Dissertations / Theses on the topic 'Biomarcador molecular'

Mestrado em Bioquímica Clínica
A presente dissertação apresenta o desenvolvimento de um dispositivo dedicado ao diagnóstico do cancro da mama em point-of-care e que foi construído com base na preparação de um novo material biomimético e sua incorporação em membranas poliméricas de poli(cloreto de vinilo), PVC, plastificado, para subsequente deteção potenciométrica. Foi considerado para este estudo o biomarcador de interesse clínico convencional no contexto do cancro da mama, o Breast Cancer Antigen (CA15-3). O desenho do novo material biossensor baseou-se na síntese de anticorpos plásticos por tecnologia de impressão molecular. O anticorpo plástico foi impresso por polimerização em volta da estrutura proteica do CA15-3, atuando este biomarcador como obstáculo ao crescimento da matriz polimérica. O polímero impresso foi obtido por eletropolimerização de pirrol, estabelecida na superfície de vidro condutor (com FTO) com base em voltametria cíclica, que compreendeu 40 ciclos entre -0,2 e 1,0 V. A mistura reacional utilizada continha monómero (pirrol, 5,0×10-3 mol/L) e proteína molde (CA15-3, 100U/mL), preparados em solução de tampão fosfato salino, com pH 7,2 e com 1% de etilenoglicol. O biomarcador foi removido da matriz polimérica por ação proteolítica da proteinase K. O material biomimético preparado foi aplicado na construção de sensores potenciométricos e testado relativamente à sua afinidade e seletividade de ligação à CA15-3, por avaliação do desempenho analítico dos elétrodos resultantes. Para este efeito, o material biomimético foi disperso em membranas de PVC plastificado, que continham ou não um aditivo iónico lipofílico, e aplicado em suporte condutor sólido. O desempenho analítico foi avaliado inicialmente em meio tampão e posteriormente em soro sintético. As melhores características de resposta analítica em soro sintético foram obtidas com membranas preparadas com material impresso e com aditivo aniónico lipofílico, tetrakis-4-(Clorofenil)borato. Os limites de deteção correspondentes foram, em média, 4,6 U/mL de CEA, para uma resposta linear a partir de 5,4 U/mL e uma sensibilidade catiónica igual a 60,6 mV/década. As análises de soro sintético dopado indicaram resultados exatos e precisos.
This thesis presents the development of a low cost sensor device for the diagnosis of breast cancer in point-of-care, made with new synthetic biomimetic materials that were incorporated in plasticized poly(vinyl chloride), PVC, membranes, for subsequent potentiometric detection. This concept was applied to target a conventional biomarker in breast cancer: Breast Cancer Antigen (CA15-3). The new biomimetic material was obtained by molecularly-imprinted technology. In this, a plastic antibody was obtained by polymerizing around the biomarker that acted as an obstacle to the growth of the polymeric matrix. The imprinted polymer was specifically synthesized by electropolymerization on FTO conductive glass, by using cyclic voltammetry, including 40 cycles within -0.2 and 1.0 V. The solution where the polymerization took place contained monomer (pyrrol, 5.0×10-3 mol/L) and protein template (CA15-3, 100U/mL), all prepared in phosphate buffer saline, with a pH of 7.2 and 1% of ethylene glycol. The biomarker was removed from the imprinted sites by proteolytic action of proteinase K. The biomimetic material was employed in the construction of potentiometric sensors and tested with regard to its affinity and selectivity for binding CA15-3, by checking the analytical performance of the obtained electrodes. For this purpose, the biomimetic material was dispersed in plasticized PVC membranes, including or not a lipophilic ionic additive, and applied on a solid conductive support of graphite. The analytical behavior was evaluated first in buffer and later in synthetic urine. The best analytical performance in buffer was obtained with membranes including biomimetic material and lipophilic anionic additive, tetrakis-4-(Chlorophenyl)borate. The average limits of detection were 4.6 U/mL of CEA, with a linear response down to 5.4 U/mL and a cationic slope of 60.6 mV/decade. The analysis of spiked serum samples showed accurate and precise results.

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Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Atualmente, indicadores bacteriológicos utilizados para avaliar a balneabilidade das águas de recreação estabelecidos em legislações, apresentam limitações como a correlação com seu hospedeiro. Uma variedade de micro-organismos anaeróbios vem sendo considerados alvos promissores no desenvolvimento de indicadores de poluição fecal hospedeiro-especifico. A espécie M. smithii é a única espécie conhecida que coloniza exclusivamente o trato gastrointestinal humano e é altamente prevalente em esgoto. Sendo assim, este projeto tem como objetivo avaliar a presença de M. smithii como bioindicador de contaminação fecal hospedeiro-especifico em águas de recreação costeira no estado do Rio de Janeiro. Para isso foram coletadas amostras de águas superficiais de13 praias (Ilha do governador (n=4), Copacabana (n=1), Leblon (n=2), Prainha (n=2), Ramos (1), Araruama (n=2), Niterói (n=1)) em seguida os parâmetros físico-químicos e as concentrações de coliformes termotolerantes foram determinados. Em seguida foi realizada a caracterização das comunidades de Methano brevibacterspp. através da construção de bibliotecas do gene rrsdo 16S rRNAea detecção e quantificação do M. smithii pela qPCR do gene nifH. Os parâmetros físico-químicos, apresentaram alterações significativas em relação a salinidade e condutividade. Quando analisados em relação a balneabilidade, somente as praias Seca, Pontinha e Ramos apresentaram-se como próprias para atividade recreativa. As análises das bibliotecas demonstraram a prevalência de M. smithiie de organismos não cultivados, muito provavelmente novas espécies do gênero Methano brevibacter ainda não descritas. A PCR convencional detectou M. smithii em 11 amostras, enquanto a qPCR detectou e quantificou cópias do gene nifHem12 amostras. A partir dos dados obtidos podemos concluir que as aplicações de novos indicadores na determinação da origem da contaminação das águas de recreação contribuem para uma avaliação mais precisa da qualidade das águas e consequentemente da saúde da pública.
Currently, bacteriological indicators used to assess bathing water recreation established in laws, have limitations such as the correlation with its host. A variety of anaerobic micro-organisms has been considered promising targets in the development of host-specific indicators of fecal pollution. The specie M. smithiiis the only known species that exclusively colonizes the human gastrointestinal tract and is highly prevalent in sewage. Thus, this project aims to assess the presence of M. smithii as bioindicator of host-specific fecal pollution in coastal recreation waters of Rio de Janeiro. For this surface water samples from 13 beaches (Ilha do Governador (n = 4), Copacabana (n = 1), Leblon (n = 2), Prainha (n = 2), Ramos (1), Araruama (n = 2), Niteroi (n = 1)) then the physico-chemical parameters and concentrations of fecal coliforms were determined. Then the characterization of communities Methanobrevibacterspp was performed. by constructing libraries rrs 16S rRNAe detection and quantification by qPCR of M. smithiinifH. The physico-chemical parameter settings showed significant changes in relation to salinity and conductivity. When analyzed for bathing, only Seca, Pontinha Ramos beaches and presented themselves as fitfor recreational activity. Analyses of libraries demonstrated the prevalence of M. smithii and uncultivated organisms, most likely new species of the genus Methanobrevibacter not yet described. Conventional PCR detected in M. smithii 11 samples, while qPCR detected and quantified copies of the nifH 12 samples. From the data obtained we can conclude that applications of new indicators in determining the source of contamination of water recreation contribute to a more accurate assessment of water quality and consequently the health of the public.

El càncer de bufeta avançat s'associa amb un mal pronòstic i amb opcions limitades de tractament. Tot i l’èxit recent amb l'ús d'inhibidors immunitaris, no tots els pacients responen a la teràpia i encara hi ha la necessitat d'opcions alternatives. La ruta de PI3K/AKT/mTOR està sobreactivada sovint en aquesta patologia i pot ser un objectiu terapèutic potencial per a la intervenció terapèutica. Es va estudiar l'eficàcia antitumoral del TAK-228, un inhibidor oral de mTORC1 / 2 en models preclínics de càncer de bufeta amb alteracions en la transducció de senyals d'aquesta via. Es va demostrar una forta inhibició de la proliferació cel·lular in vitro, i la reducció del creixement del tumor in vivo. Es van analitzar possibles biomarcadors de resposta. Es van observar forts efectes sinèrgics amb la combinació de TAK-228 i TAK-117 (inhibidor de PI3Kα). El TAK-228 va mostrar una millor eficàcia quan es va combinar amb el paclitaxel. Es necessitaran estudis addicionals amb el TAK-228 per veure si aquesta eficàcia terapèutica preclínica es tradueix en benefici clínic per a pacients amb càncer de bufeta.
Advanced bladder cancer is associated with a poor prognosis and with limited treatment options. Despite of the recent success with the use of immune check-point inhibitors, not all patients will respond to therapy and there is still need for alternative options. PI3K/AKT/mTOR pathway is frequently activated in this pathology and can be a potential therapeutic target for treatment intervention. We studied the antitumor efficacy of TAK-228, an oral mTORC1/2 inhibitor in preclinical models of bladder cancer with signal transduction alterations of this pathway. We demonstrated strong inhibition of cell proliferation in vitro, and reduction of the tumor growth in vivo. Potential biomarkers of response are analysed. Strong synergistic effects were observed with the combination of TAK-228 and TAK-117 (PI3Kα inhibitor). TAK-228 did show improved efficacy when combined with paclitaxel. Further studies with TAK-228 will be needed to see if this preclinical therapeutic efficacy is translated into clinical benefit for selected bladder cancer patients.

INTRODUÇÃO: As recidivas e as metástases são os fatores responsáveis pela morte de pacientes com câncer de pulmão (representando 90% dos casos), indicando a necessidade de conhecer as múltiplas vias sinalizadoras envolvidas em sua patogênese, progressão, invasão e metástase. Adenocarcinomas e carcinomas de grandes células invadem primariamente vasos sanguíneos e linfáticos, metastatizando à distância. Já os carcinomas de células escamosas envolvem diretamente o mediastino, sobretudo, linfonodos e pericárdio. Carcinomas neuroendócrinos de baixo grau (carcinoides típicos e atípicos) invadem e metastatizam apesar de serem indolentes, enquanto que carcinomas neuroendócrinos de alto grau (carcinoma neuroendócrino de grandes células e carcinoma de pequenas células), rapidamente metastatizam à distância. Esse espectro diferencial de invasividade nos carcinomas de pulmão ainda não pôde ser definitivamente demarcado por biomarcadores, sobretudo nas variantes neuroendócrinas. Neste aspecto, acredita-se que a EMT esteja mais intimamente envolvida no processo de invasão, despontando como potencial biomarcador. OBJETIVO: Realizar o mapeamento genético da EMT nos carcinomas pulmonares, estabelecendo uma assinatura gênica capaz de prever o potencial de invasão nos diferentes tipos histológicos do câncer de pulmão. MÉTODOS: Espécimes de tumores ressecados cirurgicamente e criopreservados de 60 pacientes foram submetidos a análise de expressão gênica através da qPCR em tempo real, por meio do kit RT2 Profiler PCR array para a EMT com 84 genes de interesse. RESULTADOS: Observou-se a elevada expressão de 24 genes (AKT1, COL1A2, COL3A1, COL5A2, DSP, EGFR, FR11, GSK3B, ILK, ITGA5, ITGAV, ITGB1, JAG1, MAP1B, MMP2, MMP3, SNAI2, SPARC, SPP1, STAT3, TCF3, TGF?3, VPS13A, WNT5A) que participam do processo da EMT e atuam no desenvolvimento da neoplasia pulmonar. Tumores em estádio avançado e com metástases linfonodais apresentaram significante maior expressão dos seguintes genes, COL1A2, COL5A2, DSP, EGFR, FR11, GSK3B, ILK, ITGAV, ITGB1, MAP1B, SNAI2 e VPS13A. Comparando-se carcinomas nãoneuroendócrinos (CEC e AD) e neuroendócrinos (CT, CA, CPPC, CNEGC), observou-se que os neuroendócrinos apresentaram elevada expressão significativa dos genes: FR11, GSK3B, ILK, ITGB1, JAG1, MAP1B e VPS13A. Em relação à sobrevida, a análise univariada demonstrou menor sobrevida para pacientes em estádio avançado do tumor com metástase linfonodal e portador de carcinoma neuroendócrino que apresenta a hiperxpressão de todos os 24 genes da EMT, com exceção dos genes COL3A1 e SPP1. Pela análise multivariada demonstrou-se que pacientes com carcinomas neuroendócrinos com expressão elevada de MMP2 e SPARC apresentaram maior risco de morte (OR 5,41 e 4,94, respectivamente), enquanto que pacientes portadores de carcinomas de células escamosas ou adenocarcinomas com baixa expressão gênica de ILK, SPP1, COL1A2, ITGB1 apresentaram menor risco de morte (OR -7,02; -0,4, -1,3 e -3,02). CONCLUSÃO: Através do presente estudo estabeleceu-se uma assinatura gênica de 24 genes capaz de prever o potencial de agressividade histológica, de invasão e de metástases nos carcinomas pulmonares neuroendócrinos e não-neuroendócrinos
INTRODUCTION: Metastasis are responsible for the death of 90% of patients with lung cancer, indicating the need to know the multiple signaling pathways involved. Adenocarcinomas (Adc) and large cell carcinomas primarily invade blood vessels with distant metastasis, whereas squamous cell carcinoma (SqCC) involves the mediastinal lymph nodes. Neuroendocrine carcinomas of low-grade (typical and atypical carcinoid) are indolent, while high-grade neuroendocrine carcinoma (large cell neuroendocrine carcinoma and small cell carcinoma) metastasize rapidly. Biomarkers of aggressiveness in lung carcinomas remain to be determined, especially in neuroendocrine variants. In these fields, Epithelial to mesenchymal transition (EMT) genes profile emerge promise as an indicator of invasion and metastasis. AIMS: Carry out the genetic mapping of EMT in lung cancer, establishing a gene signature capable of predicting the invasion potential of different histological types of lung cancer. METHODS: Were included specimens of 60 patients and the EMT gene expression was quantified with a quantitative real-time (RT)- PCR carried out on StepOnePlus(TM) Real-Time PCR System (Applied Biosystems) with RT2 Profiler PCR Array System for the EMT pathway wih 84 target genes. (Qiagen, Dusseldorf, Germany). Associations of the gene signature and clinicopathological features, as well as prognostic factors were evaluated. RESULTS: Was observed high expression of 24 genes (AKT1, COL1A2, COL3A1, COL5A2, DSP, EGFR, FR11, GSK3B, ILK, ITGA5, ITGAV, ITGB1, JAG1, MAP1B, MMP2, MMP3, SNAI2, SPARC, SPP1, STAT3, TCF3, TGFbeta3, VPS13A, WNT5A) that are involved in the EMT process and act in the development of pulmonary neoplasia. Tumors at the advanced stage and with lymph node metastasis shown a significant higher expression of the genes COL1A2, COL5A2, DSP, EGFR, FR11, GSK3B, ILK, ITGAV, ITGB1, MAP1B, SNAI2 and VPS13A. Comparing the histological subtypes non-neuroendocrine (SqCC and AD) and neuroendocrine carcinomas (TC, AT, SCLC, LCNEC), was observed that the neuroendocrine variant shown a higher significant expression of the genes FR11, GSK3B, ILK, ITGB1, JAG1, MAP1B and VPS13A. Regarding survival, univariate analysis showed lower survival for patients in the advanced tumor stage, with lymph node metastasis and with neuroendocrine carcinoma histology that presenting overexpression for all 24 EMT genes, with the exception of the COL3A1 and SPP1 genes. Cox regression controlled by, histological types and gene expression of ILK, MMP2, SPP1, SPARC, COL1A2 and ITGB1 showed that patients with neuroendocrine carcinomas with higher expression of MMP2 and SPARC had a higher risk of death (OR 5.41 and 4.94, respectively), whereas patients with squamous cell carcinomas or adenocarcinomas with lower gene expression of ILK, SPP1, COL1A2, ITGB1 showed lower risk of death (OR -7.02, -0.4, -1.3 and -3.02). CONCLUSION: Was established a potential gene signature of 24 genes involved in the EMT process and capable of predicting the histological aggressiveness, invasion and metastasis in neuroendocrine and non-neuroendocrine variants of lung carcinomas

There is now ample evidence that drugs have biologically relevant interactions with more than one protein, a behavior that is commonly referred to as polypharmacology. This finding is starting to have a true impact on the drug discovery process, transforming it into a more holistic endeavor. In contrast, chemical biology continues to be a reductionist discipline, still regarding chemical probes as highly selective small molecules that enable the modulation and study of one specific target. In an effort to bring a more comprehensive perspective to the practice of chemical biology, this Thesis aims at demonstrating that chemical probes, like drugs, tent to bind to more than one protein, a behavior that may have confounded many of the biological insights gathered using these tool compounds. Accordingly, in this Thesis we use the Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) enzyme superfamily to illustrate the consequences that chemical probe polypharmacology have for the practice of chemical biology and follow-on drug discovery. Next, we extend this analysis to a collection of chemical probes to demonstrate the ubiquity of polypharmacology and we provide guidelines to derisk the practice of chemical biology using potentially promiscuous tool compounds. Chemical biology cannot continue to overlook the existence of polypharmacology and the results presented in this Thesis urge it to become a more holistic discipline that looks at the use of tool compounds from a systems perspective.
Avui dia un gran nombre de proves demostren que els fàrmacs exerceixen interaccions biològicament rellevants amb més d’una proteïna, un comportament generalment anomenat polifarmacologia. Aquest descobriment està començant a influir en el procés de descobriment de fàrmacs, transformant-lo en una empresa més holística. Per contra, la biologia química continua essent una disciplina reduccionista que encara considera les sondes químiques com molècules molt selectives que permeten la modulació i l’estudi d’una diana específica. En un esforç per portar una visió més àmplia a la pràctica de la biologia química, aquesta Tesi té l’objectiu de demostrar que les sondes químiques, com els fàrmacs, tendeixen a unir-se amb més d’una diana, un comportament que podria haver confós moltes de les conclusions biològiques derivades del seu ús. En conseqüència, en aquesta Tesi utilitzem la superfamília de les proteïnes Poly(ADP-ribose) polymerasa (PARPs) per il•lustrar les conseqüències de la polifarmacologia de les sondes químiques en la pràctica de la biologia química i el conseqüent descobriment de fàrmacs. Seguidament, ampliem aquest anàlisi a una col•lecció de sondes químiques per demostrar la prevalença de la polifarmacologia i aportem recomanacions per a convertir l’ús de sondes químiques potencialment promiscues en biologia química en una pràctica menys arriscada. La biologia química no pot seguir obviant l’existència de la polifarmacologia i els resultats presentats en aquesta Tesi demostren que la biologia química ha d’esdevenir una disciplina més holística que consideri l’ús de sondes químiques des d’una perspectiva de sistemes.

