Academic literature on the topic 'Biomarcatori'

The present brief article sketches the various ways in which health has been defined and measured in quantitative linked register and survey research. Health, mortality, morbidity, functioning, quality of life and biomarkers are considered. A case is made for using the survey questionnaire measure of limiting long-standing illness in labour market economics. Il presente articolo delinea i vari modi in cui la salute è stata definita e misurata nella ricerca su dati di tipo survey e quantitativi di fonte amministrativa. Sono presi in considerazione salute, mortalità, morbilità, capacità funzionali, qualità della vita e biomarcatori. Negli studi di economia del lavoro, si sostiene l'opportunità di utilizzare le misure – derivanti da questionario – relative alle malattie di lungo corso che comportano limitazioni per i lavoratori.

Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin (NGAL) è uno dei più promettenti biomarcatori utilizzati nella diagnosi di “Acute Kidney Injury” (AKI), dal momento che il suo incremento è un buon predittore a breve termine dello sviluppo di insufficienza renale acuta in notevole anticipo rispetto all'incremento dei valori della creatinia sierica. Riportiamo la nostra esperienza di un caso di Crush Syndrome di due pazienti vittime dell'alluvione che ha coinvolto Messina. Lo sviluppo di AKI in seguito a Crush Syndrome è la seconda causa più comune di morte in seguito a terremoti o altri disastri naturali ma allo stesso tempo è una complicanza disastro-correlata che può essere reversibile in particolar modo in caso di diagnosi precoce e di altrettanto precoce trattamento. In questo caso, l'NGAL ci ha permesso di fare una diagnosi precoce di AKI preannunciando le alterazioni dei classici marker come la creatinina, inoltre abbiamo notato la correlazione diretta tra i valori di NGAL, l'evoluzione del danno renale e la prognosi per le due pazienti.

La sindrome cardio-renale (SCR) è una sindrome clinica ben nota, che descrive tanto gli effetti negativi dell'insufficienza renale sull'equilibrio cardio-circolatorio quanto quelli dell'insufficienza cardiaca sulla funzione renale. Molti autori hanno studiato l'utilità di marcatori sierologici ai fini dell'identificazione e del monitoraggio ambulatoriale delle varie forme di questa sindrome. L'analisi dei livelli sierici dei peptidi natriuretici è, al momento, quella maggiormente utilizzata, in quanto essi stessi non sono solo direttamente associati alla gravità delhinsufficienza cardiaca, ma anche capaci di rilevare precocemente la disfunzione renale, certamente prima che sia possible osservare un incremento nei livelli sierici di creatinina. NGAL, cistatina C, NAG, KIM-1 e IL-18 rappresentano interessanti biomarcatori per la diagnosi precoce di danno renale acuto (AKI), e quindi per la diagnosi precoce delle forme renocardiache acute, mentre il loro utilizzo in altre forme di SCR non appare codificato. Al contrario, la valutazione di KIM-1 e IL-18 sembra più utile per cercare una diagnostica differenziale tra forme diverse di insufficienza renale acuta. (Cardionephrology)

La nefropatia da contrasto (CIN) rappresenta oggi la terza causa di insufficienza renale acuta (AKI) in pazienti ospedalizzati, condizione da ricondurre a un incremento dei pazienti che si sottopongono a procedure radiologiche interventistiche richiedenti la somministrazione intravascolare di mezzi di contrasto iodati (ICM). Bisogna inoltre considerare un incremento di soggetti con fattori di rischio quali l'età avanzata, una preesistente patologia renale, scompenso cardiaco, infarto del miocardio, diabete mellito. Si considera CIN la presenza di un incremento assoluto (= 0.5mg/dL) e relativo (= 25%), rispetto ai valori basali, della creatinina sierica (sCreat) a 48–72 ore dall'esposizione dell'ICM. È noto però come in pazienti con variazioni acute del filtrato glomerulare (GFR), sCreat è un marker dotato di poca sensibilità e specificità diagnostica. Infatti, il 25–50% dell'incremento della creatinina, con alto valore predittivo di CIN, si verifica più frequentemente solo 24 ore dopo la somministrazione dell'ICM. Negli ultimi anni, sono stati condotti studi non solo al fine di identificare nuovi biomarcatori, ma anche per valutare eventuali strategie terapeutiche preventive. La somministrazione endovenosa di soluzione salina allo 0.9% è ampiamente accettata come terapia profilattica di CIN. Diversi sono inoltre gli studi condotti che prevedono la somministrazione di bicarbonato di sodio o di N-acetilcisteina (NAC). Purtroppo molti studi mancano di potenza statistica o sono basati su diverse definizioni di CIN. Ciò ha determinato la mancanza di linee guida universali accettate dai radiologi, nefrologi, cardiologi o da altre figure professionali coinvolte. Sono quindi necessari ulteriori studi al fine di validare i risultati sino ad ora ottenuti, specie utilizzando marcatori dotati di maggiore potere diagnostico e prognostico rispetto alla creatinina sierica, quali NGAL, Cistatina C e KIM-1.

Lo scompenso cardiaco (SC), processo evolutivo comune di più malattie cardiovascolari a differente eziologia (ad es. infarto del miocardio, ipertensione, cardiomiopatie, disturbi valvolari e altre), è diventato sempre più comune nella popolazione anziana, influenzando drasticamente il tasso di sopravvivenza e la qualità della vita. L’iperattività del sistema nervoso simpatico (SNS) che si associa allo SC determina un aumento delle catecolamine circolanti epinefrina e norepinefrina che, attraverso l’attivazione dei recettori beta-adrenergici (β-AR), svolgono un ruolo critico nella regolazione della funzione del sistema cardiovascolare. Una caratteristica distintiva dello SC è la diminuzione o la desensibilizzazione dei recettori β1-adrenergici (β1-AR) sulla membrana delle cellule cardiache. Le catecolamine e lo stress ossidativo sono coinvolti nella regolazione della densità dei β-AR. Lo stress ossidativo associato alla disfunzione mitocondriale sembra giocare un ruolo importante nella fisiopatologia dello SC. Infatti, una condizione di stress ossidativo è stata osservata sia in pazienti con SC che in modelli animali, e un’eccessiva esposizione a specie reattive dell’ossigeno (ROS) diminuisce l’espressione di β1-AR in cardiomiociti murini, sebbene i meccanismi sottostanti rimangano ancora non chiari. Recentemente, è stato scoperto che il recettore periferico delle benzodiazepine (PBR) svolge un ruolo chiave oltre che nell’energetica cellulare, nella regolazione della fisiologia mitocondriale e dell’equilibrio redox nei cardiomiociti. Nel presente studio, abbiamo valutato gli effetti delle catecolamine e dei ligandi del PBR sulla densità dei β1- e β2-AR nei monociti umani isolati da sangue periferico, che sono noti per esprimere entrambi i β-AR. La densità dei β-AR è stata misurata mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi selettivi diretti contro un epitopo extracellulare di β1-AR o β2-AR. Il trattamento dei monociti con benzodiazepine induceva una riduzione della densità del β1-AR, ma non del β2-AR, sulla membrana dei monociti che veniva ripristinata utilizzando [1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-meth-ylpropyl)-3 isoquinolinecarboxamide] (PK11195), un antagonista del PBR. Questi risultati suggeriscono un possibile ruolo del PBR nella regolazione della densità del β1-AR proponendo i monociti isolati dal sangue periferico sia come modello in vitro utile per lo studio del sistema recettoriale β-adrenergico che come potenziali biomarcatori di progressione della malattia e risposta alla terapia.

