Academic literature on the topic 'Bioelettronica'

Il campo della Bioelettronica si è sviluppato a partire dal 18 secolo con l’ esperimento di Luigi Galvani che, applicando uno stimolo elettrico ai muscoli di una rana dissezionata, ne osservò il movimento. Da questo esperimento si è aperta la strada che ha portato ad oggi ad un grande sviluppo tecnologico nella realizzazione di dispositivi elettronici che permettono di offrire un miglioramento generale delle condizioni di vita. Come spesso accade con le tecnologie emergenti, i materiali sono la maggiore limitazione nello sviluppo di nuove applicazioni. Questo è certamente il caso della Bioelettronica. I materiali elettronici organici, nella forma di polimeri conduttivi, hanno mostrato di poter dotare gli strumenti elettronici di grandi vantaggi rispetto a quelli tradizionali a base di silicio, in virtù delle loro proprietà meccaniche ed elettroniche, della loro biocompatibilità e dei bassi costi di produzione. E’ da questi studi che nasce più propriamente il campo della Bioelettronica Organica, che si basa sulla applicazione di semiconduttori a base di carbonio in forma di piccole molecole coniugate e di polimeri, e del loro utilizzo nei dispositivi elettronici. Con il termine di ‘Bioelettronica organica’, quindi, si descrive l’accoppiamento tra dispositivi elettronici organici e il mondo biologico, accoppiamento che si sviluppa in due direzioni: da un lato una reazione o un processo biologico può trasferire un segnale ad un dispositivo elettronico organico, dall’altro un dispositivo elettronico organico può avviare un processo biologico.

Questa tesi si inserisce nel campo della Bioelettronica Organica con lo scopo di utilizzare dei transistor elettrochimici (OECT) organici basati sul polimero conduttivo PEDOT:PSS per rilevare l’integrità di un tessuto cellulare e come biosensori di analiti in soluzione. Nella prima parte dell’elaborato, si spiegano le proprietà ed il trasporto di carica dei polimeri coniugati concentrandosi sulle caratteristiche fisico chimiche del PEDOT:PSS, seguito da una trattazione analitica del principio di funzionamento di un OECT. La seconda parte, si concentra sul lavoro sperimentale partendo da una descrizione dei processi di fabbricazione degli OECT, dei metodi di caratterizzazione utilizzati e della progettazione del set-up sperimentale per permettere le misure elettriche nell’incubatore cellulare. In seguito, viene dimostrato l’uso di un OECT completamente a base di PEDOT:PSS come sensore di un neurotrasmettitore (dopamina). In parallelo, il lavoro si è concentrato sull’ottimizzazione dei transistor in termini di formulazione di PEDOT:PSS e di geometria del dispositivo per ottenere tempi di spegnimento veloci compatibili con le risposte cellulari (<300ms). In fase di preparazione alle misure con le cellule si è valutato la funzionalità dell’OECT nelle condizioni di coltura cellulare dimostrando una buona stabilità dei dispositivi. Inoltre, sono stati progettati degli studi di simulazione tramite una membrana porosa per prevedere le risposte dei transistor in presenza di un tessuto cellulare. Partendo dall’esito positivo dei test preliminari, il lavoro si è concluso con il primo esperimento con le cellule tumorali HeLa, in cui si è monitorata la crescita cellulare con immagini ottiche correlate alle misure elettriche. I primi risultati confermano la biocompatibilità dei dispositivi e una risposta elettrica degli OECTs alla presenza delle cellule, aprendo la possibilità di utilizzare questi dispositivi per futuri esperimenti anche con diversi tipi di cellule.

In questa tesi è stato esposto il lavoro, svolto in laboratorio, di fabbricazione degli OECTs, seguito dalle misure raccolte durante le prove effettuate, con le relative analisi e discussioni dei risultati ottenuti. É stato dimostrato che gli OECTs basati sul PEDOT:PSS sono in grado di fornire una misura della concentrazione di sostanze ossidanti.