Angiogênese é o processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos existentes. É um processo vital, mas muitas doenças também dependem deste mecanismo para obter nutrientes e progredir. Estas \"doenças dependentes de angiogênese\" incluem cânceres, retinopatias e degeneração macular. Alguns inibidores da angiogênese foram desenvolvidos na última década, com o objetivo de auxiliar no manejo dessas doenças e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. A maioria destes compostos funciona inibindo a ligação de VEGFA/VEGFR2, que também é um elemento importante para a sobrevivência de células endoteliais quiescentes; e isso pode explicar parcialmente eventos adversos observados em alguns ensaios clínicos. Nossa hipótese é que a melhoria das terapias anti-angiogênicas depende de uma compreensão melhor e mais ampla desse processo, especialmente quando relacionada à progressão das doenças. Utilizando RNA-Seq e um modelo animal bem aceito de angiogênese, o modelo murino de Retinopatia Induzida por Oxigênio, exploramos o transcritoma e identificamos 153 genes diferencialmente expressos durante a angiogênese. Uma extensiva validação de vários genes realizada por qRT-PCR e hibridização in-situ confirmou a superexpressão de Esm1 em células endoteliais de tecidos com angiogênese ativa. A análise de enriquecimento desta lista de genes confirmou a ligação da angiogênese com genes frequentemente mutados em tumores, consistente com a conhecida ligação entre câncer e angiogênese, e forneceu sugestões de fármacos já aprovados que podem ser reutilizados para controlar a angiogênese em circunstâncias patológicas. Finalmente, com base neste panorama amplo da angiogênese, fomos capazes de criar um biomarcador molecular com poder prognóstico para a predição da recidiva de câncer de mama, com aplicações clínicas promissoras. Em resumo, este trabalho revelou com sucesso genes relacionados à angiogênese e forneceu novas alternativas terapêuticas, incluindo potenciais fármacos para reposicionamento. Esse conjunto de genes diferencialmente expressos é também um recurso valioso para investigações futuras.
Angiogenesis is the process of formation of new blood vessels based on existing vessels. It is a vital process but many diseases also rely on this mechanism to get nourishment and progress. These so called angiogenesis-dependent diseases include cancers, retinopathies and macular degeneration. Some angiogenesis inhibitors were developed in the past decade, aiming to help the management of such diseases and improve patients quality of life. Most of these compounds work by inhibiting VEGFA/VEGFR2 binding, which is also a key element to the survival of quiescent endothelial cells; this may partly explain unanticipated adverse events observed in some clinical trials. We hypothesize that the improvement of anti-angiogenesis therapies hinges on a better and broader understanding of the process, especially when related to diseases\' progression. Using RNA-seq and a well accepted animal model of angiogenesis, the murine model of Oxygen Induced Retinopathy, we have explored the transcriptome landscape and identified 153 genes differentially expressed in angiogenesis. An extensive validation of several genes carried out by qRT-PCR and in-situ hybridization confirmed Esm1 overexpression in endothelial cells of tissues with active angiogenesis, providing confidence on the results obtained. Enrichment analysis of this gene list endorsed a narrow link of angiogenesis and frequently mutated genes in tumours, consistent with the known connection between cancer and angiogenesis, and provided suggestions of already approved drugs that may be repurposed to control angiogenesis under pathological circumstances. Finally, based on this comprehensive landscape of angiogenesis, we were able to create a prognostic molecular biomarker for prediction of breast cancer relapse, with promising clinical applications. In summary, this work successfully unveiled angiogenesis-related genes, providing novel therapeutic alternatives, including potential drugs for repositioning. The set of differentially expressed genes is also a valuable resource for further investigations.

Els atacs isquèmics transitoris (AITs) constitueixen l’expressió clínica de la isquèmia cerebral transitòria i, freqüentment, precedeixen a l’infart cerebral. Tot i que els AITs estan associats amb un elevat risc de patir un ictus isquèmic posterior, contribueixen al desenvolupament del fenomen de la tolerància isquèmica (TI), que condueix a una resposta genòmica i proteòmica amb efectes importants sobre els sistemes homeostàtic, inflamatori i endotelial. L’estudi de biomarcadors relacionats amb aquest fenomen està adquirint una gran importància amb la idea de conèixer millor els canvis fisiopatològics d’aquesta protecció. L’objectiu general de la tesi ha estat la confirmació de l’existència del fenomen de TI induït pel patiment d’un AIT previ a l’infart cerebral en una cohort de pacients consecutius (registre ESTOICA, n=541) i de la seva traducció en canvis en el nivells d’expressió de biomarcadors circulants. Es van analitzar diferències clíniques, radiològiques i pronòstiques entre els pacients amb un AIT previ recent (n=40 [7,4%]) a l’ictus isquèmic i els que no l’havien patit amb anterioritat. També es van estudiar diferències en l’expressió de proteïnes, metabòlits i miRNAs circulants entre els dos grups. Els pacients amb un AIT previ recent presentaren un perfil etiològic diferent, amb un predomini de subtipus ateromatós i llacunar, i una millor evolució clínica i radiològica que es tradueix en un possible fenomen de TI. A més, hem identificat canvis en l’expressió proteica, metabòlica i de miRNAs circulants, fet que revela la implicació de diferents vies i actors en aquest fenomen i que poden constituir noves dianes per al desenvolupament de teràpies de neuroprotecció.
Los ataques isquémicos transitorios (AITs) constituyen la expresión clínica de la isquemia cerebral transitoria y, frecuentemente, preceden al infarto cerebral. Aunque los AITs están asociados a un elevado riesgo de sufrir un ictus isquémico posterior, contribuyen al desarrollo del fenómeno de la tolerancia isquémica (TI), que conduce a una respuesta genómica y proteómica con efectos importantes sobre los sistemas homeostático, inflamatorio y endotelial. El estudio de biomarcadores relacionados con este fenómeno está adquiriendo una gran importancia con la idea de conocer mejor los cambios fisiopatológicos de esta protección. El objetivo general de la tesi ha estado la confirmación de la existencia del fenómeno de TI inducido por el hecho de sufrir un AIT previo al infarto cerebral en una cohorte de pacientes consecutivos (registro ESTOICA, n=541) y de su traducción en cambios en los niveles de expresión de biomarcadores circulantes. Se analizaron las diferencias clínicas, radiológicas y pronosticas entre los pacientes con un AIT previo reciente (n=40 [7,4%]) al ictus isquémico y los que no lo habían sufrido con anterioridad. También se estudiaron las diferencias de expresión de proteínas, metabolitos y miRNAs circulantes entre los dos grupos. Los pacientes con un AIT previo reciente presentaron un perfil etiológico diferente, con un predominio de los subtipos ateromatoso y lacunar, y una mejor evolución clínica y radiológica que se traduce en un posible fenómeno de TI. A parte, hemos identificado cambios en la expresión proteica, metabólica y de miRNAs circulantes, echo que revela la implicación de diferentes vías y actores en este fenómeno y que pueden constituir nuevas dianas para el desarrollo de terapias de neuroprotección.
Transient ischemic attacks (TIAs) constitute the clinical expression of transient cerebral ischemia and frequently precede cerebral infarction. Although TIAs are associated with a high risk of subsequent ischemic stroke, they also contribute to the development of ischemic tolerance (IT) phenomenon, leading to a genomic and proteomic response with important effects on the homeostatic, inflammatory and endothelial systems. The study of IT biomarkers is an emerging field with the goal of improving the knowledge on the physiopathological changes that occur during IT. The main objective of the present thesis was the confirmation of the existence of the IT phenomenon induced by a previous TIA to ischemic stroke in a cohort of consicutive patients (ESTOICA register, n = 541) and its translation in changes in the expression levels of circulating biomarkers. Clinical, radiological and prognostic differences were analyzed between patients with a prior TIA (n = 40 [7.4%]) to ischemic stroke and those who had not suffered it. Differences were also studied in the expression levels of proteins, metabolites and circulating miRNAs between these two groups. Patients with a previous TIA had a different etiologic profile, with a predominance of atheromatous and lacunar subtypes, and a better clinical and radiological evolution that translates into a possible IT phenomenon. In addition, we have identified changes in protein, metabolic and circulating miRNAs, which reveals the involvement of different pathways and actors in this phenomenon and which could provide new targets for the development of neuroprotection therapies.

[ES] La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno hereditario del metabolismo del cobre causado por mutaciones en ATP7B, que codifica una proteína transportadora de cobre en el hígado. Su mal funcionamiento provoca un fallo en la excreción biliar de cobre y una acumulación progresiva de este metal en el organismo, especialmente en hígado y cerebro. En este trabajo, se explora la posible utilidad de miRNAs circulantes en plasma para identificar biomarcadores que sirvan para controlar la progresión de la enfermedad en pacientes con EW bajo tratamiento. Los modelos desarrollados para cada miRNA mostraron un buen rendimiento al clasificar a los pacientes con factores de evolución desfavorable, por lo que estos tres miRNAs se proponen como candidatos para mejorar el seguimiento clínico o para respaldar la eficacia de nuevas terapias en la EW.
[CA] La malaltia de Wilson és un trastorn hereditari del metabolisme del coure causat per mutacions en ATP7B, que codifica per a una proteïna transportadora del coure al fetge. El seu mal funcionament produeix alteracions en l'excreció biliar i l'acumulació progressiva de coure, especialment en fetge i cervell. Es va explorar la possible utilitat del perfil de miRNAs circulants com biomarcadors de progressió de la patologia hepàtica. L'avaluació dels models obtinguts per a cadascun dels tres miRNAs va mostrar un bon rendiment per a classificar al grup de pacients amb factors d’evolució desfavorable, en conseqüència, es proposen com a candidats per tal de millorar el seguiment clínic o comprovar l’efectivitat de noves teràpies en la malaltia de Wilson.
[EN] Wilson disease (WD) is an inherited disorder of copper metabolism caused by mutations in ATP7B, which encodes for a liver copper-transporting protein. Its dysfunction causes a deficit in biliary copper excretion and a progressive accumulation of this metal in the organism, mainly in liver and brain. In this work, circulating miRNAs profiling in plasma has been accomplished to identify biomarkers that could serve to monitor disease progression in WD patients under chelation therapy. Developed models for each miRNA exhibited good performance classifying patients with poor outcome factors, consequently, these three miRNAs are proposed as candidates to improve clinical follow-up or to support efficacy of novel therapies in WD.
Esta Tesis Doctoral ha sido financiada por los siguientes proyectos de investigación: “Avanzar en el diagnóstico y la prognosis de la enfermedad de Wilson” Duración: 2016-2019, Fundació Per Amor a l’Art (FPAA) IP: C. Espinós; “Bases genéticas y biomarcadores pronóstico de la enfermedad de Wilson y Wilson-like” 2020-2022, Fundació Per Amor a l’Art (FPAA) IP: C. Espinós; “Estudios clínicos, bases genéticas y biomarcadores pronóstico en enfermedades raras neurodegenerativas” 2019-2021, Instituto de Salud Carlos III (Expediente: PI18/00147) IP: C. Espinós; “De genes a terapia en enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares” 2018-2021, Generalitat Valenciana, Programa Prometeo para grupos de investigación de excelencia (Expediente: PROMETEO/2018/135) Consorcio de investigadores formado por F. V. Pallardó (coordinador), J.M. Millán, I. Galindo, P. Sanz, T. Sevilla y C. Espinós.
Sánchez Monteagudo, A. (2021). Genética molecular y biomarcadores de la enfermedad de Wilson [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171454
TESIS