SommarioIl NETest è una metodica di biologia molecolare e, in particolare, di biopsia liquida, applicata alle neoplasie neuroendocrine (NEN), che si propone come nuovo biomarcatore altamente sensibile e specifico. Il NETest consente una sorta di gene signature del tumore, definendone il profilo trascrizionale mRNA, estratto dal sangue periferico. L’applicazione pratica è nella diagnosi, dove il NETest sembra identificare anche piccoli tumori localizzati, nella definizione prognostica, con l’identificazione dei tumori con maggiore tendenza alla progressione e alla recidiva post-chirurgica, nella riposta ai trattamenti, con l’identificazione precoce di progressione nel corso di terapie anti-tumorali. A fronte di risultati iniziali estremamente promettenti, il NETest necessita di una conferma su larga scala, in ampie casistiche multicentriche.

Introduction: In the second half of the 20th century, many anomalous effects and individuals were examined, arousing concern in the medical community at the time.The rubella syndrome in the 1930s showed that the placenta was not a barrier for all exogenous agents. In 2015 an increase in the prevalence of microcephaly cases has been reported in twenty times in Brazil, and this malformation is associated with the vertical transmission of the Zika virus (ZIKV) by the Ministry of Health. Based on these data, ZIKV-related microcephaly as well as other comorbidities associated with arboviruses have been discussed in several scientific events. Therefore, it is not yet known exactly how the ZIKV can cause microcephaly. To date, there are still controversial results on (1) the risk of spontaneous abortion and teratogenesis induced by treatment with intereferon (inflammatory biomarker) with the development of diseases caused by arbovirosis; (2) the profile of the inflammatory response to arvoviroses. Objectives: Evaluate inflammatory biomarkers and morphofunctional changes caused by viral agents associated with teratogenicity. Methods and Procedures: For the accomplishment of this scientific article, a bibliographical review was used consulting the information bases like SciELO, Pubmed, base LILACs, Periódicos CAPES and CNPq and Annals of Scientific Initiation and Research of the University of Ribeirão Preto. Results: Studies show that in the active phase of viral replication in pregnant women with positive serology for Zika virus, for example, increased IL-2, IL-4, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17 and IFN -gamma. In contrast, IL-23 did not change at the same stage. The relationship between elevation of IL-4, IL-10, MCP-1, TNF-ALFA, TNF-beta and MCP-1 in the amniotic fluid of pregnant women correlated with Autistic Spectrum Disorder was also enhanced. As for the findings on biological materials from animals immunodeficiated with the Zika virus, was observed that the trophoblasts were able to reduce the replication of the viral agent and the transfer time in the placental barrier. Conclusions: Inflammatory biomarkers have a great relationship and potential for detection of teratogenic events. As for the blocking ability of viral replication, it is observed that placental precursor cells slow the transfer of the viral to the fetus, but does not prevent.

Introduction: Synovitis is a chronic inflammation concerning all early inflammatory arthritis. It is often resistent to standard pharmacological treatment and local therapy , and if not treated , the process becames irreversible. Aim of the study: To identify biomarkers useful to determine the disease activity level, to evaluate the responses to therapies and to delineate the mechanisms involved in the synovitis process, in order to find new potential therapeutic targets for this severe disease. Methods: Synovial fluid (SF), synovial tissue (ST) and/or peripheral bood (PB) samples were obtained from patients affected by psoriatric arthritis (PsA) and pigmented villonodular synovitis (PVNS). Local and sistemic disease activity indexes: knee Thompson articular index (THOMP: range 0 -9), Knee Joint Articular Index (KJAI: range 0 -14), erythrocytes sedimentation rate(ERS: norm 0–20 mm/hr), C-reactive protein (CRP: norm<10), and SF cytokine/chemokine expression levels were mesured before and after IA TNF α blockade.Characterization of synovial mononclear cell infiltration and synovial vessels, and the evaluation of the different cellular subset expression (T regulatory and Thelper 17 cells) was carried out in consecutive serial sections obtained from synovial biopsies or in mononuclear cells obtained from SF or PB. Proper antibodies were used for immunostaining. Analysis were carried out by cellular and molecular biology techniques, cytofluorimetry and immunoistochemistry. Data obtained from the patients were compared to data obtained from proper control groups. Results: SF biomarkers correlate with synovial tissue inflammation and with local and systemic indexes of disease activity in PsA. The IA TNF α blockade lead to a synovial effusion regression and a ST and SF biomarkers significant reduction compared to baseline. In PVNS affected patients, knee injectons lead to a reduction in local indexes of disease activity and in immunohistological alterations. We detected higher CSF-1mRNA expression level in PVNS compared to chronic inflammatory synovitis. The evaluation of Treg and TH17 subset cells phenotype in PsA affected patients showed an increased expression of TH17 cells both at local and systemic level. Moreover, we found some correlations between cell markers both at local and systemic level. Conclusions: Synovial effusion regression is a reliable indicator of the response to IA TNFα blockers in PsA patients and it is confirmed by the correlation between SF biomarkers to disease activity and synovial tissue inflammation. Changes following IA treatment, indicate that ST CD45+ MNC and CD31+ vessels, along with SF IL-6 and -IL-1β, may represent candidate biomarkers of the knee synovitis response to IA TNF-α blockade. The new therapeutic approach concerning serial intraarticular anti-TNF-α injections in pigmented villonodular synovitis resulted in a local clinical improvement accompanied by a rapid regression in synovial stromal fibrosis and vasculogenesis. Moreover, it was ineffective in reducing synovial CSF-1 expression. The detection of higher level of colony-stimulating factor-1 (CSF-1) in synovial tissue of pigmented villonodular synovitis (PVNS) suggests that CSF-1 play an important role in PVNS disease process and supports the idea that CSF-1/CSF-1R interaction may represent a potential therapeutic target of this disease. The higher expression of TH17 cells in contrast to the lower expression of Treg cells detected in the SF and PB of PsA patients, highlights new specific molecular targets for the development of different pharmacological approches able to inhibit the effector response, preventing TH17 activity, or enhancing the regulatory response, inducing the differentiation of Treg cells.
Introduzione: Le sinoviti sono infiammazioni croniche che riguardano tutte le artriti infiammatorie primitive. Spesso resistenti al trattamento farmacologico tradizionale ed alla terapia locale, se non curate, si dimostrano irreversibili. Scopo dello studio: Individuare biomarcatori utili a determinare il grado di attività di malattia, le risposte ai trattamenti e chiarire i meccanismi coinvolti nel mantenimento della sinovite al fine di poterli considerare nuovi possibili bersagli terapeutici per questa grave patologia. Materiali e metodi: Campioni di liquido sinoviale (LS), tessuto sinoviale (TS) e/o sangue periferico (SP) sono stati ottenuti da pazienti affetti da artrite psoriasica (AP) e sinovite villonodulare pigmentosa diffusa (PVNS). Sono stati valutati gli indici di attività di malattia locali: knee Thompson articular index (THOMP: range 0 -9), Knee Joint Articular Index (KJAI: range 0 -14) e sistemici: velocità di eritrosedimantazione (VES: norm 0–20 mm/hr), proteina C-reattiva (PCR: norm<10), e sono stati misurati i livelli di citochine/chemochine nel LS prima e dopo trattamento intra-articolare (IA) con anti-TNFα (E). La caratterizzazione dell’infiltrato cellulare sinoviale e dei vasi sinoviali e la valutazione dell’espressione di frazioni cellulari ad attività funzionale opposta (Treg e TH17) è stata ottenuta marcando con opportuni anticorpi sezioni seriali di biopsie sinoviali e cellule mononucleate separate da SP e LS rispettivamente. Tutte le analisi sono state eseguite mediante l’utilizzo di tecniche di citofluorimetria, di biologia cellulare e molecolare e di immunoistochimica e i dati raccolti dai gruppi di pazienti sono stati confrontati con quelli raccolti da opportuni gruppi di controllo. Risultati: Abbiamo dimostrato che nell’AP i biomarcatori del liquido sinoviale correlano con l’infiammazione del tessuto sinoviale e gli indici sistemici di attività di malattia e che in risposta al trattamento IA con anti-TNFα il versamento sinoviale e i biomarcatori del liquido e del tessuto sinoviale sono significativamente ridotti rispetto ai livelli basali. Nella PVNS le iniezioni IA hanno portato ad un effettivo miglioramento degli indici locali di attività di malattia e ad una riduzione delle alterazioni immunoistologiche. Lo studio di espressione del CSF-1 ha evidenziato che esso è maggiormente espresso nelle sinoviti villonodulari rispetto alle sinoviti infiammatorie croniche. La valutazione dei profili fenotipici delle frazioni cellulari Treg e TH17 nei pazienti affetti da AP ha mostrato che sia a livello sistemico che locale l’equilibrio tra le due frazioni è significativamente spostato verso il fenotipo proinfiammatorio TH17 e che vi sono correlazioni tra l’espressione di alcuni marcatori a livello locale e sistemico. Conclusioni: La regressione del versamento sinoviale è un indicatore reale della risposta ai farmaci bloccanti il TNFα nei pazienti affetti da AP ed è confermata dalle correlazioni tra i biomarcatori del LS con l’attività di malattia e l’infiammazione del tessuto sinoviale. Le alterazioni conseguenti al trattamento indicano che specifici marcatori sinoviali studiati (CD45+, CD31+, IL-1β; IL-6) possano rappresentare potenziali biomarcatori sinoviali della risposta al trattamento con tali farmaci. Il nuovo approccio terapeutico IA anti TNFα nel trattamento della PVNS ha portato ad una rapida regressione della fibrosi e della vasculogenesi. Inoltre si è dimostrato inefficace nel ridurre l’espressione del CSF-1. I più alti livelli di espressione dell’mRNA-CSF-1 riscontrati nella PVNS suggeriscono che il CSF-1 svolge un ruolo chiave nello sviluppo della malattia e che l’interazione tra CSF-1/CSF-1R possa rappresentare un potenziale bersaglio terapeutico per la sinovite villonodulare. L’elevata espressione della frazione cellulare TH17 rispetto alla frazione Treg riscontrata sia nel liquido sinoviale che nel sangue periferico dei pazienti affetti da AP ci permette di pensare a specifici bersagli molecolari per lo sviluppo di nuovi composti capaci sia di inibire la risposta effettrice, per esempio prevenendo l'attivazione antigene-specifica delle cellule TH17, sia di aumentare quella regolatoria, per esempio inducendo il differenziamento delle cellule Treg.

