Dissertations / Theses on the topic 'Biomarcatori'

Introduction: Synovitis is a chronic inflammation concerning all early inflammatory arthritis. It is often resistent to standard pharmacological treatment and local therapy , and if not treated , the process becames irreversible. Aim of the study: To identify biomarkers useful to determine the disease activity level, to evaluate the responses to therapies and to delineate the mechanisms involved in the synovitis process, in order to find new potential therapeutic targets for this severe disease. Methods: Synovial fluid (SF), synovial tissue (ST) and/or peripheral bood (PB) samples were obtained from patients affected by psoriatric arthritis (PsA) and pigmented villonodular synovitis (PVNS). Local and sistemic disease activity indexes: knee Thompson articular index (THOMP: range 0 -9), Knee Joint Articular Index (KJAI: range 0 -14), erythrocytes sedimentation rate(ERS: norm 0–20 mm/hr), C-reactive protein (CRP: norm<10), and SF cytokine/chemokine expression levels were mesured before and after IA TNF α blockade.Characterization of synovial mononclear cell infiltration and synovial vessels, and the evaluation of the different cellular subset expression (T regulatory and Thelper 17 cells) was carried out in consecutive serial sections obtained from synovial biopsies or in mononuclear cells obtained from SF or PB. Proper antibodies were used for immunostaining. Analysis were carried out by cellular and molecular biology techniques, cytofluorimetry and immunoistochemistry. Data obtained from the patients were compared to data obtained from proper control groups. Results: SF biomarkers correlate with synovial tissue inflammation and with local and systemic indexes of disease activity in PsA. The IA TNF α blockade lead to a synovial effusion regression and a ST and SF biomarkers significant reduction compared to baseline. In PVNS affected patients, knee injectons lead to a reduction in local indexes of disease activity and in immunohistological alterations. We detected higher CSF-1mRNA expression level in PVNS compared to chronic inflammatory synovitis. The evaluation of Treg and TH17 subset cells phenotype in PsA affected patients showed an increased expression of TH17 cells both at local and systemic level. Moreover, we found some correlations between cell markers both at local and systemic level. Conclusions: Synovial effusion regression is a reliable indicator of the response to IA TNFα blockers in PsA patients and it is confirmed by the correlation between SF biomarkers to disease activity and synovial tissue inflammation. Changes following IA treatment, indicate that ST CD45+ MNC and CD31+ vessels, along with SF IL-6 and -IL-1β, may represent candidate biomarkers of the knee synovitis response to IA TNF-α blockade. The new therapeutic approach concerning serial intraarticular anti-TNF-α injections in pigmented villonodular synovitis resulted in a local clinical improvement accompanied by a rapid regression in synovial stromal fibrosis and vasculogenesis. Moreover, it was ineffective in reducing synovial CSF-1 expression. The detection of higher level of colony-stimulating factor-1 (CSF-1) in synovial tissue of pigmented villonodular synovitis (PVNS) suggests that CSF-1 play an important role in PVNS disease process and supports the idea that CSF-1/CSF-1R interaction may represent a potential therapeutic target of this disease. The higher expression of TH17 cells in contrast to the lower expression of Treg cells detected in the SF and PB of PsA patients, highlights new specific molecular targets for the development of different pharmacological approches able to inhibit the effector response, preventing TH17 activity, or enhancing the regulatory response, inducing the differentiation of Treg cells.
Introduzione: Le sinoviti sono infiammazioni croniche che riguardano tutte le artriti infiammatorie primitive. Spesso resistenti al trattamento farmacologico tradizionale ed alla terapia locale, se non curate, si dimostrano irreversibili. Scopo dello studio: Individuare biomarcatori utili a determinare il grado di attività di malattia, le risposte ai trattamenti e chiarire i meccanismi coinvolti nel mantenimento della sinovite al fine di poterli considerare nuovi possibili bersagli terapeutici per questa grave patologia. Materiali e metodi: Campioni di liquido sinoviale (LS), tessuto sinoviale (TS) e/o sangue periferico (SP) sono stati ottenuti da pazienti affetti da artrite psoriasica (AP) e sinovite villonodulare pigmentosa diffusa (PVNS). Sono stati valutati gli indici di attività di malattia locali: knee Thompson articular index (THOMP: range 0 -9), Knee Joint Articular Index (KJAI: range 0 -14) e sistemici: velocità di eritrosedimantazione (VES: norm 0–20 mm/hr), proteina C-reattiva (PCR: norm<10), e sono stati misurati i livelli di citochine/chemochine nel LS prima e dopo trattamento intra-articolare (IA) con anti-TNFα (E). La caratterizzazione dell’infiltrato cellulare sinoviale e dei vasi sinoviali e la valutazione dell’espressione di frazioni cellulari ad attività funzionale opposta (Treg e TH17) è stata ottenuta marcando con opportuni anticorpi sezioni seriali di biopsie sinoviali e cellule mononucleate separate da SP e LS rispettivamente. Tutte le analisi sono state eseguite mediante l’utilizzo di tecniche di citofluorimetria, di biologia cellulare e molecolare e di immunoistochimica e i dati raccolti dai gruppi di pazienti sono stati confrontati con quelli raccolti da opportuni gruppi di controllo. Risultati: Abbiamo dimostrato che nell’AP i biomarcatori del liquido sinoviale correlano con l’infiammazione del tessuto sinoviale e gli indici sistemici di attività di malattia e che in risposta al trattamento IA con anti-TNFα il versamento sinoviale e i biomarcatori del liquido e del tessuto sinoviale sono significativamente ridotti rispetto ai livelli basali. Nella PVNS le iniezioni IA hanno portato ad un effettivo miglioramento degli indici locali di attività di malattia e ad una riduzione delle alterazioni immunoistologiche. Lo studio di espressione del CSF-1 ha evidenziato che esso è maggiormente espresso nelle sinoviti villonodulari rispetto alle sinoviti infiammatorie croniche. La valutazione dei profili fenotipici delle frazioni cellulari Treg e TH17 nei pazienti affetti da AP ha mostrato che sia a livello sistemico che locale l’equilibrio tra le due frazioni è significativamente spostato verso il fenotipo proinfiammatorio TH17 e che vi sono correlazioni tra l’espressione di alcuni marcatori a livello locale e sistemico. Conclusioni: La regressione del versamento sinoviale è un indicatore reale della risposta ai farmaci bloccanti il TNFα nei pazienti affetti da AP ed è confermata dalle correlazioni tra i biomarcatori del LS con l’attività di malattia e l’infiammazione del tessuto sinoviale. Le alterazioni conseguenti al trattamento indicano che specifici marcatori sinoviali studiati (CD45+, CD31+, IL-1β; IL-6) possano rappresentare potenziali biomarcatori sinoviali della risposta al trattamento con tali farmaci. Il nuovo approccio terapeutico IA anti TNFα nel trattamento della PVNS ha portato ad una rapida regressione della fibrosi e della vasculogenesi. Inoltre si è dimostrato inefficace nel ridurre l’espressione del CSF-1. I più alti livelli di espressione dell’mRNA-CSF-1 riscontrati nella PVNS suggeriscono che il CSF-1 svolge un ruolo chiave nello sviluppo della malattia e che l’interazione tra CSF-1/CSF-1R possa rappresentare un potenziale bersaglio terapeutico per la sinovite villonodulare. L’elevata espressione della frazione cellulare TH17 rispetto alla frazione Treg riscontrata sia nel liquido sinoviale che nel sangue periferico dei pazienti affetti da AP ci permette di pensare a specifici bersagli molecolari per lo sviluppo di nuovi composti capaci sia di inibire la risposta effettrice, per esempio prevenendo l'attivazione antigene-specifica delle cellule TH17, sia di aumentare quella regolatoria, per esempio inducendo il differenziamento delle cellule Treg.

About one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant and suffer from poor quality of life, seizure-related accidents and comorbidities, increased risk of death and disabling psychosocial consequences. Clinical outcomes for patients unresponsive to current pharmacological tools could be improved by characterization and development of biomarkers that could assist physicians in either (i) optimizing response to treatment with available antiepileptic drugs or (ii) identifying early those patients who are pharmacoresistant and could benefit from earlier referral to alternative therapies such as epilepsy surgery or neurostimulation. The first part of the research relates to pharmacokinetic biomarkers aimed at optimizing response to pharmacological treatment. Specifically, plasma concentrations of antiepileptic drugs have been shown to provide valuable indicators of pharmacological response, although their usefulness has not yet been clearly established for some second-generation drugs, partly due to lack of availability of assay methods easily applicable to therapeutic drug monitoring in the routine setting. In the present research, the latter deficiency was addressed by developing and validating two assay techniques for the determination of retigabine, known also as ezogabine, and perampanel in body fluids. For retigabine, an HPLC-UV method suitable for therapeutic drug monitoring was developed which permits sensitive quantitation of the drug in human plasma. Although therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs is usually based on their determination in plasma samples, alternative matrices, such as dried plasma spots, may offer advantages in some settings. For this reason, a HPLC-UV method for the quantitation of perampanel in dried plasma spots was developed and validated. Perampanel concentrations assessed in dried plasma spot samples obtained from patients receiving therapeutic doses were comparable to those measured in plasma samples. The second part of the research described in the present thesis relates to the investigation of microRNA (miRNA) profiles in plasma-derived extracellular vesicles as potential epigenetic biomarkers for early differentiation between patients resistant to antiepileptic drugs and patients responsive to these drugs. Additionally, miRNA expression profiles were also assessed in healthy controls in order to ascertain potential differences related to the disease itself rather than drug responsiveness. By applying a cross-sectional non-interventional open-label study design, miRNAs profiles in exosomes and microvesicles isolated from plasma were compared among 20 patients with drug-resistant focal epilepsy, 20 patients with drug-responsive focal epilepsy and 20 healthy control subjects. Extracellular purity, concentration and size distribution in each sample were ascertained by applying a combination of techniques (Western blot analysis, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy). Total RNA was extracted by exosome and microvesicle pellets, and sequenced on NGS platforms. The potential involvement of identified miRNAs in epilepsy-relevant pathways (predicted target genes and predicted pathways) was investigated by using the miRWalk 3.0 database and KEGG database. Statistical analysis of the results did not identify significant differences across groups in extracellular vesicle size or count. Five miRNAs were found to be de-regulated in exosomes isolated from pharmacoresistant patients compared with healthy controls (one was up-regulated and four were down-regulated). Four miRNAs were found to be de-regulated in microvesicles obtained from pharmacoresistant patients compared with healthy controls (two up-regulated miRNAs and two down-regulated). These findings, which require confirmation in a larger sample size, may provide valuable clues for a better understanding of processes involved in epileptogenesis as well as mechanisms implicated in pharmacoresistance.

ll sarcoma di Ewing, secondo più diffuso tumore primitivo dell’osso, è un tumore di origine mesenchimale che colpisce prevalentemente adolescenti e giovani adulti. L’attuale terapia multimodale ha raggiunto un plateau di sopravvivenza a 5 anni (5y OVS) pari al 70% per pazienti con malattia localizzata, 30% e 25% per pazienti metastatici alla diagnosi o recidivanti. Poichè inoltre i pazienti soffrono di tossicità acuta o a lungo termine legata alla chemioterapia, è fondamentale lo sviluppo di biomarcatori che ne permettano la stratificazione in base al rischio alla diagnosi. Questo studio conferma LGALS3BP e miR-34a come predittori indipendenti dell’esito clinico in 124 pazienti affetti da sarcoma di Ewing localizzato trattati presso un singolo Istituto. Pazienti alto-esprimenti hanno un rischio ridotto di sviluppare recidive locali o metastasi (HR 0.402, 95% CI 0.190-0.850 per LGALS3BP; HR 0.485, 95% CI 0.236 -0.996 per miR-34a), o di decesso legato al tumore (HR 0.397, 95% CI 0.159-0.993 per LGALS3BP; HR 0.353, 95% CI 0.132-0.943 per miR-34a). Tramite lo sviluppo e la caratterizzazione in vitro ed in vivo di un modello di over-espressione stabile di miR-34a, abbiamo confermato il ruolo oncosoppressore di questo miRNA nel sarcoma di Ewing; uno dei meccanismi sembra coinvolgere l’inibizione dell’isoforma 1B della ciclina D1, target diretto di EWS-FLI1, fattore trascrizionale aberrante caratteristico di questo tumore. È stata inoltre provata la fattibilità della quantificazione non invasiva di miR-34a circolante. Tramite whole transcriptome sequencing su biopsie pre-trattamento da pazienti selezionati in base alla differenziale risposta alla chemioterapia, sono state identificate 4 mutazioni a carico di TP53 (p.R213X, p.R248W, p.R273C ep.K386M mutazione de novo), che definiscono una classe di pazienti con scarsa risposta al trattamento, ed un pannello di lincRNAs con espressione differenziale nei due gruppi. Nell’insieme questi risultati concorrono alla definizione di uno spettro di caratteristiche molecolari che riteniamo promettenti candidati per la validazione prospettica.
Ewing sarcoma, the second most common primary bone malignancy, is a highly aggressive mesenchymal tumor arising mainly in adolescents and young adults. Current multimodal treatment has reached a plateau of 70% 5-year overall survival (5y OVS) for patients with localized disease, and 30% and 25% for patients with metastatic or recurrent disease. Moreover, patients often suffer from acute and long term toxicity related to chemotherapy. It is thus paramount the development of molecular biomarkers allowing stratification of patients based on risk at diagnosis. The present study validates LGALS3BP and miR-34a as independent predictors of clinical outcome in 124 Ewing sarcoma patients treated in a single Institution. Patients with high expression levels of these molecules have lower risk of developing local recurrences or metastasis (HR 0.402, 95% CI 0.190-0.850 for LGALS3BP;HR 0.485, 95% CI 0.236 -0.996 for miR-34a), and a lower risk of disease-related death (HR 0.397, 95% CI 0.159- 0.993 for LGALS3BP; HR 0.353, 95% CI 0.132-0.943 for miR-34a). By developing and characterizing in vitro and in vivo a stable miR34a expression model, we confirmed its oncosuppressor role in Ewing sarcoma; one of the underlying mechanisms involve the inhibition of the 1B isoform of cyclin D1, a direct target of EWS-FLI1, the aberrant transcription factor characteristic of the disease. We also show the feasibility of non-invasive circulating miR-34a quantification. Through a whole transcriptome sequencing approach applied to pre-treatment biopsies from patients with differential chemotherapy response, we identified 4 mutations in the TP53 gene (p.R213X, p.R248W, p.R273C and p.K386M de novo mutation) defining a patient group with poor response to treatment, and a panel of lincRNA with differential expression in the two groups. Overall these results contribute to the definition of a spectrum of molecular features of Ewing sarcoma impacting clinical outcome, which are promising candidates for prospective validation.

Lung cancer remains the leading cause of cancer-mortality worldwide, mainly due to late diagnosis. Thus, the identification of biomarkers for an early detection would bring great benefit not only for patients but also for high risk subjects. This project was aimed to discover plasma biomarkers potentially useful to enhance our capabilities to identify those individuals at higher risk of lung cancer in heavy smokers population, enrolled in the Multicentric Italian Lung Detection (MILD) program. To this end, we performed multiparametric analysis of proteins and metabolites linked to systemic (Serum Amyloid A, SAA; Paraoxinase 1, PON1; and 50 plasmatic cytokines) and local (proteins and metabolites in exhaled breath condensate, EBC) inflammation and oxidative stress. We also studied the relationships between these parameters and the pulmonary function measured as FEV1 (forced esxpiratory volume in 1 s). Very recently we have demonstrated that increased plasma levels of the acute phase protein SAA and decreased FEV1 levels are associated with an increased risk of lung cancer incidence in heavy smokers. On this basis, for an efficacious detection of the high risk subgroup among the heavy smoking population, we explored the relationship between SAA plasma levels and FEV1. Importantly, we found a significant inverse correlation between these parameters, suggesting that increased levels of SAA are associated to decreased pulmonary function. We then evaluated a group of cytokines by Bio-Plex Suspension Array System, allowing the simultaneous detection of 50 cytokines. According to assessed SAA levels, we evaluated 142 plasma samples by Bio-Plex. By univariate analysis of obtained results we found that SAA levels correlated directly with cytokine levels of IL-12(p40), GRO-α, HGF, MCP-3, M-CSF, SCGF, SDF-1α, IL-6 and IP-10 and that FEV1 values correlated inversely with GRO-α, HGF, MCP-3, β-NGF, SCGF and MIG concentrations. MIG showed the best association with FEV1. Multivariate analysis highlighted an association between SCGF, CTACK, MIF, MIG, IL-16 and Eotaxin. Additionally, we assessed PON1 levels by Western blot and ELISA in the 142 samples. Our data showed an inverse correlation between PON1 and the major acute phase protein CRP (C reactive protein) as well as between PON1 and SAA together with a direct correlation between PON1 and FEV1. This supported our hypothesis that the decrease of the anti-oxidant function corresponds to a systemic increase of acute phase inflammatory proteins and a decrease of pulmonary function. Regarding the locally produced proteins and metabolites we evaluated inflammatory and oxidative stress parameters in 18 EBC samples derived from heavy smokers and 18 obtained from lung cancer patients. By mass spectrometry analysis and immunoenzymatic assays (ELISA, EIA, BIO-PLEX) we generated protein profiles and assessed the levels of Surfactant Protein C, Leucotrien B4, 8-Isoprostane and a group of 14 cytokines. Noteworthy, we could detect an interesting increased level of 8-Isoprostane in EBC samples of lung cancer patients with respect to those derived from heavy smokers. Taken together our multiparametric analyses highlighted the existance of interesting relationships between specific plasma or EBC components and the impairment of lung function. This supports the interesting possibility we have identified potential biomarkers useful for the evaluation of lung cancer risk. However, their effective clinical applicability will be investigated in future studies using a higher number of subjects.

