Academic literature on the topic 'Bacteris patògens'

El género Salmonella, está compuesto de bacterias Gram-negativas, no esporuladas, en forma de bacilo. Salmonella tiene importante relevancia a nivel de salud pública ya que es uno de los principales patógenos entéricos tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. En los casos de gastroenteritis notificados en España, Salmonella se posiciona en segundo lugar, después de Campylobacter. En este trabajo se utilizó como organismo modelo de estudio S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), que en humanos causa salmonelosis, gastroenteritis caracterizada por diarrea inflamatoria, originada normalmente tras la ingestión de alimentos o agua contaminados. Los genes de virulencia de S. Typhimurium están localizados mayoritariamente dentro de islas de patogenicidad (SPI). Los genes codificados en la SPI-1 promueben la invasión de células eucariotas, la regulación de la expresión de los genes de la SPI-1 está mediada por HiIA codificada en el gen, hilA, presente en la misma SPI-1. HiIA activa la expresión de los genes que codifican para la síntesis de un sistema de secreción de tipo 3 (T3SS) encargado de secretar e inyectar proteínas efectoras dentro de la célula hospedadora. La expresión de hilA se encuentra bajo el control de unl bucle de regulación, comprendido por las proteínas HiID, HiIC y RtsA. HiID es el regulador predominante de este sistema, mientras que HiIC y RtsA se encargan de amplificar la señal de activación. Por su parte, los genes que contiene la SPI-2, están implicados en causar infecciones sistémicas y la proliferación intracelular de la bacteria. Los factores Gre son factores que regulan la elongación de la transcripción génica en procariotas. Son conocidos por promover la actividad endorribonucleotídica de la ARN polimerasa (ARNpol) cuando ésta se encuentra en un estado de pausa por retroceso causado durante la elongación de la transcripción. A pesar de que los factores Gre han sido bien caracterizados en otras enterobacterias como Escherichia coli, en Salmonella no existen estudios que describan el papel de los factores Gre en la fisiología celular. Así, el objetivo principal de esta tesis doctoral fue estudiar el papel de los factores Gre en la fisiología y patogenicidad de Salmonella. En este estudio describimos que los factores Gre forman parte de la compleja red reguladora de la expresión de los genes de la SPI-1 y SPI-2 de Salmonella. Los resultados obtenidos indican que los factores Gre de Salmonella son esenciales para la correcta expresión de las proteínas efectoras codificadas dentro de la SPI-1 (SipA, SipC y SipD) y fuera de ella (SopE), y que también juegan un papel importante en la motilidad de la célula bacteriana, fenotipos predominantes en la patogenicidad. Se pudo determinar que la regulación de la expresión de los genes de la SPI-1 y la SPI-2 por parte de los factores Gre, es a través de la regulación transcripcional del gen hilD. La regulación mediada por los factores Gre requiere de la región 3'UTR del gen hilD. Además demostramos que la actividad antipausa de la transcripción de los factores Gre es necesaria para la correcta expresi formación de biofilm en Salmonella. Esta regulación al parecer también es ejercida en una región UTR, en este caso en la región 5’UTR del gen csgD, y es independiente de la temperatura. En análisis transcriptómicos mediante la técnica de microarrays, se observó