Academic literature on the topic 'Bactéries – Paroi cellulaire'

L’étude microscopique des différents tissus d’une plante fourragère montre que les parois des cellules diffèrent d’un tissu à l’autre par leur épaisseur et par leur lignification. Dans le rumen le phloème et le parenchyme sont dégradés et disparaissent les premiers, tandis que les tissus lignifiés sont peu (sclérenchyme) ou pas dégradés (xylème). La dégradation des tissus des feuilles est plus rapide que celle des tiges. Une étude comparative du maïs normal et du maïs bm3 (plus digestible) montre que les parois lignifiées du bm3 sont partiellement dégradées dans le rumen, contrairement à ce qu’on observe avec le maïs normal. Lorsque la plante vieillit, la dégradation des tissus diminue en même temps que les parois se lignifient. Le traitement des pailles de céréales aux alcalis permet à des parois lignifiées d’être partiellement dégradées dans le rumen. Les microorganismes responsables de la dégradation des parois cellulaires peuvent être observés grâce à la microscopie. L’adhésion des bactéries aux parois, les fragments de plantes ingérés par les protozoaires et le mode particulier utilisé par les champignons anaérobies du rumen pour coloniser les tissus lignifiés sont décrits.

Du lait de quartier (n = 828) a été prélevé chez 207 femelles dromadaires (Camelus dromedarius) en lactation, provenant de troupeaux du Borana, au sud-ouest de l’Ethiopie, et élevées de manière traditionnelle. L’objectif de l’étude a été de décrire la prévalence des mammites et certaines étiologies bactériennes chez le dromadaire. Le California mastitis test (Cmt) a été utilisé comme test de dépistage et des examens bactériologiques ont été effectués pour identifier les agents pathogènes impliqués dans les mammites. La numération cellulaire somatique du lait de quartier des chamelles a également été déterminée. Vingt-cinq quartiers (12,1 p. 100) ont été trouvés non productifs parmi les 828 examinés. Un pourcentage de correspondance de 100 p. 100 a été trouvé pour les échantillons classés 3+ et 2+ avec Cmt, alors qu’un pourcentage de correspondance de 35, 71 et 85 p. 100 a été relevé pour ceux classés respectivement 0, traces et 1+ avec Cmt. Une association significative a été observée dans le lait de quartier des chamelles entre les classements positifs obtenus avec Cmt et la présence d’agents pathogènes principaux. La numération cellulaire somatique a été comprise entre 3 x 105 et 1,5 x 107 leucocytes par millilitre de lait. Les moyennes du comptage cellulaire ont montré une évolution numérique positive en fonction des classes croissantes du Cmt avec Anova. Parmi les femelles en lactation examinées, quatre (1,9 p. 100) cas cliniques de mammites ont été détectés. Des bactéries pathogènes ont été présentes dans 171 échantillons (74 p. 100) de lait de quartier examiné positif avec Cmt. Parmi les principaux agents pathogènes isolés ont été trouvées des espèces de Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Corynebacterium et Bacillus, ainsi que Actinomyces pyogenes, Escherichia coli et Pasteurella haemolytica.

The ultrastructure of a bacterium, isolated from rusticles found on the wreck of the Royal Mail Steamship (R.M.S.) Titanic, was studied. The bacterium was rod-shaped, gram-negative and produced circular, off-white, opaque colonies on marine agar. Transmission electron microscopy revealed that the bacterium had a typical gram-negative cell wall structure; the nucleoid region was scattered throughout the cytoplasm and darkly stained inclusions were found in the cytoplasm. Negative staining illustrated the presence of 2-6 peritrichous flagella on the bacterium. This bacterial isolate may be part of transient consortia involved in the formation of the rusticles.On a étudié l’ultrastructure d’une bactérie, isolée de concrétions de rouille en stalactite provenant de l’épave du Royal Mail Steamship (R.M.S.) Titanic. La bactérie, en forme de bâtonnet, était Gram négatif et produisait des colonies circulaires, blanc cassé et opaques sur de l’agar marin. La microscopie électronique à transmission a révélé que la structure de la paroi cellulaire de la bactérie était typiquement Gram négatif; la région du nucléoïde était dispersée dans le cytoplasme, caractérisé par des inclusions foncées. La coloration négative a révélé la présence de 2 à 6 flagelles péritriches. Cet isolat bactérien pourrait faire partie des consortiums transitoires qui contribuent à la formation des concrétions de rouille.

La résistance développée par les bactéries aux antibiotiques est un problème d'échelle mondiale qui a récemment attiré beaucoup d'intérêt. En effet, particulièrement chez les bactéries à Gram-négatif, on constate une depletion rapide de la quantité d'antibiotiques efficaces. De nos jours, les programmes de recherche de nouveaux antibiotiques commencent souvent par le criblage de cibles cellulaires. Les enzymes Mur, impliquées dans la biosynthèse de la paroi, sont uniques aux cellules bactériennes et nécessaires à leur survie. Le présent mémoire décrit l'utilisation des méthodes de bio-informatique structurale pour mettre en lumière un possible mécanisme d'action pour deux inhibiteurs des Mur ligases précédemment découverts : MurDpl etMurFpl. De plus, les recherches ici présentées ont permis de découvrir une grande similarité entre MurDpl et une famille de peptides antimicrobiens naturels, les tigerinines. Leur capacité à pénétrer les cellules bactériennes et la difficulté pour les bactéries de développer une résistance aux peptides antimicrobiens en général en font des composés de départ prometteurs. Nous suggérons que MurD pourrait être une cible intracellulaire des tigerinines et proposons un mécanisme d'action. De plus, par des moyens informatiques, nous évaluons les possibilités de raffiner MurDpl, MurFpl et les tigerinines de façon à augmenter leur activité.

Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. Parmi les effets revendiqués, la modulation des différentes fonctions immunitaires demeure l’un des effets les plus intéressants. Plusieurs travaux sont rapportés dans la littérature sur les effets immunomodulateurs de certaines souches probiotiques. Cependant, les résultats sont parfois controversés et les mécanismes impliqués dans cet effet immunomodulateur sont encore très peu élucidés. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries isolées à partir de fèces de bébé, et d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels ces bifidobactéries exercent leurs effets sur les différentes fonctions immunitaires. Trois souches de bifidobactéries d’origine fécale productrices d’exopolysaccharides (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64), une souche de Bifidobacterium lactis Bb12 et des souches ATCC (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) ont été utilisées. Les résultats obtenus montrent que la paroi cellulaire induit la plus forte stimulation de la prolifération cellulaire (splénocytes), accompagnée d’une forte production de IFN-γ et d’une augmentation de la sécrétion de IL-10. Une stimulation des fonctions immunitaires a également été observée avec le contenu cytoplasmique mais à un niveau moindre par rapport à la paroi. Par contre, les exopolysaccharides bruts ou fractionnés n’ont induit aucun effet. Une étude plus approfondie utilisant B. lactis Bb12 comme modèle a démontré que l’activité immunomodulatrice du contenu cytoplasmique est associée à la présence de peptides et/ou protéines acides, de poids moléculaire très variable et de faible hydrophobicité. Par ailleurs, le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries a été mise à profit pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter les espèces du genre Bifidobacterium. Ces anticorps semblent être spécifiques à une protéine majeure d’environ 58 kDa de poids moléculaire (PM) commune à plusieurs bifidobactéries. Une fois purifiés, ces anticorps ont été utilisés pour développer un test d’immuno-culture original permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries.
Probiotic bifidobacteria are known to have beneficial effects on host health. One of the interesting properties of these bacteria is their capacity to modulate the host immune function. However, the mechanisms by which the bifidobacteria influence the immune response are not well known. This project aimed to evaluate the immunodulatory potential of some bifidobacterial strains isolated from newborn feces. We tried to determine the cellular and molecular mechanisms involved in immune response induced by cytoplasmic content, cell wall and exopolysaccharides from bifidobacteria. Three exopolysaccharide-producing fecal strains of bifidobacteria (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82, and RBL64) and a commercial available strain (Bifidobacterium lactis Bb12) were tested using mouse splenocytes. The results demonstrate that a high stimulation of cell proliferation and interferon-gamma (IFN-γ) production were induced by cell wall. In addition, a concomitant stimulation of interleukin-10 (IL-10) secretion was observed. The cytoplasmic content was also shown to be immunostimulating, but less than cell wall. However, the effects observed were dose or strain-species-dependent. B. lactis Bb12 was found to be significantly more immunostimulating than other bifidobacterial strains used. Partially fractionated peptides and acidic fraction from B. lactis Bb12 showed a low hydrophobicity and appeared heat stable and mitogenic. In contrast, no immunostimulating effects were induced by exopolysaccharides. The mitogenic properties of cell wall protein were then explored to develop specific monoclonal antibodies (Mab) able to detect bifidobacteria species in food. Common proteins were revealed in cell wall extracts from bifidobacteria (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum). The proteins obtained were found to be immunonogenic in Balb/c mouse. Monoclonal antibodies (IgG) -anti-B. longum- produced cross-reacted with all bifidobacteria tested. The shared antigenicity shown by bifidobacteria was revealed by an epitope supported by a common protein of 58 kDa. This was confirmed by immune-transmission electron microscopy observation, which showed the specific interaction of these antibodies with bifidobacterial cell wall proteins. The Mab produced was also shown to be sensitive (105 cfu/ml) and specific to members of the bifidobacterial genus. The Mab developed allowed detection of viable cells of bifidobacteria using immuno-culture test.