Background: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rare, progressive, neurodegenerative disorder caused by degeneration of upper and lower motoneuron. The disease process leads to progressive muscle atrophy, weakness, fasciculations and spasticity. About two-thirds of ALS patients have a spinal form of the disease (spinal ALS), which involves the limbs. The spinal ALS has an upper or lower limb onset that starts with weakness and muscle atrophy in hands or feet whereas one-thirds of patients have a bulbar onset (bulbar ALS) usually presenting with dysarthria and dysphagia. The spinal ALS leads to death after 3-5 years from onset while the bulbar ALS die about after 2-3 years from onset. Incidence and prevalence of ALS are higher in men than in women. Male e female gender influences the clinical features of the disease: man have a greater likelihood spinal regions onset whereas women have onset at an older age. The effects of physical exercise and rehabilitation in patients with ALS are still debated: if a patient is inactive, the loss of exercise or muscle training leads to muscle atrophy and disuse that contribute to deterioration in addition to the weakness and muscle atrophy caused by denervation. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules (19-24 nucleotides), highly conserved, which regulate genes expression at the post transcriptional level. The up-regulation of a specific miRNA determines decreasing expression of the corresponding protein product. Aim: The aim of this work is the identification of new molecular and biochemical biomarkers to facilitate the study of the various subtypes of ALS. We will study if they provide information on the onset and severity of disease and they might be used as indicators of a therapeutic response in rehabilitation. We will investigate the levels of both muscle-specific (myomiRNAs) and inflammatory/angiogenic microRNAs and other molecular signatures (Myostatin, Follistatin). MicroRNAs will be analized and compared with morphometric study in muscle biopsies of ALS patient and controls. In serum, we will investigate the difference between spinal and bulbar ALS whereas, in muscle we will analyze the difference between male and female patients and in the effect of different age of onset of the disease on microRNAs. Methods: In 14 ALS patients (10 spinal and 4 bulbar) we measure the serum levels of muscle-specific miR-1, miR-206, miR-133a/b, miR-27a and the inflammatory miRNAs miR-155, miR-146a, miR-221 and miR-149*, and the expression of Myostatin and Follistatin, which are two antagonist regulator of the muscle growth. Morphometric analysis of muscle fiber size is done to correlate muscle atrophy with biochemical-molecular parameters. In 16 muscles ALS biopsies (9 male and 7 female) we analyze the levels of myomiRNAs and inflammatory miRNAs. The circulating levels of myomiRNAs are analysed also in 12 ALS patients (8 male and 4 female) after rehabilitation treatment of 8 weeks in IRCCS San Camillo (Venice). Results: In ALS patients the expression of serum miR-206 and miR-133 is significantly (p<0.005) increased and miR-27a is significantly (p<0.005) reduced compared to control, also the miRNA profile is significantly higher between spinal versus bulbar ALS. Myostatin/Follistatin ratio was significantly higher in ALS versus control and are higher in bulbar versus spinal ALS. Bulbar ALS patients present more pronounced muscle atrophy than spinal ALS, as documented by our muscle fiber morphometric analysis. In patients ALS biopsy all miRNAs we measured are strongly up-regulated in ALS patients versus control, with the exception of miR-149*. A strong up-regulation (p<0.0001) of all miRNAs is present in male versus female ALS biopsies and in group of ALS patients with age of onset below 55 versus the group of older patients. In serum after 8 weeks of rehabilitation myomiRNAs result down-regulated indicating an active proliferation of satellite cells in muscle and increased neuromuscular junctions. Conclusion: Muscle mass regulators are particularly down-expressed in bulbar ALS, suggesting a more rapid and diffuse muscle atrophic process. Similar results were obtained on Myostatin/Follistatin ratio. The differences in this regulators between clinical subgroups of ALS patients, in serum and in muscle, may suggest a possible differential role of miRNAs in the pathogenetic accurance of muscle atrophy in motoneurons disease. Furthermore our data suggest that miRNAs are good indicators of muscle recovery in response to rehabilitation conducted for eight weeks consisting of aerobic exercise.
Background: La SLA è una malattia rara, neurodegenerativa che colpisce i motoneuroni del midollo spinale, del tronco e della corteccia motoria. La perdita dei motoneuroni porta ad atrofia muscolare, debolezza muscolare, fascicolazioni e spasticità. Circa due terzi dei pazienti con SLA presentano una forma spinale della malattia che comincia sia dagli arti superiori che inferiori e sintomi associati a stanchezza con atrofia muscolare. Un terzo dei pazienti presentano un esordio bulbare della malattia che si manifesta inizialmente con disartria e disfagia per solidi e liquidi (paralisi bulbare progressiva). Nella maggior parte dei casi la forma spinale porta a decesso dopo 3-5 anni mentre la paralisi bulbare dopo una media di 2-3 anni. L'incidenza della SLA è riportata maggiore negli uomini che nelle donne. Il sesso influenza alcune caratteristiche fenotipiche della malattia tra cui l'età e il sito d'esordio e alcune caratteristiche cliniche. Gli effetti dell'esercizio fisico e della riabilitazione in pazienti affetti da SLA sono ancora dibattuti: se un paziente è inattivo, la perdita di allenamento e il disuso portano all’atrofia muscolare, che si va a sommare alla debolezza e all'atrofia muscolare causata dalla denervazione e dalla degenerazione dei motoneuroni. I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA (19-24 nucleotidi) a singolo filamento, non codificanti, altamente conservati nel corso dell'evoluzione che regolano finemente l'espressione genica a livello post-trascrizionale. L’up-regolazione di uno specifico microRNA determina un decremento dell’espressione del prodotto proteico corrispondente. Scopo: L'obiettivo di questo lavoro è l’identificazione di nuovi biomarcatori molecolari e biochimici che facilitino lo studio dei vari sottotipi di SLA, che diano informazioni su insorgenza e gravità di malattia e che possano essere utilizzati come indicatori di risposta in trials clinico-riabilitativi. Abbiamo studiato i livelli di espressione dei miRNA muscolo-specifici e infiammatori/angiogenici e altre molecole proteiche (Miostatina/Follistatina). L’analisi dei miRNA è stata comparata con la morfometria delle fibre muscolari. Nel siero, in particolare, abbiamo indagato le differenze tra pazienti ad esordio spinale e pazienti ad esordio bulbare mentre, nel muscolo, abbiamo analizzato le differenze tra maschi e femmine e tra pazienti con diversa età d'esordio. Metodi: In 14 pazienti SLA (10 spinali e 4 bulbari) abbiamo misurato i livelli sierici dei miRNA muscolo-specifici miR-1, miR-206, miR-133a/b, miR-27a e dei miRNA infiammatori miR-155, miR-146a, miR-221 e miR-149* e l'espressione della Miostatina e della Follistatina, due fattori regolatori antagonisti della crescita muscolare. L'analisi morfometrica delle fibre è stata correlata all'atrofia muscolare misurata con parametri biochimici molecolari. In 16 biopsie muscolari di pazienti SLA (9 maschi e 7 femmine) sono stati analizzati i livelli dei myomiRNA e dei miRNA infiammatori. I livelli circolanti dei myomiRNA sono stati analizzati anche in 12 pazienti SLA (8 maschi e 4 femmine) dopo trattamento riabilitativo di 8 settimane. Risultati: Nei pazienti SLA c'è un incremento significativo (p<0.005) dei livelli sierici del miR-206, miR-133 mentre il miR-27a è significativamente (p<0.005) ridotto confrontato con i controlli e anche tra pazienti spinali e bulbari. Il rapporto Miostatina/Follistatina risulta più alto nei pazienti SLA rispetto ai controlli, simili dati si riscontrano in pazienti SLA ad esordio bulbare rispetto a pazienti con esordio spinale. I pazienti con SLA bulbare presentano un grado più alto di atrofia muscolare rispetto ai pazienti con SLA spinale documentato dall'analisi morfometrica delle fibre. Nelle biopsie muscolari di pazienti SLA tutti i miRNA presi in esame risultano fortemente up-regolati (p<0.0001) nei pazienti rispetto ai controlli ad eccezione del miR-149*. Vi è una up-regolazione significativa (p<0.0001) di tutti i miRNA nei maschi rispetto alle femmine e nei pazienti con una età d'esordio sotto i 55 anni rispetto al gruppo di pazienti più vecchi. Dopo 8 settimane di riabilitazione tutti i myomiRNA risultano down-regolati. Conclusioni: I microRNA e altre molecole proteiche (Miostatina/Follistatina) risultano particolarmente down-regolati nei pazienti con SLA bulbare, suggerendo così il risultato di un processo atrofico muscolare più rapido e diffuso. Le differenze osservate nei sottogruppi di pazienti SLA, nel siero e nelle biopsie muscolari, potrebbero suggerire un possibile ruolo differenziale dei miRNA negli eventi patogenetici della malattia dei motoneuroni. Inoltre i nostri dati suggeriscono che i myomiRNA rappresentano possibili indicatori di recupero muscolare in risposta alla riabilitazione.

Parkinson’s disease (PD) is the neurological disease with the fastest growing rate. 1% of the world population over 60 years have a PD diagnosis. PD presents a complex and heterogenous clinical picture during the disease course, and dementia represents the most severe condition. This thesis investigates the neurobiological mechanisms and cognitive features of PD patients with a severe clinical phenotype – developing cognitive deterioration, reaching dementia condition. The studies included in this dissertation contributed to identifying risk factors, biomarkers, cognitive features, and sources of clinical variability of dementia in Lewy Bodies disorders (LBD) with multiple methodological approaches to neuroimaging data. Moreover, the cognitive picture of the LBD clinical spectrum has been explored by combining cross-sectional and longitudinal approaches. This dissertation provides new evidence on modifiable and non-modifiable risk factors that influence the development of severe phenotypes within LBD and those acting on the timing of dementia symptoms onset. Moreover, we identify valuable biomarker and cognitive marker candidates for dementia risk profiling since early preclinical stages.
La malattia di Parkinson è la malattia neurologica con il tasso di crescita più rapida. L'1% della popolazione mondiale oltre i 60 anni ha una diagnosi di Parkinson. Il morbo di Parkinson presenta un quadro clinico complesso ed eterogeneo durante il decorso della malattia, di cui la demenza rappresenta la condizione più grave. Questa tesi indaga i meccanismi neurobiologici e le caratteristiche cognitive dei pazienti affetti da Malattia di Parkinson con un grave fenotipo clinico – che sviluppano un deterioramento cognitivo raggiungendo la condizione di demenza. Gli studi inclusi in questo elaborato hanno contribuito a identificare fattori di rischio, biomarcatori, caratteristiche cognitive e fonti di variabilità clinica della demenza nei disturbi a corpi di Lewy (LBD) con molteplici approcci metodologici ai dati di neuroimaging. Inoltre, è stato esplorato il quadro cognitivo dello spettro clinico LBD combinando approcci cross-sectional e longitudinali. Questa tesi fornisce nuove evidenze sui fattori di rischio modificabili e non modificabili che influenzano lo sviluppo di fenotipi gravi all'interno della LBD e sui fattori che agiscono sui tempi di insorgenza dei sintomi della demenza. Identifica inoltre validi candidati biomarcatori e marcatori cognitivi per la profilazione del rischio di demenza sin dalle fasi precliniche.

Background: La Sclerosi Sistemica (SSc) è una malattia rara del tessuto connettivo caratterizzata da danno microvascolare; attivazione dei fibroblasti con aumentata produzione di collageno nella cute, vasi sanguigni e organi interni; disregolazione dell’immunità con produzione di autoanticorpi. Importante è stata la scoperta di autoanticorpi che riconoscono e attivano il recettore del PDGF in pazienti SSc ma non nei controlli, inducendo stress ossidativo e deposizione di collagene, suggerendo un loro ruolo attivo nella patogenesi della SSc. Il nostro gruppo di ricerca ha messo a punto tecniche per clonare autoanticorpi monoclonali anti-PDGFR; identificato i diversi epitopi del PDGFR riconosciuti dai vari monoclonali; dimostrato che questi autoanticorpi causano fibrosi in vivo utilizzando un nuovo modello murino. Materiali e metodi: Utilizzando un saggio ELISA già ottimizzato, sono stati analizzati i sieri di pazienti SSc. 25 sieri SSc positivi al test ELISA insieme a 25 sieri controllo sono stati spediti a Pepscan Presto, Lelystat, Olanda, e testati con una Pepscan-based ELISA. Qui è stata generata una specifica library peptidica per valutare il legame tra gli epitopi conformazionali del PDGFr e gli autoanticorpi presenti nel siero SSc e identificare quali tra questi fossero il bersaglio di una maggiore reattività. Oltre ai 60 peptidi espressione dei primi tre domini della porzione extracellulare del PDGFr, la library contiene anche 60 peptidi rappresentanti la proteina NOX-2 appartenente alla famiglia delle NADPH ossidasi. Secondo la nostra ipotesi, sia la proteina NOX-2 che il PDGFr rappresentano il bersaglio della risposta autoimmunitaria da parte dei pazienti affetti da SSc. Risultati: esiste una differente reattività dei sieri dei pazienti SSc rispetto ai sieri controllo nei confronti di alcuni peptidi contenuti nella library. Ciò dimostra che i sieri SSc contengono autoanticorpi che riconoscono epitopi conformazionali specifici: 13 appartenenti a NOX2 e 21 al PDGFR. Tra i peptidi statisticamente significativi sono stati identificati alcuni che riescono a discriminare meglio i pazienti dai controlli e che potrebbero rappresentare i possibili bersagli di test diagnostici epitope-based. Abbiamo individuato valori di cut-off, mediante curve Roc. I peptidi migliori a discriminare i pazienti SSc dai controlli sono: PEP8 e PEP9 (espressione di NOX), PEP61 e PEP75 (espressione del PDGFr). Il valore cut-off di PEP61 = 435 è quello associato alla più alta sensibilità e specificità (se= 68%, sp= 80%). Nonostante una numerosità campionaria troppo esigua per conclusioni statisticamente significative, indipendentemente dal punteggio cut off considerato, cinque individui appartenenti al gruppo controlli si posizionino sempre al di sopra del livello soglia, risultando sempre positivi ad un ipotetico test diagnostico. Conclusioni: Con questo lavoro sono stati individuati specifici epitopi conformazionali che rappresentano il sito di legame tra anticorpi anti-PDGFr con i sieri di pazienti SSc. Esiste una diversa reattività dei sieri SSc al recettore del PDGF sulla base della quale è stato possibile fare una suddivisione dei pazienti in sottogruppi in parte diversi rispetto alla tradizionale classificazione (forma diffusa vs limitata). Indipendentemente dal punteggio cut-off considerato, cinque sieri controllo presentano una reattività estremamente elevata per tutti i peptidi della library, con un comportamento paragonabile ai pazienti SSc diffusa. Ci si interroga se questa polireattività sierica può essere espressione di una familiarità verso malattie autoimmuni o di una malattia non ancora manifesta. Se queste osservazioni verranno confermate da studi su una più ampia numerosità campionaria, questi peptidi potranno rappresentare il bersaglio di specifici test diagnostici epitope-based, e soprattutto di mirate terapie molecolari.
Background: Systemic Sclerosis (SSc) is a rare disorder of the connective tissue, characterized by fibrosis of the skin, blood vessels, and visceral organs; additional manifestations include alterations of the microvasculature and production of autoantibodies. An important step forward has been the demonstration in SSc patients but not in controls, the presence of agonistic autoantibodies targeting endogenous PDGF receptor in SSc patients. These data suggest that the anti-PDGFR autoantibodies play an active role in the pathogenesis of SSc. Our research group has developed techniques to clone anti-PDGFR monoclonal autoantibodies; identified the different PDGFR epitopes recognized by agonistic anti PDGFR autoantibody; demonstrated that they are pro fibrotic in vivo tested in the preclinical model of the transgenic mouse. Materials and methods: by a competitive ELISA, serums of SSc patients were analyzed. 25 SSc serums positive by ELISA with 25 control serums were shipped to Pepscan Presto, Lelystat, The Netherlands, and tested with a Pepscan-based ELISA. A specific peptide library was then generated to evaluate the binding between the conformational epitopes of PDGFr and the autoantibodies present in the SSc serum and identify which of these are the target of higher reactivity. In addition to the 60 peptides expression of the first three domains of the extracellular portion of PDGFr, the library also contains 60 peptides representing the NOX-2 protein belonging to the NADPH oxidase family. According to our hypothesis, both the NOX-2 protein and the PDGFr are the target of the autoimmune response in SSc patients. Results: a different reactivity of the serums of SSc patients compared to the control serums emerged against some peptides contained in the library. This shows that the serums of SSc patients contain autoantibodies that recognize specific conformational epitopes:13 belonging to NOX2 and 21 to PDGFR. Among the statistically significant peptides, we identified the peptides that are able to better discriminate patients from the controls and that could represent possible targets for epitope-based diagnostic tests in the future. Cut-off values were identified, using Roc curves. The better peptides able to discriminate SSc patients from controls are: PEP8 and PEP9 (NOX expression), PEP61 and PEP75 (PDGFr expression). The cut-off value of PEP61 equal to 435 is the one associated with the highest sensitivity and specificity (se= 68%, sp= 80%). Despite too small a sample size to statistically significant conclusions, regardless of the cut-off score considered, five individuals belonging to the control group always position themselves above the threshold level, always positive to a hypothetical diagnostic test. Conclusions: with this research work, specific conformational epitopes have been identified that represent the site of binding between anti-PDGFr antibodies with serums of SSc patients. There is a different reactivity of SSc serums to the PDGF receptor on the basis of which it has been possible to subdivide patients into sub-groups that are partly different from the traditional classification (diffuse vs limited form). Independently of the cut-off score considered, five control serums have an extremely high reactivity for all peptides in the library, with a behavior comparable to diffuse SSc patients. This data makes us question whether this serum polireactivity may be the expression of a familiarity with autoimmune diseases or a disease not yet manifest. If these observations are confirmed by studies on a larger sample number, these peptides could be the target of specific epitope-based diagnostic tests, and especially of targeted molecular therapies.