que los factores Gre de Salmonella estarían implicados en la correcta expresión de muchos de los genes adquiridos horizontalmente (HGT) como son los genes presentes en las islas de patogenicidad, plásmidos y fagos. También se observó que existe un elevado número de genes distribuidos en diferentes categorías funcionales, que son corregulados por los factores Gre en conjunto con la proteína DksA, proteína que incrementa la fidelidad de la transcripción al disminuir la tasa de incorporación incorrecta de nucleótidos. Estos resultados indican que el patrón general de expresión génica de Salmonella es el resultado de una compleja interacción entre los factores Gre y la proteína DksA, que implica el control mutuo, competición por la unión a la ARNpol, y la acción similar u opuesta sobre la actividad de la ARNpol. Con los resultados presentados en esta tesis doctoral se puede concluir que los factores Gre forman parte de la compleja red de regulación de los genes de virulencia de Salmonella.ón de hilD.
Gre factors regulate gene transcription elongation in prokaryotes. In Escherichia coli they promote cleavage of the nascent RNA transcript within the elongation complex when the RNA polymerase is paused by a backtracking. Although the Gre factors have been characterized in other enterobacteria, in Salmonella there are not studies about their role in cellular physiology. The main objective of this thesis was to study the role of Gre factors in physiology and pathogenicity of Salmonella. In this study we describe Gre factors that are part of the complex regulatory network of gene expression of Salmonella pathogenicity island-1 (SPI-1) and SPI-2. The results indicate that Gre factors are pivotal in the control of predominant phenotypes in pathogenicity. They are essential for the correct expression of effector proteins encoded within (SipA, SipC and SipD) and outside SPI-1 (SopE), and they also play an important role in motility of the bacterial cell. It was determined that the regulation of gene expression of SPI-1 and SPI-2 by Gre factors is through transcriptional regulation of hilD gene. Regulation mediated by Gre factors requires hilD 3'UTR region. We demonstrated that Gre antipausa activity during transcription is necessary for the correct expression of hilD. It was also observed that Gre factors play an important role in transcriptional expression of csgD, main regulator of biofilm formation in Salmonella. This regulation is also apparently exerted through the 5'UTR region of the csgD gene, and is temperature- independent. In transcriptome analysis using Microarray, it was observed that Gre factors are implicated in the correct expression of many horizontally transferred genes (HGT) such as genes present in pathogenicity islands, plasmids and phages. It was also noted that there is a large number of genes distributed into different functional categories, which are co-regulated by Gre factors together with DksA protein, a protein that increases the accuracy of the transcript to decrease the rate of nucleotide missincorporation. These results indicate that the overall pattern of gene expression of Salmonella is the result of a complex interaction between Gre factors and DksA protein, involving the mutual control, competition for binding to ARNpol, and similar or opposite action on ARNpol activity. We can conclude that Gre factors are part of complex regulatory network of virulence genes of Salmonella.