El càncer de pulmó de cèl·lula no petita (CPCNP) es pot definir a nivell molecular per les alteracions genètiques que es produeixen en múltiples oncogens, inclosos els reordenaments dels gens ALK i ROS1. Per optimitzar el maneig clínic, el perfil molecular ha d'estar disponible per a tots els pacients per tal de fer accessibles les teràpies dirigides mitjançant tractaments inhibidors específics. Des de 2011, el test estàndard per detectar els reordenaments d’ALK i ROS1 ha estat la hibridació in situ fluorescent (FISH) utilitzant sondes de trencament i més endavant es va estandarditzar la detecció de sobreexpressió per immunohistoquímica (IHQ). Les dues tècniques tenen limitacions i han d'usar-se dins d'un context diagnòstic apropiat després de validacions per part del laboratori. En aquesta tesi doctoral es va confirmar la baixa prevalença dels reordenaments del gen ROS1 en la població espanyola i es va identificar una alta prevalença de les alteracions del nombre de còpies de ROS1 en els casos no reordenats sense que afectés a l'expressió de la proteïna ROS1 ni presentés implicacions clíniques associades en els pacients. Més recentment, l'ús de panells de seqüenciació massiva (NGS) per avaluar múltiples anomalies genòmiques clínicament rellevants ha demostrat ser viable per a la detecció d'aquests reordenaments genètics en les mostres d'adenocarcinoma de pulmó. La comparació amb les tècniques prèviament estandarditzades de FISH i IHQ s'ha investigat en el present treball de tesi doctoral per a la seva aplicació clínica. S'han trobat discrepàncies entre les tècniques, especialment en els casos ALK i ROS1 reordenats amb patró de FISH positiu per senyals 3 ' extra. Com l'efectivitat de les teràpies dirigides contra les cinases d’ALK i ROS1 depèn de la correcta selecció dels pacients segons les seves alteracions moleculars, proposem que es detalli en l'informe de resultats els patrons de FISH en el cas de positivitat. A més, segons els nostres resultats, la tècnica de NGS representa un enfocament pràctic i fiable a nivell clínic per a la detecció d’aquests reordenaments en el seu ús en mostres de teixit procedent de pacients amb CPCNP. Aquesta nova metodologia també permet avaluar en paral·lel els possibles mecanismes de resistència genètics relacionats amb les teràpies dirigides i facilitar l’accés dels pacients al tractament més adequat.
Non-small cell lung cancer (NSCLC) can be defined at the molecular level by recurrent 'driver' mutations that occur in multiple oncogenes, including ALK and ROS1. To improve outcome, molecular profiling should be available to all patients in order to make targeted therapies accessible. Since 2011, the standard test to detect ALK- and ROS1-rearranged tumors has been fluorescence in situ hybridization (FISH) using break-apart probes and later on, immunohistochemistry (IHC). Both techniques have strengths and limitations and should be used within an appropriate diagnostic context and after proper laboratory validations. In this thesis, we confirmed the low prevalence of ROS1 rearrangements in the Spanish population and identified a high prevalence of ROS1 copy number alterations that neither affect ROS1 protein expression nor present associated clinical implications. More recently, the use of next-generation sequencing (NGS) panels to assess multiple clinically relevant genomic abnormalities has shown feasibility to detect gene rearrangements in lung adenocarcinoma. Comparison with widely accepted FISH and IHC methodologies has been tested herein for clinical application. Discrepancies between techniques have been found, especially in ALK and ROS1 rearranged cases with isolated 3’ signals FISH pattern. As the effectiveness of therapies targeting ALK and ROS1 is highly dependent upon appropriate selection of patients, we propose a detailed reporting of positive FISH patterns. NGS represents a practical and reliable ALK and ROS1 testing approach for use with routine NSCLC tissue specimens, enabling patients to receive optimal therapies. This novel methodology can also assess genomic-related mechanism of resistance to targeted therapies and guide the appropriate treatment selection.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
A doença de Alzheimer é a forma de demência mais comum no idoso, afectando cerca de 10% dos indivíduos com 65 anos. Considera-se que tenha uma origem multifactorial, sendo vários os factores que contribuem para a formação das placas senis, bem como das tranças neurofibrilares, características desta patologia. O diagnóstico baseia-se no exame clínico, testes neuropsicológicos e técnicas de imagiologia cerebral, sendo feito por exclusão de outras formas de demência de causa conhecida. O defeito cognitivo ligeiro (DCL) caracteriza-se pela ocorrência de défices cognitivos subtis mantendo-se, de uma forma geral, intactas a cognição e a realização de actividades da vida quotidiana. A identificação de um biomarcador seria útil não só para o diagnóstico destas patologias, mas também para o início e monitorização de uma terapêutica neuroprotectora, para o acompanhamento da progressão da doença e para a avaliação da população em risco para a doença. Assim, pretendeu-se com este trabalho identificar parâmetros inflamatórios, de stresse oxidativo e níveis de expressão de proteínas envolvidas na morte celular, a nível do sangue periférico, que permitissem diferenciar indivíduos cognitivamente saudáveis de indivíduos com doença de Alzheimer ligeira e DCL. Analisaram-se também polimorfismos genéticos na tentativa de identificar, não só marcadores entre grupos, como indicadores de susceptibilidade para a doença. Pretendeu-se também encontrar preditores de prognóstico da conversão do estadio de DCL para doença de Alzheimer, tendo para isso sido realizado um estudo longitudinal. Os resultados obtidos sugerem que na doença de Alzheimer existe um aumento da percentagem de monócitos a produzir citocinas pró-inflamatórias, o que poderá traduzir um estado inflamatório persistente nesta patologia. Neste contexto, os monócitos, mas não os linfócitos, poderão ser considerados bons alvos de estudo para o controlo da evolução de DCL para doença de Alzheimer. Os parâmetros de stresse oxidativo estudados revelaram um decréscimo das defesas antioxidantes nos grupos de doentes com uma activação evidente do ciclo do glutatião nestas doenças e um aumento significativo nos níveis de metabolitos do monóxido de azoto. Os polimorfismos genéticos estudados não revelaram diferenças significativas entre grupos, à excepção do genótipo da apolipoproteína E. Relativamente à totalidade dos parâmetros avaliados, o grupo DCL apresentou valores intermédios entre o grupo controlo e o grupo de doentes de Alzheimer, o que confirma que esta fase se situa entre o envelhecimento normal e a demência. A confirmação destes resultados, englobando um maior número de indivíduos e o seu acompanhamento ao longo do tempo por um período previsível de cinco anos, abrem novas perspectivas na identificação de biomarcadores da doença, que poderão ser úteis no diagnóstico e prevenção da demência de Alzheimer.
Alzheimer’s Disease (AD) is the most common form of dementia in the elderly, afecting about 10% of individuals with 65 years of age, and doubling it’s incidence for every 5 years. AD is thought to be a multifactorial disease, with several factors contributing to the formation of senil plaques and neurofibrilary tangles, pathological hallmarks of the disease. Diagnose is performed by clinical examination, neuropsychological tests and brain imaging, ultimately diagnose is made by exclusion of other known forms of dementia. Mild Cognitive Impairment (MCI) is characterized by the ocorrence of subtle cognitive impairments, generaly keeping intact cognition and ordinary daily activities. Identification of a biomarker would be useful in order to allow the beginning of neuroprotective therapy as early as possible, to monitor this treatment, to relate to the progression of the disease and to identify individuals who are at risk to develop the disease. The aim of this work was to identify peripheral markers of inflammation, oxidative stress and expression levels of cell death related proteins, in order to distinguish between AD, MCI and healthy individuals. Furthermore, genetic polimorphisms were also analysed in the atempt not only to identify genetic differences between these groups, but also to identify markers of susceptibility to the disease. In addition, we also intended to find markers of conversion from an MCI condition to AD, and in order to achieve this goal, we performed a logitudinal study. Our results suggest that in AD there’s an increase in the percentage of monocytes producing pro-inflammatory cytokines, what is in accordance with a persistent inflammatory state in this pathology. Being so, monocytes, but not lymphocytes, may be considered as good biological targets in the control of the evolution from MCI to AD. Oxidative stress results showed a decrease of antioxidant defenses in our patients groups, with a clear activation of the glutathione cycle, additionaly we also found a significant increase in the levels of nitric oxide metabolites in these groups. Genetic polymorphisms screened showed no differences between groups, with the exception of ApoE genotype, as previously described. When analysing all the results from this work, it is clear that MCI’s are in between the ones from AD and the ones from healthy controls, clearly showing that this condition is probably a transition phase between healthy aging and dementia. Confirmation of these results, using a larger sample series and with a duration of approximately 5 years, will probably allow the identification of suitable biomarkers, that may be of extreme importance in diagnose and prevention of AD.

El coneixement de la biologia molecular responsable de la carcinogènesi de les neoplàsies neuroendocrines segueix essent limitada avui en dia. Aquest fet, ha limitat la identificació de biomarcadors pronòstics i predictius i el desenvolupament de teràpies dirigies en aquesta població de pacients. L’objectiu de la present tesi doctoral ha estat identificar les alteracions genòmiques i epigenòmiques de neoplàsies neuroendocrines digestives i valorar la possibilitat de crear models murins derivats de pacients com a pas previ al disseny d’estudis clínics en pacients segons les alteracions moleculars observades. El treball s’ha centrat en carcinomes neuroendocrins de primari colònic, un tipus tumoral poc freqüent, d’elevada agressivitat i orfe de tractament. Inicialment, a través del grup nacional de tumors endocrins (GETNE) s’han identificat mostres tumorals parafinades de pacients amb carcinomes neuroendocrins de primari colònic, s’ha confirmat el diagnòstic anatomopatològic i s’han realitzat estudis genòmics i epigenòmics per a la correcta tipificació molecular de les alteracions presents en aquest tipus de tumor. Paral·lelament, s’ha aconseguit crear un model murí derivat de pacient amb carcinoma neuroendocrí portador de mutació en el gen BRAF per a poder realitzar experiments in vitro amb teràpies dirigides contra aquesta mutació. En resum, els resultats han permès identificar les mutacions més prevalents en carcinomes neuroendocrins de còlon, destacant l’elevat percentatge de mutacions V600E en el gen BRAF comparat amb l’adenocarcinoma de còlon. Així mateix, el perfil de metil·lació de l’ADN dels carcinoma neuroendocrins de còlon és significativament diferent a l’observat en adenocarcinomes de còlon, que juntament amb el perfil genòmic i l’inestabilitat cromosòmica observada en el neuroendocrí confirmen les diferències tant en l’origen de les dues neoplàsies, com en la biologia molecular i la probabilitat de resposta a teràpies dirigides confirmada en els models PDX. Els resultats del present treball de tesi doctoral permetran continuar amb l’estudi de les característiques moleculars d’aquesta població de pacients, la búsqueda de nous biomarcadors i el disseny d’estudis dirigits per a una població de pacients actualment orfe de tractament efectiu.
The knowledge of the molecular biology of the neuroendocrine tumors carcinogenesis is still limited today. This fact has limited predictive and prognostic biomarker identification and the development of therapies aimed at this population of patients. The aim of this work was to identify genomic and epigenomic changes of neuroendocrine tumors of gastrointestinal tract and assess the possibility of creating mouse models derived from patients as a prelude to the design of clinical studies in patients based on the molecular alterations observed. The work has focused on primary colonic neuroendocrine carcinomas, a rare, treatment orphan and highly aggressive tumor. Initially, through the national group of endocrine tumors (GETNE) paraffin-embedded tumor samples were identified of patients with neuroendocrine carcinoma of primary colonic. After centrally pathological confirmation genomic and epigenomic studies have been conducted to characterize the molecular alterations of this tumor type. Meanwhile, it has managed to create an animal model derived from patients with neuroendocrine carcinoma carrier of the gene mutation in BRAF to carry out experiments in vitro with targeted therapies against this mutation. In summary, the results have enabled us to identify the most prevalent mutations in neuroendocrine carcinomas of the colon, highlighting the high percentage of mutations V600E in the gene BRAF compared with the adenocarcinoma of the colon. Also, the DNA methylation profile of neuroendocrine carcinoma of the colon is significantly different from that observed in adenocarcinomas of the colon, which together with the genomic profile and chromosomal instability observed in neuroendocrine carcinomas confirm the differences in the origin of the two cancers, the molecular biology of both cancer types and the likelihood of response to targeted therapies confirmed in the PDX models. The results of this doctoral thesis will continue with the study of the molecular characteristics of this patient population, the search for new biomarkers and the design of clinical trials aimed for an orphan patient population currently lacking of effective treatment.

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-25Bitstream added on 2015-01-26T13:30:20Z : No. of bitstreams: 1 000800374_20150225.pdf: 1573316 bytes, checksum: c476b2a12fd44d90c591ec7fbb40ab85 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:35Z: 000800374_20150225.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:11Z : No. of bitstreams: 1 000800374.pdf: 4978359 bytes, checksum: 5d98453223363cd41a299c852de7bacd (MD5)
Introdução: O câncer de ovário (CO) é a maior causa de morte por neoplasia ginecológica nos países desenvolvidos. Atualmente, um modelo dualístico de classificação foi proposto, sendo os tumores tipo I de baixo grau, indolentes e com mutações estáveis. Os tumores tipo II são de alto grau e mais agressivos. Além disso, na tentativa de se entender o processo de carcinogênese, vários biomarcadores têm sido estudados como as micropartículas (MPs), as citocinas e as quimiocinas. O objetivo desse estudo é a avaliação de fatores solúveis da resposta inflamatória (MPs, citocinas e quimiocinas) em mulheres com CO e compará-los com os níveis encontrados em mulheres sem malignidade e com parâmetros clínicos. Métodos: Avaliaram-se 26 mulheres com CO e 16 mulheres sem evidência de neoplasia maligna (grupo controle). Foram coletadas amostras de plasma e tecido tumoral. A avaliação dos fatores inflamatórios foi realizada por meio da dosagem de citocinas (IL-1- β, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17A, TNF e IFN-gama, e quimiocinas (CXCL8, CXCL-9, CXCL 10, CCL 2, CCL5) e das micropartículas (neutrófilos, leucócitos, monócitos, eritrócitos, endotélio, plaquetas e linfócitos) por citometria de fluxo/CBA (Cytometric Bead Array). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelos testes Kruskal- Walis ou Mann-Whitney e a sobrevida por Cox Regression. As diferenças com valor de p<0,05 foram consideradas significativas.Resultados: Não houve diferença entre os grupos em relação à idade, paridade e menopausa. No grupo de mulheres com CO, 10 (38,5%) tinham estadio I/II e 16 (61,5%) tinham estadio III/IV. Em relação ao tipo tumoral, segundo a nova classificação, 8 (30.8%) eram tipo I e 18 foram tipo II (69.2%). Citorredução ótima foi obtida em 15 (57.7%) mulheres com CO. Os valores de CA 125 foram significativamente diferentes entre os grupos. Não houve óbito em mulheres com tumores ...
Introduction : Ovarian cancer ( OC) is the leading cause of death from gynecological cancer in developed countries . Currently , a dualistic classification model was proposed .Type I tumors are low-grade , indolent and have stable mutations . Type II tumors are high grade and more aggressive . Moreover, in an attempt to understand the process of carcinogenesis , several biomarkers have been studied as microparticles (MPs ) , cytokines and chemokines. The purpose of the study was to evaluate the levels of circulating soluble biomarkers-microparticles, cytokines and chemokines- to characterize the pro-inflammatory/modulatory immune response in women with OC. The correlation between the biomarker levels and the clinico-pathological parameters were also analyzed. Methods : We evaluated 26 women with OC and 16 women without evidence of malignancy ( control group ) . Plasma samples and tumor tissue were collected . The assessment of inflammatory markers was performed by measurement of cytokine (IL -1- β , IL-2 , IL-6 , IL-10 , IL-12 , IL -17A , TNF and IFN –gamma), chemokines ( CXCL8 , CXCL -9 , CXCL 10 , CCL 2 , CCL5 ) and microparticles (neutrophils , leukocytes, monocytes, erythrocytes, endothelium , platelets and lymphocytes) by flow cytometry / CBA ( cytometric Bead Array) . Differences among groups were evaluated by Kruskal - Wallis or Mann - Whitney and survival by Cox Regression . Differences with p < 0.05 were considered significant. Results: There was no difference between groups regarding age , parity and menopause. In the group of women with OC , 10 ( 38.5 % ) were stage I / II and 16 ( 61.5 % ) were stage III / IV . Concerning tumor type , according to the new classification , 8 (30.8 % ) were type I and 18 ( 69.2 % ) were type II . Optimal cytoreduction was achieved in 15 ( 57.7 % ) women with OC . CA 125 values were significantly different between groups . There were no deaths in women with type I tumors. Stratifying by ...

Orientador: Paulo Traiman
Coorientador: Andréia Teixeira de Carvalho
Banca: José Ricardo Paciência Rodrigues
Banca: Jorge Nahas Neto
Banca: Jurandyr de Andrade
Banca: Walter Antônio Prata Pace
Resumo: Introdução: O câncer de ovário (CO) é a maior causa de morte por neoplasia ginecológica nos países desenvolvidos. Atualmente, um modelo dualístico de classificação foi proposto, sendo os tumores tipo I de baixo grau, indolentes e com mutações estáveis. Os tumores tipo II são de alto grau e mais agressivos. Além disso, na tentativa de se entender o processo de carcinogênese, vários biomarcadores têm sido estudados como as micropartículas (MPs), as citocinas e as quimiocinas. O objetivo desse estudo é a avaliação de fatores solúveis da resposta inflamatória (MPs, citocinas e quimiocinas) em mulheres com CO e compará-los com os níveis encontrados em mulheres sem malignidade e com parâmetros clínicos. Métodos: Avaliaram-se 26 mulheres com CO e 16 mulheres sem evidência de neoplasia maligna (grupo controle). Foram coletadas amostras de plasma e tecido tumoral. A avaliação dos fatores inflamatórios foi realizada por meio da dosagem de citocinas (IL-1- β, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17A, TNF e IFN-gama, e quimiocinas (CXCL8, CXCL-9, CXCL 10, CCL 2, CCL5) e das micropartículas (neutrófilos, leucócitos, monócitos, eritrócitos, endotélio, plaquetas e linfócitos) por citometria de fluxo/CBA (Cytometric Bead Array). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelos testes Kruskal- Walis ou Mann-Whitney e a sobrevida por Cox Regression. As diferenças com valor de p<0,05 foram consideradas significativas.Resultados: Não houve diferença entre os grupos em relação à idade, paridade e menopausa. No grupo de mulheres com CO, 10 (38,5%) tinham estadio I/II e 16 (61,5%) tinham estadio III/IV. Em relação ao tipo tumoral, segundo a nova classificação, 8 (30.8%) eram tipo I e 18 foram tipo II (69.2%). Citorredução ótima foi obtida em 15 (57.7%) mulheres com CO. Os valores de CA 125 foram significativamente diferentes entre os grupos. Não houve óbito em mulheres com tumores ...
Abstract: Introduction : Ovarian cancer ( OC) is the leading cause of death from gynecological cancer in developed countries . Currently , a dualistic classification model was proposed .Type I tumors are low-grade , indolent and have stable mutations . Type II tumors are high grade and more aggressive . Moreover, in an attempt to understand the process of carcinogenesis , several biomarkers have been studied as microparticles (MPs ) , cytokines and chemokines. The purpose of the study was to evaluate the levels of circulating soluble biomarkers-microparticles, cytokines and chemokines- to characterize the pro-inflammatory/modulatory immune response in women with OC. The correlation between the biomarker levels and the clinico-pathological parameters were also analyzed. Methods : We evaluated 26 women with OC and 16 women without evidence of malignancy ( control group ) . Plasma samples and tumor tissue were collected . The assessment of inflammatory markers was performed by measurement of cytokine (IL -1- β , IL-2 , IL-6 , IL-10 , IL-12 , IL -17A , TNF and IFN -gamma), chemokines ( CXCL8 , CXCL -9 , CXCL 10 , CCL 2 , CCL5 ) and microparticles (neutrophils , leukocytes, monocytes, erythrocytes, endothelium , platelets and lymphocytes) by flow cytometry / CBA ( cytometric Bead Array) . Differences among groups were evaluated by Kruskal - Wallis or Mann - Whitney and survival by Cox Regression . Differences with p < 0.05 were considered significant. Results: There was no difference between groups regarding age , parity and menopause. In the group of women with OC , 10 ( 38.5 % ) were stage I / II and 16 ( 61.5 % ) were stage III / IV . Concerning tumor type , according to the new classification , 8 (30.8 % ) were type I and 18 ( 69.2 % ) were type II . Optimal cytoreduction was achieved in 15 ( 57.7 % ) women with OC . CA 125 values were significantly different between groups . There were no deaths in women with type I tumors. Stratifying by ...
Doutor