I materiali inorganici sono stati i protagonisti dell'industria dei semiconduttori negli ultimi quarant'anni. Tuttavia, c'è stato un continuo interesse nella ricerca e nell'applicazione di semiconduttori organici (OSC) per dispositivi elettronici, grazie alla loro possibilità di essere processati a bassa temperatura, su substrati flessibili e di essere fabbricati utilizzando diverse strategie. Grazie a queste caratteristiche, questi dispositivi elettronici organici stanno rapidamente emergendo come biosensori, con un alto potenziale per diventare piattaforme point-of-care. Uno dei dispositivi piu´utilizzati è il Transistor Elettrochimico Organico (OECT). Gli OECT possono trasdurre e amplificare segnali elettrici o rilevare analiti biologici previa funzionalizzazione con specifiche unità di bioriconoscimento. Gli OECT operano a basso voltaggio, sono facili da fabbricare su diversi substrati e sono compatibili con l'ambiente acquoso, quindi possono interfacciarsi con sistemi biologici. La configurazione di un OECT include un elettrodo di gate che modula la corrente nel canale attraverso un elettrolita, che può essere non solo una soluzione tampone ma anche un fluido biologico complesso. Quando gli OECT vengono utilizzati come biosensori, il meccanismo di rilevamento si basa sulla variazione di corrente generata da reazioni specifiche con l'analita di interesse. Durante il mio dottorato di ricerca, mi sono concentrata sulla progettazione, fabbricazione e validazione di biosensori basati su OECT per il rilevamento di biomarcatori clinici, mostrando il loro alto potenziale come piattaforma di rilevamento. Abbiamo sviluppato sensori verso vari analiti, da molecole a proteine, usando diverse strategie per dotare il dispositivo di selettività verso gli analiti. In particolare, ho anche dimostrato la possibilità di integrare gli OECT nelle piante, come esempio di interfaccia con sistemi viventi. Nei primi due articoli, abbiamo sviluppato OECT stampati, che presentano PEDOT:PSS come semiconduttore sul canale. Nel primo caso, il dispositivo presenta anche un elettrodo di gate PEDOT:PSS che è stato ulteriormente funzionalizzato con gelatina biocompatibile e l'enzima ureasi per garantire la selettività verso l'urea. Il biosensore è stato in grado di monitorare diverse concentrazioni di urea con un limite di detection di 1µM. Nel secondo articolo l'elettrodo di gate di carbonio stampato è stato prima modificato con platino e succesivamente abbiamo assicurato la selettività verso l'acido urico, un biomarcatore rilevante per l'infezione, intrappolando l'urato ossidasi in una membrana a doppio strato ionico. Il biosensore ha mostrato un limite di rilevamento e selettività di 4,5 µM anche in essudato artificiale. Nel terzo articolo abbiamo progettato un biosensore per la detection di interleuchina-6 (IL6) in grado di rilevare i livelli di citochina in concentrazioni pM. Il meccanismo di rilevamento si basa sul legame specifico tra un aptamero, utilizzato come unità di rilevamento sull'elettrodo di gate, e l'IL6 in soluzione. Nel quarto articolo abbiamo presentato un sensore, basato sull'enzima glucosio ossidasi (GOx) per rilevare l'esportazione di glucosio da cloroplasti. Abbiamo dimostrato il monitoraggio di glucosio in tempo reale con una risoluzione di 1 minuto. Nel secondo articolo, abbiamo sviluppato sensori impiantabili per il monitoraggio in vivo e in tempo reale del trasporto di zuccheri nelle piante. I biosensori presentano un elettrodo di gate multienzimatico per conferire specificità per il glucosio e il saccarosio. In particolare, i dispositivi non hanno causato singificativi danni al tessuto, dimostrando che gli OECT possono rappresentatere soluzioni alternative per studiare processi fisiologici.
Inorganic materials have been the main players of the semiconductor industry for the past forty years. However, there has been a continuous growth in the research and in the application of organic semiconductors (OSCs) as active material in electronic devices, due to the possibility to process these materials at low temperature, on flexible substrates and fabricate them on large-area. Because of these features, organic electronic devices are rapidly emerging as biosensors, with a high potential for becoming a high-throughput tool for point-of-care. One of the most studied platform is the Organic Electrochemical Transistor (OECT). OECTs have been used as biosensors to transduce and amplify electrical signals or detect biological analytes upon proper functionalization with specific biorecognition units. OECTs can operate at low voltages, they are easy to fabricate on different substrates and compatible with the aqueous environment, therefore can be interfaced with living systems. The OECT device configuration includes a gate electrode that modulates the current in the channel through an electrolyte, which can be a buffered solution or a complex biological fluid. When OECTs are operated as biosensors, the sensing mechanism relies on the current variation generated from specific reactions with the analyte of interest. During my PhD, I focused on design, fabrication and validation of different OECT-based biosensors for the detection of biomarkers for healthcare applications, showing their high potential as sensing platform. We developed sensors towards different analytes, ranging from small molecules to proteins, with ad hoc strategies to endow the device with selectivity towards the species of interest. Most notably, I also demonstrated the possibility of integrating OECTs in plants, as an example of interfacing living systems. In the first two papers, we developed screen printed OECTs, presenting PEDOT:PSS as semiconducting material on the channel. In the first case, the device featured also a PEDOT:PSS gate electrode which was further functionalized with biocompatible gelatin and the enzyme urease to ensure selectivity toward urea. The biosensor was able to monitor increasing urea concentrations with a limit of detection of 1µM. In the second paper the screen-printed carbon gate electrode was first modified with platinum and then we ensured selectivity towards analyte uric acid, a relevant biomarker for wound infection, by entrapping urate oxidase in a dual-ionic-layer hydrogel membrane. The biosensor exhibited a 4.5µM limit of detection and selectivity even in artificial wound exudate. In the third paper we designed an interleukin-6 (IL6) OECT based biosensor able to detect cytokine levels down to the pM regime in PBS buffer. The mechanism of detection relies on the specific binding between an aptamer, used as sensing unit on the gate electrode, and the IL6 in solution, allowing for detection ranging from physiological to pathological levels. In the last two papers we developed OECT based biosensors to be interfaced with the plant world. In the fourth paper we presented a sensor functionalized with glucose oxidase (GOx) to detect glucose export from chloroplast. In particular, we demonstrated real-time glucose monitoring with temporal resolution of 1 minute. In the second paper, we developed implantable OECT-based sugar sensors for in vivo, real time monitoring of sugar transport in poplar trees. The biosensors presented a multienzyme-functionalized gate for specificity towards glucose and sucrose. Most notably, the OECT sensors did not cause a significant wound response in the plant, demonstrating that OECT-based sensors are attractive tools for studying transport kinetics in plants.

I sarcomi delle parti molli (SPM) sono tumori rari che spesso presentano problemi di diagnosi e di prognosi. Recentemente, lo sviluppo di tecniche “high throughput screening” ha consentito di avviare indagini globali del background molecolare del tumore del singolo paziente, fornendo dati per la selezione di biomarcatori con un significativo impatto clinico. L’individuazione di nuovi biomarcatori circolanti è fondamentale per la diagnosi precoce, per la stratificazione dei pazienti ad alto rischio e per il monitoraggio della progressione o della risposta alla terapia. Una nuova nanotecnologia assolutamente non invasiva è stata utilizzata in questo studio. Le ‘core-shell hydrogel nanoparticles’, infatti, escludendo le proteine del siero molto abbondanti possono legare e concentrare frammenti peptidici o proteine a basso peso molecolare, rilasciate dalle cellule tumorali e dai tessuti, presenti nel siero in così scarsa concentrazione da non essere rilevabili con le convenzionali tecniche immunologiche. La validazione delle proteine identificate è stata effettuata su un’altra serie di sieri da pazienti con sarcoma delle parti molli, mediante ELISA che ha mostrato livelli mediani di IGFBP7 significativamente più alti nei SPM quando paragonati ai controlli, fornendo un valore soglia di 25ng/ml per distinguere i pazienti oncologici dai non oncologici. Data l’evidenza che le molecole circolanti derivano da frammenti proteici presenti nel microambiente tumorale, l’analisi di IGFBP7 nei tessuti con IHC su un numero più ampio di campioni ha rilevato una maggiore intensità di colorazione nei tumori metastatici piuttosto che nei non metastatici con IGFBP7 come biomarcatore indipendente di cattiva prognosi. Infine l’analisi di espressione di 12 miRNA, correlati allo sviluppo e alla progressione dei tumori, con la validazione della sottoregolazione di miR-152 e la conseguente over-espressione dei suoi target MET e KIT, apre la strada a futuri studi di integrazione del profilo molecolare alla ricerca di potenziali specifici "bersagli" per future applicazioni clinico-terapeutiche sempre più personalizzate.
Soft Tissue Sarcomas (STS) are rare tumors with troubles in diagnosis and prognosis. Recently, development of "high throughput screening" techniques has allowed to carry out investigations about molecular background of the individual patient's tumor, providing data for selection of biomarkers with significant clinical impact. The identification of new circulating biomarkers is crucial for early diagnosis, for stratification of high-risk patients and for monitoring the progression or response to therapy. A new totally non-invasive nanotechnology has been used in this study. The ‘core-shell hydrogel nanoparticles’, in fact, excluding very abundant serum proteins can bind and concentrate peptide fragments or low molecular weight proteins, released by tumor cells and tissues, present in serum in so poor concentration as not to be detectable with the conventional immunological techniques. The validation of these identified proteins was carried out on another set of sera from patients with Soft Tissue Sarcomas by ELISA, that showed median IGFBP7 level significantly higher in STS when compared to controls, providing a threshold value of 25ng/ml to distinguish tumor from non-tumor patients. Since circulating molecules derived from protein fragments that are in tumor microenvironment, tissue analysis of IGFBP7 with IHC on a larger number of samples has detected a higher intensity of staining in metastatic rather than in non-metastatic tumors, with IGFBP7 as an independent biomarker of poor prognosis. Finally, expression analysis of 12 miRNA, involved in tumor development and progression, with validation of miR-152 downregulation and subsequent overexpression of its targets MET and KIT, opens the way for future integration of molecular profile studies looking for specific potential "targets" for future clinical-therapeutic personalized applications.

Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di valutare l esistenza di una diversa espressione tissutale e periferica di metalloproteasi MMP9, TIMP1 (la sua proteina inibitoria) e Osteopontina, quali possibili biomarcatori di progressione tumorale, in donne con patologie benigne dell endometrio, con carcinoma dello stesso, e di un gruppo di donne come controllo. Abbiamo reclutato per il nostro studio 31 pazienti che si erano sottoposte ad un esame isteroscopico o per sanguinamenti anomali, o per un ispessimento endometriale evidenziato durante un ecografia ginecologica. Lo stesso giorno in cui alle pazienti veniva eseguita l isteroscopia della cavità uterina, sono stati prelevati circa 10 ml di sangue venoso periferico, suddivisi in due provette: 2-3 ml per la raccolta del siero e 6-7 ml per la raccolta del plasma, con aggiunta di Na++ eparina. Le provette sono state quindi inviate, entro 30 minuti, per la loro centrifugazione ed i campioni di plasma e siero aliquotati, sono stati conservati a -80°C, fino al momento del saggio. Successivamente sono stati eseguiti i dosaggi in ELISA su siero o plasma delle tre proteine da noi considerate, con Kits disponibili commercialmente secondo la metodica indicata dal produttore (R e D System). In corso di isteroscopia, sono state praticate delle biopsie della cavità uterina o dei polipi endometriali. Un piccolo frammento tissutale veniva raccolto in Rna Later, e conservato ad una temperatura di -80°C fino alle indagini di biologia molecolare (estrazione dell RNA ed Immunoistochimica - Elisa); il restante materiale è stato inviato per effettuare l esame istologico. In accordo ai dati della letteratura, i valori medi sierici dei tre parametri da noi considerati, nonchè quelli ricavati dalle biopsie della cavità uterina di donne con carcinoma, sono significativamente più elevati rispetto a quelli di donne con patologie benigne dell endometrio ed ancora di più rispetto ai controlli. La MMP-9 e il suo inibitore TIMP-1, hanno mostrato lo stesso andamento di OPN anche se i valori di TIMP-1 circolante, in accordo con i dati riferiti in letteratura hanno mostrato una maggiore correlazione rispetto alla MMP-9.

Background: Malignant pleural mesothelioma (MPM) is an aggressive asbestosrelated cancer that develops via mesothelial cell transformation. At present there are no effective therapies for MPM. Great efforts have been made in finding specific markers/mechanisms for MPM onset, including studies into microRNAs and adenosine receptors (ARs). Recent studies have shown the differential expression of mature microRNAs in several human cancers, suggesting their potential role as oncogenes or tumor suppressor genes, and the involvement of ARs in the regulation of cell death and proliferation. Methods: In this study, we investigated miRNAs profile and the expression of A3ARs in MPM. MiRNAs profile was investigated in 5 HMCs (human normal pleural mesothelial short term cell cultures) and 5 MPMs, with microarray approach. These results were confirmed by Real Time quantitative RT-PCR and western blotting. ARs were analyzed by using RT-PCR, western blotting and saturation binding assays. HMC were treated with crocidolite asbestos which is the principal risk factor of MM. The role of A3ARs on these cellular models, evaluating cAMP production, Akt phosphorylation and NF-kB activation was investigated. The dual effect of A3AR stimulation on healthy and cancer cell growth was studied by means of proliferation, apoptosis and cytotoxicity assays. Results: A comparative analysis of miRNA expression in MPM and HMCs was carried out. Microarray profiling showed different miRNA expression between MPM and HMCs. Specifically, 13 miRNAs (17-5p, 18a, 19b, 20a, 20b, 25, 92, 106a, 106b), members of the oncomiRNA miR 17-92 and its paralogs were markedly dysregulated. Besides, in our investigation, additional miRNAs, such as miR-7, miR-182, miR-214 and miR-497 were found to be dysregulated in MPM. A3AR was up-regulated by 2.5 fold (P<0.01) in MMP when compared with HMP. Stimulation of A3ARs decreases proliferation and exerts cytotoxic and proapoptotic effect on MMC and on HMC exposed to asbestos and TNF-�, but not in HMC with an involvement of the de-regulation of Akt/NF-kB cell survival pathway. Conclusion: These data are in agreement with results which have previously been reported on dysregulated miRNAs for other solid human tumors. Moreover, in our investigation, additional miRNAs were found to be dysregulated in MPM. Interestingly, gene products which regulate the cell cycle are targets and predicted targets for these miRNAs. Our data suggest that specific miRNAs and A3ARs could be key players in MPM development/progression. In addition, some of these miRNAs may represent MPM markers and potential targets for new therapeutic approaches. Besides, our data suggest that A3AR could represent a pharmacological target to prevent tumor development after asbestos exposure and to treat full blown MPM.

Introduction. The role of psychosocial aspects in the onset of the cardiovascular disease is known but, it is not clear which features are more associated with cardiovascular risk and if they can improve the predictive capability of the classic models based on age, sex, smoking, diabetes, blood pressure and cholesterol. The study of the association among the risk of an event and the people's characteristics is, generally, conducted using two approaches: i) stochastic data modeling, ii) algorithmic modeling. In the field of epidemiology, we have always preferred the first approach because the results are interpretable by the probabilistic point of view, however, it is based on parametric assumptions that often fail to identify factors or interaction between important factors. The second approach, based on statistical learning techniques (Random Forest) is promising in terms of selection of the variables and identification of possible interactions between them. Objective. To identify items of psychosocial scale most involved in the prediction of major cardiovascular events and to evaluate the association between events and the selected items, by integrating, where possible, the information with biomarkers data. Methods. The analysis for the selection of items by using the techniques of statistical learning was conducted on 6567 individuals belonging to the cohorts MONICA-Brianza and PAMELA, aged 25-64 years who, during a median follow-up of 15 years, have experienced 527 events. The technique of random forests has been used during the selection of the items psychosocial. Since one of the main problems of random forests is the difficulty of grasping signals in the presence of strongly unbalanced data, we analyzed a dataset in which each event is paired with a non-event of the same sex, age (± 5 years) and under observation at the onset of the event. We identified the number and type of item most associated with the event of interest and we use them in a Cox proportional hazards model aimed at both the risk assessment and the evaluation of their contribution. The additional contribution of the psychosocial item was measured in terms of increase in the index of discrimination (c-index). Results. The analysis with random forests highlighted as potential predictors of cardiovascular risk 2 item related to Jenkins sleep questionnaire, 4 items related to the Jenkins Activity Survey, and two items related to the Job Content Questionnaire. These items lead to 1.3% increase in AUC when inserted into a model with age, sex, and major risk factors. Conclusions. The results suggest that the measurement of some psychosocial aspects is important in predicting the risk of cardiovascular event. The mixed strategy used to develop the risk model (algorithmic in the variable selection and the stochastic one for the estimation of the risk) is able to make the most of the features of the two approaches: less constrained to distributional assumptions and linearity of the first, the most suitable to provide an estimate interpretable in terms of the risk the second one.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è uno dei tumori più comuni al mondo e, nonostante i recenti progressi nella sua gestione, è ancora gravato da un'elevata mortalità. La previsione della prognosi nei pazienti con HCC è molto complessa e devono essere considerate diverse variabili (tra cui il carico tumorale, la funzionalità epatica residua e le condizioni cliniche). Allo scopo di stratificare accuratamente la prognosi del paziente, è inoltre necessario identificare biomarcatori circolanti affidabili. Infatti, l'alfa-fetoproteina (AFP), nonostante sia comunemente usata nell'HCC, non è completamente soddisfacente come marcatore prognostico. L'obiettivo primario di questa tesi è stato quello di valutare alcune molecole coinvolte nello sviluppo e nella progressione dell'HCC, come potenziali biomarcatori prognostici circolanti. In particolare, sono state studiate serpine (squamous cell carcinoma antigen [SCCA]-IgM), molecole di angiogenesi (hypoxia-inducible factor [HIF]-1 and vascular endothelial growth factor [VEGF]), microRNA (miR-21 e miR-122), prostaglandine (prostaglandina E2) e score infiammatori (platelets-to-lymphocytes ratio [PLR] and neutrophils-to-lymphocytes ratio [NLR]). Nella seconda parte della tesi sono stati indagati la sorveglianza, lo stadio tumorale e il trattamento, aspetti clinici essenziali da considerare per il miglioramento della sopravvivenza del paziente. I risultati ottenuti dimostrano che le molecole valutate sono potenzialmente utili nella stratificazione della prognosi del paziente e meritano una validazione in ampi studi prospettici. Inoltre, i risultati di questa tesi confermano l'importanza centrale della sorveglianza, forniscono il razionale per un'appropriata stadiazione e trattamento di grandi tumori monofocali, mostrano i cambiamenti nel tempo dell’uso e dell’efficacia della chemioembolizzazione transarteriosa, e dimostrano l’efficacia e la sicurezza della capecitabina nel trattamento dell'HCC. In quest’era della medicina personalizzata e di precisione, lo sviluppo di biomarcatori prognostici e predittivi, potenzialmente utili anche nel guidare il trattamento, e un'attenta gestione clinica sono fondamentali per migliorare la sopravvivenza del paziente.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers worldwide and, despite recent advances in its management, it is still burdened with high mortality. Prognostic prediction in HCC is very complex and several variables (among which tumor burden, residual liver function and clinical conditions) must be considered. With the aim of accurately stratify patient prognosis, reliable circulating biomarkers are urgently needed. Indeed, alpha-fetoprotein (AFP), despite being commonly used in HCC, is not completely satisfactory in prognostic prediction. The primary aim of this thesis was to evaluate as potential circulating prognostic biomarkers some molecules involved in HCC development and progression. In particular, serpins (squamous cell carcinoma antigen [SCCA]-IgM), angiogenesis molecules (hypoxia-inducible factor [HIF]-1 and vascular endothelial growth factor [VEGF]), microRNAs (miR-21 and miR-122), prostaglandins (prostaglandin E2) and inflammatory-based scores (platelets-to-lymphocytes ratio [PLR] and neutrophils-to-lymphocytes ratio [NLR]) were investigated. In the second part of the thesis, surveillance, cancer stage and treatment, which are essential clinical aspects to be considered for improving patient survival, were investigated. The results obtained demonstrate that the biomarkers evaluated are potentially useful in stratifying patient prognosis and deserve a validation in large prospective studies. Moreover, the results of this thesis confirm the central importance of surveillance, provide the rationale for appropriate staging and treatment of large monofocal tumors, show the changes over time of transarterial chemoembolization application and effectiveness, and demonstrate the efficacy and safety of capecitabine in the treatment of HCC. In this personalized and precision medicine era, the development of prognostic and predictive biomarkers, possibly useful also in guiding treatment, and a careful clinical management are fundamental to improve patient survival.

Starting from the consideration that the diagnosis of Parkinson's disease is an exquisitely clinical diagnosis, based on precise criteria of presentation and evolution of the symptoms, sometimes supported by the detection of genetic alterations that involve in a greater susceptibility to the disease but in the absence of a clear test that have the characteristics of sensitivity and specificity; the identification of biomarkers that can improve the accuracy of clinical diagnosis or help in identifying elements suggestive of prognosis and disease progression seems to be a very interesting research topic. In this regard, the perspectives offered by metabolomics are still poorly explored, since only part of informations existing in the metabolome is currently used to obtain significant data in relation to this specific neurodegenerative condition. On these assumptions, the object of this work was to explore the possibilities of use of metabolomics as a technique to research biomarkers in Parkinson's disease with the hope that the data that can be highlighted by this study may have a significant impact on clinical practice by the knowledge of the biochemical data intrinsic to this pathological condition, with the possible identification of new highly specific biomarkers for this disabling disorder of Movement.