El género "Aeromonas" pertenece a la familia "Vibrionaceas". Dentro de este généro podemos diferenciar dos grupos: un primer grupo formado por microorganismos psicrófilos no mótiles en el que únicamente hallamos la especie "Aeromonas salmonicida" y un segundo grupo formado por microorganismos mesófilos mótiles en el que hallamos las especies "Aeromonas hydrophila", "Aeromonas sobria" y "Aeromonas caviae".

Las cepas de "Aeromonas" mesófilas mótiles son microorganismos que se caracterizan por su elevada diversidad en cuanto al grado de virulencia. Estas diferencias se hallan estrechamente relacionadas con las estructuras moleculares presentes a nivel de la superficie bacteriana.

La incidencia y variabilidad de este grupo hizo que obtuviesen a partir de muestras de agua diferentes bacteriófagos específicos para las estructuras superficiales bacterianas, los cuales pudiesen emplearse como marcadores biológicos que permitiesen diferenciar a un serotipo de los restantes dentro del grupo de "Aeromonas" mótiles. De este modo, se aislaron los bacteriófagos PM1, PM2 y PM3.

El bacteriófago PM1 presenta doble cadena de DNA, capside poliédrica y una placa con fibras en la cola. Además, posee como receptor el antígeno O del lipopolisacárido (LPS) de las cepas de serotipo 0:34 y, en consecuencia, los mutantes espontáneos resistentes al citado bacteriófago carecen de antígeno 0 del LPS, aunque presentan sensibilidad a bacteriófagos de "Aeromonas" cuyo receptor es el núcleo del LPS.

El bacteriófago PM2 presenta doble cadena de DNA, cápside poliédrica y una placa basal con espinas. Además, posee como receptor el núcleo del LPS de diferentes cepas de serotipo 0:34 y 0:11 (así como "A. salmonicida"); en consecuencia, los mutantes resistentes al mismo presentan alteraciones en los oligosacáridos del núcleo del LPS, careciendo en todos los casos de antígeno 0 del LPS.

El bacteriófago PM3 presenta doble cadena de DNA y posee como receptor el flagelo monopolar de diferentes serotipos de "A. hydrophila" tanto con lámina S como sin lámina. Los mutantes resistentes a este bacteriófago presentan alteraciones en el flagelo o en la motilidad de dichas cepas bacterianas.