Bifidubaktiri d iprubyuteken (probiotiques) i yetwassnen atas assagi, yeεni ţ-ţibaktiryin mara twarnunt i tgulliyin ţţakent ayen yelhan i tdawsa. Tibaktiriyin agi zemrent ad snernint kra n tsuγnin yeţhuddun γef tfekka mgal atanan n uεebbud d izerman n bnadem. D acu kan, ar assa, ur nessin ara amek tibaktiriyin stanent tafekka. Iswi n usenfar agi d anelmud n unezmar n usnerni n ustan n bifidubaktiri. Ayagi i wakken a d-naf isemduyen n kra n tsegrin n tsiluliyin (cellules) am iferdisen (éléments) yellan daxel, s-ufella neγ i d-deggirent ar berra γef tririt n uhuddu. Krad (3) n ccetlat n bifidubaktiri id-yekkan seg izerman llufan ţwalmendent ţwasdemrent ar yiwet n ccetla tamselγut Bifidobacterium lactis Bb12. Agmuden i d-nessufeγ qqaren-d d akken asnerni yelhan n ufadi n tsiluliyin n udihan (rate) n amumad, i d- yettabaε unerni amuqran n IFN-γ yakw d usennerni n usufeγ (sécrétion) n IL-10, yefkaten-id ulesi n tsilulit (paroi cellulaire). Ayen yellan daxel n tsilulit d tazunin-ines (ipeptidiyen yak tiprutiniyin) snernayent drus γef ulesi. Ma d ayen yεenan EPS (exopolysaccharides) ulac asnnerni i d-yekkan segsen. Ma d tiprutiniyin n ulesi n bifidubakiri (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) banent-ed d timesnerniyin timuqranin n uhareb γef tfekka n umumad (Balb/c) ssutuyent afares amuqran n tfekkamgalin. Tifekkamgalin i d-yeffγen d yiwet n txellalt (IgG) mgal B. longum ţwafursent-ed s trennawet u sknent-ed tasedmirt tanmidagt (réaction croisée) yakw d ccetlat nniden n bifidubakiri. Anecta yekka-d seg yiwet n teprutint (protéine) tamsihart i yezzayen 58 kd. Tulmist n tfekkamgalin i d-yefursen yeţwasentem-ed s usadez (test) ibaw i d- yelummzen mi ţ-nerεed yakkw d cctali nniden n tbaktiriyin. Tufin n bifidubaktiri yeddren s tfekkamgalin i d-yedran yefursen yedra-d s usadez n immuno-culture. Tifekkamgalin tulmisin i-d yekkan seg yiwet n txellayt id-nessenfel zemrent ad ţwaqedcent i tifin n cctali n bfidobktiri di tgwellyin.

Les bactéries buccales n'infectent pas seulement la bouche mais y resident. Elles peuvent également passer dans la voie sanguine et atteindre des organes secondaires. S’il n'est pas traité, le biofilm dentaire peut provoquer une inflammation destructrice dans la cavité buccale, entrainant de graves complications médicales. Dans ce biofilm, Streptococcus gordonii, colonisateur oral primaire, constitue la plate-forme sur laquelle des colonisateurs pathogènes tardifs comme Porphyromonas gingivalis, l'agent causal des maladies parodontales, se lieront. L'objectif de la première partie de la thèse était de déterminer l'activité antibactérienne de onze composés de lichens appartenant à différentes familles chimiques, pour découvrir de nouveaux antibiotiques pouvant combattre ces bactéries buccales. Nous avons montré que trois composés avaient des activités antibactériennes prometteuses. L'acide psoromique enregistrait les CMIs le plus faibles. De nouveaux analogues de butyrolactone ont ensuite été conçus et synthétisés sur la base des composés antibactériens licheniques connus, les acides lichesteriniques, en substituant différents groupes fonctionnels sur le cycle butyrolactone pour améliorer son activité sur S. gordonii et P. gingivalis. Parmi les dérivés, B-12 et B-13 avaient la plus faible CMI où ils se sont révélés être des bactéricides plus forts, 2 à 3 fois plus, que l'antibiotique, doxycycline. B-12 et B-13 étaient également les plus efficaces vis-à-vis de P. gingivalis. La cytotoxicité de ces 2 composés a ensuite été vérifiée contre les cellulaires épithéliales gingivales humaines et les macrophages. Ils ne présentaient pas de toxicité contre les cellules testées. Une étude préliminaire de relation structure-activité a révélé le double rôle important apporté par deux substituants, chaîne alkyle en C5 et groupe carboxyle en C4 positions, dans leur mécanisme d'action. Ceci a été suivi par l'étude de l’activité antibiofilmique de B-12 et B-13 contre les deux souches orales en utilisant un test de cristal violet et microscopie confocale. Les deux dérivés ont montré, à une concentration plus faible, une inhibition maximale de la formation du biofilm, LCMI, de 9.38 μg/mL contre S. gordonii et 1.17 μg/mL contre P. gingivalis. Cependant, lorsque des concentrations sous-inhibitrices de B-12 et B-13 ont été utilisées, nous avons démontré que les deux souches étudiées pouvaient former des biofilms in vitro, accompagné d’une diminution de l'expression des gènes impliqués dans l'adhésion et la formation de biofilm. Pour mieux comprendre les mécanismes d'action des butyrolactones, nous avons étudié la localisation bactérienne du composé B-13 en synthétisant un B-13 marqué au NBD (4-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazole) fluorescent conservant son activité antibactérienne. Par microscopie confocale et HPLC, nous avons montré que ce composé se lie à la surface cellulaire de S. gordonii. Ensuite, B-13 induit une rupture de la paroi cellulaire conduisant à la libération des constituants bactériens et par conséquent, à la mort de S. gordonii, une bactérie Gram-positive. L'expression de deux gènes, murA et alr, impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire, a été modifiée en présence de cette butyrolactone. Les bactéries Gram négatives telles que P. gingivalis ont également montré des cellules abimées présentant une rupture de la paroi en présence de B-13, ce qui suggère que cette butyrolactone agit sur des Gram-positives et Gram-négatives avec une plus grande efficacité contre les Gram-négatives. En outre, nous avons également démontré que l'analogue de B-13, B-12, induit une perturbation de la morphologie de P. gingivalis et S. gordonii. Toutes ces études ont démontré que les butyrolactones dérivées de lichen peuvent être proposés comme des composés antibactériens puissants contre les agents pathogènes oraux qui causent des complications médicales graves