Introdução: A rejeição aguda mediada por anticorpos (RAMA) representa atualmente uma importante limitação para o sucesso do transplante renal. Seu diagnóstico é complexo e impreciso e avaliações moleculares com o desenvolvimento de biomarcadores não invasivos podem representar métodos promissores para seu diagnóstico. O objetivo do estudo foi avaliar, em pacientes transplantados renais, a expressão de genes relacionados à rejeição medida por anticorpos e celular, em tecido renal e no sangue periférico. Métodos: Estudo transversal com 56 pacientes transplantados renais divididos nas seguintes categorias diagnósticas de acordo com a classificação Banff 2007: RAMA, rejeição aguda celular (RAC), necrose tubular aguda (NTA), RAMA+RAC e normal. Foi utilizada a técnica de PCR Real-Time para a quantificação relativa dos genes: CD20, CD138, Fator de von Willebrand (FVW), TIM-3 e FOXP-3. Resultados: Pacientes com RAMA apresentaram, tanto no tecido renal quanto no sangue periférico, transcritos de mRNA para CD20 e TIM-3 significativamente aumentados (P<0,01), em relação aos grupos NTA e normal. Outros resultados com expressão significativamente maior na RAMA em relação ao grupo normal foram FOXP-3 no sangue (P<0,01), CD138 na biópsia (P<0,01) e FWV na biópsia e no sangue (P<0,05). As curvas ROC demonstraram áreas sobre a curva (ASC) de 0,950 (P<0,001) para CD20 no sangue periférico. Utilizando o ponto de corte 6,0 obtevese sensibilidade 94% e especificidade 88% para o diagnóstico de RAMA. CD138 no tecido renal apresentou ASC de 0, 905 (P<0,001), e com ponto de corte 6,0 encontrou-se sensibilidade 91% e especificidade 85%. Conclusão: A expressão de CD20, tanto em tecido renal como no sangue periférico, e de CD138 no tecido foram significativamente maiores em pacientes com RAMA. Mais estudos poderão confirmar estes achados e possibilitar a utilização da expressão destes e de outros genes como biomarcadores para o diagnóstico de RAMA.
Introduction: Acute antibody mediated rejection (ABMR) is currently a major limitation to the success of renal transplantation. Its diagnosis is complex and inaccurate and the development of non-invasive biomarkers can represent promising methods for that. The aim of this study was to evaluate, in kidney transplant patients, the expression of genes related to the antibody mediated rejection and cellular, in renal tissue and peripheral blood. Methods: Crosssectional study with 56 kidney transplant patients divided into the following diagnostic categories according by the Banff 2007 classification: ABMR, acute cellular rejection (ACR), acute tubular necrosis (ATN), ACR+ABMR and normal. We used Real Time PCR to quantify relative expression of genes: CD20, CD138, von Willebrand factor (vWF), FOXP-3 and TIM-3. Results: Patients with ABMR presented, both in renal tissue and in peripheral blood, CD20 and TIM-3 mRNA transcripts significantly increased (P <0.01), in relation to groups ATN and normal. Other results with significantly higher expression in ABMR in relation to the normal group were FOXP-3 in the peripheral blood (P <0.01), CD138 in tissue (P <0.01) and vWF renal tissue and blood (P <0.05). The ROC curves demonstrated area under the curve (AUC) of 0.950 (P <0.001) for CD20 in peripheral blood. Using the 6.0 cutoff point was obtained 94% sensitivity and 88% specificity for the diagnosis of RAMA. CD138 in renal tissue showed AUC 0, 905 (P <0.001), and 6.0 cutoff point was found 91% sensitivity and specificity 85%. Conclusion: The expression of CD20, both in renal tissue and in peripheral blood, and CD138 in tissue were significantly higher in patients with ABMR. More studies can confirm these findings and enable the use of the expression of these and other genes as biomarkers for the diagnosis of ABMR.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
Mycobacterium bovis es el microorganismo zoonótico causante de la tuberculosis bovina, patología infectocontagiosa de distribución mundial responsable de graves problemas económicos y de salud en el sector ganadero. Debido a que varios estudios han establecido la utilidad de las secuencias de inserción IS6110 e IS1081 en la identificación y tipificación de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis, el objetivo de este estudio fue establecer protocolos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la amplificación de las secuencias IS6110 e IS1081 y determinar la existencia de diferencias en su capacidad de detectar Mycobacterium bovis en tejidos bovinos. El análisis estadístico de los resultados sugirió que no existen diferencias significativas entre los ensayos de PCR convencional basados en IS1081 e IS6110, lo que contrasta con lo señalado por otros autores, quienes postulan que IS1081 está presente en mayor número de copias en cepas de Mycobacterium bovis, y por tanto, su utilidad en el diagnóstico es mayor. Debido a que la concordancia de ambas pruebas fue baja, se requieren nuevos estudios destinados a determinar la aplicabilidad de ambas secuencias en conjunto, por ejemplo en una prueba de PCR múltiple, ya que este trabajo sugiere que son complementarias para el diagnóstico de tuberculosis bovina
Proyecto FIV 121014019102003

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2015-01-26T13:30:21Z : No. of bitstreams: 1 000798819.pdf: 983001 bytes, checksum: 2fc0b03354d07607d8a8e61e7ab3880b (MD5)
Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
A alta prevalência do câncer de mama é um fator que nos instiga a investigar novos biomarcadores para a doença. Proteínas séricas ou plasmáticas já são utilizadas rotineiramente no rastreamento de algumas neoplasias. As micropartículas (MPs) são fragmentos da membrana plasmática liberadas por diversos tipos celulares e estão associadas com a resposta inflamatória. Estudos recentes mostram que a presença de MPs e citocinas/quimiocinas circulantes possuem uma relevante associação clínica com o câncer de mama. O objetivo deste estudo foi medir os níveis desses biomarcadores inflamatórios (MPs, citocinas e quimiocinas) no soro de mulheres com câncer de mama pré e pós-quimioterapia comparando com o grupo controle; assim como associar esses dados com diversos parâmetros clínicos e hemograma. Foi coletado sangue periférico de mulheres sem evidências de doenças (n=20) e com câncer de mama (n=38). Foi utilizada a citometria de fluxo para dosagens dos níveis séricos de citocinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 IL-10, IL-12, IL- 17A, TNF, IFN-gama), quimiocinas (CXCL-8, CXCL-9, CXCL-10, CCL-2, CCL-5) e micropartículas provenientes de diversas células (neutrófilos, leucócitos, monócitos, eritrócitos, endotélio, plaquetas, linfócitos). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Mann-Whitney ou Kruskal- Walis. As diferenças com valor de p<0,05 foram consideradas significativas. Não houveram diferenças significativas nos níveis de micropartículas, citocinas e quimiocinas estudadas entre os grupos controle e câncer de mama. Entretanto houve uma diminuição dos níveis de micropartículas derivadas de plaquetas nas pacientes pós-quimioterapia e um aumento de níveis séricos de IL-6, CCL-5 e CXCL-10 pós-quimioterapia. Em associação com os dados clínicos foi demostrado que baixos níveis de micropartículas derivadas de monócitos e altos níveis de CCL-2 e CXCL10 estão associados a tumores mais ...

Orientador: Agnaldo Lopes da Silva Filho
Coorientador: Andréa Teixeira de Carvalho
Banca: Paulo Traiman
Banca: Gilberto Uemira
Banca: Eduardo Batista Cândido
Banca: Ricardo dos Reis
Resumo: A alta prevalência do câncer de mama é um fator que nos instiga a investigar novos biomarcadores para a doença. Proteínas séricas ou plasmáticas já são utilizadas rotineiramente no rastreamento de algumas neoplasias. As micropartículas (MPs) são fragmentos da membrana plasmática liberadas por diversos tipos celulares e estão associadas com a resposta inflamatória. Estudos recentes mostram que a presença de MPs e citocinas/quimiocinas circulantes possuem uma relevante associação clínica com o câncer de mama. O objetivo deste estudo foi medir os níveis desses biomarcadores inflamatórios (MPs, citocinas e quimiocinas) no soro de mulheres com câncer de mama pré e pós-quimioterapia comparando com o grupo controle; assim como associar esses dados com diversos parâmetros clínicos e hemograma. Foi coletado sangue periférico de mulheres sem evidências de doenças (n=20) e com câncer de mama (n=38). Foi utilizada a citometria de fluxo para dosagens dos níveis séricos de citocinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 IL-10, IL-12, IL- 17A, TNF, IFN-gama), quimiocinas (CXCL-8, CXCL-9, CXCL-10, CCL-2, CCL-5) e micropartículas provenientes de diversas células (neutrófilos, leucócitos, monócitos, eritrócitos, endotélio, plaquetas, linfócitos). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Mann-Whitney ou Kruskal- Walis. As diferenças com valor de p<0,05 foram consideradas significativas. Não houveram diferenças significativas nos níveis de micropartículas, citocinas e quimiocinas estudadas entre os grupos controle e câncer de mama. Entretanto houve uma diminuição dos níveis de micropartículas derivadas de plaquetas nas pacientes pós-quimioterapia e um aumento de níveis séricos de IL-6, CCL-5 e CXCL-10 pós-quimioterapia. Em associação com os dados clínicos foi demostrado que baixos níveis de micropartículas derivadas de monócitos e altos níveis de CCL-2 e CXCL10 estão associados a tumores mais ...
Abstract: Not available
Doutor

Os marcadores orgânicos moleculares (hidrocarbonetos alifáticos, esteróis e álcoois) em amostras de sedimentos superficiais e de testemunhos curtos coletados em diápiros e pockmarks localizados no talude sul do Brasil, foram utilizados para identificar as possíveis contribuições biogênicas (autóctones / alóctones). De modo geral, tanto nas amostras superficiais como ao longo dos testemunhos, o maior acúmulo de carbono orgânico total nos pockmarks foi observado, indicando o possível aprisionamento de sedimentos e de matéria orgânica no interior das concavidades. A presença de β-sitosterol, campesterol, álcoois e n-alcanos pesados, indicaram contribuições terrígenas para a área de estudo, que pode ser advinda da descarga continental do Rio da Prata, uma vez que a predominância terrígena é proveniente das pradarias, típica vegetação do Uruguai e do sul do Rio Grande do Sul. O transporte de sedimentos terrígenos ocorre em direção ao norte, ao longo da plataforma continental sul brasileira, pela Corrente Costeira do Brasil. A presença de detritos de fitoplâncton e zooplâncton também ocorre devido à influência dos nutrientes do Rio da Prata. As possíveis liberações de gás/fluido, que sustentaram ecossistemas quimiossintéticos em diferentes intervalos de dois testemunhos em pockmark e diápiro foram constatadas através da presença relativamente maior de n-alcanos leves com número par de carbonos.
Organic molecular markers (aliphatic hydrocarbons, sterols and alcohols) in superficial and short cores sediment samples collected in diapirs and pockmarks located in the southern slope of Brazil were used in order to identify the possible biogenic contributions (autochthonous / allochthonous). In general, in surface samples and throughout the cores samples, the greatest accumulation of total organic carbon in the pockmarks was observed, indicating the possible entrapment of sediments and organic matter inside the concavities. The presence of β-sitosterol, campesterol, alcohols and heavy n-alkanes indicated terrigenous contributions to the study area, which may be due to the continental discharge of Río de la Plata, since the terrigenous predominance is due to the prairies, a typical vegetation of Uruguay and the south of Rio Grande do Sul. The terrigenous sediments transport is carried through the North, along the Brazilian continental shelf, by the Coastal Stream of Brazil. The presence of phytoplankton and zooplankton debris is also due to the influence of the nutrients contribution from Río de la Plata. Possible gas / fluid releases, which sustained chemosynthetic ecosystems at different intervals of two pockmark and diaper cores, were verified by the relative predominance of even-numbered carbon n-alkanes.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_araujo_ioc_dout_2015.pdf: 20521804 bytes, checksum: 9bd69ef7ed9c8b76f26b4b256fcd58cb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Apesar de tratáveis e curáveis, o diagnóstico das infecções ativa (aTB) ou latente (LTBI) por M. tuberculosis permanece desafiador, impactando diretamente o controle da tuberculose. Portanto, a apresentação de indicativos clínico-epidemiológicos é de grande importância na detecção da aTB na rotina clínica. Os LTBI são assintomáticos, sendo majoritariamente diagnosticados pela resposta imune a antígenos (Ags) micobacterianos, seja pelo teste cutâneo à tuberculina (TCT), ou pelos ensaios de liberação de interferon-gama (IGRA) baseados nos Ags da região de diferença 1 (RD1) ESAT6:CFP10. Contudo, a pequena diminuição nas taxas de novos casos de TB sugere que estes testes devem ser aprimorados. Assim, propomos, i) a avaliação de novos marcadores antigênicos, via IGRA de curta (WBA) e longa (LSA) estimulação, utilizando combinação de Ags constituintes da parede celular (ESAT6:CF10 e PstS1/CFP10), Ags associados a fase de latência (LAA) (Rv2029c, Rv2031c, Rv2034, Rv2628 e Rv3353c), bem como a nova proteína fusionada PStS1(285- 374):CFP10; ii) a investigação de biomarcadores transcriptômicos ex vivo, via amplificação de genes-alvo (qRT-PCR multiplex) ou de sequenciamento de RNA (RNAseq). Para isto, foram coletadas amostras de sangue periférico provenientes de uma coorte prospectiva de contatos recentes (rCt) e pacientes com a TB pulmonar O antígeno PstS-1(285-374):CFP10 apresentou-se mais seletivo que o tradicional ESAT6:CFP10 para os rCt com TCTpositivo (WBA = 42,9% vs 30,2%; LSA = 44,4% vs 41,3%). Em estudos longitudinais, a nova quimera foi capaz de detectar todos os casos incidentes em ambos os ensaios utilizados e de apresentar maior taxa de regressão pósquimioprofilaxia (WBA = 62,5% vs 37,5%; LSA = 77,8% vs 50%). Nenhum participante apresentou resposta exclusivamente aos Ags íntegros PstS1/CFP10. Dos LAA ensaiados, a combinatória dos Ags Rv2029c, Rv2031c e Rv2034 se destacou na detecção de respondedores ao IGRA-RD1 (93.5%). Frequência baixa de respondedores nos grupos controle (5,9%) e aTB (28,6%) foi observada para os LAA isoladamente, com aumento de detecção na combinatória (11,8% e 71,4%, respectivamente). Via amplificação multiplex de 170 alvos gênicos, os genes IFI35, PLAUR, IFIT2, LRG1, DOK2, IFITM1 e KIF22 apresentaram modulação diferencial na aTB, mas, baixo potencial de discriminação entre os rCt (Controles ou LTBI. No grupo rCt-LTBI não houve modulação diferencial para estes genes. Via RNAseq, 56 ou 98 transcritos foram identificados estarem diferencialmente expressos na infecção latente ou ativa, respectivamente, mas mantendo-se especificidade >89%, apenas o gene KRT1 ofereceu sensibilidade de 81,3% na detecção de LTBI. Altamente promissor foi a expressão diferencial dos genes DOCK9, EPHA4 e NPC2, conferindo excelente sensibilidade para pacientes com aTB (100%), ou para indivíduos sadios com alto risco de progressão para aTB. Os potenciais marcadores/biomarcadores, com perfis de resposta celular ou por transcrição gênica gerados neste estudo, fornecem possibilidades de desenvolvimento de ferramentas diagnósticas para LTBI e a TB pulmonar
Despite treatable and curable, the diagnosis methods for active (aTB) or latent (LTBI) M. tuberculosis infection remains challenging, directly affecting tuberculosis control. At clinical routine, the detection of aTB commonly relies on the presentation of clinicalepidemiological indicatives. The LTBI subjects are asymptomatic, being principally diagnosed by the elicited immune response to mycobacterial antigens (Ags), either by tuberculin skin test (TST) or, by interferon-gamma release assays (IGRA) using as stimuli Ags ESAT6 and CFP10, both present in the region of difference 1 (RD1). However, the small decrease in worldwide aTB incident cases suggests that nowadays tests for LTBI detection lack in accuracy and should be improved. Therefore, we propose the: i) evaluation of new antigenic markers, via IGRA short- (WBA) and long- term (LSA) stimulation using combination of mycobacterial cell wall antigens (ESAT6: CF10 and PstS1 / CFP10), latency-associated Ags (LAA: Rv2029c, Rv2031c, Rv2034, Rv2628 and Rv3353c) and the new fused-protein PStS1(285-374):CFP10; ii) investigation of ex vivo transcriptomic biomarkers, via target genes amplification (qRT-PCR multiplex) or RNA sequencing (RNAseq). Therefore, peripheral blood samples were collected from a prospective cohort of recent close contacts (rCt) and patients with pulmonary aTB. Stimulation with the Ag PstS-1(285-374):CFP10 was more selective than the traditional ESAT6:CFP10 at rCt-TCTpositive detection (WBA = 42.9% vs 30.2%; LSA = 44.4% vs 41, 3%). In longitudinal analysis, the new chimera was able to detect all incident cases by both tests and showed higher post-chemoprophylaxis regression rates than the RD1 Ags (WBA = 62.5% vs 37.5%; 77.8% vs LSA = 50%). No participant showed exclusive response to PstS1/CFP10 Ags. By combining the LAA Ags Rv2029c, Rv2031c and Rv2034, 93.5% of rCt-IGRA-RD1 responders were detected. While, the frequency of LAA-responders was low at control (5.9%) and aTB (28.6%) groups for the single LAA, or via Ags combination 11,8% e 71,4% , respectively. Via multiplex amplification of 170 target- genes the IFI35, PLAUR, IFIT2, LRG1, DOK2, IFITM1 and KIF22 demonstrated differential modulation at aTB, but low accuracy, showing areas under the curve ( AUC) between 0.67 and 0.73. However, no significant differential modulation was observed at LTBI group. Via RNAseq, 56 or 98 transcripts were found to be differentially expressed at latent or active infection, respectively. Keeping specificity >89%, only KRT1 gene distinguished the LTBI from aTB (sensitivity=81.3%), however, the DOCK9, EPHA4 and NPC2 genes were differentially expressed, providing excellent sensitivity for aTB (100%), or health subjects with a higher risk of progression (LTBI  aTB). The potential of new markers/biomarkers, via cellular response or gene transcription profile this study provide tools for the further development of new LTBI and pulmonary aTB diagnostic tests.
2100-04-25