Questa tesi si inserisce nell’ambito della bioelettronica organica, disciplina che studia l’interazione fra dispositivi realizzati, parzialmente o interamente, con materiali organici e il mondo biologico, con lo scopo di indagare le loro applicazioni, specie volte alla risoluzione di problemi medici. In particolare, questa tesi si propone di studiare transistor elettrochimici organici (OECT), con canale e gate realizzati con il polimero PEDOT:PSS, poli(3.4-etilenediossitiofene) drogato con polistirene sulfonato. I dispositivi sono impiegati come sensori di due diverse tipologie di analiti in soluzione: dopamina (agente riducente) e ossigeno (agente ossidante). Le analisi per il sensore di dopamina sono state realizzate per quattro concentrazioni di analita (10, 50, 100, 200 µM) disciolto in una soluzione salina di PBS in diversi volumi (10, 25, 100 ml); ciò ha consentito di osservare una buona attendibilità del sensore e di verificare che il suo comportamento dipende unicamente dalle concentrazioni di analita e non dai volumi della soluzione. Le analisi per il sensore di ossigeno sono state effettuate invece in soluzione di KCl 0.1 M e in liquido cellulare, DMEM, principalmente per concentrazioni di gas fino al 5%. E’ emerso che il dispositivo è un ottimo sensore in grado di rilevare concentrazioni di ossigeno in soluzione fino a (0.24 ± 0.07)%, ha ottime capacità amplificatorie e una bassa isteresi, che rende ogni risposta valida e indipendente dalla ‘storia’ precedente del sensore.

Questa tesi si inserisce nel ramo di ricerca della Bioelettronica organica, in particolare l'obiettivo è quello di monitorare per via elettrica la formazione e la rottura di ricoprimenti e barriere cellulari. Queste sono di particolare importanza dal punto di vista biologico per il loro ruolo di protezione e per l'azione regolatrice nel passaggio di ioni e macromolecole necessarie al benessere dell'organo. Per fare questo sono stati utilizzati gli Organic ElectroChemical Transistor (OECT) basati sul polimero organico biocompatibile PEDOT:PSS. Per poter portare a termine questo lavoro il primo passo è stato lo sviluppo di un apparato sperimentale, detto TE-OECT (Tissue Engineering-Organic ElectroChemical Transistor), che permettesse l'acquisizione delle misure a bassa intensità di segnale dall'interno di un incubatore oltre alla trasparenza necessaria all'acquisizione di misure ottiche utilizzate come riferimento. Oltre allo sviluppo, l'ottimizzazione e la calibrazione dei dispositivi e del TE-OECT, è stato sviluppato un programma per l'elaborazione dei dati. Sono state misurate le risposte degli OECT in differenti fasi della crescita di due ricoprimenti cellulari (HeLa e NIH-3T3). Per validare le misure elettriche nelle varie fasi della crescita cellulare sono state acquisite immagini al microscopio dei ricoprimenti studiati. Come ulteriore conferma di quanto osservato è stata utilizzata la Tripsina per provocare il distacco dei ricoprimenti. Sono state eseguite misure elettriche durante il distacco per verificare se fosse possibile monitorare in tempo reale l'integrità dei layer cellulari. Questo tipo di analisi permette di ottenere utili informazioni aggiuntive sullo stato del ricoprimento cellulare e rende possibile svincolare l'efficacia di un agente patogeno o l'efficacia di un enzima utilizzato per il distacco cellulare dalle analisi di tipo ottico.