About one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant and suffer from poor quality of life, seizure-related accidents and comorbidities, increased risk of death and disabling psychosocial consequences. Clinical outcomes for patients unresponsive to current pharmacological tools could be improved by characterization and development of biomarkers that could assist physicians in either (i) optimizing response to treatment with available antiepileptic drugs or (ii) identifying early those patients who are pharmacoresistant and could benefit from earlier referral to alternative therapies such as epilepsy surgery or neurostimulation. The first part of the research relates to pharmacokinetic biomarkers aimed at optimizing response to pharmacological treatment. Specifically, plasma concentrations of antiepileptic drugs have been shown to provide valuable indicators of pharmacological response, although their usefulness has not yet been clearly established for some second-generation drugs, partly due to lack of availability of assay methods easily applicable to therapeutic drug monitoring in the routine setting. In the present research, the latter deficiency was addressed by developing and validating two assay techniques for the determination of retigabine, known also as ezogabine, and perampanel in body fluids. For retigabine, an HPLC-UV method suitable for therapeutic drug monitoring was developed which permits sensitive quantitation of the drug in human plasma. Although therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs is usually based on their determination in plasma samples, alternative matrices, such as dried plasma spots, may offer advantages in some settings. For this reason, a HPLC-UV method for the quantitation of perampanel in dried plasma spots was developed and validated. Perampanel concentrations assessed in dried plasma spot samples obtained from patients receiving therapeutic doses were comparable to those measured in plasma samples. The second part of the research described in the present thesis relates to the investigation of microRNA (miRNA) profiles in plasma-derived extracellular vesicles as potential epigenetic biomarkers for early differentiation between patients resistant to antiepileptic drugs and patients responsive to these drugs. Additionally, miRNA expression profiles were also assessed in healthy controls in order to ascertain potential differences related to the disease itself rather than drug responsiveness. By applying a cross-sectional non-interventional open-label study design, miRNAs profiles in exosomes and microvesicles isolated from plasma were compared among 20 patients with drug-resistant focal epilepsy, 20 patients with drug-responsive focal epilepsy and 20 healthy control subjects. Extracellular purity, concentration and size distribution in each sample were ascertained by applying a combination of techniques (Western blot analysis, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy). Total RNA was extracted by exosome and microvesicle pellets, and sequenced on NGS platforms. The potential involvement of identified miRNAs in epilepsy-relevant pathways (predicted target genes and predicted pathways) was investigated by using the miRWalk 3.0 database and KEGG database. Statistical analysis of the results did not identify significant differences across groups in extracellular vesicle size or count. Five miRNAs were found to be de-regulated in exosomes isolated from pharmacoresistant patients compared with healthy controls (one was up-regulated and four were down-regulated). Four miRNAs were found to be de-regulated in microvesicles obtained from pharmacoresistant patients compared with healthy controls (two up-regulated miRNAs and two down-regulated). These findings, which require confirmation in a larger sample size, may provide valuable clues for a better understanding of processes involved in epileptogenesis as well as mechanisms implicated in pharmacoresistance.