El objetivo fundamental de esta tesis fue valorar la utilidad de las concentraciones plasmáticas de las proteínas de fase aguda (PFAs) como biomarcadores de enfermedades e indicadores de los parámetros productivos en la especie porcina. Las PFAs son parámetros bioquímicos que incrementan su concentración en respuesta a diferentes tipos de agresiones que afectan al organismo. En la especie porcina las tres PFAs más importantes son: haptoglobina (Hp), Pig Major Acute Phase Protein (Pig-MAP) y Proteína C-reactiva (CRP). En el estudio 1 se realizó la validación de un método inmunoturbidimétrico utilizado para la determinación de CRP humana para su uso con muestras porcinas. Se concluyó que el método de humana debido a su buena precisión, al empleo de calibrador trazable y a que es fácilmente automatizable, se puede utilizar con muestras porcinas mientras no existan métodos específicos de referencia ni materiales de referencia específicos de especie. En el estudio 2 se evaluó la cinética de las concentraciones plasmáticas de Hp, CRP y Pig-MAP a lo largo de todo el ciclo productivo en una explotación porcina de engorde. No se detectaron diferencias en la concentración de estas proteínas en función del sexo y se observó que la concentración de Pig-MAP disminuye con la edad. A la semana 8 de vida se detectó una infección subclínica producida por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) que no causó incremento de la concentración de PFAs. En cambio, al final del período de este estudio, las tres PFA incrementaron considerablemente debido a un brote clínico con problemas respiratorios graves. En el estudio 3 se determinaron los niveles de Hp y Pig-MAP en cerdos de la misma granja comercial del estudio 2 en donde a un grupo de animales se les incorporó en su dieta un inmunomodulador, los cerdos del estudio 2 sirvieron de grupo control. Los animales que recibieron en la dieta este aditivo mostraron niveles más bajos de Hp tras tres semanas de tratamiento y presentaron un mayor incremento de peso y de ganancia media diaria. Por el contrario, las concentraciones de Pig-MAP no mostraron cambios a lo largo del estudio. Las concentraciones de Hp se incrementaron en ambos grupos tras la administración de la vacuna de Aujeszky. En conclusión, este estudio demuestra que la haptoglobina en un buen biomarcador para monitorizar los parámetros productivos y la respuesta a la vacuna de Aujeszky. En el estudio 4 se llevó a cabo una infección experimental con seis cepas diferentes del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), cuatro de ellas pertenecientes al genotipo I y dos al genotipo II. Hp y CRP resultaron ser las PFAs que se incrementaron de forma más acusada tras la infección, en cambio, la concentración sérica de Pig-MAP no se alteró de forma significativa. Por último, en el estudio 5 se investigó la relación entre la presencia de lesiones pulmonares y la concentración sérica de Hp, CRP y Pig-MAP en cerdos de matadero. Los cerdos procedían de 24 granjas clasificadas en función del grado de lesión característica de pleuritis (pleuritis negativa: P-, o pleuritis positiva: P+) y de consolidación pulmonar cráneo-ventral (CVPC negativa: M- y CVPC positiva: M+) observadas en matadero. Se obtuvieron muestras de suero de 20 animales de cada granja en las que se analizaron las concentraciones de las tres PFAs. Las tres proteínas incrementaron claramente en las granjas M+, pero sólo Hp y Pig-MAP incrementaron significativamente en las P+. Los análisis ROC realizados concluyeron que la PFA que mejor discriminaba entre los grupos P+/P- y M+/M- era la Pig-MAP.
The main goal of this thesis was to evaluate the usefulness of serum concentrations of acute phase proteins (APPs) as biomarkers of disease and indicators of growth performance in pigs. The APPs are plasma protein that increase its concentration in response to different types of attacks that affect the organism. In pigs the three major APPs are: haptoglobin (Hp), Pig Major Acute Phase Protein (Pig-MAP) and C-reactive protein (CRP). Study 1 was conducted to validate an immunoturbidimetric method used for the determination of human CRP for use with porcine samples. It was concluded that the human method due to its good precision, traceable calibrator and satisfactory overlap performance, can be used with porcine samples meanwhile there is neither a reference method nor a reference material for determination of CRP in pig. In study 2, the kinetic profile of haptoglobin, C-reactive protein (CRP) and Pig-MAP were evaluated in pigs throughout the productive cycle in a fattening farm. No significant differences were observed in haptoglobin, Pig-MAP and CRP concentrations between males and females. The concentration of Pig-MAP decreased progressively until 13 weeks of age. At week 8, a PRRS virus recirculation took place but the serum concentration of any APPs did not increase. By contrast, at the end of the period of this study, all three proteins increased concomitantly to a clinical outbreak with severe respiratory problems. In study 3, the serum concentration of Hp and Pig-MAP were analyzed in a group of pigs receiving a feed additive with immunomodulatory properties. These animals were from the same commercial farm than those in study 2 and raised in parallel. For this reason, pigs of Study 2 were used as control group. Animals receiving this additive in the diet showed lower levels of Hp after three weeks of treatment and had an improvement in total body weight and average daily gain. By contrast, the concentrations of Pig-MAP were unchanged throughout the study. Hp concentrations increased in both groups after administration of Aujeszky vaccine. In conclusion, this study shows that the haptoglobin in a good biomarker to monitorize production parameters and for monitoring Aujeszky vaccine in pigs reared under standard commercial conditions. In study 4, an experimental infection was performed with six different strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), four of them belonging to genotype I and two to genotype II. Hp and CRP were found to be the APPs which increased more markedly after infection, however, the serum concentration of Pig-MAP did not change significantly. Finally, study 5 investigated the relationship between the presence of lung lesions in pigs at the slaughterhouse and serum concentration of Hp, CRP and Pig-MAP. The pigs came from 24 farms classified according to the level of pleuritis lesions (pleuritis negative: P-, or pleuritis positive: P+) and cranio-ventral pulmonary consolidation (CPVC negative: M-and CPVC positive: M+) observed in slaughterhouse. Serum samples from 20 pigs from each farm were collected and testedfor APPs. All three proteins clearly increased on farms M+, but only Hp and Pig-MAP increased significantly in the P+. ROC analysis concluded that the best APP to discriminate between groups P+ / P- and M+ / M-was Pig-MAP.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-05-20Bitstream added on 2014-06-13T18:41:10Z : No. of bitstreams: 1 marcarini_jc_dr_rcla_parcial.pdf: 265800 bytes, checksum: c6fbdf9127d68f8975699df1a232d5e7 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:00:57Z: marcarini_jc_dr_rcla_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:19Z : No. of bitstreams: 1 000728824_20161231.pdf: 225457 bytes, checksum: 79edd21e91fa8d3d9aa45c8fb9480f5f (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:49Z: 000728824_20161231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:07Z : No. of bitstreams: 1 000728824.pdf: 1493773 bytes, checksum: 9b305297fa111e5b9636e58999da953b (MD5)
Há um interesse crescente na investigação de substâncias de origem natural como os flavonóides, devido ao grande número de evidências dos benefícios que eles proporcionam para a saúde, principalmente reduzindo o desenvolvimento de doenças crônicas. Nesse contexto, a rutina é um flavonóide que tem sido bem caracterizado na literatura por apresentar uma variedade de atividades farmacológicas incluindo propriedades antiinflamatória, antialérgica, antimutagênica, imunomoduladora e hepatoprotetora. Estes efeitos protetores atribuídos a rutina estão relacionados, em grande parte, à sua propriedade antioxidante direta, no entanto, as vias moleculares e os mecanismos de ação desses processos são pouco conhecidos. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos citotóxicos, genotóxicos e protetores do flavonóide rutina em concentrações fisiológicas relevantes in vtiro. Para isso, foram utilizadas quatro linhagens de células tumorais: HTC (hepatoma de Rattus norvegicus); HepG2 (hepatoma humano); HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano) e 786-O (carcinoma renal humano). Os resultados obtidos com as células HTC mostraram que a concentração de 810 uM de rutina não foi citóxica, apresentou efeito genotóxico e não alterou a expressão dos genes GSTa2 e p38, relacionados ao metabolismo de drogas e controle do ciclo celular, respectivamente. Além disso, a análise dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN H1) dos metábolitos das células expostas a concentração genotóxica da rutina (810uM), revelou menores níveis de fosfocolina, glicerofosfocolina, creatina, lactato, acetato e glutationa. A análise dos resultados das linhagens HepG2 e HT-29 revelou que 100 μM de rutina foi citotóxica e reduziu a expressão e a atividade das principais enzimas antioxidantes endógenas: superóxido dismutase...
There is growing interest in the investigation of naturally occurring substances such as flavonoids, due to the large volume of evidence of the benefits they provide for health, mainly by reducing the development of chronic diseases. In this context, rutin is a flavonoid that has been well characterized in the literature by presenting a variety of pharmacological activities including antiinflammatory, antiallergic, antimutagenic, immunomodulating and hepatoprotective. These protective effects attributed to rutin are related in large part to their direct antioxidant properties, however, the molecular pathways and mechanisms of action of these processes are poorly understood. Thus, the objective of this study was to investigate the cytotoxic, genotoxic and protective flavonoid rutin in the relevant physiological concentrations in vtiro. Therefore, it was using four different strains: HTC (Rattus norvegicus hepatocellular); HepG2 (Human carcinoma), HT-29 (human colon adenocarcinoma) and 786- O (human kidney carcinoma). The results obtained with HTC cells showed that the concentration of 810 UM genotoxic effect of rutin showed no changes in gene expression GSTa2 and p38, related to drug metabolism and cell cycle control, respectively. In addition, NMR analysis of cells exposed to the genotoxic concentration rutin (810 UM) revealed lower levels of phosphocholine, glicerphosphocholine, creatine, lactate, acetate and glutathione. The results of the lines HepG2 and HT-29 revealed that 100 UM of rutin was cytotoxic and reduced the expression and activity of the major endogenous antioxidant enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (Gr). On the other hand, 10 UM of rutin did not alter the viability and kinetics of cell proliferation, significantly increased the... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Lúcia Regina Ribeiro
Coorientador: Mário Sérgio Mantovani
Banca: Maria Izabel Camargo Mathias
Banca: Edson Luis Maistro
Banca: Veronica Elisa Pimenta Vicentini
Banca: Denise Crispim Tavares
Resumo: Há um interesse crescente na investigação de substâncias de origem natural como os flavonóides, devido ao grande número de evidências dos benefícios que eles proporcionam para a saúde, principalmente reduzindo o desenvolvimento de doenças crônicas. Nesse contexto, a rutina é um flavonóide que tem sido bem caracterizado na literatura por apresentar uma variedade de atividades farmacológicas incluindo propriedades antiinflamatória, antialérgica, antimutagênica, imunomoduladora e hepatoprotetora. Estes efeitos protetores atribuídos a rutina estão relacionados, em grande parte, à sua propriedade antioxidante direta, no entanto, as vias moleculares e os mecanismos de ação desses processos são pouco conhecidos. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos citotóxicos, genotóxicos e protetores do flavonóide rutina em concentrações fisiológicas relevantes in vtiro. Para isso, foram utilizadas quatro linhagens de células tumorais: HTC (hepatoma de Rattus norvegicus); HepG2 (hepatoma humano); HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano) e 786-O (carcinoma renal humano). Os resultados obtidos com as células HTC mostraram que a concentração de 810 uM de rutina não foi citóxica, apresentou efeito genotóxico e não alterou a expressão dos genes GSTa2 e p38, relacionados ao metabolismo de drogas e controle do ciclo celular, respectivamente. Além disso, a análise dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN H1) dos metábolitos das células expostas a concentração genotóxica da rutina (810uM), revelou menores níveis de fosfocolina, glicerofosfocolina, creatina, lactato, acetato e glutationa. A análise dos resultados das linhagens HepG2 e HT-29 revelou que 100 μM de rutina foi citotóxica e reduziu a expressão e a atividade das principais enzimas antioxidantes endógenas: superóxido dismutase... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: There is growing interest in the investigation of naturally occurring substances such as flavonoids, due to the large volume of evidence of the benefits they provide for health, mainly by reducing the development of chronic diseases. In this context, rutin is a flavonoid that has been well characterized in the literature by presenting a variety of pharmacological activities including antiinflammatory, antiallergic, antimutagenic, immunomodulating and hepatoprotective. These protective effects attributed to rutin are related in large part to their direct antioxidant properties, however, the molecular pathways and mechanisms of action of these processes are poorly understood. Thus, the objective of this study was to investigate the cytotoxic, genotoxic and protective flavonoid rutin in the relevant physiological concentrations in vtiro. Therefore, it was using four different strains: HTC (Rattus norvegicus hepatocellular); HepG2 (Human carcinoma), HT-29 (human colon adenocarcinoma) and 786- O (human kidney carcinoma). The results obtained with HTC cells showed that the concentration of 810 UM genotoxic effect of rutin showed no changes in gene expression GSTa2 and p38, related to drug metabolism and cell cycle control, respectively. In addition, NMR analysis of cells exposed to the genotoxic concentration rutin (810 UM) revealed lower levels of phosphocholine, glicerphosphocholine, creatine, lactate, acetate and glutathione. The results of the lines HepG2 and HT-29 revealed that 100 UM of rutin was cytotoxic and reduced the expression and activity of the major endogenous antioxidant enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (Gr). On the other hand, 10 UM of rutin did not alter the viability and kinetics of cell proliferation, significantly increased the... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

