Academic literature on the topic 'Biofysica'

<p>Dynorphin A, dynorphin B and big dynorphin are endogenous opioid neuropeptides. They play an important role in a wide variety of physiological functions such as regulation of pain processing and memory acquisition. Such actions are generally mediated through the κ-receptors. Besides opioid receptor interactions, dynorphins have non-opioid physiological activities which result in excitotoxic effects in neuropathic pain, spinal cord and brain injury. In order to gain insight into the mechanisms of the non-opioid interactions of dynorphins with the cell, spectroscopic membrane-interaction studies were performed. We demonstrated that big dynorphin and dynorphin A, but not dynorphin B, penetrated into cells. All dynorphins interact with the membrane model systems with weak membrane-induced secondary structure. Big dynorphin and dynorphin A induce membrane perturbation, calcein leakage and cause permeability of the membrane to calcium in large unilamellar vesicles (LUV). But dynorphins do not translocate in the LUV membrane model system and there is a strong electrostatic contribution to the interaction of the peptides with the membrane bilayer.</p><p>In the second part of this thesis we investigated the amyloid β(1-40) peptide (Aβ). This peptide is related to Alzheimer’s disease and its soluble oligomeric aggregates are reported to contribute to the pathology of the disease. In order to provide better insight into the aggregation processes we examined the membrane interaction of Aβ in a model system. Gradual addition of small amounts of sodium dodecyl sulfate to an aqueous solution gives rise to a secondary structure conversion of Aβ peptide. The conversion can be described as a two state process, from random coil to β-sheet with formation of high molecular mass complexes between peptide and detergent, possibly mimicking the behavior of the peptide when aggregating at a cell membrane surface. At high detergent concentrations there is a transition from β-sheet to α-helix conformation.</p>

<p>The molecular motors of muscle are of potential interest in nanotechnology. These motors consist of the protein, myosin II interacting with actin filaments. It would be of interest to control the interaction between actin and myosin, e.g. in order to steer their direction of motion. Because these proteins are electrically charged their motion in a cell filled with a solution could potentially be controlled by an electric field. Here I have addressed several problems associated with experiments of this type. A main problem was found to be excessive heating of the solution. Another complication was electroosmotic flow and chemical reactions on the cell surface. The electric field can also cause electrophoretic motion of the proteins, which in some cases is undesired. The most effective way to reduce the heating of the solution was to keep the ratio between the cross sectional area of the cell and its cooling surfaces as small as possible. External cooling of the cell and keeping the ionic concentration in the solution as low as possible also prevented overheating. The electroosmotic flow could be stopped with agarose plugs at the cell openings and the surface reactions can probably be avoided if trimethylchlorosilane (TMCS) coated glass rather than nitrocellulose film is used for myosin adsorption. If electrophoretic motion turns out to be a problem it can be reduced/stopped with an electroosmotic flow in the opposite direction. A further conclusion of this study is that actin filaments may be oriented by relatively small field strengths whereas it can be necessary to use electric field strength of 1 MV/m or more to orient myosin. At this extremely high field strength the heat production, in a cell with a rectangular cross section, would probably will be to high. However, if a cell with a circular and very low cross sectional area, i.e. a capillary, is used the heating can possibly be held under an acceptable limit.