I materiali inorganici sono stati i protagonisti dell'industria dei semiconduttori negli ultimi quarant'anni. Tuttavia, c'è stato un continuo interesse nella ricerca e nell'applicazione di semiconduttori organici (OSC) per dispositivi elettronici, grazie alla loro possibilità di essere processati a bassa temperatura, su substrati flessibili e di essere fabbricati utilizzando diverse strategie. Grazie a queste caratteristiche, questi dispositivi elettronici organici stanno rapidamente emergendo come biosensori, con un alto potenziale per diventare piattaforme point-of-care. Uno dei dispositivi piu´utilizzati è il Transistor Elettrochimico Organico (OECT). Gli OECT possono trasdurre e amplificare segnali elettrici o rilevare analiti biologici previa funzionalizzazione con specifiche unità di bioriconoscimento. Gli OECT operano a basso voltaggio, sono facili da fabbricare su diversi substrati e sono compatibili con l'ambiente acquoso, quindi possono interfacciarsi con sistemi biologici. La configurazione di un OECT include un elettrodo di gate che modula la corrente nel canale attraverso un elettrolita, che può essere non solo una soluzione tampone ma anche un fluido biologico complesso. Quando gli OECT vengono utilizzati come biosensori, il meccanismo di rilevamento si basa sulla variazione di corrente generata da reazioni specifiche con l'analita di interesse. Durante il mio dottorato di ricerca, mi sono concentrata sulla progettazione, fabbricazione e validazione di biosensori basati su OECT per il rilevamento di biomarcatori clinici, mostrando il loro alto potenziale come piattaforma di rilevamento. Abbiamo sviluppato sensori verso vari analiti, da molecole a proteine, usando diverse strategie per dotare il dispositivo di selettività verso gli analiti. In particolare, ho anche dimostrato la possibilità di integrare gli OECT nelle piante, come esempio di interfaccia con sistemi viventi. Nei primi due articoli, abbiamo sviluppato OECT stampati, che presentano PEDOT:PSS come semiconduttore sul canale. Nel primo caso, il dispositivo presenta anche un elettrodo di gate PEDOT:PSS che è stato ulteriormente funzionalizzato con gelatina biocompatibile e l'enzima ureasi per garantire la selettività verso l'urea. Il biosensore è stato in grado di monitorare diverse concentrazioni di urea con un limite di detection di 1µM. Nel secondo articolo l'elettrodo di gate di carbonio stampato è stato prima modificato con platino e succesivamente abbiamo assicurato la selettività verso l'acido urico, un biomarcatore rilevante per l'infezione, intrappolando l'urato ossidasi in una membrana a doppio strato ionico. Il biosensore ha mostrato un limite di rilevamento e selettività di 4,5 µM anche in essudato artificiale. Nel terzo articolo abbiamo progettato un biosensore per la detection di interleuchina-6 (IL6) in grado di rilevare i livelli di citochina in concentrazioni pM. Il meccanismo di rilevamento si basa sul legame specifico tra un aptamero, utilizzato come unità di rilevamento sull'elettrodo di gate, e l'IL6 in soluzione. Nel quarto articolo abbiamo presentato un sensore, basato sull'enzima glucosio ossidasi (GOx) per rilevare l'esportazione di glucosio da cloroplasti. Abbiamo dimostrato il monitoraggio di glucosio in tempo reale con una risoluzione di 1 minuto. Nel secondo articolo, abbiamo sviluppato sensori impiantabili per il monitoraggio in vivo e in tempo reale del trasporto di zuccheri nelle piante. I biosensori presentano un elettrodo di gate multienzimatico per conferire specificità per il glucosio e il saccarosio. In particolare, i dispositivi non hanno causato singificativi danni al tessuto, dimostrando che gli OECT possono rappresentatere soluzioni alternative per studiare processi fisiologici.
Inorganic materials have been the main players of the semiconductor industry for the past forty years. However, there has been a continuous growth in the research and in the application of organic semiconductors (OSCs) as active material in electronic devices, due to the possibility to process these materials at low temperature, on flexible substrates and fabricate them on large-area. Because of these features, organic electronic devices are rapidly emerging as biosensors, with a high potential for becoming a high-throughput tool for point-of-care. One of the most studied platform is the Organic Electrochemical Transistor (OECT). OECTs have been used as biosensors to transduce and amplify electrical signals or detect biological analytes upon proper functionalization with specific biorecognition units. OECTs can operate at low voltages, they are easy to fabricate on different substrates and compatible with the aqueous environment, therefore can be interfaced with living systems. The OECT device configuration includes a gate electrode that modulates the current in the channel through an electrolyte, which can be a buffered solution or a complex biological fluid. When OECTs are operated as biosensors, the sensing mechanism relies on the current variation generated from specific reactions with the analyte of interest. During my PhD, I focused on design, fabrication and validation of different OECT-based biosensors for the detection of biomarkers for healthcare applications, showing their high potential as sensing platform. We developed sensors towards different analytes, ranging from small molecules to proteins, with ad hoc strategies to endow the device with selectivity towards the species of