The oral bacteria do not only infect the mouth and reside there, but also travel via the blood and reach distant body organs. If left untreated, the dental biofilm that can cause destructive inflammation in the oral cavity may result in serious systemic medical complications. In dental biofilm, Streptococcus gordonii, a primary oral colonizer, constitutes the platform on which late pathogenic colonizers like Porphyromonas gingivalis, the causative agent of periodontal diseases, will bind. The aim of the first study was to determine the antibacterial activity of eleven natural lichen compounds belonging to different chemical families to uncover new antibiotics which can fight against the oral bacteria. Three compounds were shown to have promising antibacterial activities where psoromic acid had the lowest MICs of 11.72 and 5.86 µg/mL against S. gordonii and P. gingivalis, respectively. Novel butyrolactone analogues were then designed and synthesized based on the known lichen antibacterial compounds, lichesterinic acids (B-10 and B-11), by substituting different functional groups on the butyrolactone ring trying to enhance its activity on S. gordonii and P. gingivalis.. Among the derivatives, B-12 and B-13 had the lowest MIC of 9.38 µg/mL where they have shown to be stronger bactericidals, by 2-3 times, than the reference antibiotic, doxycycline. B-12 and B-13 were also the most efficient on P. gingivalis exhibiting MIC of 0.037 and 0.293 µg/mL and MBC of 1.17 and 0.586 µg/mL, respectively. These 2 compounds were then checked for their cytotoxicity against human gingival epithelial cells and macrophages by MTT and LDH assays which confirmed their safety against the tested cell lines. A preliminary study of the structure-activity relationships unveiled the important dual role contributed by two substituents, alkyl chain at C4 and carboxyl group at C5 positions, in their mechanism of action. This was followed by the investigation of B-12 and B-13 for their antibiofilm activity against both oral strains using crystal violet assay and confocal microscopy. Both derivatives displayed a lowest concentration with maximal biofilm inhibition, LCMI, of 9.38 µg/mL against S. gordonii and 1.17 µg/mL against P. gingivalis. However, when sub-inhibitory concentrations of B-12 and B-13 were used, we demonstrated that the two investigated strains were able to form biofilms in vitro. Indeed, this antibiofilm activity decreased as indicated by the expression of the genes implicated in adhesion and biofilm formation. To better understand the mechanism of action of butyrolactones, we have investigated B-13 bacterial localization by synthesizing a fluorescently labeled B-13 with NBD (4-nitro-benzo[1,2,5]oxadiazole) conserving its antibacterial activity. By confocal microscope, we showed that this compound binds to S. gordonii cell surface and this was also demonstrated by HPLC analysis. By adhering to cell surface, B-13 induced cell wall disruption leading to the release of bacterial constituents and consequently, the death of S. gordonii, a Gram-positive bacterium. The expression of two genes, murA and alr, implicated in cell wall synthesis, was modified in the presence of this butyrolactone. Gram-negative bacteria such as P. gingivalis showed also cracked and ruptured cells in the presence of B-13, suggesting that this butyrolactone acts on Gram-positive and Gram-negative strains, but with greater efficacy against the Gram-negatives. Besides, we also demonstrated that the analogue of B-13, B-12, has also induced disruption of P. gingivalis and S. gordonii. All these studies demonstrated that butyrolactones derived from a lichen metabolite can be proposed as potent antibacterial agents against oral pathogens causing serious medical complications

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la formation d'une pourriture molle sur un large spectre de plantes hôtes. Sa virulence est principalement due à une sécrétion d'exoenzymes permettant l'hydrolyse de la paroi des cellules végétales libérant des produits consommés ensuite par la bactérie. Nous avons caractérisé génétiquement et biochimiquement le locus gan codant 8 protéines permettant le transport et le catabolisme des galactanes, un des composants de la pectine. Chez E. Chrysanthemi, d'autres facteurs sont nécessaires à la virulence. Des mutants dépourvus de glucanes périplasmiques osmorégulés (OPG) présentent une absence totale de virulence sur les plantes hôtes et un phénotype pléiotrope indiquant une perturbation de l'enveloppe bactérienne. L'étude protéomique d'un mutant opg a confirmé la profonde modification de l'enveloppe et a révélé que l'absence d'OPG induit une réponse au stress. Une mutation ponctuelle dans le gène rcsC restaure la virulence sur tubercules de pomme de terre ainsi que la majorité des autres caractères du mutant opg. L'analyse protéomique de ce mutant rcsC dans un contexte Opg+ ne donne pas d'indication sur la raison de son hypervirulence. L'activation du système Rcs passe par l'interaction des protéines RcsC et RcsD, composant le capteur membranaire, avec une lipoprotéine de la membrane externe RcsF. Notre hypothèse est que les OPG moduleraient l'interaction entre les différents partenaires. Nous. Avons entrepris une étude, encore préliminaire, visant à déterminer les interactions existantes entre une version soluble de RcsF et les boucles périplasmiques de RcsC et RcsD