ll sarcoma di Ewing, secondo più diffuso tumore primitivo dell’osso, è un tumore di origine mesenchimale che colpisce prevalentemente adolescenti e giovani adulti. L’attuale terapia multimodale ha raggiunto un plateau di sopravvivenza a 5 anni (5y OVS) pari al 70% per pazienti con malattia localizzata, 30% e 25% per pazienti metastatici alla diagnosi o recidivanti. Poichè inoltre i pazienti soffrono di tossicità acuta o a lungo termine legata alla chemioterapia, è fondamentale lo sviluppo di biomarcatori che ne permettano la stratificazione in base al rischio alla diagnosi. Questo studio conferma LGALS3BP e miR-34a come predittori indipendenti dell’esito clinico in 124 pazienti affetti da sarcoma di Ewing localizzato trattati presso un singolo Istituto. Pazienti alto-esprimenti hanno un rischio ridotto di sviluppare recidive locali o metastasi (HR 0.402, 95% CI 0.190-0.850 per LGALS3BP; HR 0.485, 95% CI 0.236 -0.996 per miR-34a), o di decesso legato al tumore (HR 0.397, 95% CI 0.159-0.993 per LGALS3BP; HR 0.353, 95% CI 0.132-0.943 per miR-34a). Tramite lo sviluppo e la caratterizzazione in vitro ed in vivo di un modello di over-espressione stabile di miR-34a, abbiamo confermato il ruolo oncosoppressore di questo miRNA nel sarcoma di Ewing; uno dei meccanismi sembra coinvolgere l’inibizione dell’isoforma 1B della ciclina D1, target diretto di EWS-FLI1, fattore trascrizionale aberrante caratteristico di questo tumore. È stata inoltre provata la fattibilità della quantificazione non invasiva di miR-34a circolante. Tramite whole transcriptome sequencing su biopsie pre-trattamento da pazienti selezionati in base alla differenziale risposta alla chemioterapia, sono state identificate 4 mutazioni a carico di TP53 (p.R213X, p.R248W, p.R273C ep.K386M mutazione de novo), che definiscono una classe di pazienti con scarsa risposta al trattamento, ed un pannello di lincRNAs con espressione differenziale nei due gruppi. Nell’insieme questi risultati concorrono alla definizione di uno spettro di caratteristiche molecolari che riteniamo promettenti candidati per la validazione prospettica.
Ewing sarcoma, the second most common primary bone malignancy, is a highly aggressive mesenchymal tumor arising mainly in adolescents and young adults. Current multimodal treatment has reached a plateau of 70% 5-year overall survival (5y OVS) for patients with localized disease, and 30% and 25% for patients with metastatic or recurrent disease. Moreover, patients often suffer from acute and long term toxicity related to chemotherapy. It is thus paramount the development of molecular biomarkers allowing stratification of patients based on risk at diagnosis. The present study validates LGALS3BP and miR-34a as independent predictors of clinical outcome in 124 Ewing sarcoma patients treated in a single Institution. Patients with high expression levels of these molecules have lower risk of developing local recurrences or metastasis (HR 0.402, 95% CI 0.190-0.850 for LGALS3BP;HR 0.485, 95% CI 0.236 -0.996 for miR-34a), and a lower risk of disease-related death (HR 0.397, 95% CI 0.159- 0.993 for LGALS3BP; HR 0.353, 95% CI 0.132-0.943 for miR-34a). By developing and characterizing in vitro and in vivo a stable miR34a expression model, we confirmed its oncosuppressor role in Ewing sarcoma; one of the underlying mechanisms involve the inhibition of the 1B isoform of cyclin D1, a direct target of EWS-FLI1, the aberrant transcription factor characteristic of the disease. We also show the feasibility of non-invasive circulating miR-34a quantification. Through a whole transcriptome sequencing approach applied to pre-treatment biopsies from patients with differential chemotherapy response, we identified 4 mutations in the TP53 gene (p.R213X, p.R248W, p.R273C and p.K386M de novo mutation) defining a patient group with poor response to treatment, and a panel of lincRNA with differential expression in the two groups. Overall these results contribute to the definition of a spectrum of molecular features of Ewing sarcoma impacting clinical outcome, which are promising candidates for prospective validation.

Lung cancer remains the leading cause of cancer-mortality worldwide, mainly due to late diagnosis. Thus, the identification of biomarkers for an early detection would bring great benefit not only for patients but also for high risk subjects. This project was aimed to discover plasma biomarkers potentially useful to enhance our capabilities to identify those individuals at higher risk of lung cancer in heavy smokers population, enrolled in the Multicentric Italian Lung Detection (MILD) program. To this end, we performed multiparametric analysis of proteins and metabolites linked to systemic (Serum Amyloid A, SAA; Paraoxinase 1, PON1; and 50 plasmatic cytokines) and local (proteins and metabolites in exhaled breath condensate, EBC) inflammation and oxidative stress. We also studied the relationships between these parameters and the pulmonary function measured as FEV1 (forced esxpiratory volume in 1 s). Very recently we have demonstrated that increased plasma levels of the acute phase protein SAA and decreased FEV1 levels are associated with an increased risk of lung cancer incidence in heavy smokers. On this basis, for an efficacious detection of the high risk subgroup among the heavy smoking population, we explored the relationship between SAA plasma levels and FEV1. Importantly, we found a significant inverse correlation between these parameters, suggesting that increased levels of SAA are associated to decreased pulmonary function. We then evaluated a group of cytokines by Bio-Plex Suspension Array System, allowing the simultaneous detection of 50 cytokines. According to assessed SAA levels, we evaluated 142 plasma samples by Bio-Plex. By univariate analysis of obtained results we found that SAA levels correlated directly with cytokine levels of IL-12(p40), GRO-α, HGF, MCP-3, M-CSF, SCGF, SDF-1α, IL-6 and IP-10 and that FEV1 values correlated inversely with GRO-α, HGF, MCP-3, β-NGF, SCGF and MIG concentrations. MIG showed the best association with FEV1. Multivariate analysis highlighted an association between SCGF, CTACK, MIF, MIG, IL-16 and Eotaxin. Additionally, we assessed PON1 levels by Western blot and ELISA in the 142 samples. Our data showed an inverse correlation between PON1 and the major acute phase protein CRP (C reactive protein) as well as between PON1 and SAA together with a direct correlation between PON1 and FEV1. This supported our hypothesis that the decrease of the anti-oxidant function corresponds to a systemic increase of acute phase inflammatory proteins and a decrease of pulmonary function. Regarding the locally produced proteins and metabolites we evaluated inflammatory and oxidative stress parameters in 18 EBC samples derived from heavy smokers and 18 obtained from lung cancer patients. By mass spectrometry analysis and immunoenzymatic assays (ELISA, EIA, BIO-PLEX) we generated protein profiles and assessed the levels of Surfactant Protein C, Leucotrien B4, 8-Isoprostane and a group of 14 cytokines. Noteworthy, we could detect an interesting increased level of 8-Isoprostane in EBC samples of lung cancer patients with respect to those derived from heavy smokers. Taken together our multiparametric analyses highlighted the existance of interesting relationships between specific plasma or EBC components and the impairment of lung function. This supports the interesting possibility we have identified potential biomarkers useful for the evaluation of lung cancer risk. However, their effective clinical applicability will be investigated in future studies using a higher number of subjects.