Estos bacteriófagos han permitido la agrupación de diferentes cepas de "Aeromonas" mesófilas que luego han correspondido a serotipos distintos. Así, las cepas sensibles al bacteriófago PM1 pertenecen al serogrupo 0:34 y presentan las siguientes características:

1.- Un perfil de proteínas de membrana externa tremendamente homogéneo.

2.- Un LPS heterogéneo, químicamente formado por KDO, L-heptosas, glucosa y hesoxaminas, y carente en D-heptosas, galactosa, rhamnosa y pentosas.

3.- Una DL(50) a 20ºC menos elevada que a 37°C, tanto en ratón como en pez, lo cual indica que son más virulentas a 20ºC que a 37°C. Este hecho se debe a la producción de antígeno 0 del LPS a 20ºC y a la práctica ausencia del mismo a 37°C. Todo ello implica al antigeno 0 del LPS en la virulencia de estas cepas.

Uno de los serotipos más importantes dentro de las "Aeromonas" mesófilas a causa de su elevado grado de virulencia es el denominado serotipo 0:11. Este serotipo presenta:

1. Un LPS homogéneo, formado químicamente por KDO y L-heptosas en el núcleo del LPS y glucosa, galactosa, mañosa y hexosaminas en el antígeno 0 del LPS.
2. Una lámina proteínica de estructura tetragonal, denominada lámina S, que recubre prácticamente la superficie celular haciendo que el LPS quede totalmente recubierto. Esta poca accesibilidad del antígeno 0 del LPS hace difícil encontrar marcadores biológicos (bacteriófagos) para este serotipo.
3. Todas las cepas de serotipo 0: 11 al igual que las de "A. salmonicida" poseen la propiedad de autoaglutinar. Dicha propiedad está ligada fundamentalmente a la presencia de lámina S y de flagelo.
4. La DL(50) de este serotipo es dos logaritmos inferior a la existente en las cepas de serotipo 0:34 y además es muy similar en todos los mutantes isogénicos obtenidos para las diferentes estructuras superficiales.

Una vez estudiados los serotipos 0:34 y 0:11 de las "Aeromonas" mesófilas se obtuvieron mutantes isogénicos, bien por resistencia a bacteriófagos específicos para las diferentes estructuras superficiales o bien mediante mutagénesis con un agente alquilante y contraselección con anticuerpos especificos frente a 1as estructuras superficiales a alterar.

Con el uso de los citados mutantes se determinó que la vía clásica del complemento es la responsable en las "Aeromonas" pertenecientes al serotipo 0:34 y 0:11 de la activación del complemento y por consiguiente, de la actividad bactericida del suero. Además, se obeservó que la lámina S peresente en las cepas de serotipo 0:11 no activaba la acción del complemento (a diferencia de la lámina A de "A. salmonicida"), sino que el determinante a nivel de las estructuras superficiales de la resistencia a la actividad bactericida del suero en ambos serotipos son los oligosacáridos del núcleo del LPS. Finalmente se demostró que el LPS de todas las "Aeromonas" mesófilas es capaz de activar el complemento, y la razón de ser sensible o resistente a la actividad bactericida del suero se debe a la fijación o no de C3b pegado a la membrana y la consiguiente formación de los complejos C5b-9.
The motile "Aeromonas" group is characterized by their high diversity degree of virulence. These differences are related with molecular structures located on the bacterial surface.

Several bacteriophages of motile "Aeromonas" were isolated and characterized from water samples. Thus, it was obtained bacteriophages whose receptors are: the 0 antigen lipopolisaccharide (LPS) of 0:34 serotype strains, the core LPS of 0:34 and 0:11 serotype strains (as soon as "Aeromonas salmonicida" and the monopolar flagellum of motile "Aeromonas".

Then, motile "Aeromnas" 0:34 and 0:11 isogenic mutants were obtained by resistance to the specific bacteriophages for different structures, or by mutagenesis with an alquilant agent and contraselection with specific antibodies.

Using the different isogenic mutants it was possible to determinate: a) the complement activation pathway in the 0:34 and 0:11 serotypes motile "Aeromonas" is the classical pathway, b) the S-layer present on the 0:11 serotype strains not activate the complement action; but, in contrast, the A-layer present on the "Aeromonas salmonicida" strains active this action, c) the complement activation determinant at the structural bacterial surface are the core LPS oligosaccharides, and d) the LPS present at all motile "Aeromonas" strains activate the classical complement pathway; and the sensibility or resistance from the bactericidal action was due to the presence or absence of C3b linked on the membranes and the subsequence formation of C5b-9 complexes.