Introduzione La sfida nella prevenzione del cancro cervicale è ridurre diagnosi e trattamenti non necessari che possono aumentare con l'introduzione del test HPV. Sono necessari test di triage per ridurre l'invio di colposcopia di donne positive al test HPV-DNA e strategie di follow-up appropriate per le donne che hanno ricevuto un trattamento per una neoplasia intraepiteliale cervicale di alto grado (CIN2 o CIN3). Obiettivi Il primo obiettivo del progetto di ricerca di dottorato è valutare l'accuratezza dei biomarcatori (mRNA di E6/E7 virali e p16/Ki67) come test di triage nei protocolli di screening basati sul test HPV-DNA. In secondo luogo, ha l’obiettivo di valutare il valore prognostico dei biomarcatori per l'identificazione di lesioni regressive. Terzo obiettivo è aggiornare linee guida nazionali per il follow-up delle donne trattate per CIN2 o CIN3 con raccomandazioni evidence-based. Metodi Presso l'Unità di Epidemiologia dell'AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, abbiamo coordinato la raccolta dati dei centri reclutatori dello studio New Technologies in Cervical Cancer 2 (NTCC2). NTCC2 mirava a misurare l'accuratezza e il valore predittivo negativo per lesioni cervicali CIN2 o più gravi (CIN2 +) di mRNA e p16/ki67 reclutando donne invitate a programmi organizzati di screening con HPV-DNA (età 25 -59). Per il terzo obiettivo, come membri del Gruppo Italiano per lo Screening del Cancro Cervicale (GISCi) abbiamo guidato l'Evidence Review Team coinvolto nel processo di sviluppo delle linee guida multi-societarie a livello nazionale, coordinando le revisioni sistematiche e il processo Evidence-to-Decision (EtD) (secondo la metodologia GRADE). Risultati L'NTCC2 ha reclutato 40.509 donne di cui 3147 (7,8%) positive all'HVP-DNA sono state incluse nell'analisi finale. Nei primi 24 mesi dal reclutamento sono stati trovate 174 CIN2 + (di cui 95 CIN3 e 1 adenocarcinoma in situ). Per l'accuratezza cross-sectional, la sensibilità aggiustata per CIN2 + è stata del 61,0% (IC95% 53,6-68,0), 94,4% (IC95% 89,1-97,3) e 75,2% (IC95% 68,1-81,6) per citologia, mRNA, e p16 rispettivamente. L’invio in colposcopia complessivo è stato rispettivamente del 65,3%, 78,6% e 63,7%. Il valore predittivo positivo (PPV) era del 9,5% per citologia, dell'8,3% per mRNA e del 10,1% per p16. Per il valore prognostico per regressione delle lesioni CIN2 + e per clearance del HPV-DNA, in NTCC2 la regressione era quasi nulla nelle donne positive ai biomarcatori, mentre nei biomarcatori negativi era del -76% (IC 95% da -97% a più del 100%) e -39% (IC95% da -72% a 33%) per mRNA e p16, rispettivamente], però con test di interazione non significativo in entrambi i casi. Inoltre, tra le donne HPV DNA+/citologia -, la clearance del HPV-DNA a 12 mesi nelle donne mRNA- era 1,9 volte (95% CI 1,7, 2,2) rispetto alle mRNA + e 1,9 volte (IC95% CI 1.5, 2.5) nelle donne p16/ki67- rispetto alle p16+. Infine, abbiamo pubblicato la prima raccomandazione sulla vaccinazione HPV delle donne trattate per CIN2/CIN3 nel repository del Sistema Nazionale Line Guida (SNLG) e completato il processo di adolopment di sei raccomandazioni votate da un precedente panel. Inoltre, abbiamo completato la sintesi delle evidenze e il processo EtD per le restanti domande cliniche sulla gestione delle donne in base ai risultati dei test di follow-up post-trattamento. Tali raccomandazioni sono in fase di revisione da parte del SNLG per la pubblicazione. Conclusioni Il presente progetto di ricerca di dottorato ha fornito nuove evidenze sull'uso dei biomarcatori nello screening del cancro cervicale, identificando p16/ki67 come il test di triage più promettente. Inoltre, ha supportato lo sviluppo di raccomandazioni nazionali aggiornando le linee guida esistenti sul follow-up delle donne trattate per CIN2 o CIN3.
Background The new challenge in cervical cancer prevention is the reduction of unnecessary diagnosis and treatment. These phenomena may increase with the introduction of the HPV test. We need triage tests to reduce colposcopy referral of HPV-DNA positive women, and we need appropriate follow up strategies for women who had a colposcopy and received treatment for a high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2 or CIN3). Objectives In the present Ph.D. research project, we aimed, firstly, to assess the accuracy of biomarkers (HPV E6/E7 mRNA and p16/Ki67) as test of triage in HPV-DNA based screening protocols. Secondly, we aimed to assess the prognostic value of these biomarkers for the identification of regressive lesions. Finally, we updated national guidelines for the follow up of women treated for CIN2 or CIN3 with evidence-based recommendations. Methods At the Epidemiology unit of AUSL-IRCCS of Reggio Emilia, we coordinated the data collection by all centres of the New Technologies in Cervical Cancer 2 (NTCC2) trial. NTCC2 aimed to measure the accuracy of mRNA and p16/Ki67 and their negative predictive value for CIN2 or more severe lesions (CIN2+) recruiting women who were invited for a new screening round based on HPV-DNA test within the screening programs (i.e. aged 25-59). Regarding the third objective, as member of the Italian Group for Cervical Cancer Screening (GISCi) we lead the Evidence Review Team involved in the multi-societal guidelines development process at a national level. We coordinated the systematic reviews and the Evidence-to-Decision (EtD) process (according to GRADE methodology). Results The NTCC2 recruited 40,509 women of which 3147 (7.8%) HVP-DNA positive were included in the baseline analysis. Cumulatively, 174 CIN2+ (including 95 CIN3 and 1 Adenocarcinoma in situ) were found within 24 months since recruitment. As for cross-sectional accuracy, adjusted sensitivity for CIN2+ was 61.0% (95%CI 53.6-68.0), 94.4% (95%CI 89.1-97.3), and 75.2% (95%CI 68.1-81.6) for cytology, mRNA, and p16/ki67 respectively. The overall referral was 65.3%, 78.6%, and 63.7%, respectively. The Positive Predictive Value (PPV) was 9.5% for cytology, 8.3% for mRNA, and 10.1% for p16/ki67. As for prognostic value for regression of CIN2+ lesions and clearance of HPV DNA, in NTCC2 data regression was almost null in biomarker-positive women at baseline, while in biomarker-negatives was [-76% (95%CI from -97% to more than 100%) and -39% (95%CI from -72% to 33%) for E6/E7 mRNA and p16/ki67, respectively]. However, the test for interaction was not statistically significant in either case. Moreover, among HPV DNA+ /cytology- women, the clearance of HPV DNA after 12 months in mRNA-negative women was 1.9 times (95% CI 1.7, 2.2) that in mRNA+ women and clearance in p16/ki67- women was 1.9 times (95% CI 1.5, 2.5) that in p16/ki67+ women. Finally, we published the first recommendation on the HPV vaccination of women treated for CIN2 or CIN3 in the National Institute of Health (SNLG) repository. We completed the adoloptment process of six recommendations voted by a previous panel on the choice of follow up tests, number of episodes, and intervals. Finally, we completed the evidence synthesis and EtD process for the remaining clinical questions on the management of women according to the results of after-treatment follow up tests. Adopted and new recommendations are currently under review by the SNLG assessment team for publication. Conclusions The present Ph.D. research project provided new evidence on the use of biomarkers in cervical cancer screening, identifying p16/ki67 as the most promising triage test. Moreover, we supported national recommendations development updating existing guidelines on the follow up of women treated for CIN2 or CIN3.

Abstract Background: Frontotemporal Lobar Degeneration FTLD is a progressive neurodegenerative syndrome, clinically and pathologically heterogeneus. FTLD includes a behavioural variant (bvFTD) and three linguistic variants (non fluent/agrammatic, semantic and logopenic variant) of primary progressive aphasia (PPA). In 2011 a Consensus Conference established new guidelines to the variants, using neuroimaging (PET/RM), neuropsychological profiles and biomarker/pathologic characteristic. Method: In our study we analyzed neuropsychology, neuroimaging and biomarkers profiles of 28 PPA patients from our centre. Aim of the study is to value the impact of new criteria for PPA in neuropsychological testing and to correlate it with neuroimaging and pathological examination. In particular, for the language examination we assessed naming, agrammatism, apraxia of speech, comprehension and ripetition, writing and reading abilities. Statistical analysis include Pearson correlation and t-test. Results: we find correlation of ripetition deficit in subject with parietal atrophy/hypometabolism; agrammatism and apraxia of speech prevalent in frontal atrophy/hypometabolism patients; naming deficit in left-temporal atrophy/hypometabolism patient with an AD pathology revealed with biomarker analysis. Conclusions: Gorno-Tempini criteria for PPA are a good instrument to classify PPA patient, creating three different and defined profiles about neuropsychological, neuroimaging and pathology aspects.

Ottenere dati affidabili sul consumo di cibo (in termini di assunzione di energia e nutrienti) è fondamentale per la promozione della salute e per la prevenzione di malattie non trasmissibili. Metodi soggettivi e retrospettivi, quali i questionari e i diari alimentari, impongono di ricordare, descrivere e quantificare con precisione l'assunzione di cibi e bevande. Recentemente è stato messo in luce il potenziale intrinseco dei biomarcatori associati all'assunzione alimentare, acquisiti mediante approcci metabolomici, per validare studi di epidemiologia nutrizionale. Nella presente tesi sono descritti alcuni strumenti innovativi di analisi dei dati, che sono stati applicati a quelli generati dal progetto CHANCE, e inseriti in algoritmi sviluppati ad hoc per la loro validazione automatica. Le informazioni raccolte, mediante diari H24R, su abitudini alimentari nell’ambito del suddetto progetto europeo sono state verificate applicando l’approccio metabolomico, basato su biomarcatori di consumo, noti in letteratura e identificati negli spettri NMR di urine raccolte sulla stessa coorte di soggetti, che sono stati oggetto di studio. I risultati mettono in luce la complessità delle relazioni esistenti tra alimenti e molecole associate al loro consumo, e, soprattutto, offrono uno strumento per assegnare a ciascun soggetto un indice di attendibilità del diario rilasciato. Dallo studio emerge anche che non tutti i biomarcatori sono equivalenti nella precisione con cui riportano il livello di assunzione del cibo corrispondente. Questo doppio errore, cioè quello determinato dalla stima errata del cibo assunto da parte del consumatore, e quello della reale quantità assimilata e metabolizzata delle molecole assunte mediante l’alimento, merita la dovuta attenzione nella decisione di utilizzare l’indice di affidabilità dei report individuali. Lo studio, comunque, rappresenta il preambolo necessario ad attivare ulteriori studi che costituiranno il seguito a questa tesi.

Detection of circulating microRNA-based biomarkers represent an innovative, non-invasive, method for early detection of cancer. However, low concentration of miRNAs released in blood, especially in the early-stage disease, and difficult localization of the tumor site limited their clinical use as effective cancer biomarkers. The amplification of circulating cancer biomarkers mediated by ultrasound can potentially overcome these issues, thus advancing the use miRNA-base biomarkers in clinical setting. This work investigated the potential of an innovative ultrasound-based prototype to improve the release of miRNAs in the extracellular fluids, with the aim of identifying novel miRNA-based biomarkers to be used for prostate cancer diagnosis, as well as for monitoring disease evolution. We provided evidence that US-mediated sonoporation amplify the release of miRNAs from both androgen-dependent and – independent PCa cells, allowing the detection of novel miRNA with potential predictive and prognostic value. Moreover, we showed that ultrasound treatment improves drug delivery opening the route to new possible therapeutic applications. KEYWORDS: miRNAs, Biomarkers, Prostate Cancer, Ultrasounds.

La sorveglianza sanitaria sui lavoratori a rischio è finalizzata alla formulazione di un giudizio di idoneità specifico per la mansione svolta, attraverso un procedimento che comprenda l’esame clinico effettuato in fase di avviamento al lavoro, nonché accertamenti sanitari preventivi richiesti in base alla valutazione dei rischi. Per tale motivo, la validazione di biomarcatori come rilevatori precoci della patologia potrebbe migliorare la valutazione del rischio per la salute e contribuire a politiche efficaci per la prevenzione di malattie causate da esposizioni ambientali e/o professionali. Il Mesotelioma Maligno della Pleura (MPM) è un tumore strettamente legato all’esposizione professionale all’asbesto. Migliorare le tecniche per la diagnosi è essenziale per una diagnosi precoce e per il trattamento terapeutico, per cui esiste la reale necessità di identificare marcatori tumorali che possano essere utilizzati per una diagnosi non invasiva del MPM. Livelli anomali di microRNAs (miRNA) sono stati ritrovati in molti tipi di cancro. La loro de-regolazione è associabile a diversi tipi di tumori, quindi il profilo di espressione dei miRNA può identificare una neoplasia. L’obiettivo di questo studio è investigare le potenzialità dei miRNA come biomarcatori di esposizione,diagnosi precoce e prognosi. A questo scopo, è stato analizzato il profilo di espressione di 88 miRNA coinvolti nel cancro estratti da biopsie di tessuto fresco. I campioni di MPM e quelli di controllo sono stati analizzati tramite qRT-PCR che ha rilevato una marcata differenza nel profilo di espressione dei miRNA tra tessuto patologico e sano. La maggior parte dei miRNA sono risultati sottoespressi ed in particolare 8 miRNA sottoregolati sono risultati statisticamente significativi. La loro de-regolazione risulta più evidente nel tumore allo stadio avanzato. Tre fra i miRNA significativi (miRNA-335, miRNA-126 emiRNA-32) sono stati confermati in un numero maggiore di campioni paraffinati; solo il miRNA-126 ha mantenuto una de-regolazione significativa e la capacità di discriminare il tessuto normale dal patologico e la stadiazione del tumore. La performance del miRNA-126 come biomarker è stata valutata anche in campioni di siero di soggetti ex-esposti all’amianto e soggetti con MPM e comparata con soggetti di controllo. Il miRNA-126 discrimina significativamente soggetti ex-esposti e soggetti affetti da MPM dai controlli. Pertanto in questo lavoro è stato identificato uno specifico profilo di espressione dei miRNA per il MPM ed è stato proposto il miRNA-126 come potenziale biomarker di esposizione e di diagnosi precoce del MPM.
The monitoring of the health of workers at risk is aimed at formulating a fitness certificate specific to their occupational task. Clinical examination is first performed in start-up and then subsequent periodic medical examinations are carry out according to risk. Therefore, the use of biomarkers that could determine the early stages of the disease may improve the assessment of risk to health and contribute to effective policies for preventing diseases caused by environmental and occupational exposures. Malignat pleural Mesothelioma (MPM) is well known to be linked to asbestos exposure at the workplace. Improved detection methods for diagnosis of this type of neoplastic disease are essential for an early and reliable detection and treatment. Thus, focus has been on finding tumour markers used for non-invasive detection of MPM. There is emerging evidence of abnormal levels of microRNAs (miRNAs) in tumours. While some miRNAs commonly exhibit altered amounts across tumours, often, different tumour types produce unique patterns of miRNAs, related to their tissue of origin. In this study, miRNA isolated from MM fresh-frozen biopsies was profiled for the expression of 88 miRNAs involved in cancer. MPM samples and normal tissues were analysed by quantitative reverse transcription-PCR miRNA array. A marked difference in miRNA expression pattern was observed between normal tissue and tumours. Most of miRNA were down-regulated in tumours, and among them 8 miRNA were significantly under expressed. Their down-regulation was more evident in advanced tumours. Three of these miRNAs (miRNA-335, miRNA-126, miRNA-32) were validated in the larger sample series, and only miR-126 showed significant differential expression, distinguish MPM samples from normal tissues and tumour staging. Furthermore, the performance of the miRNA-126 as biomarkers was evaluated in serum samples of asbestos-exposed subjects, MPM patients and compared with age-matched healthy subjects. The miRNA-126 significantly distinguish asbestos-exposed subjects and MPM patients from age-matched controls. We first identify a specific miRNA profile for MPM and we propose miRNA-126 as potential biomarker of exposure and for early diagnosis and prognosis of MPM.

Nivolumab rappresenta attualmente uno standard per il trattamento di seconda linea del carcinoma renale metastatico (mRCC). E’ un anticorpo monoclonale IgG4 diretto contro programmed death-1 (PD-1) ed agisce inibendo il legame tra PD-1 e il suo ligando. Nella maggior parte dei pazienti, il farmaco ripristina la risposta immunitaria antitumorale T-mediata, migliorando la sopravvivenza e il tasso di rispsote obiettive. Tuttavia, in un certo numero di pazienti non si osserva una risposta al trattamento, motivando la crescente necessità di predire e incrementare il numero di pazienti responsive al trattamento con inibitori dei checkpoint immunitari. Il sistema immunitario rappresenta quindi un mediatore dell’attività del farmaco, suggerendo che l’equilibrio tra agenti regolatori positivi e negativi del sistema immunitario possono avere un ruolo chiave nell’efficacia terapeutica. Oggetto di attenzione sono fattori solubili coinvolti nel reclutamento e nella regolazione delle cellule T effettrici, i sottotipi di cellule T regolatorie e il rapporto tra cellule T effetrici e regolatorie. L’obiettivo principale del progetto è identificare biomarcatori sierici e immunitari in pazienti affetti da mRCC e trattati con Nivolumab per predire quali pazienti possono beneficiare del trattamento. E’ uno studio prospettico, longitdinale, su pazienti affetti da mRCC trattati con Nivolumab nella normale pratica clinica. Lo studio indaga le variazioni nei principali parametri immunitari nella popolazione in esame, attraverso l’analisi di prelievi ematici al basale e a distanza di 1, 2, 3, 6 ed eventualmente 12 mesi. Vengono prelevati 30 mL di sangue periferico da cui sono estratte le cellule perferiche mononucleate. Le cellule vengono conservate in azoto liquido. Vengono testati i seguenti anticorpi: CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, FoxP3, ICOS, CXCXR6, CXCR3, CD95, CD45RA, CCR7, CD95, HLA-DR, CD38, CD28, CD27, CD71, CD87, CD39, TIM3, TIGIT, CCR4, Glycoforin, PD-1/IgG4, CD57, KI-67. Questa citometria a flusso multicolor viene analizzata in collaborazione con il Dr. Lugli (Humanitas Milano). I campioni vengono ottenuti attraverso un citometro a flusso BD Symphony. Per l’analisi dei dati viene utilizzato FlowJo 9.6 per MacOSX. Da gennaio 2016 a ottobre 2018 sono stati arruolati 21 pazienti. L’età media è di 60 anni (33-79). La maggiro parte dei pazienti ha un’istologia a cellule chiare (90%). Il Nivolumab è stato somministrato come terapia di seconda linea nel 59% dei casi e di terza linea nel 27% dei casi. Secondo International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium Score (IMDC score) il 72% ha un rischio prognostico intermedio e il 14% ha un rischio prognostico sfavorevole. Con un follow up mediano di 14 mesi (min 2 max 31), il tasso di sopravvivenza a 6 e 12 mesi è rispettivamente del 74% (95%CI 48-88) e del 47% (95%CI 22-68). La mediana di sopravvivenza libera da progressione è di 4.2 mesi (95%CI 3-10). Un controllo di malattia è stato registrato in 8 pazienti (40%) definiti responder (R). Al momento dell’analisi il trattamento era in corso di 4 pazienti. Dati preliminari mostrano che KI67, marker di proliferazione, aumenta dopo 15 giorni di trattamento. Coerentemente anche HLA-DR e CD38 sono aumentati. La riattivazione del sistema immunitario è l’obiettivo del trattamento con Nivolumab. Auspichiamo di individuare marker facilmente misurabili predittivi di risposta al trattamento. Un follow up più lungo sarà necesario per confermare i dati preliminari.
Nivolumab represents the new second-line treatment for metastatic renal cell carcinoma (mRCC). This drug is a fully human IgG4 against PD-1 and his role is to inhibits programmed death-1 (PD-1)/PD-1 ligand 1 (PD-L1) immune checkpoint. In the majority of patients, this drug is able to restore the patient’s tumour-specific T-cell-mediated response thus improving both overall survival and objective response rate. However, a lack of clinical response occurs in a number of patients, raising questions about how to predict and increase the number of patients who receive long-term clinical benefit from immune checkpoint therapy. The requirement for the immune system as a mediator of the drug's activity suggests that the balance of positive and negative regulators of the immune response at the time of therapy may be critical for therapy efficacy. Of particular interest are soluble factors involved in the recruitment and regulation of effector T cells, the frequency of different subsets of regulatory T cells and the ratio between effector T cells and regulatory T cells. The main aim of this project is to identify immune and serum biomarkers that are modulated in patients with metastatic renal cell carcinoma during and treated with immune checkpoint inhibitors and that can discriminate patients who most likely benefit from such therapy. This is a prospective, longitudinal, study on patients with mRCC who will receive Nivolumab in standard clinical practice. The project investigates changes in main immune parameters in patients with mRCC treated with nivolumab by analysing blood samples at baseline and after 1, 2, 3, 6 and eventually 12 months. Thirty mL of blood were collected and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated according to standard procedures. PBMC were stored in liquid nitrogen. Then, PBMC were thawed according to standard procedures and stained with a viability probe and the following antibodies recognizing: CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, FoxP3, ICOS, CXCXR6, CXCR3, CD95, CD45RA, CCR7, CD95, HLA-DR, CD38, CD28, CD27, CD71, CD87, CD39, TIM3, TIGIT, CCR4, Glycoforin, PD-1/IgG4, CD57, KI-67. This 28-color multicolour flow cytometry panel was set up in collaboration with Dr. Lugli (Humanitas, Milan). Samples were acquired by using a BD Symphony flow cytometer. Compensation was set using single stained controls and gating strategy was checked by using FMO. Data analysis was performed using FlowJo 9.6 under Mac OSX. From January 2016 until October 2018 we enrolled 21 patients. The median age was 60 years (33-79). The majority of patients had clear cell histology (90%). Nivolumab was given as second-line therapy in 57% of patients, as third line therapy in 29% of cases. According with International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium Score (IMDC score) 72% of patients were in the intermediate prognostic risk group and 14% in poor risk. With a median follow-up of 14 months (min: 2 max: 31), 6-months and 12-months survival rate were 74% (95%CI 48-88) and 47% (95%CI 22-68), respectively. Median progression-free survival (PFS) was 4.2 months (95% 3-10). Disease control was achieved in 8 patients (40%), defined responder (R). At time of analysis treatment was ongoing in 4 patients. Preliminary data on PBMC show that Ki-67, a marker of cell proliferation, is increased after 15 days of therapy in some patients. Accordingly, the expression of HLA-DR and CD38 are increased. Reactivation of the immune system is one of the main goals of nivolumab. We expect to identify easily measurable immune biomarkers that predict the responsiveness to nivolumab. Finding novel biomarkers that predict the response to therapy with nivolumab and monitor its efficacy can be of great benefit for the success of treatment. Longer follow up is required to assess preliminary immunological data.

