Dissertations / Theses on the topic 'Banque de peptides'

Une banque de peptides cycliques de sept acides aminés exprimés en surface de bactériophages a été utilisée pour la sélection d'inhibiteurs d'un anticorps anti-idiotypique (9G4H9) présentant une activité de type fJ-Iactamase. Cet anticorps catalytique a été produit précédemment au laboratoire via le réseau idiotypique, présentant l'image interne de l'enzyme bactérienne fJ-Iactamase dans son site actif. Les travaux présentés se basent sur la mise en œuvre d'une procédure de sélection originale en deux étapes dans le but de caractériser des clones spécifiques du site actif de l'anticorps 9G4H9. Plusieurs familles de séquences ont été caractérisées, présentant des caractéristiques biochimiques communes. Sept peptides cycliques ont été synthétisés sous forme soluble et testés pour leur capacité d'inhibition indépendamment de l'environnement protéique du support phagique. Finalement, un peptide (Pep 90) présente une forte affinité pour l'anticorps, avec un Kd = 7,4 10-8 M. Des tests d'inhibition directe ont permis d'évaluer une valeur d'inhibition: IC50 = 90~M. Cette étude confirme que la sélection de banques exprimées en surface de phage est une méthode efficace pour déterminer des informations topologiques.

Pour nous permettre de realiser une etude systematique des proprietes organoleptiques et biologiques des peptides (en majorite des decapeptides), nous avons construit une banque de souches transformees de saccharomyces cerevisiae. Chaque clone de cette banque possede un vecteur qui code pour un peptide unique de sequence inconnue et qui permet son excretion dans le milieu de culture. La secretion est obtenue en fusionnant le gene codant pour le peptide avec celui codant pour le pre-pro du facteur. La premiere partie de ce memoire decrit les differentes etapes de la construction du vecteur d'expression-secretion et de la souche de levure receptrice. Nous decrivons en particulier le principe original du procede de synthese des genes par amplification enzymatique et montrons comment la synthese chimique d'oligonucleotides a ete orientee de facon a obtenir une majorite de decapeptides et pour que tous les acides amines soient representes de facon equitable dans les peptides. La transformation de la levure avec une population de plasmides codant chacun pour un peptide unique nous permet d'obtenir une banque d'environ 4000 clones. La deuxieme partie de ce memoire presente l'analyse de la banque. Les dosages effectues sur un peptide facilement identifiable dans le milieu permettent de montrer que le systeme d'excretion est fonctionnel. Par contre, les dosages hplc revelent que la quantite de peptides produits est faible car inferieure a 10 m. Ce resultat nous a amene a developper plusieurs strategies pour tenter d'augmenter la secretion. Nous avons tout d'abord construit un plasmide se maintenant en un plus grande nombre de copies dans la cellule et aussi realise des cultures a haute densite cellulaire. On arrive ainsi a augmenter la production de peptides qui est d'environ 10##7 m. La faible production de ces transformants serait due a une degradation par la souche receptrice. On pense que cette degradation n'est pas due a une protease extracellulaire