Background: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rare, progressive, neurodegenerative disorder caused by degeneration of upper and lower motoneuron. The disease process leads to progressive muscle atrophy, weakness, fasciculations and spasticity. About two-thirds of ALS patients have a spinal form of the disease (spinal ALS), which involves the limbs. The spinal ALS has an upper or lower limb onset that starts with weakness and muscle atrophy in hands or feet whereas one-thirds of patients have a bulbar onset (bulbar ALS) usually presenting with dysarthria and dysphagia. The spinal ALS leads to death after 3-5 years from onset while the bulbar ALS die about after 2-3 years from onset. Incidence and prevalence of ALS are higher in men than in women. Male e female gender influences the clinical features of the disease: man have a greater likelihood spinal regions onset whereas women have onset at an older age. The effects of physical exercise and rehabilitation in patients with ALS are still debated: if a patient is inactive, the loss of exercise or muscle training leads to muscle atrophy and disuse that contribute to deterioration in addition to the weakness and muscle atrophy caused by denervation. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules (19-24 nucleotides), highly conserved, which regulate genes expression at the post transcriptional level. The up-regulation of a specific miRNA determines decreasing expression of the corresponding protein product. Aim: The aim of this work is the identification of new molecular and biochemical biomarkers to facilitate the study of the various subtypes of ALS. We will study if they provide information on the onset and severity of disease and they might be used as indicators of a therapeutic response in rehabilitation. We will investigate the levels of both muscle-specific (myomiRNAs) and inflammatory/angiogenic microRNAs and other molecular signatures (Myostatin, Follistatin). MicroRNAs will be analized and compared with morphometric study in muscle biopsies of ALS patient and controls. In serum, we will investigate the difference between spinal and bulbar ALS whereas, in muscle we will analyze the difference between male and female patients and in the effect of different age of onset of the disease on microRNAs. Methods: In 14 ALS patients (10 spinal and 4 bulbar) we measure the serum levels of muscle-specific miR-1, miR-206, miR-133a/b, miR-27a and the inflammatory miRNAs miR-155, miR-146a, miR-221 and miR-149*, and the expression of Myostatin and Follistatin, which are two antagonist regulator of the muscle growth. Morphometric analysis of muscle fiber size is done to correlate muscle atrophy with biochemical-molecular parameters. In 16 muscles ALS biopsies (9 male and 7 female) we analyze the levels of myomiRNAs and inflammatory miRNAs. The circulating levels of myomiRNAs are analysed also in 12 ALS patients (8 male and 4 female) after rehabilitation treatment of 8 weeks in IRCCS San Camillo (Venice). Results: In ALS patients the expression of serum miR-206 and miR-133 is significantly (p<0.005) increased and miR-27a is significantly (p<0.005) reduced compared to control, also the miRNA profile is significantly higher between spinal versus bulbar ALS. Myostatin/Follistatin ratio was significantly higher in ALS versus control and are higher in bulbar versus spinal ALS. Bulbar ALS patients present more pronounced muscle atrophy than spinal ALS, as documented by our muscle fiber morphometric analysis. In patients ALS biopsy all miRNAs we measured are strongly up-regulated in ALS patients versus control, with the exception of miR-149*. A strong up-regulation (p<0.0001) of all miRNAs is present in male versus female ALS biopsies and in group of ALS patients with age of onset below 55 versus the group of older patients. In serum after 8 weeks of rehabilitation myomiRNAs result down-regulated indicating an active proliferation of satellite cells in muscle and increased neuromuscular junctions. Conclusion: Muscle mass regulators are particularly down-expressed in bulbar ALS, suggesting a more rapid and diffuse muscle atrophic process. Similar results were obtained on Myostatin/Follistatin ratio. The differences in this regulators between clinical subgroups of ALS patients, in serum and in muscle, may suggest a possible differential role of miRNAs in the pathogenetic accurance of muscle atrophy in motoneurons disease. Furthermore our data suggest that miRNAs are good indicators of muscle recovery in response to rehabilitation conducted for eight weeks consisting of aerobic exercise.
Background: La SLA è una malattia rara, neurodegenerativa che colpisce i motoneuroni del midollo spinale, del tronco e della corteccia motoria. La perdita dei motoneuroni porta ad atrofia muscolare, debolezza muscolare, fascicolazioni e spasticità. Circa due terzi dei pazienti con SLA presentano una forma spinale della malattia che comincia sia dagli arti superiori che inferiori e sintomi associati a stanchezza con atrofia muscolare. Un terzo dei pazienti presentano un esordio bulbare della malattia che si manifesta inizialmente con disartria e disfagia per solidi e liquidi (paralisi bulbare progressiva). Nella maggior parte dei casi la forma spinale porta a decesso dopo 3-5 anni mentre la paralisi bulbare dopo una media di 2-3 anni. L'incidenza della SLA è riportata maggiore negli uomini che nelle donne. Il sesso influenza alcune caratteristiche fenotipiche della malattia tra cui l'età e il sito d'esordio e alcune caratteristiche cliniche. Gli effetti dell'esercizio fisico e della riabilitazione in pazienti affetti da SLA sono ancora dibattuti: se un paziente è inattivo, la perdita di allenamento e il disuso portano all’atrofia muscolare, che si va a sommare alla debolezza e all'atrofia muscolare causata dalla denervazione e dalla degenerazione dei motoneuroni. I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA (19-24 nucleotidi) a singolo filamento, non codificanti, altamente conservati nel corso dell'evoluzione che regolano finemente l'espressione genica a livello post-trascrizionale. L’up-regolazione di uno specifico microRNA determina un decremento dell’espressione del prodotto proteico corrispondente. Scopo: L'obiettivo di questo lavoro è l’identificazione di nuovi biomarcatori molecolari e biochimici che facilitino lo studio dei vari sottotipi di SLA, che diano informazioni su insorgenza e gravità di malattia e che possano essere utilizzati come indicatori di risposta in trials clinico-riabilitativi. Abbiamo studiato i livelli di espressione dei miRNA muscolo-specifici e infiammatori/angiogenici e altre molecole proteiche (Miostatina/Follistatina). L’analisi dei miRNA è stata comparata con la morfometria delle fibre muscolari. Nel siero, in particolare, abbiamo indagato le differenze tra pazienti ad esordio spinale e pazienti ad esordio bulbare mentre, nel muscolo, abbiamo analizzato le differenze tra maschi e femmine e tra pazienti con diversa età d'esordio. Metodi: In 14 pazienti SLA (10 spinali e 4 bulbari) abbiamo misurato i livelli sierici dei miRNA muscolo-specifici miR-1, miR-206, miR-133a/b, miR-27a e dei miRNA infiammatori miR-155, miR-146a, miR-221 e miR-149* e l'espressione della Miostatina e della Follistatina, due fattori regolatori antagonisti della crescita muscolare. L'analisi morfometrica delle fibre è stata correlata all'atrofia muscolare misurata con parametri biochimici molecolari. In 16 biopsie muscolari di pazienti SLA (9 maschi e 7 femmine) sono stati analizzati i livelli dei myomiRNA e dei miRNA infiammatori. I livelli circolanti dei myomiRNA sono stati analizzati anche in 12 pazienti SLA (8 maschi e 4 femmine) dopo trattamento riabilitativo di 8 settimane. Risultati: Nei pazienti SLA c'è un incremento significativo (p<0.005) dei livelli sierici del miR-206, miR-133 mentre il miR-27a è significativamente (p<0.005) ridotto confrontato con i controlli e anche tra pazienti spinali e bulbari. Il rapporto Miostatina/Follistatina risulta più alto nei pazienti SLA rispetto ai controlli, simili dati si riscontrano in pazienti SLA ad esordio bulbare rispetto a pazienti con esordio spinale. I pazienti con SLA bulbare presentano un grado più alto di atrofia muscolare rispetto ai pazienti con SLA spinale documentato dall'analisi morfometrica delle fibre. Nelle biopsie muscolari di pazienti SLA tutti i miRNA presi in esame risultano fortemente up-regolati (p<0.0001) nei pazienti rispetto ai controlli ad eccezione del miR-149*. Vi è una up-regolazione significativa (p<0.0001) di tutti i miRNA nei maschi rispetto alle femmine e nei pazienti con una età d'esordio sotto i 55 anni rispetto al gruppo di pazienti più vecchi. Dopo 8 settimane di riabilitazione tutti i myomiRNA risultano down-regolati. Conclusioni: I microRNA e altre molecole proteiche (Miostatina/Follistatina) risultano particolarmente down-regolati nei pazienti con SLA bulbare, suggerendo così il risultato di un processo atrofico muscolare più rapido e diffuso. Le differenze osservate nei sottogruppi di pazienti SLA, nel siero e nelle biopsie muscolari, potrebbero suggerire un possibile ruolo differenziale dei miRNA negli eventi patogenetici della malattia dei motoneuroni. Inoltre i nostri dati suggeriscono che i myomiRNA rappresentano possibili indicatori di recupero muscolare in risposta alla riabilitazione.

