cell population during HIV-1 infection, do not undergo X4 or R5 Env-mediated autophagy. However, autophagosomes are present in infected macrophages. Our last results demonstrated that an early autophagic phase is triggered in target CD4 T cells 2h after the contact with Env-expressing cells. Neither the fusogenic function of gp41, nor gp120 binding to CD4 and CXCR4 is implicated in the induction of this early autophagic phase. Interestingly, this process seems necessary to establish an efficient HIV-1 replication. Our results suggest that HIV-1 adopts a strategy to use the autophagic pathway to its own profit and pointes this process as a key for the HIV-1-associated physiopathology

Résumé : L’autophagie est un mécanisme constitutif et inductible de dégradation des composants cytoplasmiques afin de maintenir l’homéostasie cellulaire. Elle est souvent modulée par les virus car il s’agit également d’un mécanisme de défense antiviral. Elle peut avoir un rôle proviral quand elle est détournée et régulée par les virus. Nous avons précédemment observé au laboratoire que le cytomégalovirus humain (HCMV) stimule la formation des autophagosomes de manière précoce indépendamment de l’expression des protéines virales, puis qu’il entraine un blocage de l’autophagie aux temps tardifs. Dans ce travail, nous avons montré que ce virus a développé des stratégies impliquant la synthèse de deux protéines virales, IRS1 et TRS1, pour inhiber l’autophagie. De façon surprenante, nous avons également mis en évidence un rôle proviral de l’autophagie aux temps tardifs de l’infection par le HCMV. Nous avons pu montrer par des techniques de biochimie et d’imagerie cellulaire que l’expression aussi bien de TRS1 que d’IRS1 est capable de bloquer la formation des autophagosomes dans les cellules. Nous avons identifié le mécanisme d’action de ces protéines. Il est indépendant de la protéine kinase PKR mais nécessite une interaction avec Beclin 1, une protéine de la machinerie autophagique. Nous avons localisé le site d'interaction de Beclin 1 avec IRS1 et TRS1 (BBD pour Beclin 1 binding domain) au niveau de leur région N-terminale. Ce domaine, conservé entre les deux protéines, est nécessaire pour l’inhibition de l’autophagie. Le site d’interaction d’IRS1 a été identifié dans le domaine en superhélice (coiled-coil domain) CCD de Beclin 1. Nous avons caractérisé le rôle de TRS1 et IRS1 dans la modulation de l’autophagie dans le contexte de l’infection virale, en utilisant différents virus mutants : des virus dans lesquels on a supprimé soit le gène IRS1, soit le gène TRS1 et un virus dans lequel il manque les deux gènes IRS1 et TRS1. Les résultats obtenus suggèrent qu’IRS1 et TRS1 sont effectivement toutes les deux impliquées dans ce processus. Afin de mieux comprendre le rôle de l’interaction de ces protéines avec Beclin 1, nous avons étudié le phénotype d’un virus mutant qui n’exprime pas IRS1 et qui contient une délétion de la région BBD de TRS1. Nous avons montré que ce virus mutant ne se lie pas à Beclin 1 et qu’il ne bloque pas l’autophagie. De manière surprenante, il n’a pas de défaut de production virale, suggérant que l’inhibition de l'autophagie ne serait pas essentielle pour la réplication virale. Nous avons développé d’autres approches, comme l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de l’autophagie ou de lentivirus hébergeant des shRNA, qui montrent que l’inhibition de l’autophagie est capable de diminuer la production virale et au contraire que sa stimulation l’augmente. Ces derniers résultats suggèrent que l’autophagie pourrait être bénéfique au HCMV dans certaines conditions<br>Abstract: Autophagy is a constitutive and inducible mechanism of degradation of cytoplasmic components, in order to maintain the cellular homeostasis. Autophagy is often modulated by viruses, because it is also considered as an antiviral defense mechanism. It can have a beneficial role, when it is hijacked and regulated by viruses. We have previously observed in our laboratory that the human cytomegalovirus (HCMV) stimulates autophagosome formation, at the early stage of infection, independently of viral protein expression then, later on, it blocks autophagy. In this work, we showed that this virus has developed strategies involving the synthesis of several viral proteins, such as IRS1 and TRS1, to inhibit autophagy. Surprisingly, we also demonstrated a proviral role of autophagy at late stages of infection with HCMV. We showed, through biochemical and cellular