Mon travail de thèse a porté sur le ciblage de la vascularisation tumorale : des molécules ciblant l'endothélium tumoral ont été recherchées dans le but d'amener des molécules thérapeutiques spécifiquement vers l'endothélium tumoral afin de le détruire et d'atteindre la tumeur qui en dépendait. D'après les données de la littérature, deux cibles ont été choisies pour notre étude : la sélectine E et l'endogline. La sélectine E est une glycoprotéine surexprimée à la surface de l'endothélium activé des zones inflammatoires et tumorales. Classiquement, des antagonistes de son ligand naturel, le SleX, sont recherchés. En nous appuyant sur les groupements clés de l'interaction entre la sélectine E et le SleX, plusieurs familles de mimes du SleX ont été élaborées. La capacité de ces mimes à déplacer l'interaction du SleX exprimé à la surface des cellules HL-60 avec la sélectine E a été évaluée dans un test d'adhésion. Cependant, aucun des mimes testés n'a présenté une affinité suffisante pour envisager son utilisation comme tête de ciblage. Une deuxième stratégie a consisté à rechercher des ligands peptidiques de la sélectine E en criblant des HUVECs activées avec une banque de peptides sur phages. Plusieurs phages-peptides testés en ELISA ont montré une meilleure affinité pour la sélectine E et / ou avec la sélectine P par rapport au phage sans insert. Des tests de compétition avec des peptides synthétiques correspondants permettront d'évaluer leur spécificité pour la cible. En ce qui concerne l'endogline, des ligands peptidiques ont été recherchés avec une banque de peptides sur phages. Dans un premier temps, le gène codant l'endogline humaine a été cloné dans un vecteur d'expression eucaryote afin de réaliser la sélection sur la protéine cellulaire. Une sélection sur la protéine recombinante a été réalisée par la suite pour diminuer le bruit de fond lié aux cellules. Parmi les peptides obtenus, certains ont montré des homologies de séquence avec des ligands de l'endogline et le test de ces phages-peptides en ELISA sur la protéine recombinante a donné un fort signal par rapport au phage sans insert. Ces peptides seront caractérisés prochainement. En conclusion, des ligands peptidiques des sélectines E et P et de l'endogline ont peut-être été identifiés. Ce travail a par ailleurs permis de mettre en place les outils nécessaires à l'utilisation de la technologie de sélection avec des banques de peptides sur phages dans les meilleures conditions possibles.

Les interactions specifiques entre recepteurs et ligands ou anticorps et antigene ont ete etudiees a l'aide de peptides issus du criblage de banques de peptides. La premiere partie de ce travail concerne la mise au point d'un test diagnostique de l'infection des chats par le virus de l'immunodeficience feline (vif). Ce test est fonde sur la reconnaissance specifique par les anticorps des chats infectes d'un peptide synthetique derive de l'enveloppe transmembranaire du virus. Notre test s'avere le plus performant selon les criteres de sensibilite, specificite et rapidite de detection. Une deuxieme partie est consacree a l'etude de la reconnaissance de peptides par des anticorps monoclonaux ou des recepteurs. Deux recepteurs membranaires, le cd40 exprime sous forme soluble et le recepteur beta-3-adrenergique exprime a la surface de cellules, ont servi a cribler des banques de peptides aleatoires exprimes en fusion sur des proteines de bacteriophage m13. Les resultats obtenus suggerent que les systemes de criblage employes etaient inoperants pour la selection de peptides specifiques de l'un ou l'autre recepteur. Nous avons pu determiner les residus critiques responsables des principaux contacts avec un anticorps monoclonal anti-peptide de l'enveloppe du vif. L'etude de 3 auto anticorps anti-adn nous a permis d'isoler des sequences peptidiques reconnues par certains de ces anticorps. Ces sequences, qui definissent un motif consensus sont specifiques d'un seul anticorps. L'injection de certains de ces peptides presentes a la surface de bacteriophages induit chez la souris une reponse anti-adn, suggerant que ces peptides sont capables de mimer l'adn du point de vue antigenique

Le but de ce travail est la selection d'anticorps catalytiques capables de catalyser une liaison peptidique. La reaction choisie est le couplage entre la glycine et la leucine. En respectant les hypotheses enoncees par pauling en 1946, et par jencks en 1969 nous avons synthetise un analogue stable de l'etat de transition de la reaction etudiee. L'analogue couple a une proteine porteuse est utilise pour l'immunisation de souris et pour la selection d'anticorps specifiques. Cette selection a ete realisee a partir de trois banques, une banque combinatoire de fragments scfv de souris, une banque combinatoire naive de fab humains et une banque naive de fragments de vh humain chamelises. Bien que plusieurs clones exprimant des fragments d'anticorps specifiques de l'haptene aient ete isoles aucun fragment d'anticorps specifique de l'analogue de l'etat de transition ne possede l'activite catalytique attendue. Nous avons suggere que les methodes classiques de detection disponibles ne permettent pas de deceler l'activite catalytique recherchee. Tout d'abord, la sensibilite de detection est insuffisante et le turnover des reactions catalysee par les abzymes est encore relativement modeste. De plus, les methodes de detection d'activite sont souvent indirectes en etant basees sur l'affinite de l'anticorps pour l'analogue de l'etat de transition et non pas sur la catalyse. Pour pallier a ces limites, nous avons mis au point de nouveaux tests de detection directe de l'activite catalytique applicable a de nombreuses reactions bi-moleculaire