</p><br><p>Nya generationer av datorer, digitalkameror, mobiltelefoner och annan elektronisk/teknisk utrustning tenderar att bli mindre utrymmeskrävande i förhållande till sin kapacitet i jämförelse med föregående modeller. Detsamma gäller också nya diagnostiska verktyg inom sjukvård, miljöövervakning m.m. Ett behov av aktiva komponenter av mindre format finns alltså på olika håll och möjligheten att skapa komponenter med proteiner som utgångspunkt har börjat undersökas. I denna studie fokuseras på aktin och myosin som tillsammans utgör de viktigaste proteinkomponenterna i skelettmuskler hos t.ex. människor och däggdjur. Dessa proteiners främsta uppgift är således att skapa en rörelse. Hur aktin och myosin fungerar tillsammans kan undersökas i konstgjorda testsystem (in vitro motility assay; IVMA), där proteinerna studeras utanför sin naturliga miljö. Vid den IVMA-metod som ligger till grund för denna undersökning förflyttar sig aktinet mer eller mindre okontrollerat ovanpå myosinet som fästs till en glasyta. För att aktinets rörelse skall bli tekniskt intressant måste denna rörelse kunna kontrolleras med viss noggrannhet. Då dessa proteiner är elektrisk laddade finns möjlighet att påverka/styra dem med elektromagnetiska kraftfält. Huvudsyftet med detta arbete har varit att undersöka om aktinets hastighet och rörelseriktning är möjlig att kontrollera med elektriska fält och vilka komplikationer som kan uppstå. Vid IVMA-försöken är aktinet och myosinet omgivna av en vattenbaserad saltlösning som är nödvändig för dessa proteiners funktion. Eftersom saltvatten är elektriskt ledande, så kommer en elektrisk ström att gå igenom saltlösningen när det elektriska fältet kopplas på. Den elektriska strömmen genom saltlösningen leder i sin tur till att lösningen värms upp. Risk finns alltså att saltlösningens temperatur stiger så mycket så att proteinerna upphör att fungera. Ett annat resultat av elektriska fält genom vattenbaserade lösningar är s.k. elektroosmotiskt flöde. Fenomenet elektroosmos innebär att lösningen försätts i en rörelse som är proportionell mot det elektriska fältets storlek. Vid kraftiga elektriska fält är det alltså möjligt att aktinet sköljs med i det elektroosmotiska flödet. Ytterligare en komplikation som kan uppstå vid elektriska fält genom IVMA-cellen är reaktioner i den beläggning som täcker glasytan vilken utgör botten på cellen. I detta examensarbete har en stor del av tiden ägnats åt att eliminera/reducera ovanstående oönskade bieffekter vid användandet av elektriska fält för att styra proteiner.</p>

Cellular biophysics deals with the physical aspects of cell biology. This thesis presents a number of studies where mathematical models and data analysis can increase our understanding of this field. During recent years development in experimental methods and mathematical modeling have driven the amount of data and complexity in our understanding of cellular biology to a new level. This development has made it possible to describe cellular systems quantitatively where only qualitative descriptions were previously possible. To deal with the complex data and models that arise in this kind of research a combination of tools from physics and cell biology has to be applied; this constitutes a field we call cellular biophysics. The aim of this doctoral thesis is to develop novel approaches in this field. I present eight studies where quantitative modeling and analysis are involved. The first two studies concern cells interacting with their surrounding environment in the kidney. These cells sense fluid flow and respond with calcium (Ca2+) signals. The interaction between fluid and cells in renal tubular epithelium can be described by biomechanical models. This thesis describes a mathematical model of flow sensing by cilia with focus on the flow frequency response and time delay between the mechanical stress and the Ca2+ signaling response. Intracellular Ca2+ is kept at a very low level compared to the extracellular environment, while several intracellular compartments have higher Ca2+ concentration than the cytoplasm. This makes Ca2+ an efficient messenger for intra­cellular signaling, the process whereby signals are transduced from an extracellular stimulus to an intracellular activity such as gene expression. An important type of Ca2+ signaling is oscillations in intracellular Ca2+ concentration which occur due to the concerted interplay between different transport mechanisms within a cell. A study in this thesis examines ways to explain these mechanisms in terms of a mathematical model. Another study in the thesis reports that erythropoietin can regulate the water permeability of astrocytes and that it alters the pattern of Ca2+ oscillations in astrocytes. In this thesis the analysis of this Ca2+ signaling is described. Simulations described in one of the studies show how different geometries can affect the fluorescence recovery and that geometrically constrained reactions can trap diffusing receptors in dendritic spines. When separate time scales are present in a fluorescence revovery after photobleaching (FRAP) experiment the reaction and diffusion components can be studied separately. Applying single particle tracking methods to the migration trajectories of natural killer cells shows that there is a correlation between the formation of conjugates and transient confinement zones (TCZs) in these trajectories in vitro. TCZs are also present in in vivo experiments where they show strong similarities with the in vitro situation. This approach is a novel concept in data analysis methods for tracking immune cells.