imaging technologies, that expression of both TRS1 and IRS1 is able to block the formation of autophagosomes. We identified the mechanism of action of these proteins. It is independent of the protein kinase PKR but requires interaction with Beclin 1, a protein of the autophagic machinery. We mapped the interaction site of Beclin 1 with IRS1 and TRS1 in their N-terminal region and called it BBD for Beclin 1-binding domain. This domain (BBD)is conserved between the two proteins and essential to inhibit autophagy. We also identified the site of interaction of IRS1 in the coiled-coil domain (CCD) of Beclin 1. We characterized the role of IRS1 and TRS1 in the modulation of autophagy, in the context of viral infection, using different mutant viruses: viruses in which either the IRS1 or the TRS1 gene has been removed and a mutant virus lacking both IRS1 and TRS1 genes. Our results suggest that both IRS1 and TRS1 are involved in the regulation of this process. To better understand the role of the interaction of these proteins with Beclin 1, we studied the phenotype of a mutant virus that does not express IRS1 and which contains a deletion of the N-terminal region of TRS1. We showed that this mutant does not bind to Beclin 1 and is not able to block autophagy. Surprisingly, it has no defects in viral production, suggesting that inhibition of autophagy is not essential for viral replication. We developed other approaches, including the use of pharmacological modulators of autophagy or shRNA knockdown, which show that the inhibition of autophagy is able to reduce viral production and, on the contrary, that its stimulation increases it. These results suggest that autophagy may be beneficial to HCMV in certain conditions

Le travail de cette thèse s’est articulé autour de l’étude de CRMP5 au cours du développement du système nerveux central. Nous avons mis en évidence une interaction directe entre CRMP5 et la tubuline, conduisant à une inhibition de la pousse neuritique dans différentes lignées cellulaires, ainsi qu’à une inhibition d’élongation uniquement au niveau des dendrites et non de l’axone, dans des cultures primaires de neurones de l’hippocampe. De plus, nous avons montré que CRMP5 pouvait annuler l’action de CRMP2, connue pour promouvoir la pousse neuritique, de façon dominante mais dépendante de la présence sur CRMP5 du site de fixation à la tubuline. Contrairement à CRMP2, l’expression de CRMP5 étant transitoire pendant la différentiation neuronale, elle permettrait de restreindre de façon spatio-temporelle l’effet de CRMP2 sur la pousse neuritique, régulant ainsi la polarité neuronale. D’autre part, nous avons également rapporté la présence de CRMP5 au niveau mitochondrial où elle pourrait jouer un rôle dans le processus d’autophagie des mitochondries. Enfin, nous nous sommes intéressés à l’étude de la CRMP5 exprimée en conditions pathologiques, et nous avons observé une nouvelle localisation nucléaire de la protéine dans certaines cellules cancéreuses. Etant localisée dans plusieurs compartiments subcellulaires et impliquée dans différents mécanismes moléculaires, l’ensemble de ce travail décrit donc la protéine CRMP5 comme une protéine « multi-fonctionnelle »<br>The purpose of this work is to focus on the study of CRMP5 during development of the central nervous system. We have demonstrated a direct interaction between CRMP5 and tubulin, leading to inhibition of neurite outgrowth in different cell lines, and inhibition of growth only at dendritic but not axonal level, in hippocampal neurons. Furthermore, we showed that CRMP5 could counteract the previously described CRMP2 effect on neurite outgrowth. The CRMP5 acted as a dominant signal to counteract CRMP2 outgrowth promotion and this function is also dependent on the tubulin-binding capacity of CRMP5.Unlike CRMP2, the CRMP5 expression being transient during neuronal differentiation, it would imply in the spatiotemporal regulation of the CRMP2 effect on neurite outgrowth, thereby regulating neuronal polarity. In another part, we also reported the presence of CRMP5 at mitochondrial level in vivo where it could play a role in mitochondrial autophagic process.Finally, we were interested in the study of CRMP5 expressed in pathological conditions, and we discovered a new nuclear localization of the protein in some cancer cells. Being localizedin several subcellular compartments and involved in different molecular mechanisms, this work describes CRMP5 as a "multi-functional" protein