Les peptides constituent une famille de biomolécules dont l'utilisation dans différents domaines thérapeutiques (cancer, diabète, sida) s'est fortement développée ces dernières années. Le défi pour les chimistes consiste à y accéder grâce à de nouvelles méthodes fiables et efficaces. La première partie de notre travail a d'abord été orientée vers le développement deux méthodes de ligations non natives efficaces et complémentaires de celles existant. La première méthode, appelée ligation thiocarbamate, permet d'obtenir des peptides alkylthiocarbamate avec de très bons rendements, alors que la seconde, appelée ligation azaGly, aboutit à la formation d'un azaGlypeptide. La seconde partie de cette thèse traite de la conception et synthèse de nouveaux peptides susceptibles d'inhiber la signalisation HGF/SF-MET. Le récepteur à activité tyrosine kinase MET et son ligand, l'HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scattor Factor), sont des cibles de choix pour une thérapie anti-cancéreuse. La ligation thiocarbamate, précédemment décrite, et la ligation thioéther plus classique ont été utilisées pour préparer une chimiothèque de peptides sulfonatés d'inhiber cette signalisation de façon extracellulaire. La capacité de liaison des composés de la chimiothèque avec le domaine extracellulaire de MET a été évaluée grâce à la technologie biopuces. L'activité biologique (tests MTT, d'activité kinase) des meilleurs produits a été ensuite évaluée.

L'activation constitutive des protéines STAT5A et STAT5B, retrouvée dans de nombreux cas d'hémopathies malignes et de tumeurs solides, entraîne une forte transcription de gènes prolifératifs et anti-apoptotiques, contribuant au développement tumoral. Ces protéines représentent donc des cibles prometteuses pour de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la recherche d'inhibiteurs des protéines STAT5 est importante car les traitements actuels contre les leucémies sont peu spécifiques, entraînant des effets secondaires. Ainsi, ce projet vise à sélectionner des molécules capables d'inhiber l'activité des protéines STAT5 à partir d'une banque peptidique exprimée sur bactériophage (phage-display). Les premiers travaux ont consisté à produire et à purifier la protéine recombinante STAT5B. La recherche de peptides interagissant avec la protéine recombinante cible a ensuite été réalisée par une procédure de sélection par affinité, conduisant à l'identification de deux séquences peptidiques différentes (PepA et PepM) interagissant avec la protéine lorsqu'elles sont présentées sur phage. L'affinité des peptides sous forme soluble a ensuite été mesurée par Biacore (technologie SPR). Ces résultats montrent que le peptide PepM présente une forte affinité pour STAT5B de l'ordre du nanomolaire. Des expériences de pull-down également montrent que PepM interagit avec la protéine STAT5 lorsqu'elle est sous forme active. Enfin, après avoir confirmé le succès de l'internalisation du peptide dans différentes lignées cellulaires, les résultats préliminaires montrent que cette molécule diminue la viabilité de cellules cancéreuses lorsqu'elles dépendent de l'activité des protéines STAT5
Constitutive activation of STAT5 proteins has been demonstrated in numerous cases of malignant hemopathies and solid tumors. This phenomenon results in enhanced transcription of proliferative and anti-apoptotic genes, contributing to cancer development. Consequently, STAT5 proteins are attractive targets for innovative anticancer therapy. Developing STAT5 direct inhibitors is all the more important that current treatment against leukemias are few specific and cause secondary effects. This project aims at selecting STAT5 inhibiting molecules from a peptide library expressed on bacteriophage surface (phage display technology). First, recombinant STAT5B protein was produced, purified and used as a target during affinity-based selection. After a two-step selection, two peptides (PepA and PepM) were identified. The affinity of the two soluble peptides was measured by Biacore (Surface Plasmon Resonance technology) : PepM shows an nanomolar affinity towards STAT5B recombinant protein. This peptide interacts also with active STAT5 protein as demonstrated by pull down experiments. Finally, PepM effects on different cell lines were studied. This peptide penetrates in cells and preliminary results show that PepM diminishes STAT5 dependent cell viability