Parkinson’s disease (PD) is the neurological disease with the fastest growing rate. 1% of the world population over 60 years have a PD diagnosis. PD presents a complex and heterogenous clinical picture during the disease course, and dementia represents the most severe condition. This thesis investigates the neurobiological mechanisms and cognitive features of PD patients with a severe clinical phenotype – developing cognitive deterioration, reaching dementia condition. The studies included in this dissertation contributed to identifying risk factors, biomarkers, cognitive features, and sources of clinical variability of dementia in Lewy Bodies disorders (LBD) with multiple methodological approaches to neuroimaging data. Moreover, the cognitive picture of the LBD clinical spectrum has been explored by combining cross-sectional and longitudinal approaches. This dissertation provides new evidence on modifiable and non-modifiable risk factors that influence the development of severe phenotypes within LBD and those acting on the timing of dementia symptoms onset. Moreover, we identify valuable biomarker and cognitive marker candidates for dementia risk profiling since early preclinical stages.
La malattia di Parkinson è la malattia neurologica con il tasso di crescita più rapida. L'1% della popolazione mondiale oltre i 60 anni ha una diagnosi di Parkinson. Il morbo di Parkinson presenta un quadro clinico complesso ed eterogeneo durante il decorso della malattia, di cui la demenza rappresenta la condizione più grave. Questa tesi indaga i meccanismi neurobiologici e le caratteristiche cognitive dei pazienti affetti da Malattia di Parkinson con un grave fenotipo clinico – che sviluppano un deterioramento cognitivo raggiungendo la condizione di demenza. Gli studi inclusi in questo elaborato hanno contribuito a identificare fattori di rischio, biomarcatori, caratteristiche cognitive e fonti di variabilità clinica della demenza nei disturbi a corpi di Lewy (LBD) con molteplici approcci metodologici ai dati di neuroimaging. Inoltre, è stato esplorato il quadro cognitivo dello spettro clinico LBD combinando approcci cross-sectional e longitudinali. Questa tesi fornisce nuove evidenze sui fattori di rischio modificabili e non modificabili che influenzano lo sviluppo di fenotipi gravi all'interno della LBD e sui fattori che agiscono sui tempi di insorgenza dei sintomi della demenza. Identifica inoltre validi candidati biomarcatori e marcatori cognitivi per la profilazione del rischio di demenza sin dalle fasi precliniche.