The regulation of the expression of virulence genes in Salmonella enterica serovar Typhimurium is an intensively studied feature of Salmonella lifestyle. How Salmonella integrates environmental signals to activate virulence-related genes within the host has been explored. The genes encoded in Salmonella pathogenicity island I (SPI-1) required for the invasion of epithelial cells are well characterized, and many regulators involved in the activation of SPI-1 genes have been described. However, little is known about mechanism involved in the repression of SPI-1 under conditions were Salmonella does not require the expression of virulence-related genes. The expression of SPI-1 encoded genes have been reported to be a burden for Salmonella physiology and therefore mechanism to control shut down of SPI-1 under non permissive conditions might play a crucial role in Salmonella physiology. Here we describe that at exponential phase, CRP-cAMP, which acts as an activator at stationary phase, represses the expression of SPI-1 genes. The overall objective of this thesis was to characterize how CRP-cAMP silences SPI-1 expression under non-permissive conditions and to describe the molecular mechanism behind this phenotypic observation. In this thesis we i) define the target gene for the CRP-mediated regulation of SPI-1 ii) elucidate at which level of regulation CRP-cAMP modulates the expression of the SPI-1 genes master regulator hilD iii) characterize the involvement of CRP-cAMP dependent sRNA in hilD regulation iv) characterize the interaction of the CRP-cAMP dependent sRNA Spot 42 with the hilD 3’UTR region to regulate SPI-1 and v) explore the role of CRP-cAMP in the modulation of the SPI-1 repressor CsrA through the regulation of the long non-coding RNA csrB and csrC. CRP-cAMP represses hilA expression at exponential phase (non-permissive conditions for SPI-1 expression) and acts as an activator at stationary phase (permissive conditions for SPI-1 expression). CRP-cAMP mediated repression of hilA causes a concomitant attenuation in the expression level of SPI-1 encoded effector proteins. The regulation of SPI-1 during logarithmic growth phase occurs upstream of HilA by repressing hilD, hilC and rtsA expression and is mediated by the regulation of hilD expression at the post transcriptional level through the hilD 3’UTR. CRP-cAMP mediated regulation of hilD requires, in addition to the hilD 3’UTR, the sRNA chaperone Hfq and the major endonuclease RNAse E. CRP-cAMP represses the expression of the sRNA Spot 42 at exponential phase. We show that Spot 42 positively regulates hilD expression at exponential growth phase and requires of the presence of the hilD 3’UTR, the sRNA chaperone Hfq and the major endonuclease RNAse E. Interestingly, Spot 42 and the hilD 3’UTR region physically bind to Hfq. Spot 42 physically interacts with the last 150 nt of the hilD 3’UTR and unstructured region III of Spot 42 is required for the regulation of hilD. CRP-cAMP represses csrC but not csrB expression at exponential phase to regulate the expression of hilD. Remarkably, the CRP-cAMP dependent sRNA Spot 42 positively regulates the expression of csrC.
La regulación de la expresión de genes de virulencia en Salmonella enterica serovar Typhimurium es una característica intensamente estudiada en Salmonella. La forma en que Salmonella integra señales ambientales para activar los genes relacionados con la virulencia dentro del huésped ha sido explorada. Los genes codificados en la isla de patogenicidad I de Salmonella (SPI-1) son necesarios para la invasión de células epiteliales, están bien caracterizados y se han descrito muchos reguladores implicados en su activación. Sin embargo, poco se sabe sobre el mecanismo implicado en la represión de SPI-1 en condiciones en las que Salmonella no requiere la expresión de genes relacionados con la virulencia. Es sabido que la expresión de genes codificados por SPI-1 son una carga para la fisiología de Salmonella y por lo tanto el mecanismo para controlar la represión de SPI-1 en condiciones no permisivas podría desempeñar un papel crucial en la fisiología de Salmonella. Aquí se describe que en fase exponencial, CRP-cAMP, que actúa como un activador en fase estacionaria, reprime la expresión de los genes SPI-1. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar cómo el CRP-cAMP silencia la expresión de SPI-1 en condiciones no permisivas y describir el mecanismo molecular detrás de esta observación fenotípica. El CRP-cAMP reprime la expresión de hilA en la fase exponencial (condiciones no permisivas para la expresión de SPI-1) y actúa como un activador en fase estacionaria (condiciones permisivas para la expresión de SPI-1). La represión mediada por CRP-cAMP de hilA provoca una atenuación concomitante en el nivel de expresión de proteínas efectoras codificadas por SPI-1. La regulación de SPI-1 durante la fase de crecimiento logarítmico se produce aguas arriba de HilA mediante la represión hilD, hilC y rtsA expresión y está mediada por la regulación de hilD a nivel post transcripcional a través de la hilD 3'UTR. La regulación mediada por CRP-cAMP de hilD requiere, además de la hilD 3'UTR, la chaperona Hfq y la endonucleasa RNAsa E. CRP-cAMP reprime la expresión del sRNA Spot 42 en la fase exponencial. Mostramos que Spot 42 regula positivamente la expresión hilD en la fase de crecimiento exponencial, Spot 42 interacciona físicamente con los últimos 150 nt de la hilD 3'UTR.