Les bactéries présentent plusieurs mécanismes qui leur confèrent la capacité de faire face à des situations difficiles.Dans un contexte global de résistance aux antibiotiques, les bactéries à Gram négatif présentent des mécanismes de résistance intrinsèque. L'enveloppe multicouche complexe et dynamique, enrobée de lipopolysaccharides (LPS), confère à ces bactéries une capacité de survie accrue. La biosynthèse de ces glycolipides est initiée dans le cytoplasme et son transport se déroule depuis la membrane interne jusqu'à la membrane externe, avec une voie de biosynthèse/transport dédiée.La machinerie de transport des lipopolysaccharides (Lpt) comprend sept protéines fondamentales (LptA à LptG) qui couvrent toute l'enveloppe. Au niveau de la membrane interne, le transporteur LptB2FG couple l'hydrolyse de l'ATP avec l'extraction du LPS. LptB2 est directement en charge de l’hydrolyse de l’ATP tandis que LptF/G interagit avec le LPS et le transporte vers LptC/LptA dans le périplasme.Cette machinerie utilise une architecture conservée avec des domaines de jellyroll dédiés présents sur LptF/G/C/A qui s'assemblent en un pont permettant au LPS de s'écouler vers la membrane externe.Les molécules qui seraient capables de perturber les interactions entre protéines et les différents domaines jellyroll du système, pourraient devenir de puissants inhibiteurs de la construction de la paroi cellulaire. La thanatine, un peptide antimicrobien naturel, a été décrite comme ciblant les domaines jellyroll de la machinerie. Nous avons examiné son effet dans la perturbation du complexe LptC/A. La thanatine se lie pas à LptC mais uniquement à LptA et inhibe l'assemblage du complexe à faible concentration (de l’ordre du nao molaire), démontrant ainsi le potentiel des interactions entre les jellyrolls du système LptC.Le réseau d'interactions entre LptB2FG et LptC/A n'est pas entièrement compris. Le LptB2FG a été produit dans des micelles de détergents et dans des particules de type nanodisque, pour sonder les interactions avec LptC et LptA à l'échelle atomique, à l'aide de diverses techniques biophysiques.Dans l'assemblage du pont LptB2FGCA, LptC/F interagissent principalement à travers les domaines jellyroll. Une mutation dans le résidu R212 de LptF a rendu la présence de la protéine LptC facultative in vivo.La caractérisation biophysique/biochimique a montré une interaction inchangée du mutant LptB2FG avec LptC et LptA, tandis que l'activité ATPase a montré un manque de régulation par la présence de ses partenaires. Cela nous a conduit à proposer que R212 soit un point de contrôle dans LptF pour que LptB2FG détecte le bon assemblage de la machinerie.Lorsque le complexe LptB2FGCA est assemblé in vitro, LptB2 s'est avérée capable de catalyser le phosphotransfert entre deux molécules d'ADP, générant de l'ATP et de l'AMP, et représentant une nouvelle activité (Adenylate Kinase) jusqu'alors non décrite pour cette protéine. Étant un sujet très récent dans la littérature, le rôle des transporteurs à double fonction n'est pas encore bien compris. Pour caractériser l'équilibre entre ATPase et Adenylate Kinase, nous avons muté LptB2 sur des motifs ABC clés pour sonder l'emplacement de l'activité Adenylate Kinase. L’étude du complexe LptB2FG préparé dans des particules de nanodisques, suggère que l'équilibre entre les activités dépend de l'assemblage dynamique de LptB2FGCA. La caractérisation structurale de LptB2 dans sa forme apo et lié aux nucléotides a été initiée.Ce projet, axé sur le système Lpt essentiel pour la survie bactérienne, met en lumière l'importance des interactions protéine-protéine comme cibles pour la conception de futurs composés antimicrobiens. L’intérêt de cibler des transporteurs à double fonction, à la fois impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire et l'exportation de médicaments, pourrait aussi représenter une piste prometteuse pour la recherche future de nouvelles drogues