Un gruppo internazionale di clinici, esperti in disturbi progressivi del linguaggio, si riunì per tre volte tra il 2006 ed il 2009, con lo scopo di creare un classificazione definitiva delle PPA e delle sue tre varianti, utilizzando come punto di partenza i criteri esistenti in letteratura (Tabella 1 - Mesulam, 2003) ma integrandoli alla luce delle informazioni fornite dalle strumentazioni più recenti (neuroimaging, dosaggio liquorale). Le linee guida cosi delineate prevedono che, affinché la diagnosi di PPA sia verosimile, l'insorgenza del disturbo linguistico deve apparire insidiosa e dall'andamento ingravescente; l'afasia deve essere evidente sia nel linguaggio spontaneo che in seguito ad una valutazione neuropsicologica e deve rappresentare, almeno nella fase iniziale, il sintomo d’esordio, nonché il segno clinico più evidente. L'autonomia nelle attività di base ed in quelle strumentali della vita quotidiana deve essere preservata, ad eccezione di quelle attività strettamente correlate all'utilizzo del linguaggio. Tutte le altre funzioni cognitive dovrebbero risultare coinvolte solo successivamente, ma l'afasia rappresenterà comunque il deficit cognitivo più evidente per tutta la durata della malattia. I principali criteri di esclusione includono un disturbo mnesico o visuo-spaziale nelle fasi iniziali della malattia, marcati disturbi comportamentali e la presenza di lesioni focali (ictus, tumori). La recente classificazione della PPA proposta da Gorno-Tempini in tre differenti varianti: non-fluente (NFPA), semantica (SVPA) e logopenica (LPA) (Gorno-Tempini et al., 2011), richiede un processo diagnostico complesso, che si articola su tre livelli differenti: l’assessment neuropsicologico, il neuroimaging e l’analisi liquorale. In questo studio abbiamo correlato i risultati ottenuti in test specifici, scelti per indagare le caratteristiche linguistiche tipiche di ogni variante di PPA, con i livelli liquorali delle proteine Aβ, Tau e Ptau, ed il pattern atrofico riscontrato alla risonanza magnetica. Lo scopo della ricerca è quello di creare una batteria neuropsicologica in grado di effettuare ipotesi diagnostiche e realizzare diagnosi differenziale tra le singole varianti di PPA già nelle fasi iniziali della malattia. Lo scopo della nostra ricerca è proprio questo: individuare test cognitivi che più di altri siano predittivi nell’individuare la possibile presenza di PPA già nelle fasi inziali della patologia. Si è partiti dalla consapevolezza che i domini cognitivi maggiormente compromessi siano la capacità di denominazione, la comprensione, la scrittura, la lettura, la ripetizione e la capacità di fruibilità lessicale. Si sono, infatti, selezionate cinque prove: la batteria di Milano II, per l’indagine delle competenza linguistiche, il Token Test, per valutare la comprensione di ordini verbali, le fluenze verbali, per indagare la fruibilità lessicale, il Boston Naming Test per la capacità di denominazione e il Mini Mental State Examination per l’efficienza cognitiva globale. Analizzando la correlazione tra i tre diversi marcatori considerati (test neuropsicologici, localizzazione delle aree atrofiche e dosaggio liquorale) è emerso che la presenza di agrammatismo, e di aprassia verbale rappresentano i deficit neuropsicologici più sensibili per la diagnosi di NFPA già nelle fasi iniziali della patologia. Punteggi al di sotto del range normativi, ottenuti nelle prove di ripetizione (sia di parole, non parole che di frasi complesse), rappresenta un buon predittore per la diagnosi di LPA. Infine, punteggi patologici nelle prove di lettura (soprattutto di frasi) e di denominazione di stimoli visivi (Boston Naming Test) potrebbe essere un indicatore precoce per la diagnosi di SPA. Obiettivo futuro sarà quello di ampliare il campione e proseguire con follow-up longitudinali a 6-8 mesi per delineare il progredire della patologia. Inoltre, per ciascuno dei test somministrati si cercherà di determinare dei valori soglia specifici per la diagnosi di PPA in modo da consentirne pieno utilizzo diagnostico, già nelle fasi iniziali della malattia, soprattutto in contesti clinici in cui non sia possibile determinare i biomarcatori liquorali.

Le urine costituiscono il fluido biologico di elezione nella ricerca di biomarcatori per le patologie renali in quanto possono essere raccolte in modo semplice e non invasivo; una strategia per la semplificazione del proteoma urinario è rappresentata dall’isolamento degli exosomi urinari (UE), nanovescicole di membrana (30-100 nm) rilasciate dalle cellule epiteliali nello spazio urinario. In questo lavoro abbiamo focalizzato l’attenzione sulla nefropatia diabetica (DN), una comune complicazione del diabete ed una delle cause più frequenti di insufficienza renale terminale (ESDR), e sulle tubulopatie ereditarie (SLTs), un gruppo eterogeneo di malattie genetiche rare dell’età pediatrica caratterizzate da difetti in proteine coinvolte nel riassorbimento di sodio-cloruro a livello dell’ansa di Henle e/o dei tubuli renali distali, come i cotrasportatori NCC NKCC2, alterati rispettivamente nella sindrome di Gitelman (GS) e nella sindrome di Bartter1 (B1). L’obiettivo che ci siamo proposti è stato quello di studiare il proteoma degli UE in: 1) un modello animale di DN, i ratti ZDF (Zucker Diabetic Fatty), e corrispondenti controlli, per l’identificazione di potenziali biomarcatori diagnostici/prognostici e 2) pazienti affetti da SLTs e controlli sani al fine di proporre un approccio diagnostico complementare/alternativo all’analisi genetica e fornire un punto di partenza per la ricerca di biomarcatori. Per quanto riguarda lo studio della DN, sono state raccolte le urine delle 24 ore da 7 ratti ZDF e controlli a differenti età per monitorare l’evoluzione della DN, gli UE sono stati isolati mediante ultracentrifugazione, seguita da caratterizzazione biochimica. Dopo l’allestimento di un pool rappresentativo di UE di ratti ZDF e controlli a 20 settimane, ne è stato analizzato il proteoma tramite LC-ESI-MS/MS portando all’identificazione ed alla quantificazione label-free di 286 proteine. Il contenuto differenziale di alcune di queste proteine è stato confermato tramite immunoblotting; il contenuto della Major-Urinary-Protein-1 è risultato significativamente più alto, quello della proteina Xaa-Pro-Dipeptidase più basso e quello della Neprilisina invariato, rispettivamente, negli UE di ratti ZDF rispetto ai controlli. Per quanto riguarda le SLTs, la casistica era formata da 32 pazienti SLTs già studiati dal punto di vista genetico e biochimico-clinico, da 4 pazienti SLTs non classificabili e da 22 controlli sani. Dopo la raccolta delle seconde urine del mattino, sono stati isolati e caratterizzati gli UE. I risultati hanno mostrato che il segnale relativo al cotrasportatore NCC risulta significativamente ridotto o assente negli UE dei pazienti GS rispetto ai controlli, e allo stesso modo il cotrasportatore NKCC2 per i pazienti B1. Le differenze nei livelli di queste due proteine negli UE ci consentono il riconoscimento dei pazienti GS e B1 rispetto ai controlli e, in combinazione con i dati biochimico-clinici, rispetto agli altri pazienti Bartter. E’ stato quindi proposto e validato statisticamente un approccio diagnostico che può risultare utile in casi di SLTs a diagnosi incerta. Per quanto riguarda la proteina NCC è stata inoltre effettuata una correlazione tra la quantità del trasportatore presente negli UE e la gravità della mutazione corrispondente. Per l’identificazione di biomarcatori delle altre due forme di SLTs studiate, la sindrome di Bartter2 (B2) e di Bartter3 (B3), abbiamo allestito un pool di UE, abbiamo separato le proteine mediante elettroforesi bidimensionale selezionando alcuni spot differenziali da analizzare tramite LC-ESI-MS/MS; il contenuto differenziale negli UE di alcune proteine identificate verrà validato mediante IB. In conclusione possiamo affermare che la composizione proteica degli UE risulta alterata in maniera riproducibile in presenza di nefropatia diabetica e di tubulopatie ereditarie; le differenze evidenziate possono costituire un punto di partenza per l’identificazione di biomarcatori diagnostici/prognostici e per il chiarimento dei meccanismi patogenetici di tali malattie.

In the last decades, the increase of industrial activities and of the request for the world food requirement, the intensification of natural resources exploitation, directly connected to pollution, have aroused an increasing interest of the public opinion towards initiatives linked to the regulation of food production, as well to the institution of a modern legislation for the consumer guardianship. This work was planned taking into account some important thematics related to marine environment, collecting and showing the data obtained from the studies made on different marine species of commercial interest (Chamelea gallina, Mytilus edulis, Ostrea edulis, Crassostrea gigas, Salmo salar, Gadus morhua). These studies have evaluated the effects of important physic and chemical parameters variations (temperature, xenobiotics like drugs, hydrocarbons and pesticides) on cells involved in the immune defence (haemocytes) and on some important enzymatic systems involved in xenobiotic biotransformation processes (cytochrome P450 complex) and in the related antioxidant defence processes (Superoxide dismutase, Catalase, Heat Shock Protein), from a biochemical and bimolecular point of view. Oxygen is essential in the biological answer of a living organism. Its consume in the normal cellular breathing physiological processes and foreign substances biotransformation, leads to reactive oxygen species (ROS) formation, potentially toxic and responsible of biological macromolecules damages with consequent pathologies worsening. Such processes can bring to a qualitative alteration of the derived products, but also to a general state of suffering that in the most serious cases can provoke the death of the organism, with important repercussions in economic field, in the output of the breedings, of fishing and of aquaculture. In this study it seemed interesting to apply also alternative methodologies currently in use in the medical field (cytofluorimetry) and in proteomic studies (bidimensional electrophoresis, mass spectrometry) with the aim of identify new biomarkers to place beside the traditional methods for the control of the animal origin food quality. From the results it’s possible to point out some relevant aspects from each experiment: 1. The cytofluorimetric techniques applied to O. edulis and C. gigas could bring to important developments in the search of alternative methods that quickly allows to identify with precision the origin of a specific sample, contributing to oppose possible alimentary frauds, in this case for example related to presence of a different species, also under a qualitative profile, but morpholgically similar. A concrete perspective for the application in the inspective field of this method has to be confirmed by further laboratory tests that take also in account in vivo experiments to evaluate the effect in the whole organism of the factors evaluated only on haemocytes in vitro. These elements suggest therefore the possibility to suit the cytofluorimetric methods for the study of animal organisms of food interest, still before these enter the phase of industrial working processes, giving useful information about the possible presence of contaminants sources that can induce an increase of the immune defence and an alteration of normal cellular parameter values. 2. C. gallina immune system has shown an interesting answer to benzo[a]pyrene (B[a]P) exposure, dose and time dependent, with a significant decrease of the expression and of the activity of one of the most important enzymes involved in the antioxidant defence in haemocytes and haemolymph. The data obtained are confirmed by several measurements of physiological parameters, that together with the decrease of the activity of 7-etossi-resourifine-O-deetilase (EROD linked to xenobiotic biotransformation processes) during exposure, underline the major effects of B[a]P action. The identification of basal levels of EROD supports the possible presence of CYP1A subfamily in the invertebrates, still today controversial, never identified previously in C. gallina and never isolated in the immune cells, as confirmed instead in this study with the identification of CYP1A-immunopositive protein (CYP1A-IPP). This protein could reveal a good biomarker at the base of a simple and quick method that could give clear information about specific pollutants presence, even at low concentrations in the environment where usually these organisms are fished before being commercialized. 3. In this experiment it has been evaluated the effect of the antibiotic chloramphenicol (CA) in an important species of commercial interest, Chamelea gallina. Chloramphenicol is a drug still used in some developing countries, also in veterinary field. Controls to evaluate its presence in the alimentary products of animal origin, can reveal ineffective whereas the concentration results to be below the limit of sensitivity of the instruments usually used in this type of analysis. Negative effects of CA towards the CYP1A- IPP proteins, underlined in this work, seem to be due to the attack of free radicals resultant from the action of the antibiotic. This brings to a meaningful alteration of the biotransformation mechanisms through the free radicals. It seems particularly interesting to pay attention to the narrow relationships in C. gallina, between SOD/CAT and CYP450 system, actively involved in detoxification mechanism, especially if compared with the few similar works today present about mollusc, a group that is composed by numerous species that enter in the food field and on which constant controls are necessary to evaluate in a rapid and effective way the presence of possible contaminations. 4. The investigations on fishes (Gadus morhua, and Salmo salar) and on a bivalve mollusc (Mytilus edulis) have allowed to evaluate different aspects related to the possibility to identify a biomarker for the evaluation of the health of organisms of food interest and consequently for the quality of the final product through 2DE methodologies. In the seafood field these techniques are currently used with a discreet success only for vertebrates (fishes), while in the study of the invertebrates (molluscs) there are a lot of difficulties. The results obtained in this work have underline several problems in the correct identification of the isolated proteins in animal organisms of which doesn’t currently exist a complete genomic sequence. This brings to attribute some identities on the base of the comparison with similar proteins in other animal groups, incurring in the possibility to obtain inaccurate data and above all discordant with those obtained on the same animals by other authors. Nevertheless the data obtained in this work after MALDI-ToF analysis, result however objective and the spectra collected could be again analyzed in the future after the update of genomic database related to the species studied. 4-A. The investigation about the presence of HSP70 isoforms directly induced by different phenomena of stress like B[a]P presence, has used bidimensional electrophoresis methods in C. gallina, that have allowed to isolate numerous protein on 2DE gels, allowing the collection of several spots currently in phase of analysis with MALDI-ToF-MS. The present preliminary work has allowed therefore to acquire and to improve important methodologies in the study of cellular parameters and in the proteomic field, that is not only revealed of great potentiality in the application in medical and veterinary field, but also in the field of the inspection of the foods with connections to the toxicology and the environmental pollution. Such study contributes therefore to the search of rapid and new methodologies, that can increase the inspective strategies, integrating themselves with those existing, but improving at the same time the general background of information related to the state of health of the considered animal organism, with the possibility, still hypothetical, to replace in particular cases the employment of the traditional techniques in the alimentary field.