<br>Cellens biologiska fysik behandlar de fysikaliska aspekterna av cellbiologi. Denna avhandling presenterar ett antal studier där matematiska modeller och dataanalys kan öka vår förståelse av detta område. Under senare år har utvecklingen av experimentella metoder och matematisk modellering drivit mängden data och komplexiteten i vår förståelse av cellbiologi till en ny nivå. Denna utveckling har gjort det möjligt att beskriva cellulära system kvantitativt där endast kvalitativa beskrivningar tidigare var möjliga. För att hantera de komplexa data och modeller som uppstår i denna typ av forskning krävs en kombination av verktyg från fysik och cellbiologi; detta utgör ett område vi kallar cellens biologiska fysik. Syftet med denna avhandling är att utveckla nya metoder inom detta område. Jag presenterar åtta studier där kvantitativ modellering och analys ingår. De första två studierna behandlar hur celler interagerar med sin omgivning i njurarna. Dessa celler känner av ett vätskeflöde och svarar med kalcium (Ca2+)-signaler. Samspelet mellan vätska och celler i tubulärt njurepitel kan beskrivas med biomekaniska modeller. Denna avhandling beskriver en matematisk modell för flödeskänslighet hos cilier med fokus på flödesfrekvenssvar och tidsfördröjningen mellan den mekaniska påverkan och Ca2+-signaleringssvaret. Intracellulärt Ca2+ hålls på en mycket låg nivå jämfört med den extracellulära miljön, samtidigt som flera intracellulära delar har högre Ca2+-koncentrationen än cytoplasman. Detta gör Ca2+ till en effektiv bärare för intracellulär signalering, den process där signaler överförs från ett extracellulärt stimuli till en intracellulär händelse, exempelvis genuttryck. En viktig typ av Ca2+-signalering är de oscillationer i intracellulär Ca2+-koncentration som uppstår på grund av det ordnade samspelet mellan olika transportmekanismer i en cell. En studie  i denna avhandling undersöker olika sätt att förklara dessa mekanismer i form av en matematisk modell. En annan studie i avhandlingen rapporterar att erytropoietin kan reglera vattenpermeabilitet av astrocyter och att det ändrar mönstret av Ca2+-oscillationer i astrocyter. I denna avhandling beskrivs analysen av denna Ca2+-signalering. Simuleringar som beskrivs i en av studierna visar hur olika geometrier kan påverka fluorescensåterhämtning och att geometriskt begränsade reaktioner kan fånga in receptorer in i dendrittaggar. När separata tidsskalor förekommer i ett fluorescence revovery after photobleaching (FRAP)-experiment kan reaktions- och diffusionskomponenter studeras separat. Tillämpande av single particle tracking-metoder på naturliga mördarceller visar att det finns ett samband mellan bildandet av konjugat och transient confinement zones (TCZs) i dessa trajektorier in vitro. TCZs förekommer också i in vivo-experiment där de visar stora likheter med in vitro-situationen. Denna strategi är ett nytt grepp inom dataanalys-metoder för att spåra immunceller.<br>QC 20100726

Natural killer (NK) cells are lymphocytes of the innate immune system responsible for lysing tumor and virally-infected cells. Investigating NK cell heterogeneity can inform the development of more efficacious immunotherapeutic treatments. Cell motility is an essential aspect of NK cell function. Moreover, the cell migration behavior within cell populations displays a marked heterogeneity. For some time it has been clear that cell-matrix interactions can radically alter the behavior of certain types of cells. (1) However, conventional studies of cell migration have relied on flat (2-D) surfaces, and thus do not take this potentially game-changing third dimension into account. Still, migration studies using ECM-mimicking biomaterials such as collagen and Matrigel may employ volume imaging, but often fail to quantify and analyze the vertical direction of migration. This project used silicon microchip-based technology, extracellular matrixlike type I collagen hydrogel, and fluorescence laser scanning confocal microscopy to study the migration behavior of single cells in 3-D. NK and targetcells were embedded in a collagen gel matrix deposited inside sub-mm scale microwells. The microwell provides natural barriers to cell migration, and so ensures that the cells remain confined within the imaging volume. The entire volume of the microwell was scanned