Recientemente se ha reconocido la patogenicidad de Aeromonas en cuadros gastrointestinales del hombre y de los animales (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010). Se han publicado nuevos estudios que amplían el conocimiento de su taxonomía, los factores asociados a su virulencia, así como también, la frecuencia de su resistencia a los antibióticos, especialmente en las especies causantes de infecciones graves como Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii subsp. sobria (Albarral 2013; Ghenghesh et al., 2014; Fatima et al., 2013). Se han aislado causando procesos infecciosos graves como bacteriemias, heridas, endocarditis, meningitis y neumonías (Tequianez et al., 2005; Rodríguez et al., 2005; Fátima et al., 2013; Grim et al., 2013). Existen diferentes factores de virulencia, principalmente citotoxinas, enterotoxinas, hemolisinas, proteasas, gelatinasas, ADNasas y otros que pueden determinar su patogenicidad (Ghenghesh et al., 2014; Grim et al., 2013). En el medio ambiente, Aeromonas es muy ubicua y está ligada al ambiente acuático. Los datos epidemiológicos sugieren fuertemente que muchas de las infecciones son adquiridas a través del consumo de agua y/o alimentos contaminados (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010; Carvalho et al., 2012), aunque por el momento no se han descrito los linajes predominantes en ambos ecosistemas. La Hipótesis de esta Tesis Doctoral fue que los aislados de Aeromonas de muestras clínicas humanas que producen cuadros invasivos, poseen factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad distintos a las muestras medioambientales, y además corresponden a linajes genéticos diferentes. Nuestro Objetivo General fue caracterizar fenotípica y genotípicamente una colección de cepas de Aeromonas de distintos orígenes en relación con su patogenicidad. Para llevar a cabo este estudio se realizó en primer lugar un estudio retrospectivo de la prevalencia y su evolución en el tiempo (1996-2014) de Aeromonas en muestras clínicas del Hospital Universitario Ramón y Cajal de Madrid. También se creó una colección de 40 cepas de diferentes orígenes [ambientales del Río Loa, Antofagasta en Chile (n=6), aguas residuales de Túnez (n=5), diarrea (n=19), bacteriemia (n=9), y neumonía (n=1)] y se les realizó diferentes análisis fenotípicos, bioquímicos y moleculares. En todas las cepas se determinó la sensibilidad a antibióticos, la presencia de factores de virulencia y su diversidad clonal mediante electroforesis en campo de pulso. Posteriormente, 15 cepas seleccionadas fueron tipadas mediante MultiLocus Sequence Typing (MLST) y en ellas también se estudió la variabilidad de la estructura de su lipopolisacárido. Finalmente en 6 cepas se analizó su adherencia a la línea celular Caco-2 y su capacidad de invasión. Los resultados mostraron que A. hydrophila (84%) es la especie más prevalente en nuestras muestras clínicas seguida por A. caviae (12%). El número de muestras con Aeromonas se ha duplicado desde 1996 hasta 2014, siendo las heces la muestra mayoritaria con diferencia. Dentro de nuestra colección de 40 cepas, no se evidenció resistencia a los antibióticos y las cepas clínicas portaban mayor número de genes de virulencia, en comparación que las ambientales. Los estudios de campo pulsado mostraron una gran diversidad genética y las 15 tipadas mediante MLST se correspondieron con STs no descritas. La estructura del LPS fue cepa-dependiente, correspondiéndose las estructuras más complejas con las cepas de origen clínico. A pesar de su origen invasivo, nuestras cepas no presentan capacidad para invadir e internalizarse dentro de las células Caco2 diferenciadas a mucosa intestinal. Finalmente, y a modo de conclusión general, podemos que al igual que ocurre en otros microorganismos, la virulencia y patogenicidad debe ser demostrada a nivel de cada cepa, ya que no se puede generalizar dentro de una misma especie, y que el estado inmunológico del huésped también juega un relevante papel en la infección por Aeromonas.
In the last years, several studies demonstrating the pathogenicity of the Aeromonas genera, their taxonomic updates, their virulence factors and their antimicrobial resistance profile. Aeromonas are very ubiquitous in the environment and it is linked to aquatic ecosystems. The epidemiology strongly suggests that infections are a consequence of the contact with contaminated water and/or food. In spite of this, the predominant lineages linked to human infections have not been described. Our Hypothesis was that clinical human strains possess different virulence factors than those from environmental origin, and corresponds with different genetic lineages. The Aim was to characterize an Aeromonas collection from different origins. First, we realized a retrospective study between 1996-2014 of the Aeromonas clinical strains collected at the University Hospital Ramon and Cajal. Second, we collected 40 strains of different origins [Rio Loa, Antofagasta in Chile (n=6), waste water of Tunis (n=5), diarrhoea (n=19), bacteraemia (n=9), and pneumonia (n=1)]. All strains were identify and we determine their virulence factors, their antibiotics susceptibility and their genetic diversity by PFGE. Furthermore, 15 selected strains were typed by MLST and also analyzed the lipopolysaccharide. Finally, the adherence/invasion ability of 6 strains to Caco-2 was evaluated. The results showed that A. hydrophila (84 %) is the more prevalent specie in our clinical samples followed for A. caviae (12 %). Their frequency has doubled from 1996 to 2014, being the faeces the most frequent sample. Inside our collection of 40 strains, antibiotic resistance was not observed and the clinical strains carried more virulence genes than the environmental ones. The PFGE studies showed a great genetic diversity and the 15 MLST-typed strains corresponded with not previously described STs. The lipopolysaccharide structure was strain dependent, and the most complex structures correspond to clinical isolates. Our strains were unable to invade the Caco2 cells differentiated to mucous intestinal. Finally, and as general conclusion, the virulence and pathogencity might be studied to level for each strain individually, since it is not possible to generalize inside the same species. In addition, the immunological condition of the patients also might play a relevant role in the Aeromonas infection.