In the last decades, the increase of industrial activities and of the request for the world food requirement, the intensification of natural resources exploitation, directly connected to pollution, have aroused an increasing interest of the public opinion towards initiatives linked to the regulation of food production, as well to the institution of a modern legislation for the consumer guardianship. This work was planned taking into account some important thematics related to marine environment, collecting and showing the data obtained from the studies made on different marine species of commercial interest (Chamelea gallina, Mytilus edulis, Ostrea edulis, Crassostrea gigas, Salmo salar, Gadus morhua). These studies have evaluated the effects of important physic and chemical parameters variations (temperature, xenobiotics like drugs, hydrocarbons and pesticides) on cells involved in the immune defence (haemocytes) and on some important enzymatic systems involved in xenobiotic biotransformation processes (cytochrome P450 complex) and in the related antioxidant defence processes (Superoxide dismutase, Catalase, Heat Shock Protein), from a biochemical and bimolecular point of view. Oxygen is essential in the biological answer of a living organism. Its consume in the normal cellular breathing physiological processes and foreign substances biotransformation, leads to reactive oxygen species (ROS) formation, potentially toxic and responsible of biological macromolecules damages with consequent pathologies worsening. Such processes can bring to a qualitative alteration of the derived products, but also to a general state of suffering that in the most serious cases can provoke the death of the organism, with important repercussions in economic field, in the output of the breedings, of fishing and of aquaculture. In this study it seemed interesting to apply also alternative methodologies currently in use in the medical field (cytofluorimetry) and in proteomic studies (bidimensional electrophoresis, mass spectrometry) with the aim of identify new biomarkers to place beside the traditional methods for the control of the animal origin food quality. From the results it’s possible to point out some relevant aspects from each experiment: 1. The cytofluorimetric techniques applied to O. edulis and C. gigas could bring to important developments in the search of alternative methods that quickly allows to identify with precision the origin of a specific sample, contributing to oppose possible alimentary frauds, in this case for example related to presence of a different species, also under a qualitative profile, but morpholgically similar. A concrete perspective for the application in the inspective field of this method has to be confirmed by further laboratory tests that take also in account in vivo experiments to evaluate the effect in the whole organism of the factors evaluated only on haemocytes in vitro. These elements suggest therefore the possibility to suit the cytofluorimetric methods for the study of animal organisms of food interest, still before these enter the phase of industrial working processes, giving useful information about the possible presence of contaminants sources that can induce an increase of the immune defence and an alteration of normal cellular parameter values. 2. C. gallina immune system has shown an interesting answer to benzo[a]pyrene (B[a]P) exposure, dose and time dependent, with a significant decrease of the expression and of the activity of one of the most important enzymes involved in the antioxidant defence in haemocytes and haemolymph. The data obtained are confirmed by several measurements of physiological parameters, that together with the decrease of the activity of 7-etossi-resourifine-O-deetilase (EROD linked to xenobiotic biotransformation processes) during exposure, underline the major effects of B[a]P action. The identification of basal levels of EROD supports the possible presence of CYP1A subfamily in the invertebrates, still today controversial, never identified previously in C. gallina and never isolated in the immune cells, as confirmed instead in this study with the identification of CYP1A-immunopositive protein (CYP1A-IPP). This protein could reveal a good biomarker at the base of a simple and quick method that could give clear information about specific pollutants presence, even at low concentrations in the environment where usually these organisms are fished before being commercialized. 3. In this experiment it has been evaluated the effect of the antibiotic chloramphenicol (CA) in an important species of commercial interest, Chamelea gallina. Chloramphenicol is a drug still used in some developing countries, also in veterinary field. Controls to evaluate its presence in the alimentary products of animal origin, can reveal ineffective whereas the concentration results to be below the limit of sensitivity of the instruments usually used in this type of analysis. Negative effects of CA towards the CYP1A- IPP proteins, underlined in this work, seem to be due to the attack of free radicals resultant from the action of the antibiotic. This brings to a meaningful alteration of the biotransformation mechanisms through the free radicals. It seems particularly interesting to pay attention to the narrow relationships in C. gallina, between SOD/CAT and CYP450 system, actively involved in detoxification mechanism, especially if compared with the few similar works today present about mollusc, a group that is composed by numerous species that enter in the food field and on which constant controls are necessary to evaluate in a rapid and effective way the presence of possible contaminations. 4. The investigations on fishes (Gadus morhua, and Salmo salar) and on a bivalve mollusc (Mytilus edulis) have allowed to evaluate different aspects related to the possibility to identify a biomarker for the evaluation of the health of organisms of food interest and consequently for the quality of the final product through 2DE methodologies. In the seafood field these techniques are currently used with a discreet success only for vertebrates (fishes), while in the study of the invertebrates (molluscs) there are a lot of difficulties. The results obtained in this work have underline several problems in the correct identification of the isolated proteins in animal organisms of which doesn’t currently exist a complete genomic sequence. This brings to attribute some identities on the base of the comparison with similar proteins in other animal groups, incurring in the possibility to obtain inaccurate data and above all discordant with those obtained on the same animals by other authors. Nevertheless the data obtained in this work after MALDI-ToF analysis, result however objective and the spectra collected could be again analyzed in the future after the update of genomic database related to the species studied. 4-A. The investigation about the presence of HSP70 isoforms directly induced by different phenomena of stress like B[a]P presence, has used bidimensional electrophoresis methods in C. gallina, that have allowed to isolate numerous protein on 2DE gels, allowing the collection of several spots currently in phase of analysis with MALDI-ToF-MS. The present preliminary work has allowed therefore to acquire and to improve important methodologies in the study of cellular parameters and in the proteomic field, that is not only revealed of great potentiality in the application in medical and veterinary field, but also in the field of the inspection of the foods with connections to the toxicology and the environmental pollution. Such study contributes therefore to the search of rapid and new methodologies, that can increase the inspective strategies, integrating themselves with those existing, but improving at the same time the general background of information related to the state of health of the considered animal organism, with the possibility, still hypothetical, to replace in particular cases the employment of the traditional techniques in the alimentary field.

Il Tumore a Cellule Giganti dell’osso (TCG) è una rara neoplasia che rappresenta il 5% dei tumori di natura ossea; sebbene venga considerato un tumore a decorso benigno può manifestare caratteri di aggressività locale dando origine a recidive locali nel 10-25% dei casi, e nel 2-4% dei casi metastatizza a livello polmonare. In questo studio è stata valutata l’espressione dei miRNA mediante miRNA microarray in 10 pazienti affetti da TCG, 5 con metastasi e 5 liberi da malattia; sono stati riscontrati miRNA differenzialmente espressi tra i 2 gruppi di pazienti e la successiva validazione mediante Real Time PCR ha confermato una differenza significativa per il miR-136 (p=0.04). Mediante analisi bioinformatica con il software TargetScan abbiamo identificato RANK e NF1B come target del miR-136 e ne abbiamo studiato l’espressione mediante Real Time PCR su una più ampia casistica di pazienti affetti da TCG, metastatico e non, evidenziando una maggior espressione di NF1B nel gruppo di pazienti metastatici, mentre RANK non ha dimostrato una differenza significativa. L’analisi di Western Blot ha rilevato una maggiore espressione di entrambe le proteine nei pazienti metastatici rispetto ai non metastatici. Successivamente è stato condotto uno studio di immunoistochimica su TMA di 163 campioni di pazienti affetti da TCG a diverso decorso clinico che ha dimostrato una maggiore e significativa espressione di entrambe i target nei pazienti con metastasi rispetto ai non metastatici; le analisi di popolazione mediante Kaplan-Meier hanno confermato la correlazione tra over-espressione di RANK, NF1B e ricaduta con metastasi (p=0.001 e p<0.0005 rispettivamente). Lo studio di immunoistochimica è stato ampliato alle proteine maggiormente coinvolte nell’osteolisi che risultano avere un significato prognostico; tuttavia mediante analisi di ROC, la co-over-espressione di RANK, RANKL e NF1B rappresenta il migliore modello per predire la comparsa di metastasi (AUC=0.782, p<0.0005).
Giant Cell Tumor of bone (GCTb) is a rare locally aggressive tumour representing 5% of all bone tumors. Local recurrences occur in 10-25% of cases, and it may occasionally give lung metastases in 2-5% of cases. In this study, the expression of miRNAs was evaluated using miRNA microarray analysis in 10 patients with GCTb, 5 with lung metastases and 5 disease-free; several miRNAs were differentially expressed between the 2 groups of patients and the subsequent validation by Real Time PCR confirmed a significant difference for miR-136 (p=0.04. Using bioinformatic analysis with the TargetScan software, we identified RANK and NF1B as miR-136 targets and their expression was analysed by Real Time PCR on a larger series of GCTb, showing higher levels of NF1B in metastatic than in disease-free patients. RANK didn’t show any difference. Western Blot analysis revealed an increased expression of both NF1B and RANK in the first group and an immunohistochemistry study performed on TMA sections of 163 GCTb samples with different clinical course included other proteins involved in osteolysis. A significant higher expression of both targets NF1B and RANK was seen in metastatic compared to disease-free patients; the Kaplan-Meier analysis confirmed the correlation between over-expression of RANK and NF1B and probability of metastasis occurrence (Log Rank p=0.001 and p<0.0005 respectively). Although other proteins involved in osteolysis presented a prognostic impact, ROC curve revealed that the simultaneous over-expression of RANK, RANKL and NF1B was the best model to predict the risk of metastases (AUC=0.782, p<0.0005 ).

Il Tumore a Cellule Giganti dell’osso (TCG) è una rara neoplasia che rappresenta il 5% dei tumori di natura ossea; sebbene venga considerato un tumore a decorso benigno può manifestare caratteri di aggressività locale dando origine a recidive locali nel 10-25% dei casi, e nel 2-4% dei casi metastatizza a livello polmonare. In questo studio è stata valutata l’espressione dei miRNA mediante miRNA microarray in 10 pazienti affetti da TCG, 5 con metastasi e 5 liberi da malattia; sono stati riscontrati miRNA differenzialmente espressi tra i 2 gruppi di pazienti e la successiva validazione mediante Real Time PCR ha confermato una differenza significativa per il miR-136 (p=0.04). Mediante analisi bioinformatica con il software TargetScan abbiamo identificato RANK e NF1B come target del miR-136 e ne abbiamo studiato l’espressione mediante Real Time PCR su una più ampia casistica di pazienti affetti da TCG, metastatico e non, evidenziando una maggior espressione di NF1B nel gruppo di pazienti metastatici, mentre RANK non ha dimostrato una differenza significativa. L’analisi di Western Blot ha rilevato una maggiore espressione di entrambe le proteine nei pazienti metastatici rispetto ai non metastatici. Successivamente è stato condotto uno studio di immunoistochimica su TMA di 163 campioni di pazienti affetti da TCG a diverso decorso clinico che ha dimostrato una maggiore e significativa espressione di entrambe i target nei pazienti con metastasi rispetto ai non metastatici; le analisi di popolazione mediante Kaplan-Meier hanno confermato la correlazione tra over-espressione di RANK, NF1B e ricaduta con metastasi (p=0.001 e p<0.0005 rispettivamente). Lo studio di immunoistochimica è stato ampliato alle proteine maggiormente coinvolte nell’osteolisi che risultano avere un significato prognostico; tuttavia mediante analisi di ROC, la co-over-espressione di RANK, RANKL e NF1B rappresenta il migliore modello per predire la comparsa di metastasi (AUC=0.782, p<0.0005).
Giant Cell Tumor of bone (GCTb) is a rare locally aggressive tumour representing 5% of all bone tumors. Local recurrences occur in 10-25% of cases, and it may occasionally give lung metastases in 2-5% of cases. In this study, the expression of miRNAs was evaluated using miRNA microarray analysis in 10 patients with GCTb, 5 with lung metastases and 5 disease-free; several miRNAs were differentially expressed between the 2 groups of patients and the subsequent validation by Real Time PCR confirmed a significant difference for miR-136 (p=0.04. Using bioinformatic analysis with the TargetScan software, we identified RANK and NF1B as miR-136 targets and their expression was analysed by Real Time PCR on a larger series of GCTb, showing higher levels of NF1B in metastatic than in disease-free patients. RANK didn’t show any difference. Western Blot analysis revealed an increased expression of both NF1B and RANK in the first group and an immunohistochemistry study performed on TMA sections of 163 GCTb samples with different clinical course included other proteins involved in osteolysis. A significant higher expression of both targets NF1B and RANK was seen in metastatic compared to disease-free patients; the Kaplan-Meier analysis confirmed the correlation between over-expression of RANK and NF1B and probability of metastasis occurrence (Log Rank p=0.001 and p<0.0005 respectively). Although other proteins involved in osteolysis presented a prognostic impact, ROC curve revealed that the simultaneous over-expression of RANK, RANKL and NF1B was the best model to predict the risk of metastases (AUC=0.782, p<0.0005 ).

In questa tesi vengono valutati gli effetti sui modelli di regressione lineare da parte di troncature deterministiche dei dati analizzati, e viene proposto un metodo alternativo per effettuare queste regressioni, che rimuova queste distorsioni. In particolare vengono discussi questi effetti nel campo della ricerca biologica, come nel progetto Mark-Age. Il progetto Mark-Age ha come obiettivo quello di ottenere un set di biomarcatori per l'invecchiamento, attraverso l'uso di metodi di data learning in analisi di tipo trasversale; elaborando cioè diverse variabili misurate sulle popolazioni esaminate riguardanti più sistemi fisiologici contemporaneamente e senza escludere interazioni locali fra queste. E' necessario tenere conto in queste analisi che questi dati sono deterministicamente troncati per via dei criteri di selezione sull’età dei partecipanti, e che questo ha un effetto rilevante sui metodi di analisi standard, i quali invece ipotizzano che non vi sarebbe alcuna relazione fra l’assenza di un dato ed il suo valore, se questo fosse misurato. In questa tesi vengono studiati gli effetti di questa troncatura sia per quanto riguarda la selezione di modelli ottimali, che della stima dei parametri per questi modelli. Vengono studiati e caratterizzati questi effetti nell'ambito di un toy model, che permette di quantificare la distorsione e la perdita di potenza dovuta alla troncatura. Viene inoltre introdotto un appropriato metodo di regressione, chiamato Tobit, che tenga conto di questi effetti. Questo metodo viene infine applicato ad un sottoinsieme dati del progetto Mark-Age, dimostrando una notevole riduzione del bias di predizione, ottenendo anche una stima della precisione di queste predizioni.

Human biomonitoring (HBM) is an ideal tool for evaluating toxicant exposure in health risk assessment. Chemical substances or their metabolites related to environmental pollutants can be detected as biomarkers of exposure using a wide variety of biological fluids. Individual exposure to aromatic hydrocarbon compounds (benzene, toluene, and o-xylene –“BTX”) were analysed with a liquid chromatography coupled to electrospray ionisation-mass spectrometry (μHPLC-ESI-MS/MS) method for the simultaneous quantitative detection of the BTX exposure biomarker SPMA, SBMA and o-MBMA in human urine. Urinary S-phenylmercapturic acid (SPMA) is a biomarker proposed by the American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) for assessing occupational exposure to benzene (Biological Exposure Index of 25 microg/g creatinine). Urinary S-benzylmercapturic (SBMA) and o-methyl S-benzyl mercapturic acid (o-MBMA) are specific toluene and o-xylene metabolites of glutathione detoxicant pathways, proposed as reliable biomarkers of exposure. To this aim a pre-treatment of the urine with solid phase extraction (SPE) and an evaporation step were necessary to concentrate the mercapturic acids before instrumental analysis. A liquid chromatography separation was carried out with a reversed phase capillary column (Synergi 4u Max-RP) using a binary gradient composed of an acquous solution of formic acid 0.07% v/v and methanol. The mercapturic acids were determinated by negative-ion-mass spectrometry and the data were corrected using isotope-labelled analogs as internal standards. The analytical method follows U.S. Food and Drug Administration guidance and was applied to assess exposure to BTX in a group of 396 traffic wardens. The association between biomarker results and individual factors, such as age, sex and tobacco smoke were also investigated. The present work also included improvements in the methods used by modifying various chromatographic parameters and experimental procedures. A partial validation was conducted to evaluate LOD, precision, accuracy, recovery as well as matrix effects. Higher sensitivity will be possible in future biological monitoring programmes, allowing evaluation of very low level of BTX human exposure. Keywords: Human biomonitoring, aromatic hydrocarbons, biomarker of exposure, HPLC-MS/MS.

Human biomonitoring (HBM) is an ideal tool for evaluating toxicant exposure in health risk assessment. Chemical substances or their metabolites related to environmental pollutants can be detected as biomarkers of exposure using a wide variety of biological fluids. Individual exposure to aromatic hydrocarbon compounds (benzene, toluene, and o-xylene –“BTX”) were analysed with a liquid chromatography coupled to electrospray ionisation-mass spectrometry (μHPLC-ESI-MS/MS) method for the simultaneous quantitative detection of the BTX exposure biomarker SPMA, SBMA and o-MBMA in human urine. Urinary S-phenylmercapturic acid (SPMA) is a biomarker proposed by the American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) for assessing occupational exposure to benzene (Biological Exposure Index of 25 microg/g creatinine). Urinary S-benzylmercapturic (SBMA) and o-methyl S-benzyl mercapturic acid (o-MBMA) are specific toluene and o-xylene metabolites of glutathione detoxicant pathways, proposed as reliable biomarkers of exposure. To this aim a pre-treatment of the urine with solid phase extraction (SPE) and an evaporation step were necessary to concentrate the mercapturic acids before instrumental analysis. A liquid chromatography separation was carried out with a reversed phase capillary column (Synergi 4u Max-RP) using a binary gradient composed of an acquous solution of formic acid 0.07% v/v and methanol. The mercapturic acids were determinated by negative-ion-mass spectrometry and the data were corrected using isotope-labelled analogs as internal standards. The analytical method follows U.S. Food and Drug Administration guidance and was applied to assess exposure to BTX in a group of 396 traffic wardens. The association between biomarker results and individual factors, such as age, sex and tobacco smoke were also investigated. The present work also included improvements in the methods used by modifying various chromatographic parameters and experimental procedures. A partial validation was conducted to evaluate LOD, precision, accuracy, recovery as well as matrix effects. Higher sensitivity will be possible in future biological monitoring programmes, allowing evaluation of very low level of BTX human exposure. Keywords: Human biomonitoring, aromatic hydrocarbons, biomarker of exposure, HPLC-MS/MS.

Nell’era dei nuovi farmaci, il ruolo della chemioterapia ad alte dosi con successivo trapianto di cellule staminali emopoietiche autologhe (ASCT) nei pazienti affetti da Mieloma Multiplo di nuova diagnosi (NDMM) è stato messo in discussione. L’European Myeloma Network ha proposto il trial clinico multicentrico, prospettico, di fase III EMN02/HO95 MM che ha comparato, in oltre 1500 pazienti, l’efficacia della terapia di intensificazione con Bortezomib, Melphalan e Prednisone (VMP) rispetto a chemioterapia ad alte dosi di Melphalan (HDM) e successivo ASCT nei pazienti di età ≤ 65 anni affetti da NDMM. Inoltre, è stato indagato il ruolo di un consolidamento con Bortezomib, Lenalidomide e Desametasone rispetto a nessun consolidamento e confrontata l’efficacia del singolo (ASCT-1) versus il doppio ASCT (ASCT-2). Nell’analisi finale dello studio ASCT si è confermato come lo standard di cura dei pazienti giovani con NDMM, in quanto è in grado di garantire una migliore qualità di risposta (risposta ≥VGPR, 84 % VS 77%; p=0.0020) e una prolungata PFS (mediana di 56.7 mesi VS 41.9 mesi), anche in sottogruppi di pazienti con caratteristiche citogenetiche di alto rischio per del(17p) ± t(4;14) ± t(14;16). A un follow-up di oltre 6 anni, ASCT si è associato a un significativo prolungamento della OS (OS stimata a 75 mesi pari a 69% per pazienti del braccio ASCT rispetto a 63% per il braccio VMP, p=0.034) e a un controllo più duraturo della malattia rispetto alla terapia di intensificazione con nuovi farmaci (PFS2 stimata a 75 mesi pari a 57% versus 49% e TTnT mediano di 66 mesi versus 47 mesi, rispettivamente). Il confronto tra ASCT-1 e ASCT-2 ha evidenziato come ASCT-2 garantisca un miglioramento prognostico sia di PFS (HR 0.74) sia di OS (HR 0.62), con beneficio particolarmente evidente nei pazienti portatori di del(17p) (HR per progressione 0.24 o morte 0.30).
In the era of new drugs, the role of high-dose chemotherapy with subsequent autologous hematopoietic stem cell transplantation (ASCT) in newly diagnosed multiple myeloma patients (NDMM) has been questioned. The European Myeloma Network proposed the multi-centric clinical trial, prospective, phase III EMN02/HO95 MM which compared, in over 1500 patients, the efficacy of intensification therapy with Bortezomib, Melphalan and Prednisone (VMP) to high-dose Melphalan (HDM) and subsequent ASCT in NDMM patients aged 65 years. In addition, this trial compared the role of consolidation with Bortezomib, Lenalidomide and Desametasone versus no consolidation and the efficacy of single (ASCT-1) versus double ASCT (ASCT-2). The final analysis of the study confirmed ASCT as the standard of care for NDMM young patients. It is able to guarantee a better quality of response (≥VGPR response, 84 % vs 77%; p=0.0020) and a prolonged PFS (median of 56.7 months vs 41.9 months), also in the subgroups of patients with high risk cytogenetic features for del(17p) ± t(4;14) ± t(14;16). In a follow-up of over 6 years, ASCT was associated with a significant extension of OS (OS estimated at 75 months 69% for ASCT arm compared to 63% for VMP arm, p=0.034) and a longer-lasting control of the disease compared to intensification therapy with new drugs (PFS2 estimated at 75 months 57% versus 49% and median TTnT of 66 months versus 47 months, respectively). The comparison between ASCT-1 and ASCT-2 showed that ASCT-2 ensures prognostic improvement of both PFS (HR 0.74) and OS (HR 0.62), with particularly benefit in patients with del(17p) (HR for progression 0.24 or death 0.30).