Bacteria display several intrinsic mechanisms which confers them the ability to cope with disadvantageous situations, such as nutrient deprivation, environmental inter/intra-species competition, managing adaptation to detrimental conditions, and handling effects of antibacterial compounds.In a global context of antibiotic resistance accelerated by anthropogenic activities, gram negative bacteria display intrinsic resistance mechanisms. The complex and dynamic multilayered envelope, coated with lipopolysaccharides (LPS), confers these bacteria increased survivability. Biosynthesis of these complex glycolipids is initiated in the cytoplasm, and its transport proceeds along the inner membrane, periplasm, until reaching the outer membrane, with a dedicated biosynthetic pathway and transport machinery.The Lipopolysaccharide Transport (Lpt) machinery comprises 7 fundamental proteins (LptA to LptG) that span the entire envelope. More specifically, at the inner membrane, LptB2FG ABC transporter couples ATP hydrolysis with LPS extraction. LptB2 cycles ATP while LptF/G interact with LPS and carry it towards LptC and LptA in the periplasm.This machinery uses a conserved architecture with dedicated jellyroll domains present on LptF, LptG, LptC and LptA that assemble into a bridge that allow LPS flow to the outer membrane.Molecules that would disrupt protein-protein interactions between the different jellyroll domains of the Lpt system could become potent cell wall inhibitors. Thanatin, a natural occurring antimicrobial peptide, has been described as targeting the jellyroll domains of the machinery. We screened its effect in the disruption of LptC-LptA complex. Thanatin binds to LptA but not LptC and inhibits the assembly of the complex at low nM concentrations, showing the potential of targeting Lpt Jellyroll-jellyroll interactions.The network of interactions between the Inner membrane complex, LptB2FG and periplasmic LptC and LptA is not fully understood. LptB2FG was produced in detergent micelles and within nanodisc particles, to probe interactions with LptC and LptA at an atomic scale, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and biophysical techniques.In the assembly of the LptB2FGCA bridge, LptC and LptF interact mostly through the jellyroll domains. A mutation in the LptF jellyroll (R212 residue) rendered LptC presence facultative in vivo.Biophysical and biochemical characterization showed unaltered interaction of mutant LptB2FG with LptC and LptA, whereas ATPase activity showed lack of regulation by presence of its partners. This led us to propose that R212 is a checkpoint in the LptF jellyroll, acting as a hub for LptB2FG to sense proper assembly of the machinery.When LptB2FGCA complex is assembled in vitro, LptB2 was found capable of catalyzing phosphotransfer between ADP molecules, generating ATP and AMP, a novel activity (Adenylate Kinase) previously undescribed for this protein. Being a topic of very recent interest in the literature, the role of dual-function transporters is not understood. To characterize the balance between ATPase and AK, we mutated LptB2 on key ABC motifs to probe possible location for AK activity. LptB2FG studied in nanodisc particles, suggests that balance between activities depends on the dynamic assembly of LptB2FGCA, with regulatory mechanisms possibly not being shared between both activities. Structural characterization of LptB2 in apo and nucleotide bound-state was initiated .This project, focused on the essential Lpt system, sheds light on the importance of protein-protein interactions as targets for designing future antimicrobial compounds. It could also be worth evaluating if dual-function transporters, involved in cell wall synthesis and drug export, are valid targets for future drug screenings

La TLS est une paroi externe très fine, d'organisation trilamellaire, rencontrée chez certaines microalgues vertes. Cette TLS, formée de macromolécules très résistances aux attaques chimiques et enzymatiques, est connue pour son rôle important en géochimie. Nous avons étudié deux Chlorophycées possédant une composition différente des parois : Chlorella emersonii (TLS+) et Chlorella vulgaris (TLS-) ; l'objectif principal était de savoir si la TLS est capable de protéger les constituants algaires, lors de la fossilisation, contre les attaques bactériennes. Dans une première partie, nous avons comparé certaines caractéristiques physiologiques algaires (biomasse, teneur en chlorophylle, activités photosynthétique et respiratoire) et leurs variations en fonction de l'intensité lumineuse. L'effet de la température et d'inhibiteurs (KCN et SHAM) de la respiration ont été également testés sur ces algues. Dans une seconde partie, nous avons mené des expériences d'incubations, à l'obscurité, avec deux bactéries (Pseudomonas oleovorans et Flavobacterium aquatile). Avant l'incubation les algues ont subit un choc thermique. Les observations par MET ont montré qu'il n'y a pas de rupture des parois et qu'après incubations les bactéries ne sont ni attachées ni à l'intérieur des algues. Les altérations induites par les bactéries dans l'abondance et/ou la distribution des constituants algaires (hydrocarbures, acides gras, TAG, et chlorophylles) ont été déterminées après 1 et 4 mois. L'examen des contrôles a montré une forte dégradation (non-bacterienne) dans les constituants algaires qui semble s'accentuer en présence des bactéries. L'ensemble des résultats a montré qu'il n'y a pas de différence dans l'ampleur des dégradations entre les deux algues. La présence de TLS ne semble pas protéger le contenu cellulaire de C. Emersonii. Par ailleurs, l'observation de dégradations intenses en absence de bactéries, montrant la grande ampleur des processus d'autodégradation, pourrait avoir des implications géochimiques importantes.