P. aeruginosa es uno de los principales patógenos nosocomiales y posee una gran capacidad de desarrollar resistencias a los antimicrobianos con la emergencia de cepas multirresistentes (MDR) y extremadamente resistentes (XDR). En las últimas décadas se ha producido un incremento de las infecciones por cepas multirresistentes que plantea la necesidad de desarrollar estrategias de control de infección y un uso prudente de los antimicrobianos. En este contexto se desarrolla la presente tesis doctoral en la que se incluyen ocho trabajos publicados en revistas científicas, que están encaminados tanto a mejorar el conocimiento epidemiológico de P. aeruginosa como a evaluar el impacto de la multirresistencia en la patogenicidad y virulencia de P. aeruginosa desde una perspectiva clínica, epidemiológica y experimental. La posible existencia de un coste biológico asociado a la multirresistencia supondría una menor virulencia de las cepas multirresistentes y podría justificar un uso más selectivo de las antibioticoterapias empíricas. Este proyecto doctoral incluye un estudio retrospectivo de neumonías asociada a ventilación mecánica por P. aeruginosa en el que se demostró que la mortalidad precoz era superior en las causadas por cepas no multirresistentes que en aquellas causadas por cepas multirresistentes. En un segundo estudio retropectivo, se identificó el consumo de fluoroquinolonas como principal factor de riesgo para el desarrollo de bacteriemia por P. aeruginosa XDR. Esta tesis incluye un estudio observacional prospectivo en el que se realizó vigilancia activa de colonización intestinal y de infección por P. aeruginosa. Gracias a este estudio se demostró que: 1) la colonización intestinal por cepas de P. aeruginosa MDR es más tardía que la colonización por cepas sensibles; 2) el consumo previo de fluoroquinolonas y carbapenémicos son los principales factores de riesgo para la colonización por P. aeruginosa multirresistente; 3) la colonización intestinal es un requerimiento clave para el desarrollo posterior de infección por P. aeruginosa; 4) la invasividad clínica fue mayor en las cepas no multirresistentes que en las multirresistentes, desarrollando los pacientes colonizados por cepas de P. aeruginosa no multirresistente con más frecuencia y precocidad infección que aquellos colonizados por cepas multirresistentes policlonales; 5) la intensidad de la respuesta inflamatoria se asoció con la severidad de la infección por P. aeruginosa, especialmente en infecciones bacteriémicas y 6) la respuesta inflamatoria fue superior en las infecciones por P. aeruginosa XDR en las que había un mayor porcentaje de infecciones bacteriémicas. En esta tesis también se incluye un estudio multicéntrico de pacientes con bacteriemia por P. aeruginosa se investigaron los genotipos del sistema de secreción tipo III y su relación con el pronóstico de los pacientes; demostrándose que el genotipo exoU+ es uno de los principales determinantes de virulencia de P. aeruginosa y se asocia a una mayor mortalidad precoz. Este genotipo fue más frecuente en los fenotipos no multirresistentes que en los multirresistentes. Finalmente, mediante un modelo experimental in vitro e in vivo se evaluó el impacto de la multirresistencia en la patogenicidad y virulencia de P. aeruginosa. En el modelo de peritonitis-sepsis murino se observó que las cepas multirresistentes presentaron menor capacidad de producir infección localizada y diseminada, menor capacidad de producir respuesta inflamatoria y menor mortalidad que las cepas sensibles. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistente producen una colonización más tardía y sufren un coste biológico, manifestado con una menor tasa de crecimiento in vitro, una menor invasividad clínica, una menor capacidad de producir respuesta inflamatoria y una menor mortalidad atribuible de las cepas multirresistentes. Esto permite considerar un mayor margen en el abordaje empírico de estas situaciones clínicas y una utilización más ajustada de la antibioterapia.
Pseudomonas aeruginosa is one of the most common nosocomial pathogens worldwide, and continuously evolving resistance to multiple antimicrobial agents has become a significant health problem. However, the biological implications of antibiotic resistance on the pathogenicity and virulence of P. aeruginosa are not clearly established. It is believed that acquisition of resistance mechanisms may have a negative impact on bacterial fitness (a fitness cost), resulting in impaired bacterial physiology and, in turn, a loss of virulence. Improve knowledge about the possible biological cost associated with resistance may help to implement infection control strategies as well as improve antibiotic prescription. In this context, this doctoral thesis evaluates the impact of multidrug resistance on the pathogenicity of P. aeruginosa through epidemiological, clinical and experimental studies. Using clinical and epidemiological data, we investigated if there were differences in the outcome, in the ability to develop colonization and infection between multidrug resistant (MDR) and non-MDR P. aeruginosa strains. In a retrospective study we observed that early mortality was higher in ventilator-associated pneumonia caused by non-MDR P. aeruginosa than those caused by MDR strains. In a prospective study we demonstrated that intestinal colonization occurred more prematurely for non-MDR P. than for MDR isolates. The ability to produce infection (clinical invasiveness) was also higher in patient colonized by non-MDR isolates than those colonized by MDR strains. Furthermore, using in vitro and in vivo models we demonstrated that MDR profiles were associated with a reduction in virulence of P. aeruginosa. In vitro growth rate was shorter in non-MDR than in MDR isolates. In a mice peritonitis/sepsis model we observed that non-MDR P. aeruginosa isolates had a greater ability to produce infection, to elicit inflammatory response and to cause mortality than MDR strains. Overall, our data suggest that multidrug resistance is associated with a biological cost in P. aeruginosa.