for two hours by time-lapse fluorescence microscopy. A total of N  = 14 NK cell migration trajectories were quantified using fluorescence centroid measurements. Results suggest that NK cells retain their cytotoxicity when embedded in the collagen matrix used for the 3-D migration assay. The average migration speed of the studied NK cells in three dimensions was found to be 3.7 ± 0.5μm/min (mean± SEM). Additionally, the NK cells exhibited a directional bias in migration, slightly preferring horizontal migration over vertical migration. In conclusion, this assay readily lends itself to short-term imaging of the migration behavior and cell-cell interactions of NK and target cells embedded in collagen gel in microwells. This microwell-gel system shows promising prospects for future applications at the interface of immunology and engineering.<br>NK-celler är lymfocyter tillhörande det ospecifika immunförsvaret vars uppgift är att uppsöka och avdöda tumör- och virusinfekterade celler. Genom att undersöka heterogeniteten inom NK-cellspopulationer öppnas en möjlighet att förbättra effektiviteten hos immunoterapeutiska behandlingar. Cellmotilitet är en viktig aspekt av NK-cellers funktion. Därutöver uppvisar cellmigrationsbeteendet inom cellpopulationer en märkbar heterogenitet. Det har under en tid stått klart att cell-matris-interaktioner kan ha en genomgripande effekt på beteendet hos vissa celltyper.(1) Emellertid grundar sig traditionella studier av cellmigration på användandet av tvådimensionella, plana ytor, och frånser på detta vis den potentiellt avgörande effekt som den tredje dimensionen kan ha på resultatet. Likväl kan studier som använder extracellulär matrix-liknande biomaterial, såsom kollagen och Matrigel, och som därutöver drar nytta av volymsavbildning för cellmigration ändå ofta bortse från att kvantifiera och analysera cellmigrationen i vertikalled. Detta projekt använde kiselbaserad mikrochipteknologi, extracellulär matrixliknande hydrogel typ I kollagen, samt fluorescensmikroskopi för att undersöka cellmigrationbeteendet hos enskilda NK-celler i 3-D. NK- och målceller bäddades in i en kollagenmatris vilken i sin tur gjöts in i en mindre än millimeterstor mikrobrunn. Mikrobrunnen utgör en naturlig barriär för cellmigration och kan således försäkra att cellerna stannar inuti avbildningsvolymen. Hela mikrobrunnens volym avbildades under två timmar med hjälp av tidsfördröjd fluorescensmikroskop. En tidsserie av mätningarna sammanställdes sedan. Totalt sammanställdes och kvantifierades N  = 14 NK-cellers cellmigrationsbanor genom att uppskatta cellernas fluorescenta mittpunkter i den återskapade 3-D-volymen. Resultaten ger vid handen att NK-celler behåller sin cytotoxiska förmåga när de är inbäddade i 3-D-matrisen som används i mikrobrunnsuppsättningen. Den tredimensionella medelhastigheten för cellmigrationen hos de undersökta cellerna var 3.7±0.5 μm/min (medelvärde±standardfelet). Därutöver uppvisade NK-cellerna en bias i den genomsnittliga riktningen hos cellmigrationen, där horisontell cellmigration föredrogs framför vertikal cellmigration. Avslutningsvis kan sägas att denna experimentella uppsättning utan större problem kan användas för korttidsavbildning av cellmigrationsbeteende och cell-cell-interaktioner hos NK- och målceller inbäddade i en mikrobrunnsingjuten kollagenmatris. Detta mikrobrunn-gel-baserade system uppvisar lovande möjligheter för framtida tillämpningar i gränsytan mellan immunologi och ingenjörskonst.

In this diploma project the so-called fixed beam moving stage (FBMS) module in the Raith 150 electron beam lithography system has been evaluated for making large area zone plate exposures. The project goal, besides the evaluation of the module, has been to find an exposure recipe for exposing zone plates with diameter up to 500 μm. The zone plates fabricated with this method will be used for synchrotron and x-ray free electron laser applications. The thesis starts with a short introduction to zone plate properties and fabrication procedures. Then the work where FBMS exposed zone plates are compared with normal write field exposures of 75 μm diameter zone plates is described. The conclusion is that for these small diameters, major problems with wobbly zones occur for the FBMS patterns. However, for larger diameters the pattern typically looks better. The final result with large area exposures are excellent zone plate patterns with 500 μm diameter and 100 nm outermost zone width. The total exposure time was 2 h 15 min. This relatively short time indicate that it will be practically possible to use the Raith system for these large area exposures.