Un Fab recombinant, neutralisant les quatre sérotypes du virus de la dengue, a été obtenu à partir d'un hybridome murin, 4E11. Sa chaîne légère présente des homologies avec deux autres anticorps dirigés contre d'autres virus. L'affinité de l'anticorps parental et du Fab 4E11 pour l'antigène est de 10(9)M(-1). Le pouvoir de neutralisation du Fab est inférieur à celui de l'anticorps parental, d'un facteur 4 à 8. L'épitope de l'anticorps 4E11 avait été situé dans la région de la protéine d'enveloppe du virus (E) comprise entre les résidus 296 et 400 [E(296-400)](Mégret et coll. ,1992). Cet épitope a été précisément localisé, par criblage de banques de phages-peptides. Un clone de phage-nonapeptide non contraint (C1) a été sélectionné avec une fréquence de 1/2, et présentai 3 résidus identiques avec la région E(306-314). Deux autres clones sélectionnés présentaient des homologies avec cette région. Un modèle tridimensionnel de la protéine E a montré que la région E(306-314) est exposé aux solvants. Le phage-nonapeptide C1, et le peptide synthétique correspondant à E(306-314), réagissent avec 4E11. Ce peptide synthétique neutralise le virus de la dengue in vitro et représente la majeure partie de l'épitope de 4E11. La région E(284-310) a été décrite (Chen et al,1997) comme pouvant être impliquée dans la fixation du virus de la dengue aux héparanes sulfates fortement sulfatés (HSFS), présents à la surface des cellules-hôtes. Il a été montré que l'anticorps 4E11 bloque la fixation d'un fragment recombinant de la protéine E sur un modèle d'héparance sulfate fortement sulfaté, donc le mécanisme de neutralisation proposé pour l'anticorps 4E11 est celui de l'inhibition de la fixation du virus de la dengue aux HSFS de la surface des cellules hôtes.

Le VIH-1 est l'agent infectieux qui cause le SIDA. De nombreuses thérapies existent pour combattre le SIDA mais aucune ne permet son éradication et des résistances apparaissent. Le développement de nouvelles thérapies est donc nécessaire. Les anticorps simple-domaine (sdAb) de lamas présentent les propriétés idéales pour le développement de molécules neutralisantes. Des lamas ont donc été immunisés avec Vpr et les formes native, ou induite par un miniCD4, du trimère de gp140 (partie extracellulaire de l'enveloppe (Env)). Des banques de sdAbs ont ensuite été construites et des sélections par phage display et par double hybride ont été réalisées. Trois sdAbs se liant au site de liaison du co- récepteur de l'Env et un sdAb se liant au site de liaison du CD4 ont ainsi été sélectionnés. Ces sites sont conservés mais difficile d'accès pour des immunoglobulines conventionnelles. Ces sdAbs ont ensuite été caractérisés par ELISA, SPR et cytométrie de flux pour leur capacité de liaison à différentes Env, et en « single round assay » pour leur capacité de neutralisation d'un large spectre (LS) de pseudovirus. Des protéines multidomaines (plusieurs sdAbs reliés par un linker) ont ensuite été construites et testées pour leur neutralisation. Plusieurs de ces molécules, neutralisant un LS de virus, pourraient être utilisées dans des microbicides. La stabilité caractéristique des sdAbs, même en absence de formation de pont disulfure, par exemple dans un environnement réducteur tel que le cytoplasme, est primordiale dans le développement d'anticorps intracellulaires (intrabodies)
HIV-1 is the infectious agent of AIDS. Numerous therapies exist to fight AIDS, but they are not able to eradicate it, and resistances appear. So, new therapy development is necessary. Single-domain antibodies (sdAb) of llamas have ideal properties to develop neutralizing molecules. So, llamas have been immunized with Vpr and with free or miniCD4 induced trimeric gp140 (extracellular part of the envelope (Env)). SdAb libraries have been built and selections were done by phage display and yeast two hybrid. Three sdAbs targeting the co-receptor binding site of the Env and one sdAb targeting the CD4 binding site have been selected. These sites are conserved but inaccessible by conventional immunoglobulins. These sdAbs have been characterized by ELISA, SPR and FACS for their ability to bind different Env and by single-round assay for their neutralization ability. Multimeric proteins (linked sdAbs) have been built and tested for their neutralization ability. Several of these molecules are able to neutralize a broad spectrum of pseudoviruses. They can be used in microbicides. The characteristic stability of these sdAbs, even without disulfide bound formation, ie into reducing environment, as the cytoplasm, is primordial for intracellular antibody (intrabody) development. One sdAb anti-Vpr has been selected using the Sos Recruitment System (SRS), an yeast two-hybrid system allowing detection of cytoplasmic protein-protein interactions. This sdAb is able to alter the localization of its antigen into eukaryotic cells. It is a proof of concept ot the use of SRS in the selection of intracellularly functional sdAbs