Les glycannes sont des acteurs essentiels des relations hôtes-pathogènes qui s’établissent lors d’une infection et l’influence de ces composés complexes est loin d’être élucidée. Dans ce projet, ces relations ont été étudiées en se focalisant sur les glycannes provenant de deux organismes pathogènes majeurs pour l’Homme, à savoir Mycobacterium tuberculosis et Candida albicans. D’un côté, Mycobacterium tuberculosis, qui cause la tuberculose humaine, est la première cause de décès dans le monde lié à un seul pathogène et l’émergence de souches multi-résistantes a mis en avant le besoin urgent de nouvelles cibles médicamenteuses. Dans ce contexte, nos travaux ont porté sur la recherche de glycosidases impliquées dans le catabolisme de la paroi mycobactérienne et plus particulièrement de l’arabinogalactane (AG) qui représente un versant très peu documenté de la biologie de la paroi mycobactérienne à l’heure actuelle. Les investigations ont d’abord permis d’identifier une exo-galactofuranohydrolase mais aussi, dans le cadre de cette thèse, une galactose mutarotase impliquée dans le recyclage du galactose de la chaîne galactane de l’AG suite à l’action de la première enzyme. D’un autre côté, Candida albicans a été étudié dans le cadre des candidoses invasives (CI) rencontrées principalement dans les services de réanimation. Cette infection fongique est très préoccupante car les taux de mortalité restent extrêmement élevés due à un diagnostic précoce qui fait cruellement défaut. En effet, l’outil de référence aujourd’hui utilisé pour leur diagnostic est l’hémoculture mais celle-ci n’est positive que dans 50 % des cas. D’autres tests diagnostiques ont été développés en ciblant notamment les composants de la paroi cellulaire de Candida comme les β-D-1,3-glucanes ou encore les mannanes mais ces derniers représentent un coût exorbitant pour les hôpitaux et ils sont très hétérogènes en termes de performance. C’est donc dans ce cadre que nous avons participé à l’élaboration d’un test de diagnostic des CI basé sur l’analyse et la quantification par spectrométrie de masse d’un disaccharide sérique provenant du métabolisme des glycannes de C. albicans. Différentes cohortes locales mais aussi européennes ont été mises en place pour l’étude des performances de ce nouveau test. Un versant plus fondamental a également permis de mettre en avant le tréhalose comme étant le disaccharide retrouvé dans les sérums de patients infectés
The glycans are essential actors of the host-pathogen connections that are established during the infection and the influence of these complex compounds is far from being elucidated. In this project, these interactions were studied by focusing on glycans from two major pathogenic organisms for humans, namely Mycobacterium tuberculosis and Candida albicans. On one side, Mycobacterium tuberculosis, which causes human tuberculosis, is the leading cause of death in the world linked to a single pathogen and the emergence of multi-resistant strains has highlighted the urgent need of new drug targets. In this context, our work focused on the research of glycosidases involved in the catabolism of the mycobacterial cell wall and more particularly of arabinogalactan (AG), which represents a very little documented side of mycobacterial cell wall biology for the moment. The investigations allowed us to identify an exo-galactofuranohydrolase but also, in the context of this thesis, a galactose mutarotase involved in the recycling of galactose from the galactan chain of AG following the action of the first enzyme. On the other hand, Candida albicans has been studied in the context of invasive candidiasis (IC) encountered mainly in intensive care units. This fungal infection is very worrying because mortality rates remain extremely high due to an early diagnosis that is sorely lacking. Indeed, the gold standard used for their diagnosis is the blood culture but it is only positive in 50 % of cases. Other diagnostic tests have been developed by targeting Candida cell wall components such as β-D-1,3 glucans or mannan, but they represent an exorbitant cost for hospitals and are very heterogeneous in term of performance. It is therefore in this context that we participated in the development of an IC diagnostic test based on mass spectrometry analysis and quantification of a serum disaccharide derived from the metabolism of C. albicans glycans. Different local but also European cohorts have been set up to study the performance of this new test. A more fundamental side also highlighted trehalose as the disaccharide found in the sera of infected patients

Clostridium cellulolyticum est une bactérie anaérobie stricte et cellulolytique qui produit des complexes multienzymatiques (cellulosomes) très performants pour la dégradation des polysaccharides de la paroi végétale. C. cellulolyticum adhère à la cellulose et ce phénomène intervient dès les premiers stades de croissance. Pour de nombreuses bactéries cellulolytiques, les cellulosomes semblent impliqués dans le processus d'adhérence et alors que les mécanismes moléculaires mis en jeu pour l'adhérence à la cellulose sont connus ou proposés, celui ou ceux de C. cellulolyticum sont inconnus.Mon projet de thèse a consisté à étudier l'adhérence et la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et d'identifier le ou les facteurs moléculaires impliqués dans l'adhérence. J'ai ainsi mis en œuvre deux stratégies distinctes. D'une part, une approche par mutagénèse aléatoire qui a permis d'isoler deux clones à l'adhérence diminuée et d'autre part, une approche par mutagénèse ciblée visant à inactiver des gènes candidats, susceptibles d'intervenir dans l'adhérence.J'ai aussi étudié la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et observé que les cellules adhèrent avec une haute spécificité et affinité à la cellulose. La colonisation des fibres se ferait en mono-couche cellulaire et par successions d'événements d'adhésion-relarguage-réadhésion. Un mutant d'inactivation de CipC, la protéine d'échafaudage des cellulosomes, a mis en évidence l'implication de cette protéine dans l'adhérence, mais aussi que l'adhérence à la cellulose pourrait être multifactorielle. Enfin, j'ai étudié le rôle de HycP, une protéine à CBM3 dont la fonction est inconnue