Targeting protein with the aim of ubiquitin-labelling for degradation is a new and upand coming field of drug discovery. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) areheterobifunctional linker molecules that connects the target molecule to an E3ubiquitin ligase, subsequent ubiquitination of the target protein initiates the proteindegradation by the proteosome system. The functional nature or mechanism ofPROTACs have the potential to reach previously undruggable proteins with shallowbinding pockets where traditionally designed inhibitors have failed. This projectexamines the possibility to develop a biophysical strategy for characterization andranking of PROTAC compounds. During the project biophysical methods such as SPRwith BIAcore T200, GCI with WAVE, switchSense and MST have been used todevelop a PROTAC ranking assay. Limited solubility of the PROTAC compoundshindered the development of a PROTAC ranking assay, the concentrations neededfor affinity estimation could not be reached due to the solubility of the PROTACcompounds under given condition. Hence further development of the PROTACranking assay is required. There is potentially a great deal of knowledge that can begathered from a working biophysical PROTAC ranking assay that can assist in thedevelopment of new therapeutic compounds.

<p>Vi har identifierat flexibelt utbyte och lagring av data i databaser, tillsammans med långvarig satsning på olika existerande och framtida modeller som nyckar till förståelse av det regler nätverk som utgör bron mellan geno- och fenotyp. Denna pilot studie av modellering av stora cellulära kontroll nätverk utgår från en intressant medicinsk frågeställning inom molekylär cellbiologi: Är framtvingad expression av Cdc6, aktivering av Cdk4/6 och Cdk2 tillräcklig för förankringsfri entré av cell cykelns S fas? Vi försöker konstruera en modell för att besvara denna fråga, på så sätt att vi kan detektera problem vid modellering av stora kontroll nätverk, diskutera implikationer och möjliga lösningar.</p><p>Vår modell är baserad på 1447 reaktioner och innehåller 1343 olika molekyler. Vi använde graf teori för att studera dess topologi och gjorde följande fynd: Nätverket är skalfritt och avtar enligt en potensfunktion, som var väntat baserat på tidigare arbeten. Nätverket består av ett stort väl förenat kluster. Det kan inte bli modulariserat i form av starka komponenter eller block i en användbar form. Detta eftersom vi fann en stor komponent eller ett stort block som innehöll majoriteten av alla molekyler och mer än hundra små komponenter eller block med en eller några molekyler. Vårt nätverk stämmer inte överens med en hierarkisk nätverks modell bestående av block förenade av cut-vertices.</p><br><p>We have identified flexible exchange and storage of data in databases, together with prolonged investment in different existing and future modelling formalisms as key issues in successful understanding of the regulatory network responsible for the connection between geno- and phenotype. This pilot study of modelling of large-scale regulatory networks starts with a medically interesting question from molecular cell biology: Is enforced expression of Cdc6, activation of Cdk4/6 and Cdk2 sufficient for anchorage-independent entry of the S phase of the cell cycle? We try to construct a model for answering this question, in such a way that we can reveal obstacles of large-scale regulatory modelling, discuss their implications and possible solutions.</p><p>Our model is based on 1447 reactions and contains 1343 different molecules. We used graph theory to study its topology and made the following findings: The network is scale-free and decays as a power-law, as could be expected based on earlier works. The network consists of one huge well connected cluster. It cannot be modularised into strong components or blocks in a useful way, since we get one big component or block containing a majority of all molecules and more than a hundred tiny components or blocks with one or a few molecules. Our network does not agree with a hierarchical network model consisting of blocks linked by cut-vertices.</p>

This work aims to investigate the fragmentation of an ionized Cystine molecule, as simulated in the framework of molecular dynamics and quantum mechanics. Cystine is viewed as a model system for larger sets of peptides -- ultimately contributing to the understanding of protein photofragmentation, which is crucial for determining the structure of a protein using new methods. The analysis software was written in Python, partly in conjunction with another student. The photofragmentation of the molecule is analyzed in terms of bond integrity versus time and mass-to-charge ratios for the resulting fragments. Generally, the molecule disintegrates into more and smaller fragments the higher the degree of ionization is.<br>I det föreliggande arbetet undersöks fragmenteringen av en joniserad molekyl Cystin, som simulerats medelst molekyldynamik och kvantmekanik. Cystin betraktas som ett modellsystem för större peptidstrukturer -- något som i längden kan bidra till större förståelse för fotofragmentering av proteiner, vilket i sin tur är avgörande inom nya metoder för strukturbestämning. Analysprogrammet skrevs i Python och delvis i samarbete med en annan student. Molekylens fotofragmentering analyseras med avseende på bindningsintegritet över tid, samt mass-laddningskvot hos de resulterande fragmenten. I allmänhet sönderfaller molekylen till fler och mindre fragment ju högre joniseringsnivån är.