interest. Most notably, I also demonstrated the possibility of integrating OECTs in plants, as an example of interfacing living systems. In the first two papers, we developed screen printed OECTs, presenting PEDOT:PSS as semiconducting material on the channel. In the first case, the device featured also a PEDOT:PSS gate electrode which was further functionalized with biocompatible gelatin and the enzyme urease to ensure selectivity toward urea. The biosensor was able to monitor increasing urea concentrations with a limit of detection of 1µM. In the second paper the screen-printed carbon gate electrode was first modified with platinum and then we ensured selectivity towards analyte uric acid, a relevant biomarker for wound infection, by entrapping urate oxidase in a dual-ionic-layer hydrogel membrane. The biosensor exhibited a 4.5µM limit of detection and selectivity even in artificial wound exudate. In the third paper we designed an interleukin-6 (IL6) OECT based biosensor able to detect cytokine levels down to the pM regime in PBS buffer. The mechanism of detection relies on the specific binding between an aptamer, used as sensing unit on the gate electrode, and the IL6 in solution, allowing for detection ranging from physiological to pathological levels. In the last two papers we developed OECT based biosensors to be interfaced with the plant world. In the fourth paper we presented a sensor functionalized with glucose oxidase (GOx) to detect glucose export from chloroplast. In particular, we demonstrated real-time glucose monitoring with temporal resolution of 1 minute. In the second paper, we developed implantable OECT-based sugar sensors for in vivo, real time monitoring of sugar transport in poplar trees. The biosensors presented a multienzyme-functionalized gate for specificity towards glucose and sucrose. Most notably, the OECT sensors did not cause a significant wound response in the plant, demonstrating that OECT-based sensors are attractive tools for studying transport kinetics in plants.

Questa tesi si inserisce nell’ambito dell’elettronica organica e ha lo scopo di studiare nuovi sensori di ossigeno per valutare il livello di ipossia in cui crescono culture cellulari. Per farlo sono stati realizzati dei transistor elettrochimici organici (OECT) basati sul poli(3,4-etilenedoissitiofene) drogato con polistirene sulfonato (PEDOT:PSS). Le misure sono state effettuate in una soluzione 0.1 M di KCl e in un mezzo di coltura cellulare, con concentrazioni di ossigeno comprese tra lo 0% e il 5%. Si è studiata la risposta dei dispositivi in soluzione 0.1 M di KCl al variare delle tre aree di gate disponibili (0.2, 0.7, 1.9 cm^2), fornendone una caratterizzazione tramite l’analisi delle transcaratteristiche e delle curve di output in tre ambienti (aria, azoto, ossigeno al 5%). Si è poi analizzato l’incremento della corrente di drain nel tempo al seguito di incrementi periodici della concentrazione di ossigeno in soluzione. Gli esperimenti mostrano una correlazione lineare tra incremento relativo di corrente ed aumento di concentrazione di ossigeno, ma eseguendo fit lineari si ottengono pendenze delle rette molto disomogenee tra loro e apparentemente non correlate con i parametri geometrici dei campioni. Si è quindi ipotizzato che le anomalie ottenute siano legate alla degradazione di campioni a causa della loro sovraossidazione durante l’esecuzione delle misure e suggerito nuovi esperimenti per valutare tali effetti. Si sono infine analizzati i risultati ottenuti nel medium cellulare al variare delle due aree di gate che hanno fornito le risposte migliori nelle misure precedenti (0.2 e 1.9 cm^2). In questo caso il gate con area minore si è rivelato più sensibile, ma si sono ottenuti andamenti anomali della corrente di drain in funzione del tempo, probabilmente dovuti alla natura elettrochimica del mezzo di coltura cellulare.

La Bioelettronica organica è una disciplina sviluppatosi a partire dal XVII secolo con l’esperimento di Luigi Galvani che, applicando uno stimolo elettrico ai muscoli di una rana dissezionata, ne osservò il movimento. La Bioelettronica organica è un’evoluzione della suddetta disciplina nel quale elementi di natura biologica vengono combinati con dispositivi elettronici avanzati, basati sull’utilizzo di materiali organici, con lo scopo di realizzare dispositivi in grado di interagire con la materia vivente per sviluppare nuove metodologie diagnostiche, di analisi e terapeutiche. L’accoppiamento tra dispositivi elettronici organici e il mondo biologico si sviluppa in due direzioni: da un lato una reazione o un processo biologico può trasferire un segnale ad un dispositivo elettronico organico, dall’altro un dispositivo elettronico organico può avviare un processo biologico. In particolare, il mio studio di tesi riguarda l’interazione tra dispositivi elettronici e cellule neuronali in grado sia di riconoscere e analizzare l’attività cerebrale, sia di intervenire sul funzionamento tramite micro-stimoli elettrici localizzati. I materiali elettronici organici, quali polimeri conduttivi e piccole molecole, hanno mostrato di poter consentire la fabbricazione di strumenti elettronici che offrono numerosi vantaggi rispetto a quelli tradizionali a base di silicio, in virtù delle loro proprietà elettroniche e meccaniche, della loro biocompatibilità, dei bassi costi di produzione, così da permettere di minimizzare l’invasività e sviluppare applicazioni sempre più innovative.