O adenocarcinoma de pâncreas continua sendo uma doença com alta mortalidade apesar dos avanços na ciência e na tecnologia. O diagnóstico é tardio, na maior parte dos casos, impossibilitando uma abordagem com fins curativos. Os estudos em busca de um método para o diagnóstico precoce ou mesmo um tratamento eficaz, até o momento, não revelaram mudanças significativas. Atualmente, pesquisas em biologia molecular apontando alterações em determinados genes nos tumores de pâncreas parecem ser promissoras. Neste sentido, porém seguindo uma outra linha de pesquisa, o estudo atual que objetiva a determinação das características nucleares das células neoplásicas através da cariometria por análise digital, constitui um passo inicial para futuras especulações. Recentemente, estudos em outros tecidos como o prostático, o mamário e o endométrio vêm demonstrando existir eficácia na diferenciação entre seus tecidos normais e neoplásicos e também uma forte relação entre as alterações encontradas na cromatina de seus núcleos celulares e a agressividade de seus respectivos tumores. Utilizando-se tecido pancreático estocado em parafina por até onze anos no laboratório de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), foram determinadas as características nucleares em mil e trezentos núcleos de células ductais de adenocarcinoma de pâncreas e de tecido pancreático normal. Noventa e três características da cromatina foram estudadas por análise digital. Onze características apresentaram valores diferentes entre os dois grupos e estas diferenças foram estatisticamente significativas. A média para o valor da ÁREA nuclear nos tumores foi de 977.78 e de 336.60, no tecido normal; a da RLM278 foi de 353.23 e 97.07; a da RLM266 de 99.32 e 28.06; a do PERIM de 125.58 e 65.05; a do ROUND de 1.37 e 1.04; a da IOD de 123.49 e 107.97; a da FRACDIM de 1.22 e 1.05; a da DENSMIN de 0.01 e 0.14; a da DENSMAX de 0.53 e 0.62; a da DENSSD 0.25 e 0.10 e a da DENS20P de 0.49 e 0.33, respectivamente para os núcleos dos tumores e para os do tecido normal. Sete destas características serviram como marcadores ideais de neoplasia. Estes achados permitiram a criação de uma assinatura digital específica para cada um dos dois tipos de tecido estudado.
Pancreatic adenocarcinoma still results in high mortality rates despite recent advances in science and technology. The diagnosis is late in most cases, hindering the possibilities of cure. So far, studies searching for early diagnostic methods or effective treatment of pancreatic cancer have not resulted in significant changes. Molecular biology has recently expanded our knowledge about the association between gene abnormalities and pancreatic cancer. Following a different research line, this study aims to determine nuclear features of neoplastic cells through digital karyometry assessment, proposing a first step for future speculations. Studies of other tissues like prostate, breast, and endometrium have recently shown efficacy in differentiating between their normal and neoplastic tissues and also a strong relation between changes found in chromatin of cell nuclei and tumor aggressiveness. In the present study, nuclear features were determined in one thousand and three hundred cells removed from cancerous and normal pancreatic tissue stored at the HCPA Pathology Unit through an eleven year period. Ninety-three chromatin features were studied by digital karyometry. Eleven features showed significantly different values between both groups. The average values for nuclear AREA in cancerous and normal tissue was, respectively, 977.78 and 336.60; for RLM278 was 353.23 and 97.07; for RLM266 99.32 and 28.06; PERIMETER of 125.58 and 65.05; ROUNDNESS of 1.37 and 1.04; IOD of 123.49 and 107.97; FRACDIM of 1.22 and 1.05; DENSMIN of 0.01 and 0.14; DENSMAX of 0.53 and 0.62; DENSSD of 0.25 and 0.10; and DENS20P of 0.49 and 0.33, for cancerous nuclei and normal nuclei, respectively. Seven of those features served as ideal neoplasm markers. Such findings yielded the creation of a specific digital signature for each of the two types of studied tissues.

Orientador: Patrícia Pintor dos Reis
Resumo: Introdução: O câncer de pulmão é a principal causa de morte por câncer no mundo. Apesar dos avanços nas estratégias de diagnóstico e o desenvolvimento de novas terapias com alvos moleculares, pouco progresso tem sido observado quanto ao aumento de sobrevida dos pacientes. Portanto, a identificação de novos biomarcadores ainda é necessária para o desenvolvimento de novas terapêuticas para carcinomas pulmonares. Nesse contexto, os microRNAs (miRNAs) são moléculas promissoras, pois constituem uma classe de RNAs não-codantes reguladores da expressão gênica os quais têm sido evidenciados como biomarcadores diagnósticos, prognósticos e preditivos no câncer. Materiais e Métodos: Amostras de tecido pulmonar tumoral e normal de 38 pacientes com carcinoma de pulmão de células não pequenas (da sigla em inglês NSCLC), dos subtipos histológicos adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas, foram avaliadas para a expressão global de miRNAs utilizando a plataforma TaqMan® Array Human MicroRNA card A v3.0 (Life Technologies). Os miRNAs com alterações na expressão (FC≥2,0) e p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os dados de expressão foram associados com a sobrevida global. Análises de bioinformática permitiram identificar genes-alvo regulados pelos miRNAs desregulados. A relação entre sobrevida global e a identificação de uma assinatura de expressão de miRNAs foi avaliada com objetivo de integrar nossos achados utilizando bancos de dados públicos. Resultados: Os resul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Doutor

El cáncer de páncreas es una enfermedad con un pronostico infausto en el momento actual. Durante los últimos años se ha realizado un esfuerzo para intentar mejorar el tratamiento oncológico de este tumor, no obstante, la supervivencia de los pacientes con un cáncer de páncreas avanzado no llega a los doce meses de vida como media. Las previsions para la próxima década son que el cáncer de páncreas será la segunda causa de muerte por cáncer en Estados Unidos. El motivo de este pronóstico es la falta de estrategias para diagnosticar la enfermedad en estadios iniciales, y por lo tanto potencialment curables, y el fracaso del tratamiento oncológico. El major conocimiento de la biologia del cáncer de páncreas ha permitido definir a este tumor como heterogeneo, así como identificar las mutacions más frecuentes en la mayoría de los tumores de páncreas. Por desgracia, hasta el momento actual estas alteracions biológicas no se ha conseguido que sean dianas terapéutica. En los últimos años somos testigos de la identificación de alteracions moleculares presentes en un porcentaje pequeño, pero potencialment son dianes terapéuticas. En esta tesis se ha realizado un esfuerzo durante cuatro años de recoger la información clínica y biológica de los pacientes con un cáncer de páncreas que han participado en el programa de pre-screening molecular del Hospital Universitari Vall d´Hebrón de Barcelona. El objetivo de esta tesis es profunditzar en el conocimiento de la biologia molecular del cáncer de páncreas, y seguir buscando nuevas alteracions moleculares potenciales dianes terapéuticas. Con ello conseguiríamos augmentar las armes terapéuticas para luchar contra esta enfermedad. La mutación mas frecuente en el cáncer de páncreas es la de KRAS. Por este motivo, una parte importante del análisis de la tesis se ha centrado en profunditzar en el conocimiento de esta alteración en el cáncer de páncreas. Durante años han mejorado las técnicas que permiten diagnosticar mutaciones presentes en este tumor, aumentando la sensibilidad de las mismas, y permitiendo así una mayor aproximación a la biologia del tumor. Al mismo tiempo, y en la misma línia, se ha investigado el beneficio de la participación de los pacientes afectos de un cáncer de páncreas que han progresado al tratamiento considerado estandar, en un estudio fase I dentro de la Unidad de Fases I de l´Hospital Universitari Vall d´Hebrón. Esta tesis es un principio para continuar trabajando en la misma dirección, aprendiendo de las dificultades que han ido apareciendo a lo largo del desarrollo de la misma.
Pancreatic cancer presented a dismal prognosis. During the last years an efford has been done in order to improve the results of the chemotherapy in this tumor, however, the overall survival in these patients is less than twelve months. A recent publication suggested that in the next decade pancreatic cancer will be the second leading cause of cancer related dead. The reason is that we don´t have a protocol for diagnosed the tumor in an early stage, when it is potencially curable, and also the lack of effective treatments. The improvement in the knowledge of the biology of the pancreatic neoplasm had allowed to define this tumor as heterogeneous disease, and also define the most common mutations in the pancreatic tumor. Unfortunatelly these mutations are not therapeutic targets. In the last years we identify a mutations, with low frequency, that are target therapies. This tesis is an efford durting four years to collect clincal and biological information of the patients who have participated in the molecular pre-screening of the Vall d´Hebrón University hospital in Barcelona. The objective of this work is to deep in understanding the biology of pancreatic cancer, and also identify potential target therapies. With it we can increase the weapons to treat pancreatic cancer. The most freqüent mutation in pancreatic cancer is KRAS, for this reason, in this tesis we focused on deeping the understanding of this alteration. During years we have improved the sensitivity of the techniques that allow the diagnosis of these molecular alterations, thus allowing a better understanding of pancreatic cancer biology. We also investigate the benefit of the participation of the patients with an advanced pancreatic cancer that progressed to standard therapy to participated in a phase I trial in the Unidad de Fases I de l´Hospital Universitari Vall d´Hebrón. This work is a principle to continue working in the same direction