Background: La Sclerosi Sistemica (SSc) è una malattia rara del tessuto connettivo caratterizzata da danno microvascolare; attivazione dei fibroblasti con aumentata produzione di collageno nella cute, vasi sanguigni e organi interni; disregolazione dell’immunità con produzione di autoanticorpi. Importante è stata la scoperta di autoanticorpi che riconoscono e attivano il recettore del PDGF in pazienti SSc ma non nei controlli, inducendo stress ossidativo e deposizione di collagene, suggerendo un loro ruolo attivo nella patogenesi della SSc. Il nostro gruppo di ricerca ha messo a punto tecniche per clonare autoanticorpi monoclonali anti-PDGFR; identificato i diversi epitopi del PDGFR riconosciuti dai vari monoclonali; dimostrato che questi autoanticorpi causano fibrosi in vivo utilizzando un nuovo modello murino. Materiali e metodi: Utilizzando un saggio ELISA già ottimizzato, sono stati analizzati i sieri di pazienti SSc. 25 sieri SSc positivi al test ELISA insieme a 25 sieri controllo sono stati spediti a Pepscan Presto, Lelystat, Olanda, e testati con una Pepscan-based ELISA. Qui è stata generata una specifica library peptidica per valutare il legame tra gli epitopi conformazionali del PDGFr e gli autoanticorpi presenti nel siero SSc e identificare quali tra questi fossero il bersaglio di una maggiore reattività. Oltre ai 60 peptidi espressione dei primi tre domini della porzione extracellulare del PDGFr, la library contiene anche 60 peptidi rappresentanti la proteina NOX-2 appartenente alla famiglia delle NADPH ossidasi. Secondo la nostra ipotesi, sia la proteina NOX-2 che il PDGFr rappresentano il bersaglio della risposta autoimmunitaria da parte dei pazienti affetti da SSc. Risultati: esiste una differente reattività dei sieri dei pazienti SSc rispetto ai sieri controllo nei confronti di alcuni peptidi contenuti nella library. Ciò dimostra che i sieri SSc contengono autoanticorpi che riconoscono epitopi conformazionali specifici: 13 appartenenti a NOX2 e 21 al PDGFR. Tra i peptidi statisticamente significativi sono stati identificati alcuni che riescono a discriminare meglio i pazienti dai controlli e che potrebbero rappresentare i possibili bersagli di test diagnostici epitope-based. Abbiamo individuato valori di cut-off, mediante curve Roc. I peptidi migliori a discriminare i pazienti SSc dai controlli sono: PEP8 e PEP9 (espressione di NOX), PEP61 e PEP75 (espressione del PDGFr). Il valore cut-off di PEP61 = 435 è quello associato alla più alta sensibilità e specificità (se= 68%, sp= 80%). Nonostante una numerosità campionaria troppo esigua per conclusioni statisticamente significative, indipendentemente dal punteggio cut off considerato, cinque individui appartenenti al gruppo controlli si posizionino sempre al di sopra del livello soglia, risultando sempre positivi ad un ipotetico test diagnostico. Conclusioni: Con questo lavoro sono stati individuati specifici epitopi conformazionali che rappresentano il sito di legame tra anticorpi anti-PDGFr con i sieri di pazienti SSc. Esiste una diversa reattività dei sieri SSc al recettore del PDGF sulla base della quale è stato possibile fare una suddivisione dei pazienti in sottogruppi in parte diversi rispetto alla tradizionale classificazione (forma diffusa vs limitata). Indipendentemente dal punteggio cut-off considerato, cinque sieri controllo presentano una reattività estremamente elevata per tutti i peptidi della library, con un comportamento paragonabile ai pazienti SSc diffusa. Ci si interroga se questa polireattività sierica può essere espressione di una familiarità verso malattie autoimmuni o di una malattia non ancora manifesta. Se queste osservazioni verranno confermate da studi su una più ampia numerosità campionaria, questi peptidi potranno rappresentare il bersaglio di specifici test diagnostici epitope-based, e soprattutto di mirate terapie molecolari.
Background: Systemic Sclerosis (SSc) is a rare disorder of the connective tissue, characterized by fibrosis of the skin, blood vessels, and visceral organs; additional manifestations include alterations of the microvasculature and production of autoantibodies. An important step forward has been the demonstration in SSc patients but not in controls, the presence of agonistic autoantibodies targeting endogenous PDGF receptor in SSc patients. These data suggest that the anti-PDGFR autoantibodies play an active role in the pathogenesis of SSc. Our research group has developed techniques to clone anti-PDGFR monoclonal autoantibodies; identified the different PDGFR epitopes recognized by agonistic anti PDGFR autoantibody; demonstrated that they are pro fibrotic in vivo tested in the preclinical model of the transgenic mouse. Materials and methods: by a competitive ELISA, serums of SSc patients were analyzed. 25 SSc serums positive by ELISA with 25 control serums were shipped to Pepscan Presto, Lelystat, The Netherlands, and tested with a Pepscan-based ELISA. A specific peptide library was then generated to evaluate the binding between the conformational epitopes of PDGFr and the autoantibodies present in the SSc serum and identify which of these are the target of higher reactivity. In addition to the 60 peptides expression of the first three domains of the extracellular portion of PDGFr, the library also contains 60 peptides representing the NOX-2 protein belonging to the NADPH oxidase family. According to our hypothesis, both the NOX-2 protein and the PDGFr are the target of the autoimmune response in SSc patients. Results: a different reactivity of the serums of SSc patients compared to the control serums emerged against some peptides contained in the library. This shows that the serums of SSc patients contain autoantibodies that recognize specific conformational epitopes:13 belonging to NOX2 and 21 to PDGFR. Among the statistically significant peptides, we identified the peptides that are able to better discriminate patients from the controls and that could represent possible targets for epitope-based diagnostic tests in the future. Cut-off values were identified, using Roc curves. The better peptides able to discriminate SSc patients from controls are: PEP8 and PEP9 (NOX expression), PEP61 and PEP75 (PDGFr expression). The cut-off value of PEP61 equal to 435 is the one associated with the highest sensitivity and specificity (se= 68%, sp= 80%). Despite too small a sample size to statistically significant conclusions, regardless of the cut-off score considered, five individuals belonging to the control group always position themselves above the threshold level, always positive to a hypothetical diagnostic test. Conclusions: with this research work, specific conformational epitopes have been identified that represent the site of binding between anti-PDGFr antibodies with serums of SSc patients. There is a different reactivity of SSc serums to the PDGF receptor on the basis of which it has been possible to subdivide patients into sub-groups that are partly different from the traditional classification (diffuse vs limited form). Independently of the cut-off score considered, five control serums have an extremely high reactivity for all peptides in the library, with a behavior comparable to diffuse SSc patients. This data makes us question whether this serum polireactivity may be the expression of a familiarity with autoimmune diseases or a disease not yet manifest. If these observations are confirmed by studies on a larger sample number, these peptides could be the target of specific epitope-based diagnostic tests, and especially of targeted molecular therapies.