Nell'ambito della medicina bioelettronica vi è un grande interesse nello sviluppo di bioelettrodi elastici ad interfaccia nanostrutturata per la rilevazione dei segnali elettrici del sistema nervoso. Uno dei materiali organici più performanti è il polimero conduttivo 3,4-polietilenediossitiofene (PEDOT), drogato col polianione polistirene sulfonato (PSS) a formare il PEDOT:PSS nanocomposito. Questo composto tende però a perdere le proprietà elettrochimiche di partenza quando sottoposto a stress meccanico. Per ottenere una caratterizzazione del materiale è stata esaminata la spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) come funzione della frequenza temporale di alcuni elettrodi d' oro rivestiti di PEDOT:PSS elettrodepositato, utilizzando dei substrati microfabbricati. Sono stati inoltre eseguiti confronti con bioelettrodi PEDOT:PSS con l'aggiunta di glicole polietilenico (PEG) in fase di deposizione elettrochimica, un plastificante che migliora le proprietà elastiche dei bioelettrodi. Al fine di ottenere una caratterizzazione topologica dei dispositivi, si è fatto uso di un Microscopio a Forza Atomica (AFM). Infine, è stata elaborata una metodologia per caratterizzare i dispositivi sotto l'azione di uno stress meccanico molto ricorrente nelle applicazioni mediche. Si è constato che gli spettri di impedenza dei bioelettrodi possono essere ragionevolmente descritti da un circuito equivalente formato da una resistenza in serie ad una capacità. I parametri ricavati tramite questo modello sembrano suggerire inoltre un'analogia quantitativa nel comportamento del PEDOT:PSS e del PEDOT:PSS:PEG.

I dispositivi elettronici organici, come i diodi a emissione di luminosa (OLED), i transistor ad effetto di campo (OFET) e le celle solari (OPV) hanno raggiunto una maturità tecnologica e, nel caso di OLED e OPV, anche la produzione industriale. I progressi significativi nella sintesi chimica, nella lavorazione dei materiali e nell'ingegneria dei dispositivi ne hanno migliorato le prestazioni e l'affidabilità. Tuttavia, diverse domande riguardanti il meccanismo di funzionamento dei dispositivi sono ancora irrisolte, specialmente negli OFET. Il trasporto di carica nei semiconduttori organici coinvolge diverse interfacce dei materiali e una delle domande principali che i ricercatori stanno cercando di risolvere, è come la morfologia del dispositivo influenzi il meccanismo di trasporto della carica attraverso il dispositivo. Infatti, la morfologia, il disordine molecolare, energetico e i difetti superficiali possono facilmente influenzare le prestazioni dei semiconduttori. C'è una ricerca impellente atta alla comprensione degli aspetti meccanici della nucleazione e della crescita dei film sottili organici su test pattern reali nell’ottica di comprenderne la morfologia. L'obiettivo principale di questo lavoro è stata la comprensione della correlazione tra i diversi modi di crescita, la morfologia e la risposta elettrica degli OFET in stato solido e in un ambiente elettrolitico. Per questa tesi abbiamo utilizzato come semiconduttore organico il pentacene. La motivazione di questa scelta ricade nella volontà di comprendere la fisica dei transistor a base di pentacene, in funzione dello spessore del canale del semiconduttore. Quest’ultimo, infatti, è stato il nucleo del progetto Marie Curie Sklodowska SPM 2.0, che ha supportato il mio lavoro di ricerca. Il risultato principale di questa tesi è stato aver individuato caratterizzato una nuova crescita anomala dei film sottili di pentacene rispetto all'aumento dello spessore, vale a dire, la massa nel canale del semiconduttore organico. In questa nuova modalità di crescita, vi è una variazione rispetto alla modalità di crescita solitamente osservata in caso di rapido incremento della rugosità, in cui una crescita strato su strato nelle fasi iniziali, si evolve improvvisamente in un modo auto affine caratterizzato da isole in crescita costituite da blocchi a terrazze. Abbiamo osservato questa crescita a temperature di deposizione più basse, ma abbiamo scoperto che in un intervallo preciso di temperatura e velocità di deposizione, vale a dire, 80 ° C e 0,1 A / s, questo modo di crescita non avviene. Abbiamo infatti osservato che invece si verifica un’iterazione della transizione di wetting/dewetting all'aumentare dello spessore. Le sue caratteristiche peculiari consistono nel