O carcinoma de células renais (CCR) é o tumor mais agressivo que afeta o rim de pessoas adultas. O CCR é uma doença heterogênea, com diferentes alterações moleculares e variados patrões histológicos e clínicos que apresentam evolução diferente. Atualmente apenas variáveis anatomopatológicas clássicas são utilizadas para determinar o prognóstico dos pacientes. Utilizando uma plataforma de microarranjos de DNA, nosso grupo identificou em um trabalho anterior um conjunto de genes que se encontram diferencialmente expressos em tumores de rim. Neste estudo, nove candidatos foram selecionados para avaliação como marcadores de prognóstico no CCR. Foi confirmada a alteração na expressão dos genes ARNTL, ACTN4 e EPAS1 (p < 0,05) em amostras tumorais de CCR através de PCR em tempo real. Adicionalmente, foi observada a alteração da expressão dos genes ARNTL, EPAS1 e CASP7 em linhagens celulares imortalizadas derivadas de tumores renais, recapitulando por tanto, as alterações observadas nos tumores obtidos de pacientes. Posteriormente investigamos o padrão de expressão proteica destes candidatos por imunohistoquímica utilizando microarranjos de tecidos. Foi detectada a diminuição significativa (p < 0,05) da expressão das proteínas ACTN4, ARNTL, CASP7 e EPAS1 em tumores de pacientes com CCR relativamente ao tecido renal não tumoral. Além disso, foi possível determinar valores de imunomarcação capazes de estratificar pacientes com CCR em diferentes grupos de risco quanto à sobrevida câncer-específica, que adicionalmente apresentaram associação significativa com parâmetros anatomopatológicos utilizados na clínica. As imunomarcações de ACTN4, ARNTL, e EPAS1 se mostraram parâmetros independentes de prognóstico de sobrevida dos pacientes. A imunomarcação de CASP7 foi capaz de identificar subgrupos de pacientes com pior prognóstico dentro de um conjunto de pacientes de baixo risco em função do estadio clinico, além de identificar pacientes com menor risco de morte pelo câncer entre aqueles apresentaram recorrência em até 5 após a cirurgia. O conjunto de resultados obtidos aponta para um novo conjunto de biomarcadores moleculares com potencial relevância para auxiliar no prognóstico de pacientes com carcinoma de células renais.
The renal cell carcinoma (RCC) is the most aggressive tumor that affects the kidney in adult people. The RCC is a heterogeneous disease, with many different molecular alterations and varied histological and clinical patterns with different outcome. Currently, only classic anatomopathological variables are used to determine patients\' prognosis. Using a DNA microarray platform, our group identified in a previous work a set of genes differentially expressed in renal tumors. In this study, nine candidates were selected for evaluation as prognostic biomarkers in RCC. Alteration of the gene expression in RCC tumor samples was confirmed for ARNTL, ACTN4 and EPAS1 (p < 0.05) by real time PCR. Additionally, gene expression changes of ARNTL, EPAS1 and CASP7 were also observed in immortalized cell lines derived from renal tumors, recapitulating the expression changes detected in the patients\' tumors. Next, we used tissue microarrays to investigate the protein expression of the selected candidates by immunohistochemistry. Expression of the proteins ACTN4, ARNTL, CASP7 and EPAS1 was detected as significantly downregulated (p < 0.05) in patients´ tumors relative to non-tumor renal tissue. Furthermore, immunostaining patterns of the selected candidates were able to stratify patients with RCC in different risk groups according to cancer-specific survival, which also showed significant associations with anatomopathological parameters used in the clinics. ACTN4, ARNTL and EPAS1 immunostaining resulted as independent prognostic parameters of patient survival. CASP7 immunostaining was able to identify subgroups of patients with worse prognosis in a set of low risk patients as determined by their clinical stage, and also identified patients with lower risk of death from cancer amongst patients that relapsed within 5 years after surgery. Overall, these results point to a new set of molecular biomarkers with potential relevance to help in the prognosis of patients with renal cell carcinoma.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada por fungos termodimórficos do complexo Paracoccidioides brasiliensis - P. brasiliensis e P. lutzii. Pacientes com PCM revelam comprometimento imune celular específico. Apesar do tratamento efetivo, os fungos quiescentes podem levar à recaída, geralmente tardia, cujo diagnóstico sorológico tem se mostrado pouco sensível. A sensibilidade do teste de imunodifusão é de cerca de 90% em pacientes com PCM não tratados, mas de apenas 45% em casos de recaída. Além disso, o soro de pacientes com PCM causada por P. lutzii, freqüente na região Centro-Oeste do Brasil, não reage com o antígeno clássico obtido do Pb B-339. No seguimento dos pacientes, continua a busca de um critério que dê maior segurança à decisão de se suspender o tratamento. Esses achados mostraram a necessidade de métodos alternativos de diagnóstico e seguimento, como os utilizados em proteômica, que constituiram o presente estudo. Assim, proteínas expressas no soro de pacientes com PCM em atividade - não tratada (causada por P. brasiliensis e por P. lutzii), com recaída da doença (causada por P. brasiliensis) e de controles saudáveis foram identificadas usando-se abordagem proteômica, realizada em quatro etapas - quantificação de proteínas, digestão de proteínas em solução, sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massa e análise de dados para identificação de proteínas. Foram identificadas 29 proteínas plasmáticas à admissão, cuja comparação entre os grupos de pacientes sugeriu que a presença da immunoglobulin (Ig) alpha-2 chain C region e a ausência de Ig heavy chain V-III TIL indicariam infecção por P. lutzii e que a ausência da proteína complement factor B poderia ser um preditor de recaída. Na análise evolutiva das proteínas identificadas em pacientes com PCM por P. brasiliensis em tratamento, comparando-se aqueles que apresentaram com os que não revelaram recaída, 29 proteínas foram identificadas. As interações observadas entre as proteínas, usando transferrin e haptoglobin como a principal proteína de ligação, foram fortes com todas as demais. O acompanhamento desses pacientes sugere que a presença de cerulosplamin pode ser um marcador de recaída e que a de transferrin e a apolipoprotein A-II podem contribuir para a avaliação da cura e suspensão do tratamento, evitando que esta decisão seja muito precoce. A avaliação das proteínas selecionadas, identificadas por metodologia proteômica, deve ser realizada em um número maior de pacientes, para validar esses achados.
Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by thermodymorphic fungi of the Paracoccidioides brasiliensis complex - P. brasiliensis and P. lutzii. Patients with PCM reveal specific cellular immune impairment. Despite the effective treatment, quiescent fungi can lead to relapse, usually late, whose serological diagnosis has presented low sensitivity. The double agar gel immunodiffusion test shows a 90% sensitivity in untreated PCM patients, but it is much lower (45%) in cases of relapse. In addition, serum from patients with PCM caused by P. lutzii, frequent in the Midwest region of Brazil, do not react with the classical antigen obtained from Pb B-339. In the follow-up of the patients, persists the search of a criterium that gives a higher safety for treatment discontinuation. These findings showed the need for alternative methods for diagnosis and follow-up, such as those based on proteomics, which constituted the present study. Thus, serum expressed proteins from patients with active - untreated PCM (caused by P. brasiliensis and by P. lutzii), from relapsed PCM patients (caused by P. brasiliensis) and from healthy controls were identified using a proteomic approach, performed in four steps - protein quantification, protein digestion in solution, peptide sequencing by mass spectrometry and data analysis for protein identification. A total of 29 plasma proteins were identified at admission (before introduction of the treatment), and the comparison regarding groups suggested that the presence of the immunoglobulin (Ig) alpha-2 chain C region and the absence of heavy chain Ig V-III TIL are indicative of infection by P. lutzii and that the absence of the complement factor B protein may be a predictor of relapse. The evaluation of the proteins during the treatment follow-up of the PCM patients infected by P. brasiliensis, separated regarding the presence of relapse, identified 29 proteins. The interactions observed between the proteins, using transferrin and haptoglobin as the main binding protein, were strong with all the others. Patients’ follow-up suggests that cerulosplamin may be a marker of relapse and that transferrin and apolipoprotein A-II may contribute to the evaluation of cure and discontinuation of treatment, avoiding that this decision is too early. The study of the selected proteins in a higher number of patients should be carried out in order to validate these findings.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017.
Made available in DSpace on 2018-01-09T03:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349092.pdf: 3180449 bytes, checksum: 35a901a7c9ca1f0f4a4f37c9384ff1d0 (MD5) Previous issue date: 2017
A intensificação de atividades industriais e agrícolas na margem de corpos d?água tem imposto aos ambientes aquáticos uma crescente carga de resíduos. Dentre esses, poluentes orgânicos persistentes (POPs) e metais-traço, os quais se concentram no ambiente e nos organismos em decorrência de sua difícil degradação. POPs são biomagnificados através da dieta, alcançando níveis elevados em tecidos adiposos de predadores de topo, como cetáceos. POPs são frequentemente relacionados à maior incidência de doenças oportunistas e de carcinomas e à diminuição das taxas reprodutivas em cetáceos. Faz-se necessário o emprego de biomarcadores que permitam identificar antecipadamente quadros de exposição a tais compostos. O presente trabalho mensurou biomarcadores de biotransformação de xenobióticos, do sistema de defesa antioxidante e defesa imunológica em amostras tegumentares de botos da tainha, residentes no Complexo Estuarino de Santo Antônio dos anjos-Imaruí-Mirim, SC (CEL), e no estuário da Lagoa dos Patos, RS (ELP). Valores de contaminantes bioacumulados e resposta de biomarcadores foram comparados entre locais, machos e fêmeas, adultos e juvenis e entre botos amostrados no inverno e no verão. Níveis de resposta de biomarcadores também foram correlacionados aos níveis de organoclorados (OCs), bifenilas policloradas (PCBs) e éteres difenílicos polibromados (PBDEs) bioacumulados. Botos de CEL e ELP apresentaram padrão de PCBs e pesticidas similares. Botos de CEL apresentaram valores médios de ?DDTs/?PCBs significativamente maiores que os animais de ELP, e correlação negativa (r=-0,57) entre a o tamanho da área de concentração de vida e ?POPs bioacumulados. No ELP, os botos apresentaram concentrações mais elevadas de Mirex e PCBs. Dentre os biomarcadores avaliados, níveis de transcrição de metalotionéina 2A (MT2) foram significativamente mais elevados em botos de CEL. Local não exerceu influência significativa sobre níveis de resposta dos demais biomarcadores, Além do local, estação de coleta e sexo influenciaram significativamente concentrações de POPs bioacumulados e níveis de resposta de biomarcadores. Concentração de PCBs, DDTs e hexaclorobenzeno (HCB) foram menores em botos amostrados no inverno. Similarmente, atividade glutationa-S-transferase (GST) foi menor em botos amostrados no inverno. Variação sazonal também foi observada para níveis de transcrição de interleucina 1 (IL1), glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), beta-actina (B-ACT), receptor aril de hidrocarboneto (AHR) e glutationa-S-transferase, isoforma pi (GST-pi), com valores mais elevados de transcrição em botos amostrados no inverno. Em relação ao sexo, concentração de PCBs, DDTs e Mirex foram significativamente maiores em machos. O número de transcritos do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHCII) e beta-actina (B-ACT) também foram significativamente maiores em machos. As atividades superóxido dismutase (SOD), GPx e GR não variaram de acordo com local, sexo, faixa etária ou estação de coleta. Apesar de não terem sido obtidos valores de correlação significativos entre as classes de POPs e os níveis de resposta de biomarcadores, a análise de componentes principais (PCA) permite observar variação similar entre PBDEs, PCBs, Mirex e HCB e atividade GST, SOD e, em menor grau, atividade GPx. Resultados da PCA também indicam variação similar entre DDTs e níveis de transcritos de ARNT e, em menor grau, atividade GR. Atividade EROD e catalase ficaram abaixo do limite de detecção, assim como níveis de transcrição de CYP1A, interleucina-2 (IL-2) e interferon gama (IFN-g) ficaram abaixo do limite de detecção. Portanto, tais biomarcadores não foram incluídos em análises subsequenrtes. Os resultados indicam que níveis de POPs mensurados estão abaixo de valores críticos obtidos em áreas extremamente poluídas e reforçam o papel do Rio Tubarão como fonte de POPs para CEL. A análise de biomarcadores reflete os níveis de contaminação dos botos, apresentando variação também moderada entre as amostras. Níveis de transcrição de MT2, no entanto, indicam maior contaminação por metais-traço em CEL, embora tais elementos não tenham sido mensurados no presente trabalho. Os dados obtidos reforçam o potencial de uso dos níveis de transcrição de ARNT bem como atividade de GST como biomarcadores de exposição a POPs. Níveis de transcrição de MHCII sugerem maior resposta imune em botos com maiores níveis de POPs bioacumulados, possivelmente decorrente de uma maior exposição destes animais a patógenos. Por fim, nossos resultados enfatizam a necessidade de levar em conta a variação sazonal e de sexo quando da realização de estudos de biomonitoramento em cetáceos.
Abstract : Intensified industrial and agricultural development around waters bodies imposes upon aquatic environments an increasing load of chemical residues. Among these, persistent organic pollutants (POPs) and trace metals that accumulate on the environment and its organisms due to its resistance to degradation. POPs are biomagnified through diet, reaching high levels in adipose tissue of top predator, such as cetaceans. POPs are frequently associated to higher occurrence of opportunistic diseases, genetic alterations and diminishing reproductive rates on cetaceans. As such, is necessary to use biomarkers that indicate early-on exposure to POPs. The present study measured biomarkers of xenobiotic biotransformation, antioxidant defense system and immune response in integument tissue of bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) resident to the estuarine complex of Santo Antonio dos anjos-Imaruí-Mirim, SC (CEL) and to Patos lagoon estuary, RS (ELP). Contamination levels and biomarkers response values were compared between locations, males and females, adults and juveniles and dolphins sampled in the summer or winter. Biomarkers response values were also correlated to levels of bioaccumulated organochlorine pesticides, polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and polychlorinated biphenyls (PCBs). Dolphins from CEL and ELP present a similar PCB congeners and pesticides pattern. CEL dolphins showed significantly higher ?DDTs/?PCBs values than ELP dolphins, and present a negative correlation (r= -0.57) between concentration area and ?POPs bioaccumulated. For ELP, dolphins showed higher Mirex and PCBs levels. Among analyzed biomarkers, transcription levels of metallothionein 2A (MT2) were significantly higher in dolphins from CEL. Location did not influence significantly other biomarkers. Besides location, sampling season and gender influenced significantly the concentration of POPs bioaccumulated and biomarkers response. PCBs, DDTs and hexachlorobenzene (HCB) levels were significantly lower in dolphins sampled in the winter. Similarly, glutathione-S-transferase (GST) activity was lower in dolphins sampled in the winter. Seasonal variation was also observed for transcription levels of interleukin-1 (IL-1), glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), beta-actin (B-ACT), aryl hydrocarbon receptor (AHR) and glutathione-S-transferase pi (GST-pi), with significantly higher values in samples obtained in the winter. Regarding gender, PCBs, DDTs and Mirex levels were significantly higher in males. Transcription levels of major histocompatibility complex class II (MHCII) and beta-actin (B-ACT) were also significantly higher in males. Superoxide dismutase (SOD), GPx and GR activity did not vary significantly with location, gender or sampling season. Despite the absence of significant correlation values between POPs classes and biomarkers response, principal component analysis (PCA) exhibits similar variation patterns among PBDEs, PCBs, Mirex and HCB and GST, SOD and GPx activity. PCA results also indicate similar variation pattern between DDTs and ARNT transcription levels and, to a minor extent, GR activity. EROD and catalase activity remained below detection limit, as did the transcription levels of CYP1A, interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma (IFN-g). As such, these biomarkers were excluded from further analysis. Results indicate that measured POPs levels are moderate, below critical values obtained in highly polluted areas and reinforce the role of Tubarao River as a main source of POPs to CEL. Biomarkers response reflected POPs levels and showed moderate variation between samples. However, results indicated a possibly higher contamination of CEL by trace metals and support the usage of ARNT and GST activity as biomarkers to POPs exposure. Also, MHCII transcription rates suggested an increased immune response in contaminated animals, possibly due to a higher exposure to pathogens. Finally, our results emphasize the need to consider seasonal variability upon using molecular biomarkers in cetaceans biomonitoring studies.

- Introducció: Actualment, hi ha una elevada prevalença d'obesitat en les societats desenvolupades. A causa d'aquest fet, neix un creixent interès per dur a terme una alimentació òptima; així com, de disposar d'adequats biomarcadors robustos de salut/malaltia que ens ajudin a predir si un individu està predisposat a patir una malaltia, com l'obesitat, abans que aquesta es desenvolupi. De manera que, amb aquesta informació es puguin posar en marxa certes estratègies nutricionals per a la seva prevenció. - Contingut de la investigació: L'estudi que s'aborda en aquesta tesi pretén contribuir a identificar i caracteritzar potencials biomarcadors predictius d'obesitat i/o alteracions metabòliques associades. S'ha desenvolupat un model animal basat en la suplementació materna amb leucina durant la lactància, basant-se en la hipòtesi que la suplementació amb leucina podria incrementar els nivells de leptina en llet materna. En aquest context, resultats previs del grup han demostrat el paper protector enfront de l'obesitat de la ingesta de quantitats òptimes de leptina en rates lactants mascles i, en relació a la leucina, encara que hi ha certa controvèrsia en si és beneficiosa o perjudicial, s'ha associat amb l'obesitat i resistència a la insulina. Els resultats indiquen que la suplementació de la dieta estàndard amb leucina (2%) en rates, promou un augment de la leptina en llet i això s'associa al desenvolupament d'una progènie masculina protegida, en certa mesura, enfront del desenvolupament d'obesitat induïda per dietes hipercalòriques. No obstant això, té l'efecte contrari en la progènie femenina, que mostra major propensió a l'obesitat i també resistència a l'acció de la insulina. És interessant destacar que els efectes adversos observats sobre la progènie femenina es contraresten si la suplementació amb leucina es manté la resta de la vida, mentre que a la progènie masculina, això resulta en hiperinsulinèmia. - Conclusió: S'han identificat un conjunt de biomarcadors, dels quals se seleccionen els següents pel seu potencial interès en l'àmbit de l'obesitat i per a la seva validació en altres models experimentals i humans: a) de major susceptibilitat a obesitat en femelles: menor expressió de leptina, adiponectina i UCP2 en teixit adipós; b) de millor control glucèmic en femelles: major proporció de linoleic i menor de oleic i mirístic en plasma; c) de protecció enfront de l'obesitat en mascles: lactància amb llet enriquida en leptina i PUFAs; d) de control glucèmic inadequat en mascles: nivells plasmàtics baixos de linolènic i elevats de linoleic.
- Introducción: Actualmente, existe una elevada prevalencia de obesidad en las sociedades desarrolladas. Debido a este hecho, nace un creciente interés por llevar a cabo una alimentación óptima; así como, de disponer de adecuados biomarcadores robustos de salud/enfermedad que nos ayuden a predecir si un individuo está predispuesto a padecer una enfermedad, como la obesidad, antes de que ésta se desarrolle. De manera que, con esta información se puedan poner en marcha ciertas estrategias nutricionales para su prevención. - Contenido de la investigación: El estudio que se aborda en esta tesis pretende contribuir a identificar y caracterizar potenciales biomarcadores predictivos de obesidad y/o alteraciones metabólicas asociadas. Se ha desarrollado un modelo animal basado en la suplementación materna con leucina durante la lactancia, basándose en la hipótesis de que la suplementación con leucina podría incrementar los niveles de leptina en leche materna. En este contexto, resultados previos del grupo han demostrado el papel protector frente a la obesidad de la ingesta de cantidades óptimas de leptina en ratas lactantes machos y, en relación a la leucina, aunque hay cierta controversia en si es beneficiosa o perjudicial, se ha asociado con la obesidad y resistencia a insulina Los resultados indican que la suplementación de la dieta estándar con leucina (2%) en ratas, promueve un aumento de la leptina en leche y ello se asocia al desarrollo de una progenie masculina protegida, en cierta medida, frente al desarrollo de obesidad inducida por dietas hipercalóricas. Sin embargo, tiene el efecto contrario en la progenie femenina, que muestra mayor propensión a la obesidad y también resistencia a la acción de la insulina. Es interesante destacar que los efectos adversos observados sobre la progenie femenina se contrarrestan si la suplementación con leucina se mantiene el resto de la vida, mientras que en la progenie masculina, ello resulta en hiperinsulinemia. - Conclusión: Se han identificado un conjunto de biomarcadores, de los cuales se seleccionan los siguientes por su potencial interés en el ámbito de la obesidad y para su validación en otros modelos experimentales y humanos: a) de mayor susceptibilidad a obesidad en hembras: menor expresión de leptina, adiponectina y UCP2 en tejido adiposo; b) de mejor control glucémico en hembras: mayor proporción de linoleico y menor de oleico y mirístico en plasma; c) de protección frente a la obesidad en machos: lactancia con leche enriquecida en leptina y PUFAs; d) de control glucémico inadecuado en machos: niveles plasmáticos bajos de linolénico y elevados de linoleico.
- Introduction: Currently, there is a high prevalence of obesity in developed societies. Due to this fact, there is a growing interest for optimal nutrition and, for adequate and robust biomarkers of health/disease to help in the prediction of health outcome, to know whether an individual is predisposed to a disease, such as obesity, before it develops. So, this information can contribute to the implementation of nutritional strategies for prevention. - Research content: The study addressed in this Thesis aims to contribute to the identification and characterization of potential predictive biomarkers of obesity and/or associated metabolic disturbances. We have developed an animal model based on maternal leucine supplementation during lactation, based on the hypothesis that leucine supplementation might increase levels of leptin in breast milk. In this context, previous results of our research group demonstrated the protective role against obesity associated with the intake of optimal amounts of leptin in lactating male rats; and in relation to leucine, although there is some controversy whether beneficial or detrimental, it has been associated with obesity and insulin resistance. The results indicate that supplementation of standard diet with leucine (2%) in rats, promotes an increase in milk leptin, which is associated to the development of a male offspring protected, to some extent, against the development of obesity induced by high energy dense diets. However, it has the opposite effect on the female progeny, showing greater propensity for obesity and resistance to insulin action. Interestingly, the adverse effects on female offspring were counteracted by chronic leucine supplementation, while in the male offspring, this resulted in hyperinsulinemia. - Conclusion: A set of biomarkers have been identified, of which the following are selected for their potential interest in the field of obesity and for validation in other experimental models and humans: a) of increased susceptibility to obesity in females: lower expression of leptin, adiponectin and UCP2 in adipose tissue; b) better glycemic control in females: higher proportion of linoleic acid and lower of oleic and myristic acids in plasma; c) protection against obesity in males: leptin- and PUFA-enriched milk; d) of inadequate glycemic control in males: low plasma levels of linolenic acid and high plasma linoleic acid.