Background. I meccanismi di neoformazione ossea ed il link patogenetico che lega quest’ultima all’infiammazione e alla attività di malattia nelle spondiloartriti assiali (axSpA) non sono ancora del tutto chiariti. Scopo. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare le concentrazioni sieriche della semaforina 3A (SEMA 3A), della sclerostina, della bone morphogenic protein (BMP-2), dell’IL-17A e della calprotectina nei pazienti affetti da axSpA e di valutare tali proteine come possibili biomarcatori di neoformazione ossea, attività di malattia e remissione. Materiali e metodi Sessanta pazienti affetti da SpA assiale giunti consecutivamente alla nostra osservazione sono stati arruolati nel corso dello studio. Sono stati inoltre arruolati 30 controlli sani, appaiati per età e sesso. In tutti i pazienti sono stati registrati i principali parametri clinico-demografici. Per ogni paziente sono stati inoltre valutati i principali indici di attività di malattia, di disabilità e di remissione. In tutti i pazienti sono state valutate le radiografie della colonna e del bacino eseguite entro sei mesi dalla visita di arruolamento. Il danno radiografico alla colonna è stato valutato mediante modified Stoke Ankylosing Spondylitis Spinal Score (mSASSS); il coinvolgimento delle articolazioni sacro-iliache è stato valutato mediante assegnazione di uno score variabile fra 1 e 4 in accordo ai criteri di New York. Livelli sierici di Sema3A, sclerostina, BMP-2, IL-17A e calprotectina Le concentrazioni sieriche delle proteine Sema3A, sclerostina, BMP-2, IL-17A e calprotectina sono state valutate utilizzando Kit ELISA commerciali. Risultati Non si è evidenziava nessuna differenza significativa fra le concentrazioni sieriche [mediana (25°-75°)] di Sema3A tra i pazienti [0.26 (0.20-0.31) pg/ml] e i controlli [0.28 (0.26-0.3) pg/ml; p =n.s.). I livelli di Sema3A correlavano positivamente con i valori di VES (rho=0.37, p=0.049;) ma, non sono state riscontrate correlazioni significative tra i valori di Sema3A e i gli indici di danno radiografico. La concentrazione sierica di sclerostina [mediana (25°-75°)] è risultata significativamente più alta nei controlli sani [18.04 (13.6-24) pg/ml] rispetto ai pazienti affetti da SpA [6.46 (4.5-11.1) pg/ml; p value < 0.01] ed inoltre per valori < 13.18 la determinazione della sclerostina presentava una elevata sensibilità (82%) e specificità (90%) per la diagnosi di SpA assiale. Tuttavia, Nessuna correlazione statisticamente significativa è stata riscontrata tra le concentrazioni sieriche di sclerostina con il danno radiografico o con gli indici clinici di attività ed i parametri di laboratorio. Le concentrazioni di BMP-2 non sono risultate differenti tra pazienti e controlli ma correlano positivamente (Spearman rho: 0.39, p=0.03) con l’indice mSASSS. Di notevole interesse, le concentrazioni plasmatiche di BMP-2 correlavano inversamente con i livelli di IL-17A. I livelli di calprotectina sono risultati significativamente più elevati nei pazienti con SpA assiale e correlavano significativamente con i livelli di IL-17A, tuttavia nessuna relazione è stata riscontrata con i valori di mSASSS. Conclusioni: I risultati del nostro studio suggeriscono il possibile ruolo della Sema3A, sclerostina, BMP-2 e calprotectina nelle complesse dinamiche che legano l’infiammazione al rimodellamento osseo nei pazienti con axSpA.

Objective: To correlate neuropsychological testing with cerebrospinal fluid Amyloid beta (AD), tau and Ptau levels in patients with Mild Cognitive Impairment (MCI) Background: Principal diagnostic instrument to define global cognitive state is the Mini Mental State Examination (MMSE). Cognitive domains that best predict progression from amnestic MCI to AD are episodic memory and executive functioning. Were selected two neuropsychological tests for both domains: Story Recall Test (SRT) and Paired-Associate Learning (PAL) to examine episodic verbal memory, and Coloured Progressive Matrices of Raven (CPMR) and Clock Drawing Test (CDT) to investigate executive functioning. Methods: Forty subjects with amnestic MCI were recruited. All of them underwent neurological exam, neuropsychological testing and lumbar puncture at time of diagnosis. Cognition were explored by MMSE (global cognitive functioning), CPMR and CDT (executive functions), SRT and PAL (episodic verbal memory). Statistical analysis was carried out by using t-test and Spearman test for correlations. Results: In the whole population, no significant correlation between cognitive and biological markers was observed. Considering CSF biomarker level of amiloidβ, thirteen subjects showed an altered pattern and converted to AD after few months, the other subjects whit a normal profile did not convert. MMSE show a significant difference between converters/no converters groups (26.4 versus 27.6 p=0.066). Also CDT and SRT had a significant difference between two groups (3 versus 5 p= 0.003 and 5.85 versus 8.32, p=0.03). Conclusion: According to these results, MMSE value is lower in converters, in according to patological biomarkers profile. PAL and CDT are more specific to predict conversion from MCI to AD.

Gastrointestinal (GI) tumors refers to malignant conditions afflicting esophagus, stomach, intestin, bladder, liver and pancreas. These kinds of neoplasms are considered overall the most lethal in the world. Gastrointestinal tumors represents 22% of total cancers and the major danger for world health with 12% of total annual deaths. In the last years, in Europe the high rate of GI tumors, evaluated more than 250.000 new cases and 140.000 deaths. Even though the incidence of GI tumors is decreasing in the western area of the world, these neoplasms actually remain a serious issue for worldwide public health. In particular in Asia and in some areas of South America, GI tumors are the most common cancers and represent the main cause of death. Although diagnosis improvements, many times GI tumors are identified too late due to unclear symptoms or uncertain screening method. In most cases, GI tumor patients are diagnosed at the late stage, therefore they loss the opportunity to take advantage of early clinical intervention and about 20-45% of them are surgically resected after tumor relapse or metastasis development. The aggressive character of GI tumors is related to an high number of anomalies among which oncogenes and telomerase activation, oncosuppressor genes inactivation and many anomalies in growth factors and receptors. In particular, rectal cancer is one of the most common tumor worldwide. Incidence and mortality rate change depending on geographic areas. In the United States, more than 130.000 new cases and more than 50.000 death every years are evaluated. In the European Union, rectal cancer represents more than 35% of total colorectal neoplasms; the incidence is 15-25/100.000 every year. Esophageal cancer is the sixth major cause of mortality correlated to the tumor and the eighth more common tumor type worldwide. In the world 450.000 individuals are afflicted by esophageal tumor and its incidence is increasing. Esophageal cancer represents the most common cause of cancer death in the world male population. The prognosis is moderately unfavourable with a 5 years survival rate varying between 15% to 26% according to the treatment type; best results can be obtained with an early diagnosis during the early stages. Surgical resection and radiotherapy represent the main curative treatments in early stages of both esophageal and rectal cancers but a considerable percentage of patients is classified as locally advanced tumor. In this group of patients, the tumor grows beyond rectal or esophageal epithelium or can invade surrounding organs and structures; in these cases surgery and radiotherapy are not sufficient leading to a major risk of locoregional recurrence and metastasis development. In the last years, surgical excision combined with neoadjuvant therapy are considered the gold standard treatment for locally advanced rectal and esophageal cancer. Effectively, more than half of patients treated with neo-adjuvant 5-Fluorouracil and/or cisplatin -based chemoradiotherapy (CRT) for locally advanced rectal and esophageal carcinomas has shown to be effective to downstage more than half preoperative treated patients. Other half patients is not able to be effective responders to chemotherapy. Up to date no variables are known to be strong predictive of response. Interindividual variations in DNA repair and metabolism of pyrimidine nucleotides, folates and cisplatin may be important mechanisms for resistance to radio and chemotherapy. Common gene polymorphisms in these pathways have been well described and their associations with anticancer-treatment outcome have been widely investigated using statitical linear models, with inconsitent results. Epistasis is the naturaly occurring interaction between genes at two or more loci so that the phenotype differes from what expected if the genes were expressed indipendently. Its a frequent phenomenon, that linear statistics cannot reveal and it shoud be considered in pharmacogenetic studies. The Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) method was designed specifically to identify interactions among discrete variables that influence a binary outcome and is increasingly used in pharmacogenetics. This method classifies genotypes in “responders” or “non responders” in order to reduce the multidimensionality of data in only one dimension; so we can identify genetic combiantions confering disease prediction. The aim of the present study was to correlate some polymorphisms of genes involved in DNA repair systems, detoxification pathway and antitumoral drug mechanisms of action and methabolism with clinical outcome of concomitant chemoradiotherapy actually used as standard neoadjuvant for rectal and esophageal cancer patients. Furthermore, we want to evaluate the use of new approches to identify genotype-phenotype correlations. In this study, 70 patients with stage II and III rectal cancer were enrolled, 18 females and 52 males, mean age 62 years old. They were treated with 5 weeks of 300 mg/m2/die 5 fluorouracil protracted venous infusion concurrent to 56 Gy radiation followed by surgical resection. Responses at tumor level were directly evaluated on surgical specimens and scored according to TNM classification. Patients were considered as responders (if T0, complete response; if T1 or T2, partial response) or non responders (if T3 and T4). Genomic DNA was extracted from peripheral blood lymphocytes and ERCC1, XPD, XPA, XRCC1, XRCC3, UMPS, MTHFR677, MTHFR1298, TYMS 3'UTR and TYMS 5'VNTR genotypes were analyzed by PCR-RFLP and dHPLC. In particular, the following SNPs were analyzed: XRCC1 Arg399Gln (rs25487), MTHFR 677 C>T (rs1801133), MTHFR 1298 A>C (rs1801131),TYMS 3'UTR 1494del6 (rs34489327), TYMS 5'UTR 28bp (rs34743033), TYMS 5'UTR G/C (rs2853542), XPC Lys939Gln A>C (rs2228001), XPD (ERCC2) A>C (rs121913019), ERCC1 C>T (rs121913027), XRCC3 Thre241Met G>A (rs861539), UMPS T>C (rs10049380). Polymorphisms were selected according to genotipic frequencies of our population and considered only if minor variant frequency was at least 10% in the Caucasian population. Genotypes were correlated with tumor outcomes to CRT considering both complete (T0 vs T1-4) and major (T0-2 vs T3-4) responses. About the second set of samples, 124 mid/low locally advanced esophageal GEJ tumors patients (T2-T4 with or without positive lymph nodes) and treated with neoadjuvant CRT were enrolled. All patients received weekly docetaxel (35 mg/m2) and cisplatin (25mg/m2), protracted venous infusion of fluorouracil (150 mg/m2/die) and concomitant radiotherapy (50 Gy). Radical surgery was performed 6-8 weeks after treatment was completed. DNA was extracted from peripheral leukocytes using a commercial kit (Wizard Genomic, Promega). Polymorphisms in genes of the DNA repair systems (XPA-rs1800975, XPC-rs2228000, XPC-rs2228001, XPD-rs13181, XRCC1-rs25487, XRCC3-rs861539, ERCC1-rs11615), drug pathways (MTHFR-rs1801133, TYMS-rs34743033, UMPS-rs1801019) and detoxification (MDR1-rs2032582, GSTP1-rs11338272) were characterized through RLFP-PCR and dHPLC analysis. Tumor responses were directly evaluated on surgical specimes and organized according to TNM classification. Pathological complete response (CR) was defined as the absence of residual tumor (ypT0N0); near pathological complete response (nCR) was defined as the presence of microfoci of cancer cells at the primary site with negative lymph nodes; the remaining patients were classified as non responders (NR). Responders were defined as patients having CR or nCR. Cancer specific survival (CSS) was defined as the time between diagnosis and death from cancer; relapse-free survival (RFS) was defined as the time between initiation of therapy and the first evidence of disease recurrence. Survival curves were computed with the Kaplan-Meyer method and compared using the log rank test. Statistical analysis were performed using chi square test, logistic regression and Multifactor Dimensionality Reduction method. Patients responded to CRT at tumor level as follows: pT0 (patients without tumor) in 25.7% , pT1-2 (patients with an important tumor reduction) in 34.3% and pT3-4 (patients without tumor reduction) in 40%. So less than half of patients demostrated to have any response from CRT, according to the literature. All genotype data were correlated to pathological response. Chi square tests showed no significant correlation between genotipization and local patological respose. Also logistic regression was performed and no associations between genotype, sex, age and pathological response were revealed. On the contrary, using the MDR method, we showed a significant correlation between the combination of XRCC1/MTHFR677 genetic variants and major response (p=0,0009) that was correcly predicted in 77.8% of patients. About the esophageal cancer set of patients, univariate analysis showed that MTHFR 677TT, MDR1 2677GT, GSTP1 114CC, XPC 499CC and XPC 939AC+CC genotypes were associated to shorter RFS with a p value ≤0.1 and were defined as high risk variants. A model including these five polymorphisms discriminated three numerically similar subgroups, carriers of 0-2 (n= 48), 3 (n= 38) or 4-5 (n= 36) high risk genotypes, for which 5-year RFS was 67.1%, 50.0% and 20.9% (p= 0.0002) and 5-year CSS was 71.1%, 55.8% and 25.8% (p=0.0003), respectively. When the 5-SNP panel was combined with histology, the analysis split patients in two main subsets with 5-year RFS rates ranging from 61% to75% and 22% to 36%. In particular, 5-year RFS was different in the subset with 3 high risk polymorphisms according to histology: 61% in squamous and 36% in adenocarcinoma patients (p=0.06). Globally, two class risk could be obtained with 5 years RFS and CSS rates of 65% vs 27% (HR 3.0, 95% CI 2.0-6.0, p<0.0001) and 69% vs 31% (HR 2.9, 95% CI 1.8-5.7, p<0.0001), respectively. In the end, the combination of pathological response with the 5-SNP panel allowed the allocation of the whole series in two major informative risk classes: high (47.5% of patients, including all NRs and nCRs with 3-5 unfavourable genotypes) or low risk (52.5% of patients, including all CRs and nCRs with 0-2 unfavourable genotypes) class. The two final groups had statistically different outcomes: 5-year PFS rates were 79.4% vs 17.7% (HR 6.71, 95% CI : 3.98-12.0, p<0.0001) and 5-year CSS rates were 79.3% vs 26.3% (HR 6.25, 95% CI : 3.6-11.5, p<0.0001). The internal validation procedure by MDR confirmed our models as good predictors. Finally, important to underline, before establishing the SNPs panel, all the single polymorphisms were evaluated and associated to pathological response, both in rectal and in esophageal cancer patients through univariate analysis. XPC Lys939Gln SNP was significantly associated with pathological response: pts carrying wild genotype presented complete or major response in 84.1% of cases, compared to 52.6% and 40% in heterozygotes and Gln homozygotes, respectively (p=0.0006). No association was found with the other SNPs. In contrast with these findings, in the set of rectal patients, as above mentioned, univariate analysis revealed any statistically significant association between pathological response and SNPs, not even with XPC Lys939Gln, predicting pathological response in esophageal neoplasms; in this sample set it was not related to a significant reduction of tumor mass in rectal cancers (p=0.37). In conclusion our data demonstrated the role of a panel of 4 genes/5 SNPs in predicting PFS and CSS in patients receiving the same intensive neoadjuvant chemoradiation protocol. Polymorphisms of XPC, MDR1, GSTP1 and MTHFR deserve further evaluation in order to guide therapeutic decisions in this setting of patients. Another important aspect of these results is the predictive value in pathological response only in esophageal and not in rectal cancer patients. Furthermore, our findings suggest that epistasis should be considered when analysing pharmacogenetic associations. The Multifactor Dimensionality Reduction is an easy and valid method to detect genetic combinations that can identify patients with a high probability of tumor response when chemoradiotherapy for colonrectal cancer is indicated.
I tumori gastrointestinali (GI) si riferiscono a condizioni maligne che colpiscono esofago, stomaco, intestino, vescica, fegato e pancreas e vengono considerati complessivamente i tumori con maggiore grado di letalità a livello mondiale. I tumori gastrointestinali rappresentano il 22% di tutti i tumori e la maggiore minaccia per la salute mondiale con il 12% delle morti annuali complessive correlate al tumore. Negli ultimi anni, l'alto grado di incidenza dei tumori GI, in Europa ha stimato più di 250mila nuovi casi e 140mila morti. Sebbene l'incidenza dei tumori gastrointestinali sia diminuita nella parte occidentale del mondo dagli anni 40'-80', rimane in ogni caso un problema per la salute pubblica mondiale. In particolare, in Asia e in alcune parti del Sud America, i tumori gastrointestinali sono il tipo di neoplasie più diffuse e causa di morte. Nonostante i progressi nella diagnosi dei tumori gastrointestinali, alcuni vengono individuati molto tardi a causa di sintomi poco evidenti o metodi di screening poco specifici. La maggior parte dei pazienti vengono diagnosticati all'ultimo stadio, pertanto perdono le oppurtunità di interventi medici precoci e circa il 20-45% di questi vanno incontro a resezione in seguito a ricaduta tumorale o sviluppo di metastasi a causa della natura altamente aggressiva dei tumori. La natura aggressiva di questi tumori è correlata ad un elevato numero di anomalie tra cui l'inattivazione di alcuni geni oncosoppressori, l'attivazione di numerosi oncogeni, riattivazioni di telomerasi e anomalie in diversi fattori di crescita o altri recettori. In particolare, il cancro al retto è considerato uno dei tumori più comunemente riscontrati in tutto il mondo. L'incidenza e l'indice di mortalità variano a seconda dell'area geografica. Negli Stati Uniti si stimano più di 130mila nuovi casi e più di 50mila morti nell'ultimo anno. Nell' Unione Europea , il tumore al retto rappresenta il 35% dei tumori colonrettali; l'incidenza è 15-25/100,000 all'anno e la mortalità è 4-10/100,000 all'anno. Mentre il cancro all'esofago è la sesta tra le cause maggiori di mortalità correlate al tumore e l'ottavo tipo di tumore più diffuso a livello mondiale. Nel mondo 450.000 persone sono affette da tumore all'esofago e la sua incidenza è in aumento. Il tumore all'esofago rappresenta la causa maggiore di morte per cancro nella popolazione maschile mondiale. La prognosi è relativamente sfavorevole con un tasso di sopravvivenza a 5 anni che varia dal 15% al 26% in base al tipo di trattamento; i risultati migliori si hanno con una diagnosi precoce della malattia durante gli stadi iniziali. La resezione chirurgica e la radioterapia rappresentano la terapia curativa per gli stadi precoci di tumore al retto e all'esofago ma una percentuale significativa di pazienti viene classificata come tumore localmente avanzato. In questo gruppo di pazienti, il tumore cresce oltre le pareti del retto o esofago oppure è in grado di invadere gli organi o strutture vicine; in questo caso la chirurgia e la radioterapia sono inadeguate portando ad un maggior rischio di ricaduta locoregionale e sviluppo di metastasi. Negli ultimi anni la combinazione di excisione chirurgica e terapia neoadiuvante prechirurgica è considerata come terapia gold standard per il tumore al retto ed esofageo localmente avanzato. Infatti in più della metà dei pazienti che vengono trattati con chemioterapia, tra cui 5-fluorouracile e/o cisplatino, mostrano un significativo downstaging del tumore iniziale e una riduzione di recidive locali. L'altra metà dei pazienti non è in grado di rispondere in maniera efficace alla chemioterapia. Attualmente non esistono variabili in grado di predire la risposta alla chemioterapia. Esistono però numerose variazioni interindividuali in meccanismi importanti come la riparazione del DNA e il metabolismo dei folati, delle pirimidine e del cisplatino che possono influire sulla resistenza alla radio e chemioterapia. Alcuni polimorfismi di geni conosciuti essere coinvolti in questi pathway sono stati ampiamente descritti in letteratura e sono stati associati con l'outcome del trattamento antitumorale. Ad oggi però non esiste ancora un pannello di polimorfismi in grado di predire l'outcome terapeutico e la maggiorparte degli studi utilizza modelli statistici lineari per analizzare i dati ottendo risultati inconsistenti. Anche per quanto riguarda l'analisi dei genotipi esistono molte divergenze, infatti la statistica lineare non è in grado di valutare l'epistasi ovvero le interazione che normalmente avvengono tra i geni a livello di due o più loci pertanto il fenotipo sarà differente se si considera l'espressione di un gene in maniera indipendente. Questo fenomeno molto frequente deve essere considerato qualora si intraprendano studi di farmacogenetica e la statistica lineare non è in grado di valutare questo aspetto. Il metodo Multifactor Dimensionality Reduction è stato progettato specificamente per identificare le interazioni tra variabili discrete che possono influenzare un outcome binario e attualmente viene sempre più utilizzato in studi di farmacogenetica in quanto il numero delle variabili che si vogliono analizzare è consistente. Questo metodo classifica i genotipi in “risposta” o “non risposta” in modo da ridurre la multidimensionalità dei dati in una sola dimensione, in questo modo è possibile individuare combinazioni genetiche che conferiscano un determinato grado di predittività della malattia. Lo scopo di questo studio consiste nel valutare la correlazione tra alcuni polimorfismi in geni coinvolti nella riparazione del DNA, nel pathway di detossificazione e nel meccanismo di azione e metabolismo dei farmaci antitumorali con l'outcome clinico dei trattamenti radiochemioterapici concomitanti impiegati attualmente come standard in neoadiuvante per i pazienti affetti da tumore al retto e all’esofago. Inoltre, si vuole valutare l’utilizzo di nuovi approcci statistici per individuare correlazioni genotipo-fenotipo. In questo studio sono stati arruolati 70 pazienti con tumore rettale di stadio II e II, di cui 18 femmine e 52 maschi con età media di 62 anni. Tutti i pazienti sono stati trattati per 5 settimane con 300 mg/m2/die di 5-fluorouracile mediante infusione venosa e contemporaneamente con radiazioni 56 Gy, seguito da resezione chirurgica. Le risposte a livello tumorale sono state direttamente valutate sui campioni chirurgici e ordinate secondo la classificazione TNM. I pazienti sono stati considerati come responsivi (se pT0 ovvero in caso di completa scomparsa del tumore e pertanto risposta completa; pT1 o pT2 in caso di risposta parziale) o non responsivi (se pT3 e pT4) Sono stati raccolti i campioni di sangue periferico dei pazienti arruolati e il DNA genomico è stato estratto da linfociti di sangue periferico mediante kit commerciale Wizard Genomic (Promega). Il DNA così ottenuto è stato utilizzato per l'analisi dei genotipi di ERCC1, XPD, XPA, XPC, XRCC1, XRCC3, UMPS, MTHFR677, MTHFR1298, TYMS 3'UTR and TYMS 5'VNTR mediante PCR-RFLP. In particolare abbiamo analizzato i seguenti SNPs: XRCC1 Arg399Gln (rs25487), MTHFR 677 C>T (rs1801133), MTHFR 1298 A>C (rs1801131),TYMS 3'UTR 1494del6 (rs34489327), TYMS 5'UTR 28bp (rs34743033), TYMS 5'UTR G/C (rs2853542), XPC Lys939Gln A>C (rs2228001), XPD (ERCC2) A>C (rs121913019), ERCC1 C>T (rs121913027), XRCC3 Thre241Met G>A (rs861539), UMPS T>C (rs10049380). La scelta dei polimorfismi da analizzare si è basata sulla ricerca degli stessi su dbSNP di NCBI in base alle frequenze genotipiche nella nostra popolazione. I genotipi sono stati correlati con gli outcome del tumore dopo chemioradioterapia considerando sia la risposta completa ovvero T0 vs T1-4 sia quella maggiore ovvero T0-2 vs T3-4. Per quanto riguarda il set di pazienti con tumore esofageo, sono stati arruolati 124 pazienti con tumore esofageo localmente avanzato e della giunzione gastroesofagea (GEJ) (T2-T4 con o senza linfonodi positivi) e trattati con CRT neoadiuvante. Tutti i pazienti hanno ricevuto settimanalmente docetaxel (35mg/m2) e cisplatino (25mg/m2), infusione protratta di fluorouracile (150mg/m2/die), radioterapia concomitante (50Gy) e successivamente intervento chirurgico radicale. Sono stati raccolti i campioni di sangue periferico dei pazienti arruolati e il DNA genomico è stato estratto da linfociti di sangue periferico mediante kit commerciale Wizard Genomic (Promega). Il DNA così ottenuto è stato utilizzato per l'analisi PCR- RFLP dei seguenti polimorfismi dei geni coinvolti nella riparazione del DNA (XPA-rs1800975, XPC-rs2228000, XPC-rs2228001, XPD-rs13181, XRCC1-rs25487, XRCC3-rs861539, ERCC1-rs11615), nel meccanismo del farmaco (MTHFR-rs1801133, TYMS-rs34743033, UMPS-rs1801019) e nella detossificazione (MDR1-rs2032582, GSTP1-rs1138272). Le risposte a livello tumorale sono state direttamente valutate sui campioni chirurgici e ordinate secondo la classificazione TNM. La risposta patologica completa (CR) è stata definita come assenza di tumore (ypT0N0); la risposta patologica quasi completa (nCR) è stata definita come presenza di microfoci di cellule tumorali nel sito primario con linfonodi negativi; i restanti pazienti sono stati classificati come non responsivi (NR). I pazienti CR ed nCR sono stati classificati invece come responsivi. La cancer specific survival (CSS) è stata definita come il tempo tra la diagnosi e la morte causata dal tumore; il relapse free survival (RFS) è stato definito come il tempo tra l'inizio della terapia e la prima evidenza di ricaduta della malattia. Le curve di sopravvivenza sono state calcolate con il metodo Kaplan-Meyer e confrontate utilizzando il log rank test. Le analisi statistiche sono state eseguite con il test chi quadro, regressione logistica e con il metodo Multifactor Dimensionality Reduction. I pazienti con tumore al retto che hanno risposto alla radiochemioterapia a livello tumorale sono stati suddivisi nel seguente modo: pT0 (pazienti in cui la massa tumorale era completamente sparita) 25,7%, pT1-pT2 (pazienti in cui la massa tumorale si era notevolmente ridotta ma non scomparsa del tutto) 34,3% e pT3-4 (pazienti in cui la massa tumorale era rimasta invariata o quasi dopo trattamento con cherioradioterapia) 40%. Pertanto poco meno della metà dei pazienti non hanno risposto al trattamento, in accordo con i dati di letteratura. Le genotipizzazioni di tutti i pazienti sono state correlate con la risposta patologica. L'analisi statistica con il test chi quadro non ha mostrato nessuna correlazione tra genotipi e risposta patologica. E' stato eseguito anche il test di regressione logistica e non sono state osservate correlazioni tra genotipo, età, sesso e risposta patologica. Al contrario invece, utilizzando il metodo MDR abbiamo dimostrato una correlazione significativa tra la combinazione delle varianti genetiche XRCC1/MTHFR677 e la risposta maggiore (p=0,0009) che è stata correttamente predetta nel 77,8% dei pazienti. Per quanto riguarda i pazienti con tumore esofageo, le analisi univariate mostrano che i genotipi MTHFR 677TT, MDR1 2677GT, GSTP1 114CC, XPC 499CC, e XPC 939AC+CC sono associati a un ridotto RFS con p value ≤ 0.1 e pertanto sono state definite come varianti ad alto rischio. Un modello che include questi 5 polimorfismi ha discriminato tre sottogruppi numericamente simili, portatori di 0-2 (n=48), 3 (n=38) e 4-5 (n=34) genotipi ad alto rischio, per i quali è stato calcolato un RFS a 5 anni di 67.1%, 50% e 20.9% (p=0.0002) rispettivamente e un CSS a 5 anni di 71.1%, 55.8% e 25.8% (p=0.0003) rispettivamente. Nel momento in cui il pannello di 5 SNPs è stato combinato con i dati istologici, le analisi hanno suddiviso i pazienti in due set principali con RFS a 5 anni dal 61% al 75% e dal 22% al 36%. In particolare, RFS a 5 anni era differente nel gruppo di pazienti con 3 varianti ad alto rischio e in accordo con l'istologia: 61% nei pazienti con tumore squamoso e 36% nei pazienti con adenocarcinoma (p=0.06). Globalmente, due classi di rischio potrebbero essere ottenute con i seguenti valori di RFS e CSS a 5 anni 65% vs 27% (HR 3.0, 95% CI 2.0-6.0, p<0.0001 e 69% vs 31% (HR 2.9, 95%CI 1.8-5.7, p<0.0001). La combinazione di risposta patologica con in pannello di 5 SNPs ha permesso la ridistribuzione di tutti i gruppi nelle due classi di rischio maggiormente informative: alto rischio (47.5% dei pazienti, inclusi tutti i NRs e nCRs con 3-5 genotipi sfavorevoli) e basso rischio (52.5% dei pazienti, inclusi tutti i CRs e nCRs con 0-2 genotipi sfavorevoli). Questi due gruppi hanno outcome statisticamente differenti: PFS a 5 anni 79.4% vs 17.7% (HR 6.71, 95% CI 3.98-12, p<0.0001) e CSS a 5 anni 79.3% vs 26.3% (HR 6.25, 95%CI 3.6-11.5, p<0.0001). La procedura di validazione interna mediante MDR ha confermato i nostri modelli come buoni predittori. Infine, oltre al pannello sono stati valutati i singoli polimorfismi in associazione con la risposta patologica per entrambi I set di pazienti, tumore all’esaofago e al retto, mediante analisi univariata. Il polimorfismo XPC Lys939Gln è stato significativamente associato alla risposta patologica: I pazienti con il genotipo wild type nell’84.1% dei casi hanno raggiunto una risposta patologica completa o maggiore rispetto al 52.6% e 40% dei pazienti eterozigoti o Gln omozigoti (p=0.0006). Nessun’altra associazione significativa è stata trovata con gli altri SNPs. Per quanto riguarda invece il set di pazienti con tumore al retto, a conferma di quanto detto sopra, le analisi univariate non hanno rilevato nessuna relazione statistica significatica tra la risposta patologica e gli SNPs, nemmeno con XPC Lys939Gln, predittivo di risposta invece nelle neoplasie esofagee; in questo caso il polimorfismo non era associato ad una significativa riduzione della massa tumorale nelle forme rettali (p=0.37). In conclusione, i nostri dati hanno dimostrato il ruolo di un pannello a 4/5 SNPs nel predire PFS e CSS in pazienti che hanno ricevuto lo stesso protocollo di terapia neoadiuvante chemioterapico. I polimorfismi di XPC, MDR1, GSTP1 e MTHFR meritano ulteriori valutazioni per guidare meglio le decisioni terapeutiche in pazienti con queste caratteristiche. Il polimorfismo XPC 939 è associato alla risposta patologica nei pazienti con tumore all’esofago ma non nei pazienti con tumore al retto. Inoltre, i nostri risultati ci permettono di affermare che l'epistasi dovrebbe essere sempre considerata nel momento in cui si analizzano associazioni farmacogenetiche. Il Multifactor Dimensionality Reduction è un metodo semplice e molto valido per individuare le combinazioni genetiche in grado di identificare quei pazienti con tumore al retto con un alta probabilità di rispondere in maniera soddisfacente alla chemioradioterapia.