fatto che la morfologia delle isole come terrazze monomolecolari, viene mantenuta. Tuttavia, i parametri morfologici, come le lunghezze di correlazione e la rugosità, che estraiamo dalle immagini della microscopia a forza atomica (AFM), mostrano oscillazioni anomale con periodo che aumenta con lo spessore. Per spiegare l'andamento dei parametri, abbiamo ideato un'equazione empirica, che comprende sia la crescita 3D auto affine sia le oscillazioni tipiche della transizione di wetting/dewetting, come nei fenomeni dello spinodal dewetting. Abbiamo quindi analizzato le caratteristiche elettriche dell'OFET operante allo stato solido e in ambiente elettrolitico. È stata quindi analizzata la correlazione dei parametri del transistor con la morfologia. Gli esperimenti che sono stati condotti utilizzando la AFM bimodale, ci hanno permesso di studiare le proprietà meccaniche di film sottili di conduttori e semiconduttori. Quest'ultima attività è stata svolta presso il CSIC-ICMM di Madrid durante il mio periodo di studio presso il laboratorio del Prof. Ricardo Garcia.
Organic electronic devices, such as light emitting diodes (OLEDs), field effect transistors (OFETs) and solar cells (OPVs) have reached a technological maturity and, in the case of OLEDs and OPVs, industrial production. Significant advancements in chemical synthesis, materials processing and device engineering have boosted the device performance and reliability. However, several concepts regarding the mechanism of the device operations are still unresolved, especially in OFETs. Charge transport in the organic semiconductors involves different interfaces of the materials and one of the most important questions that people tries to address is how the morphology of the device affects the mechanism of charge transport across the device. Indeed, morphology, molecular and energy disorder, and surface defects can easily influence their performance. There is a compelling quest for understanding the mechanical aspects of the organic thin film nucleation and growth on real test patterns in order to understand the morphology. The main goal of this thesis was to understand the correlation between different growth modes, morphology, and the electrical response of OFETs in solid state operation as well as in an electrolytic environment. Pentacene is the workhorse organic semiconductor that we used throughout this thesis. The motivation is understanding the physics of the pentacene transistors as a function of the semiconductor channel thickness, and it was the core of the EC-Marie Curie project SPM 2.0 that supported my research work. As a new important finding out of this thesis, we discovered and assessed a new anomalous growth of Pentacene thin films vs increase of the thickness, viz. the mass of organic semiconductor in the OFET channel. In this novel growth mode, there is a breakdown to the usually observed growth mode upon rapid roughening, where a layer-by-layer growth at the early stages suddenly evolves into a self-affine mode characterized by growing islands made of terrace stacks. We observed this mode at the lower deposition temperatures, but we discovered that at a precise range of deposition temperature and rate, viz. 80°C and 0.1 A/s, this growth mode is not observed, instead an iteration of wetting/dewetting transition occurs as thickness increases. Its peculiar features consist of the fact that the morphology of the islands as stacks of monomolecular terraces, is retained. However, the morphological parameters, such as correlation lengths and roughness, that we extract from atomic force microscopy (AFM) images exhibit anomalous oscillations with period increasing with thickness. In order to explain the trend of the parameters, we devised an empirical equation that encompasses both self-affine 3D growth and the oscillations typical of wetting/dewetting transition as in the spinodal dewetting phenomena. We then analyzed the electrical characteristics of the OFET operated as solid-state device as well as electrolyte gated devices. The correlation of the transistor parameters with the morphology were analyzed. Experiments using bimodal AFM allowed us to investigate the mechanical properties of conductive and semiconductive thin films. The latter activity was carried out at CSIC-ICMM in Madrid during the secondment at the laboratory of Professor Ricardo Garcia.