Nesta tese, apresentamos nossas estratégias para desenvolver um ambiente matemático e computacional para análises em larga-escala de dados de expressão gênica obtidos pela tecnologia de microarranjos de DNA. As análises realizadas visaram principalmente à identificação de marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos. Apresentamos o resultado de diversas análises implementadas através do ambiente desenvolvido, as quais conduziram a implementação de uma ferramenta computacional para a anotação automática de plataformas de microarranjos de DNA e de outra ferramenta destinada ao rastreamento da análise de dados realizada em ambiente R. Programação eXtrema (eXtreme Programming, XP) foi utilizada como técnica de planejamento e gerenciamento dos projetos de análise dados de expressão gênica. Todos os conjuntos de dados foram obtidos por nossos colaboradores, utilizando-se duas diferentes plataformas de microarranjos de DNA: a primeira enriquecida em regiões não-codificantes do genoma humano, em particular regiões intrônicas, e a segunda representando regiões exônicas de genes humanos. A primeira plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de expressão gênica em tumores de próstata e rim humanos, sendo que análises utilizando SAM (Significance Analysis of Microarrays) permitiram a proposição de um conjunto de 49 sequências como potenciais biomarcadores de prognóstico de tumores de próstata. A segunda plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de transcritos expressos em sarcomas, carcinomas epidermóide e carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço. As análises com sarcomas permitiram a identificação de um conjunto de 12 genes relacionados à agressividade local e metástase. As análises com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço permitiram a identificação de 7 genes relacionados à metástase linfonodal.
In this PhD Thesis, we present our strategies to the development of a mathematical and computational environment aiming the analysis of large-scale microarray datasets. The analyses focused mainly on the identification of molecular markers for diagnosis and prognosis of human cancers. Here we show the results of several analyses implemented using this environment, which led to the development of a computational tool for automatic annotation of DNA microarray platforms and a tool for tracking the analysis within R environment. We also applied eXtreme Programming (XP) as a tool for planning and management of gene expression analyses projects. All data sets were obtained by our collaborators using two different microarray platforms. The first is enriched in non-coding human sequences, particularly intronic sequences. The second one represents exonic regions of human genes. Using the first platform, we evaluated gene expression profiles of prostate and kidney human tumors. Applying SAM to prostate tumor data revealed 49 potential molecular markers for prognosis of this disease. Gene expression in samples of sarcomas, epidermoid carcinomas and head and neck epidermoid carcinomas was investigated using the second platform. A set of 12 genes were identified as potential biomarkers for local aggressiveness and metastasis in sarcoma. In addition, the analyses of data obtained from head and neck epidermoid carcinomas allowed the identification of 7 potential biomarkers for lymph-nodal metastases.

El treball descrit en aquesta tesi fa referència al tractaments de glioblastomes (GBM) GL261 preclínics que creixen en ratolins C57BL/6, també al seguiment no invasiu de la resposta a la teràpia, usant tècniques de ressonància magnètica (RM). El model immunocompetent GL261 GBM s’indueix per injecció estereotàctica de cèl·lules GL261 a l’estriat de ratolins WT C57BL/6. Tres agents terapèutics s’han provat en aquest model: el CX-4945®, inhibidor de la proteïna kinasa II (CK2), i dos agents alquilants d’administració oral usats habitualment en pràctica clínica pel tractament de GBM: la temozolamida (TMZ) i la ciclofosfamida (CPA). La CK2 ha estat descrita com a diana potencial pel tractament del càncer, ja que contribueix en el desenvolupament tumoral, proliferació i supressió de l’apoptosi. A més, nivells elevats d’expressió s’han demostrat en varis tipus de càncer. Malgrat això, el CX-4945, el qual està en fase clínica I/II, no va produir l’efecte beneficiós desitjat descrit per altres autors quan es va usar amb el nostre model de GBM GL261. A més, el tractament d’aquest model amb 3 cicles de TMZ, ja ha estat descrit en el nostre grup amb un augment significatiu de la supervivència. Per contra, la teràpia combinada de 3 cicles TMZ amb CX-4945, inesperadament, va revertir l’efecte beneficiós de la TMZ, el que va suggerir una interferència amb el sistema immunitari relacionat amb el desenvolupament i tractament del càncer. Això ens va portar a considerar l’ús d’un esquema de teràpia metronòmic (administració de dosis baixes separades per períodes iguals i sense llargs períodes de repòs entremig) descrit amb resultats prometedors a la literatura. La CPA, la TMZ i el CX-4945 van ser analitzats en un esquema de teràpia metronòmic a dosis diferents. Dins les diferents estratègies analitzades, els millors resultats es van obtenir amb el protocol metronòmic de teràpia combinada, cada 6 dies, de TMZ i CX-4945, mostrant un increment significatiu en la supervivència. Aquests resultats també van apuntar cap a la probable participació del sistema immunitari en resposta a la teràpia, tot i que es necessitaran futurs estudis d’histopatologia per confirmar aquesta hipòtesis. Altres resultats interessants addicionals van ser: en primer lloc, l’aparició d’un clar edema peritumoral durant moments concrets del tractament quimioterapèutic. En segon lloc, que la metodologia no-invasiva per determinar la resposta a la teràpia basat en l’anàlisi semi-supervisat de fonts d’imatge espectroscòpica de ressonància magnètica (MRSI), prèviament desenvolupat en el nostre grup amb ratolins tractats amb TMZ, també va demostrar ser viable per detectar la resposta induïda pel CPA en el nostre model preclínic. Això suggeriria que es pot observar un “patró metabolòmic de resposta” comú sota diferents estratègies terapèutiques. I en tercer lloc, l’aparició de limfomes trobats en les necròpsies de ratolins curats després de dosis cumulatives elevades de TMZ (480-1400 mg/Kg), suggerint que cal investigar estratègies per disminuir la dosi administrada d’agents alquilants per evitar efectes perjudicials en els ratolins tractats.
Work described in this thesis deals with the treatment of GL261 preclinical glioblastoma (GBM) growing in C57BL/6 mice, as well as with the non-invasive assessment of response to therapy using magnetic resonance (MR) techniques. The GL261 GBM is an immunocompetent model induced by stereotactic injection of GL261 cells into the striatum of C57BL/6 WT mice. Three different therapeutic agents have been tested in this model: CX-4945®, a protein kinase II (CK2) inhibitor, and two oral alkylating agents commonly used in the clinic for GBM treatment, temozolomide (TMZ) and cyclophosphamide (CPA). CK2 has been described as a potential suitable target for cancer treatment because it contributes to tumour development, proliferation, and apoptosis suppression in cancer. In addition, elevated CK2 expression levels have been demonstrated in several cancer types. Nevertheless, CX-4945, which already reached phase I/II clinical trials, did not produce the expected beneficial effect described by others when applied to our GL261 GBM model. Moreover, the GL261 GBM treatment with 3 TMZ cycles had been already described by our group with significant survival improvement. Nevertheless, the combined therapy 3 cycle-TMZ+CX-4945, unexpectedly, reverted the beneficial effect of TMZ, which suggested an interference with the immune cycle related with cancer development and treatment. This lead us to consider the use of a metronomic schedule (administration of low and equally spaced doses of drugs without long rest periods in between) described with promising results in the literature. CPA, TMZ and CX-4945 were assessed in a 6-day schedule metronomic schedule at different doses. Among the different strategies evaluated, best results were obtained with the combined metronomic administration, every 6 days, of TMZ and CX-4945 drugs, showing significant improved survival. This also pointed to the probable paticipation of the host mice immune system in therapy response, although further histopathological studies will be needed to fully confirm this hypothesis. Additional interesting findings were: firstly, a clear peritumoral brain edema appearance during certain stages of chemotherapeutic treatment. Secondly, that the non-invasive method for therapy response assessment based in semi-supervised source analysis of Magnetic Resonance Spectroscopy Imaging (MRSI) data, previously developed in our group with TMZ-treated mice, also proved useful for detecting CPA-induced response in our preclinical model. This would suggest that a common “metabolomics responding pattern” can be observed under different therapeutic strategies. And thirdly, the necropsy findings in mice cured from GL261 GBM after high TMZ cumulative dosage (480-1400 mg/Kg), which presented relevant lymphoma incidence, suggesting that strategies to decrease the administered dose should be investigated to avoid harmful effects in mice treated with alkylating agents.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, Florianópolis, 2017.
Made available in DSpace on 2017-09-19T04:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349736.pdf: 3657948 bytes, checksum: 502be3f29d73aeb8434a290ebf7d60a8 (MD5) Previous issue date: 2017
Animais estuarinos, como a ostra nativa Crassostrea brasiliana, possuem mecanismos fisiológicos e bioquímicos de adaptação e tolerância às variações de salinidade constantes destes ambientes. Além destas variações, os estuários estão sob constante pressão das atividades antrópicas e recebem diariamente resíduos constituídos por misturas complexas de compostos químicos, tais como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos fenantreno, pireno e fluoreno. A ostra nativa C. brasiliana possui viabilidade zootécnica e econômica para cultivo, além de mostrar-se potencial espécie biomonitora em programas de monitoramento ambiental em estuários. Com o objetivo de avaliar respostas moleculares e bioquímicas de C. brasiliana expostas a diferentes HPAs e salinidades, e contribuir com a busca de novos biomarcadores de contaminação por HPAs, neste trabalho foi avaliada, em um primeiro experimento, a influência de três salinidades (35, 25 e 10 ?) nos níveis transcricionais de genes relacionados ao metabolismo de biotransformação, ao metabolismo de aminoácidos e ácidos graxos e de genes que codificam para enzimas antioxidantes, em brânquias de C. brasiliana expostas ao fenantreno (100 ?g.L-1). Genes de biotransformação de fase I (CYP2AU1 e CYP2-like1) e fase II (GSTm-like e GSTO-like) foram afetados principalmente pela exposição ao fenantreno e salinidade, respectivamente. Os resultados de interação entre os fatores salinidade e fenantreno nos genes CYP2-like2 e SULT-like sugerem que, em baixas salinidades, as ostras são mais susceptíveis aos efeitos do fenantreno em nível transcricional. O efeito da salinidade sobre os genes relacionados ao sistema de defesa antioxidante (CAT-like e SOD-like) e metabolismo de aminoácidos (GAD-like, GLYT-like, ARG-like e TAUT-like) sugere um importante papel desses genes na codificação de proteínas que envolvem proteção contra danos oxidativos e adaptações celulares à salinidade. Em um segundo experimento, foram avaliadas as respostas moleculares e de enzimas de biotransformação em brânquias de C. brasiliana expostas a duas concentrações de pireno (50 e 100 ?g.L-1) e fluoreno (100 e 200 ?g.L-1). A exposição ao pireno induziu significativamente a transcrição dos genes e atividade de enzimas de biotransformação de fase I e II: CYP1-like; CYP2-like, CYP356A1-like; CYP2AU1; GSTO-like; GSTm-like; SULT-like; atividade GSTm e EROD, ressaltando a importância desse processo em C. brasiliana. Em resposta à exposição ao fluoreno, houve o aumento da transcrição apenas do gene CYP2AU1. A maior quantidade de respostas encontradas no pireno comparadas ao fluoreno, pode estar relacionada à maior lipofilicidade do pireno, tendendo à maior interação hidrofóbica com as camadas lipídicas da membrana celular e do retículo endoplasmático, facilitando sua entrada. Em suma, este estudo mostra o envolvimento de genes e enzimas relacionados com o sistema de biotransformação de fase I e II de HPAs em ostras C. brasiliana e evidencia os efeitos da salinidade sobre a transcrição de genes do sistema antioxidante e do metabolismo de aminoácidos. Além disso, contribui na busca de novos biomarcadores de contaminação aquática por HPAs e sugere o uso do gene CYP2AU1 como potencial biomarcador molecular em ostras C. brasiliana expostas a estes compostos.

Abstract : Estuarine animals, such as the oyster Crassostrea brasiliana, possess physiological and biochemical mechanisms of adaptation to tolerate constant salinity changes. These ecosystems are under constant pressure due to anthropogenic activities and receive high input of xenobiotics, including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), such as phenanthrene, pyrene and fluorene. Oysters C. brasiliana show zootechnical and economical viability for aquaculture and are a potential biomonitoring species in environmental programs. The aim of this study was to evaluate biochemical and molecular responses in C. brasiliana exposed to different PAHs and salinities in order to search for new potential biomarkers of PAH contamination. In the first study, the transcriptional changes in gills of oysters exposed to phenanthrene (100 ?g.L-1) kept at three salinities (35, 25 e 10 ?) were evaluated. Phase I (CYP2AU1 e CYP2-like1) and phase II (GSTm-like e GSTO-like) biotransformation genes in gill of oysters were affected mainly by phenanthrene exposure and salinity, respectively. The interaction effects of salinity and phenanthrene upon CYP2-like2 and SULT-like genes suggest that at low salinity oysters were more responsive to the phenanthrene effects at the transcriptional level. Antioxidant defense metabolism (CAT-like e SOD-like) and amino acid metabolism (GAD-like, GLYT-like, ARG-like e TAUT-like) -related genes were responsive to salinity, suggesting an important role of these genes in codifying proteins involved in oxidative damage protection and salinity cellular adaptation. In a second study, molecular and enzymatic biotransformation responses were evaluated in gills of oysters exposed to pyrene (50 e 100 ?g.L-1) and fluorene (100 e 200 ?g.L-1). Pyrene exposure strongly induced CYP1-like; CYP2-like, CYP356A1-like; CYP2AU1; GSTO-like; GSTm-like; SULT-like gene transcription and GSTm and EROD activity, highlighting the importance of phase I and II biotransformation processes in C. brasiliana. Oysters exposed to fluorene showed an increase only in CYP2AU1 transcript levels. The highest amount of responses found in pyrene compared to fluorene exposure may be associated to the pyrene higher lipophilicity. The greater hydrophobic interaction between pyrene and lipid layers of the cell membrane and endoplasmic reticulum, facilitates its entry. Thereby, these studies show the involvement of genes and enzymes related to PAH phase I and II biotransformation system in C. brasiliana. In addition, they highlight the effects of salinity in the transcript levels of antioxidant and amino acid metabolism -related genes. They also contribute to the identification of new biomarkers of aquatic PAH contamination and suggests the use of CYP2AU1 gene as potential molecular biomarker in oysters, C. brasiliana, exposed to these compounds.

Orientador: Marcos Nogueira Eberlin
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química
Made available in DSpace on 2018-08-15T20:42:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abdelnur_PatriciaVerardi_D.pdf: 5557128 bytes, checksum: 61ed7f2c805466ffbfeb599d933481d4 (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: O objetivo principal deste projeto de doutorado foi o de estudar novas aplicações da espectrometria de massas (MS) para bio-moléculas com o emprego de novas técnicas e aborgadens recentes. Um dos objetivos foi estudar identificação seletiva e mais rapida de um AA em uma sequência peptídica. Estudou-se também as formas tridimensionais dos pepíideos e de seus íons fragmentos formados (a, b e y), utilizando ferramentas modernas de MS, como a IMMS e reações íon/molécula, uma vez que a estrutura tridimensional exata destes íons ainda não é totalmente elucidada. Uma técnica recente em espectrometria de massas, o imageamento químico por MALDI-MS, foi também empregado na busca de biomarcadores proteicos para câncer. Esta técnica apresenta perspectivas de aplicações em diversas áreas de grande importância como na área médica, uma vez que fornece uma imagem dos constituintes químicos de tecidos. Esta imagem pode detectar um câncer a partir de dados químicos e não apenas pela morfologia das células como é feito atualmente. Neste trabalho, analisou-se amostras de tecidos pancreáticos normais, tumorais e com pancreatite, e algumas proteinas foram identificadas e apresentaram-se potencial como biomarcadores para este tipo de câncer
Abstract: The aim of this doctoral project was to study new applications of mass spectrometry (MS) to bio-molecules by using new techniques and recent approaches room pressure, with the goal of obtaining a more rapid and selective identification of an AA in a peptide sequence. Three-dimensional forms of the peptides and their fragment ions formed (a, b and y), were also studied using modern tools of MS, as ion-mobility mass spectrometry (IMMS) and ion / molecule reactions. This study was important because the exact three-dimensional structure of these ions is not yet fully elucidated. A recent technique in mass spectrometry, the chemical imaging by MALDI-MS, was also employed in the search for protein biomarkers for cancer. This technique presents prospects for applications in several areas of great importance as in the medical field since it provides a picture of the chemical constituents of tissues. In this image, cancer can be detected cancer based on the chemical data and not only on the morphology of cells as is normally done today. In this study, we analyzed samples of normal pancreatic tissue, tumor and pancreatitis, and some proteins have been identified and presented themselves as potential biomarkers for this cancer
Doutorado
Quimica Organica
Doutor em Ciências

Orientadora : Profª. Drª. Maritana Mela Prodocimo
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2016
Inclui referências : f. 49-59
Resumo: A contaminação de ambientes aquáticos tornaAbstract: Contamination in aquatic environments has become a major problem due to population and urban expansion. Therefore, it is important to acknowledge the different classes of contaminants - agricultural, industrial and urban - as well as their sources and mode of action of these residues on natural environment and live organisms. Natural and anthropogenic stressors are recurrent in aquatic environment and can affect resident biota and human health. Diffuse sources of contamination require broader approaches that take into consideration the complexity and variability of biological responses after exposure to complex mixtures of contaminants. Active biomonitoring is a useful tool to detect and quantify environmental impact and consists of translocating organisms from a non