Le cancer de la vessie est un cancer fréquent et extrêmement onéreux par patient puisque plusieurs patients subissent des récidives de cancer et ont recours parfois à des chirurgies complexes. Il est donc important de diagnostiquer efficacement ces cancers lors de la prise en charge initiale du patient. En effet, la procédure standard d’imagerie pour la détection du cancer est la cystoscopie de la vessie guidée par lumière blanche, toutefois cette méthode ne permet pas de bien distinguer les cellules qui sont propices à l’invasion musculaire des cellules de cancer de la vessie non infiltrant. Ce mémoire propose d’utiliser un nouvel immunoconjugué fluorescent ciblant la sous-unité alpha du récepteur de l’interleukine 5, un nouveau biomarqueur spécifique aux cellules du cancer de la vessie infiltrant, afin d’effectuer la cystoscopie de la vessie guidée par fluorescence. Pour ce faire, un protocole de conjugaison du fluorochrome cyanine-5 (Cy5) à un anticorps monoclonal a été développé. De plus, un protocole de conjugaison d’un peptide Cell Accumulator (ACCUM) sur cet anticorps fluorescent (A14-Cy5-ACCUM) a été optimisé. Ensuite, la capacité de cet immunoconjugué à marquer les cellules humaines de cancer de la vessie infiltrantes du muscle (MIBC), HT1376, a été testée. Par la suite, un nouveau modèle orthotpique murin de MIBC humain permettant la validation préclinique prochaine de l’A14-Cy5-ACCUM a été développé. Une banque de plasma et sérum sanguin, et d’urine de patients sains et atteints de cancer de la vessie a été compilé. Cette biobanque contient 111 échantillons de plasma sanguin et d’urine qui pourront être utilisé afin de tester l’hypothèse selon laquelle le niveau d’interleukine-5 sanguin pourrait être un facteur pronostique pour la progression du cancer de la vessie. Ce projet jette les bases pour l’évaluation potentielle de la cystoscopie guidée par fluorescence lors de la prise en charge initiale des patients atteints de cancer de la vessie afin d’améliorer la survie sans progression et la survie à long terme des patients atteints de MIBC.
Abstract: Bladder cancer is a frequent and extremely costly cancer when evaluated on a per-patient basis because of its high recurrence rate and patients undergoing complex medical procedures. It is of utmost importance to better identify the aggressiveness of this cancer at initial diagnosis. The standard procedure for bladder cancer detection is still white-light guided cystoscopy, which relies mostly on physicians experience in regard to identifying invasive malignancies. This memoir proposes the use of a new fluorescent immunoconjugate, targeting the alpha subunit of interleukin-5 receptor (IL-5R[apha]), a new biomarker specific to muscle-invasive bladder cancer (MIBC) cells for fluorescence-guided cystoscopy. To do so, a conjugation protocol to fluorescently label a monoclonal antibody with cyanine-5 fluorophores has been developped. Then, a conjugation protocol to attach Cell Accumulator (ACCUM) peptides to this fluorescent immunoconjugate (A14-Cy5-ACCUM) has been optimized. Moreover, the ability of A14-Cy5-ACCUM to stain MIBC cell line HT1376 has been tested. Most importantly, a novel orthotpic rat model of human MIBC for the future preclinical validation of fluorescence-guided cystoscopy in rat bladder has been developped. Finally, a new bladder cancer tissue repository at the CHUS has been established. This repository contains a total of 111 plasma and urine patient samples that will be helpful to evaluate if interleukin-5 blood levels could be used as a prognosis marker for bladder cancer progression. This project laid the basis for the potential evaluation of fluorescence-guided cystoscopy during initial diagnosis of bladder cancer patients to improve their disease-free and long-term survival.