Clostridium cellulolyticum is a strict anaerobe, cellulolytic bacteria. It produces multienzymatic complexes, called cellulosomes, which are able to efficiently degrade the plant cell wall polysaccharides. Cellulolytic bacteria, including C. cellulolyticum do binds to cellulose since early growth stage. For most of the studied cellulolytic bacteria, adherence to cellulose seems to be mediated by their cellulosomes. However, molecular factors involved in C. cellulolyticum adherence to cellulose remain unknown.My Ph.D. aimed to implement different but complementary strategies to study adhesion and colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum and to identify the molecular mechanism(s) by which the bacteria bind to cellulose. In order to identify some proteins encoding genes involved in adhesion, I firstly developed random mutagenesis and isolated two adhesion deficient mutants. I also used a targeted mutagenesis tool to inactivate some candidate genes.My studies highlight C. cellulolyticum adheres with both high specificity and affinity to cellulose. Colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum forms a mono-layer of segregated cells on cellulose surface and may occur through cycles of adhesion-release-re-adhesion to substrate. Inactivation of the CipC encoding gene led to a short decrease of the mutant strain's adherence level. This result suggests some other proteins may be involved in C. cellulolyticum adhesion to cellulose. Finally, I studied HycP, a produced and secreted CBM3 encoding protein of unknown function. HycP is a unique protein among databases and may have a phagic origin

La recrudescence de la tuberculose a été favorisée par l'émergence de souches du bacille tuberculeux, Mycobacterium tuberculosis, résistantes aux agents antituberculeux et notamment à l'isoniazide (INH). Cet antituberculeux de première ligne inhibe un métabolisme propre aux mycobactéries, la biosynthèse des acides mycoliques. Ces acides gras à très longue chaîne sont des composés majeurs et caractéristiques de l'enveloppe mycobactérienne. Une cible moléculaire de l'isoniazide, la protéine InhA, est une énoyl-ACP réductase et catalyse une étape de la voie classique de biosynthèse d'acides gras, avec une spécificité pour des substrats à longue chaîne. InhA interviendrait dans un système d'élongation d'acides gras participant à la biosynthèse des acides mycoliques. Toutefois, aucune donnée expérimentale n'a clairement établi le rôle de cette protéine chez les mycobactéries. Parmi les systèmes d'élongation mycobactériens, c'est le système FAS-II qui est le plus susceptible de contenir InhA. Après isolement d'une fraction protéique soluble présentant l'activité d'élongation FAS-II, nous avons démontré la présence de InhA dans cette fraction et confirmé l'implication de cette protéine dans FAS-II, en utilisant des inhibiteurs de l'activité de InhA. La microscopie électronique a permis de localiser InhA à la fois dans le cytoplasme et dans l'enveloppe. En effet, nous avons mis également en évidence la présence de InhA dans un extrait de parois mycobactérien catalysant l'activité de biosynthèse des acides mycoliques. La sensibilité de cette dernière activité aux inhibiteurs de InhA suggère fortement l'implication de InhA, et de FAS-II, dans la biosynthèse des acides mycoliques mycobactériens. Par contre, la protéine InhA n'a pas été détectée dans des genres apparentés, résistants à l'INH et synthétisant des acides mycoliques plus courts. Afin de rechercher de nouvelles cibles potentielles pour des agents anti-mycobactériens, nous avons étudié le produit du gène mabA, en opéron avec inhA sur le chromosome de M. Tuberculosis. Après surproduction de MabA dans Escherichia coli et purification, son activité catalytique a été caractérisée et correspond à une b-cétoacyl réductase, NADPH-dépendante, spécifique de substrats à longue chaîne. Ces propriétés, ainsi que la présence de MabA dans la fraction enzymatique contenant le système FAS-II suggèrent l'implication de cette protéine dans le même complexe enzymatique que InhA. L'étude de la structure tridimensionnelle de MabA par modélisation moléculaire a permis de montrer que cette protéine appartenait à la famille structurale des RED (réductases/épimérases/deshydrogénases), et qu'elle était susceptible d'interagir avec l'isoniazide. Nous avons effectivement pu montrer que l'activité de MabA était inhibée par cet antibiotique
Emergence of tubercle bacilli resistant to multiple drugs has prompted the search for a new generation of antibiotics effective against Mycobacterium tuberculosis. Among the first line antituberculous drugs, isoniazid (INH) is highly specific of mycobacteria, and its primary effect corresponds to inhibition of a characteristic metabolism of these bacteria, the mycolic acid biosynthesis. Mycolic acids are very long-chain fatty acids and are major components of mycobacterial cell-wall. It was established that an isoniazid target, the InhA protein, is a 2-trans-enoyl-ACP reductase probably involved in the mycolic acid pathway. However, the exact role of InhA in mycobacteria is still unclear. Reduction of enoyl compounds corresponds to one step of fatty acid biosynthesis. We therefore isolated an enzymatic complex which contains the InhA protein, and using InhA inhibitors, we showed that the elongation activity of the system is InhA-dependent. Moreover, the inhibition of mycolic acid biosynthesis in cell-wall extracts by InhA inhibitors strongly suggests that the InhA-containing elongation system participates in the mycolic acid production in mycobacteria. .