I materiali inorganici sono stati i protagonisti dell'industria dei semiconduttori negli ultimi quarant'anni. Tuttavia, c'è stato un continuo interesse nella ricerca e nell'applicazione di semiconduttori organici (OSC) per dispositivi elettronici, grazie alla loro possibilità di essere processati a bassa temperatura, su substrati flessibili e di essere fabbricati utilizzando diverse strategie. Grazie a queste caratteristiche, questi dispositivi elettronici organici stanno rapidamente emergendo come biosensori, con un alto potenziale per diventare piattaforme point-of-care. Uno dei dispositivi piu´utilizzati è il Transistor Elettrochimico Organico (OECT). Gli OECT possono trasdurre e amplificare segnali elettrici o rilevare analiti biologici previa funzionalizzazione con specifiche unità di bioriconoscimento. Gli OECT operano a basso voltaggio, sono facili da fabbricare su diversi substrati e sono compatibili con l'ambiente acquoso, quindi possono interfacciarsi con sistemi biologici. La configurazione di un OECT include un elettrodo di gate che modula la corrente nel canale attraverso un elettrolita, che può essere non solo una soluzione tampone ma anche un fluido biologico complesso. Quando gli OECT vengono utilizzati come biosensori, il meccanismo di rilevamento si basa sulla variazione di corrente generata da reazioni specifiche con l'analita di interesse. Durante il mio dottorato di ricerca, mi sono concentrata sulla progettazione, fabbricazione e validazione di biosensori basati su OECT per il rilevamento di biomarcatori clinici, mostrando il loro alto potenziale come piattaforma di rilevamento. Abbiamo sviluppato sensori verso vari analiti, da molecole a proteine, usando diverse strategie per dotare il dispositivo di selettività verso gli analiti. In particolare, ho anche dimostrato la possibilità di integrare gli OECT nelle piante, come esempio di interfaccia con sistemi viventi. Nei primi due articoli, abbiamo sviluppato OECT stampati, che presentano PEDOT:PSS come semiconduttore sul canale. Nel primo caso, il dispositivo presenta anche un elettrodo di gate PEDOT:PSS che è stato ulteriormente funzionalizzato con gelatina biocompatibile e l'enzima ureasi per garantire la selettività verso l'urea. Il biosensore è stato in grado di monitorare diverse concentrazioni di urea con un limite di detection di 1µM. Nel secondo articolo l'elettrodo di gate di carbonio stampato è stato prima modificato con platino e succesivamente abbiamo assicurato la selettività verso l'acido urico, un biomarcatore rilevante per l'infezione, intrappolando l'urato ossidasi in una membrana a doppio strato ionico. Il biosensore ha mostrato un limite di rilevamento e selettività di 4,5 µM anche in essudato artificiale. Nel terzo articolo abbiamo progettato un biosensore per la detection di interleuchina-6 (IL6) in grado di rilevare i livelli di citochina in concentrazioni pM. Il meccanismo di rilevamento si basa sul legame specifico tra un aptamero, utilizzato come unità di rilevamento sull'elettrodo di gate, e l'IL6 in soluzione. Nel quarto articolo abbiamo presentato un sensore, basato sull'enzima glucosio ossidasi (GOx) per rilevare l'esportazione di glucosio da cloroplasti. Abbiamo dimostrato il monitoraggio di glucosio in tempo reale con una risoluzione di 1 minuto. Nel secondo articolo, abbiamo sviluppato sensori impiantabili per il monitoraggio in vivo e in tempo reale del trasporto di zuccheri nelle piante. I biosensori presentano un elettrodo di gate multienzimatico per conferire specificità per il glucosio e il saccarosio. In particolare, i dispositivi non hanno causato singificativi danni al tessuto, dimostrando che gli OECT possono rappresentatere soluzioni alternative per studiare processi fisiologici.
Inorganic materials have been the main players of the semiconductor industry for the past forty years. However, there has been a continuous growth in the research and in the application of organic semiconductors (OSCs) as active material in electronic devices, due to the possibility to process these materials at low temperature, on flexible substrates and fabricate them on large-area. Because of these features, organic electronic devices are rapidly emerging as biosensors, with a high potential for becoming a high-throughput tool for point-of-care. One of the most studied platform is the Organic Electrochemical Transistor (OECT). OECTs have been used as biosensors to transduce and amplify electrical signals or detect biological analytes upon proper functionalization with specific biorecognition units. OECTs can operate at low voltages, they are easy to fabricate on different substrates and compatible with the aqueous environment, therefore can be interfaced with living systems. The OECT device configuration includes a gate electrode that modulates the current in the channel through an electrolyte, which can be a buffered solution or a complex biological fluid. When OECTs are operated as biosensors, the sensing mechanism relies on the current variation generated from specific reactions with the analyte of interest. During my PhD, I focused on design, fabrication and validation of different OECT-based biosensors for the detection of biomarkers for healthcare applications, showing their high potential as sensing platform. We developed sensors towards different analytes, ranging from small molecules to proteins, with ad hoc strategies to endow the device with selectivity towards the species of interest. Most notably, I also demonstrated the possibility of integrating OECTs in plants, as an example of interfacing living systems. In the first two papers, we developed screen printed OECTs, presenting PEDOT:PSS as semiconducting material on the channel. In the first case, the device featured also a PEDOT:PSS gate electrode which was further functionalized with biocompatible gelatin and the enzyme urease to ensure selectivity toward urea. The biosensor was able to monitor increasing urea concentrations with a limit of detection of 1µM. In the second paper the screen-printed carbon gate electrode was first modified with platinum and then we ensured selectivity towards analyte uric acid, a relevant biomarker for wound infection, by entrapping urate oxidase in a dual-ionic-layer hydrogel membrane. The biosensor exhibited a 4.5µM limit of detection and selectivity even in artificial wound exudate. In the third paper we designed an interleukin-6 (IL6) OECT based biosensor able to detect cytokine levels down to the pM regime in PBS buffer. The mechanism of detection relies on the specific binding between an aptamer, used as sensing unit on the gate electrode, and the IL6 in solution, allowing for detection ranging from physiological to pathological levels. In the last two papers we developed OECT based biosensors to be interfaced with the plant world. In the fourth paper we presented a sensor functionalized with glucose oxidase (GOx) to detect glucose export from chloroplast. In particular, we demonstrated real-time glucose monitoring with temporal resolution of 1 minute. In the second paper, we developed implantable OECT-based sugar sensors for in vivo, real time monitoring of sugar transport in poplar trees. The biosensors presented a multienzyme-functionalized gate for specificity towards glucose and sucrose. Most notably, the OECT sensors did not cause a significant wound response in the plant, demonstrating that OECT-based sensors are attractive tools for studying transport kinetics in plants.

I sarcomi delle parti molli (SPM) sono tumori rari che spesso presentano problemi di diagnosi e di prognosi. Recentemente, lo sviluppo di tecniche “high throughput screening” ha consentito di avviare indagini globali del background molecolare del tumore del singolo paziente, fornendo dati per la selezione di biomarcatori con un significativo impatto clinico. L’individuazione di nuovi biomarcatori circolanti è fondamentale per la diagnosi precoce, per la stratificazione dei pazienti ad alto rischio e per il monitoraggio della progressione o della risposta alla terapia. Una nuova nanotecnologia assolutamente non invasiva è stata utilizzata in questo studio. Le ‘core-shell hydrogel nanoparticles’, infatti, escludendo le proteine del siero molto abbondanti possono legare e concentrare frammenti peptidici o proteine a basso peso molecolare, rilasciate dalle cellule tumorali e dai tessuti, presenti nel siero in così scarsa concentrazione da non essere rilevabili con le convenzionali tecniche immunologiche. La validazione delle proteine identificate è stata effettuata su un’altra serie di sieri da pazienti con sarcoma delle parti molli, mediante ELISA che ha mostrato livelli mediani di IGFBP7 significativamente più alti nei SPM quando paragonati ai controlli, fornendo un valore soglia di 25ng/ml per distinguere i pazienti oncologici dai non oncologici. Data l’evidenza che le molecole circolanti derivano da frammenti proteici presenti nel microambiente tumorale, l’analisi di IGFBP7 nei tessuti con IHC su un numero più ampio di campioni ha rilevato una maggiore intensità di colorazione nei tumori metastatici piuttosto che nei non metastatici con IGFBP7 come biomarcatore indipendente di cattiva prognosi. Infine l’analisi di espressione di 12 miRNA, correlati allo sviluppo e alla progressione dei tumori, con la validazione della sottoregolazione di miR-152 e la conseguente over-espressione dei suoi target MET e KIT, apre la strada a futuri studi di integrazione del profilo molecolare alla ricerca di potenziali specifici "bersagli" per future applicazioni clinico-terapeutiche sempre più personalizzate.
Soft Tissue Sarcomas (STS) are rare tumors with troubles in diagnosis and prognosis. Recently, development of "high throughput screening" techniques has allowed to carry out investigations about molecular background of the individual patient's tumor, providing data for selection of biomarkers with significant clinical impact. The identification of new circulating biomarkers is crucial for early diagnosis, for stratification of high-risk patients and for monitoring the progression or response to therapy. A new totally non-invasive nanotechnology has been used in this study. The ‘core-shell hydrogel nanoparticles’, in fact, excluding very abundant serum proteins can bind and concentrate peptide fragments or low molecular weight proteins, released by tumor cells and tissues, present in serum in so poor concentration as not to be detectable with the conventional immunological techniques. The validation of these identified proteins was carried out on another set of sera from patients with Soft Tissue Sarcomas by ELISA, that showed median IGFBP7 level significantly higher in STS when compared to controls, providing a threshold value of 25ng/ml to distinguish tumor from non-tumor patients. Since circulating molecules derived from protein fragments that are in tumor microenvironment, tissue analysis of IGFBP7 with IHC on a larger number of samples has detected a higher intensity of staining in metastatic rather than in non-metastatic tumors, with IGFBP7 as an independent biomarker of poor prognosis. Finally, expression analysis of 12 miRNA, involved in tumor development and progression, with validation of miR-152 downregulation and subsequent overexpression of its targets MET and KIT, opens the way for future integration of molecular profile studies looking for specific potential "targets" for future clinical-therapeutic personalized applications.