La diarrea és la segona causa de mortalitat infantil a nivell mundial, essent també una de les afectacions més freqüent en viatgers després d’un viatge a zones tropicals. Els patògens implicats de manera més freqüent són d'origen bacterià, destacant per la seva rellevància soques diarreogèniques d'Escherichia coli i Shigella spp. Aquesta patologia usualment sol ser de caràcter autolimitant, però a vegades requereix de l'ús d'antimicrobians, ja sigui per la seva durada o severitat. Lamentablement al llarg dels últims anys els nivells de resistència a antimicrobians no han fet més que incrementar, dificultant els tractaments i fent precís la introducció de noves alternatives de tractament. En la present tesi s'analitzen tant els nivells com els mecanismes de resistència a antimicrobians en soques bacterianes causants de diarrea infantil en zones periurbanes de Lima (Perú), així com de mostres causants de diarrea en viatgers. Els resultats mostren elevats nivells de resistència als antimicrobians que s’usen actualment en el tractament d’aquesta patologia, especialment a ampicil·lina, cotrimoxazol i les quinolones. En aquest últim cas, el resultats obtinguts en analitzar les mostres d'origen infantil van mostrar uns nivells inusualment elevats de resistència, donat el fet que les quinolones no s'usen en aquest segment d'edat. Aquest fet indica que les soques han estat en contacte amb formes residuals, el que fa suposar que l'adquisició de la resistència s’ha produït de manera exògena, potser com a conseqüència d’un ús elevat de quinolones en altres ambients. Així en aquestes soques es constatà una elevada proporció de mutacions als gens gyrA i parC, així com la presència d'elements de resistència transferibles: qnrB o aac (6 ') Ib-cr. Es determina l’us potencial de la rifaximina com una alternativa als tractaments actuals, tant les dades obtingudes in vitro, com la seva baixa capacitat de desenvolupar mutants in vitro resistents als antimicrobians van mostrar la seva potencial utilitat en el tractament de la diarrea d’origen bacterià. A més a més es va observar que les soques que esdevenien resistents, aquesta selecció perdurava en el temps, essent de caràcter estable. No obstant els resultats obtinguts en analitzar les soques comensals i diarreogèniques d'E coli aïllades de nens menors de 2 anys de la zona de Chorrillos (Lima) es va veure que presentaven elevades proporcions de resistència a antimicrobians, associats sobretot a sobreexpressió de bombes d’expulsió inhibibles per Phenyl-Argynil-beta- Naphtylamyda (un inhibidor de bombes), fet que suggereix la presència de factors ambientals que afavoreixin la desregulació d'aquestes bombes fent que els bacteris esdevinguin resistents.
Diarrhea is the second leading cause of child mortality worldwide, being also the most common of the effects on travelers after trip to the tropics. The most frequent pathogen isolated are bacteria, and among these diarrheogenic Escherichia coli and Shigella spp are relevant. Usually diarrhoea is a self-limiting disease, but sometimes depending of the duration or severity, the use of antimicrobials is required. Unfortunately, over in the last years, the levels of antimicrobial resistance have been increased and the introduction of alternatives of treatment are necessary. In this thesis both the levels and mechanisms of antimicrobial resistance in bacterial strains causing childhood diarrhea in peri-urban areas of Lima (Peru) are analyzed, as well as samples causing diarrhea in travelers. The results show high levels of antimicrobial resistance in use, especially ampicillin, co-trimoxazole and quinolones. In the latter case, the obtained results showed unusual high levels of resistance because quinolones are not used in this age, which suggests the acquisition of resistant strains was exogenously, perhaps due to the high use of quinolones is done in other environments. In these strains the high frequency of mutations in genes gyrA and parC as well as the presence of transferable mechanisms as qnrB or aac (6 ') Ib-cr was verified. The potential of rifaximin as an alternative to current treatments are evaluated. The data from in vitro development of antimicrobial resistant mutants showed its potential usefulness, although the selected strains the resistance was stable. However the results obtained by analyzing diarrheogenic and commensal strains of E. coli isolated from children under 2 years in the area of Chorrillos (Lima) showed elevated levels of antimicrobial resistance associated with efflux pumps overexpression (inhibitable by Argynil-Phenyl-beta- Naphtylamyda). This fact suggests the presence of environmental factors such as toxic, that favoring deregulation of these efflux pumps.