The research project is focused on the evaluation of proteome in biological fluids from patients with renal cell carcinoma and diabetic nephropathy by a ClinProt-MALDI-TOF approach. Currently there aren’t specific biomarkers for an earlier diagnosis of RCC and nephropathic development especially in T1D patients. The most promising MS-based screening methods for the discovery of multiple biomarkers in body fluids is ClinProt, which couple a prefractionation chromatographic step with MS analysis. Renal Cell Carcinoma (RCC) is the most common kidney malignancy and its incidence is increasing worldwide each year. Since patients have a poor prognosis due to a lack of sensitivity to radio- and chemio-therapies biomarkers for early diagnosis and monitoring the state of disease are urgently needed. Concerning the diabetic nephropathy, it is the major vascular complication of type 1 diabetes and it is the leading cause of the end stage renal disease worldwide. The earliest diagnostic sign for the presence of diabetic renal damage is an increase in the albumin excretion rate, but unfortunately it isn’t an accurate predictor. So the study was aimed to perform profiling studies on urine/serum of healthy subjects and patients (RCC and diabetics with nephropathy) linking solid phase extraction technique using functionalized magnetic beads to MS analysis. In addition the proteome investigation was extended on patients with a non-RCC tumor allowing to distinguish different renal diseases. These results provided basis for the development of clinically valid proteins/peptides patterns for RCC and diabetic nephropathy diagnosis, improving the knowledge of the pathological processes in disease development.

Scopo della tesi è delineare un possibile approccio alla valutazione della cardiotossicità nei pazienti sottoposti a cure chemioterapiche a base di Antracicline, Taxani e Trastuzumab. Si valuta l'importanza e idoneità dell'ecografia volumetrica nella determinazione della funzionalità cardiaca in ambito oncologico e la fragilità della frazione di eiezione nel diagnosticare efficacemente la cardiotossicità indotta dai farmaci anti-tumorali, fornendo, come alternativa, il monitoraggio di strain longitudinale e biomarcatori come la Troponina I.

This doctoral dissertation aims to explore the in vivo role of Positron Emission Tomography (PET) imaging along the dementia continuum, from the preclinical to the prodromal and to the overt dementia phase, to provide a comprehensive picture of the mechanisms underlying neurodegeneration. Evidence in individuals with genetic risk to develop Alzheimer’s dementia suggests that the pathophysiological process leading to neurodegeneration starts years before the clinical diagnosis of dementia. For this reason, it is crucial to investigate biomarkers at the earliest possible stage of dementia. Mild Cognitive Impairment, pre-Mild Cognitive Impairment, and Subjective Cognitive Decline represent conditions with an increased risk of developing Alzheimer’s disease and other dementias, but some individuals will remain stable over time, and others will return to normal cognition. To correctly classify these subjects has significant therapeutic and prognostic repercussions. We investigated the diagnostic and prognostic role of FDG-PET in identifying subjects at risk for developing dementia and individuals with a favorable prognosis. We coupled brain metabolism information with in vivo pathological, structural, cerebrospinal fluid, and neuropsychological and neuropsychiatric data to improve diagnostic classification and predictive accuracy. We also explored the role of in vivo neuroinflammation in different stages of neurodegeneration, including Alzheimer’s disease dementia and Mild Cognitive Impairment. Neuroinflammation is a potential driver of neurodegenerative changes in several conditions, but its beneficial or detrimental role depends on the disease stage. Overall, our results confirm that the preclinical and prodromal stages of neurodegenerative dementias are heterogeneous states, and biomarkers assessment helps to classify or exclude individuals along the trajectory of neurodegeneration.
L'obiettivo di questa Tesi di Dottorato è di indagare il ruolo della PET (Tomografia ad Emissione di Positroni) come metodica di studio di soggetti appartenenti al continuum della demenza, dalle fasi preclinica e prodromica fino alla fase di demenza conclamata, per svelare i meccanismi che sottendono la neurodegenerazione. Lo studio di soggetti con rischio genetico di sviluppare demenza di Alzheimer ha portato all’evidenza che i processi patologici responsabili della neurodegenerazione hanno inizio anni prima delle manifestazioni cliniche della demenza. Per questo motivo è fondamentale identificare ed analizzare i marcatori di malattia il più precocemente possibile. Le condizioni di Mild Cognitive Impairment, pre-Mild Cognitive Impairment e Subjective Cognitive Decline includono soggetti con un rischio aumentato di sviluppare demenza rispetto alla popolazione generale, anche se molti di questi individui resteranno stabili nel tempo ed alcuni torneranno allo stato cognitivo iniziale. La corretta stratificazione di questi individui ha quindi importanti ripercussioni prognostiche e terapeutiche. Abbiamo pertanto indagato il ruolo diagnostico e prognostico della PET-FDG nell’identificare soggetti a rischio di demenza e soggetti con prognosi favorevole. I dati relativi al metabolismo cerebrale sono stati correlati a marcatori di patologia, strutturali, liquorali, neuropsicologici e neuropsichiatrici, per ottenere un’elevata accuratezza diagnostica e prognostica. E’ stata inoltre indagata la presenza di neuroinfiammazione in soggetti in diverse fasi di demenza neurodegenerativa, dalla demenza di Alzheimer alla fase di Mild Cognitive Impairment. La neuroinfiammazione è un importante attore nei cambiamenti degenerativi della demenza, ma il suo ruolo, protettivo o deleterio, dipende della fase di malattia. Nel complesso, i nostri risultati confermano che le fasi preclinica e prodromica di demenza sono condizioni eterogenee, e lo studio dei biomarcatori è necessario per identificare (o escludere) soggetti nella traiettoria della neurodegenerazione.

La neuropatia periferica indotta da chemioterapia (CIPN) rappresenta da tempo uno degli effetti collaterali neurologici più rilevanti delle terapie oncologiche. Tuttavia, nonostante i progressi dei regimi terapeutici oncologici, la comparsa di importanti eventi avversi influisce ancora sull’efficacia della terapia antineoplastica, portando alla riduzione o all’interruzione del trattamento. Il paclitaxel è un efficace agente antitumorale utilizzato nel trattamento di diversi tumori, sebbene il suo uso clinico sia spesso limitato dall’insorgenza della neuropatia periferica indotta da paclitaxel (PIPN). Si è ipotizzato che numerose alterazioni legate all’invecchiamento siano alla base della suscettibilità al danno nervoso in età avanzata. Tuttavia, i risultati di questi studi non sono conclusivi e altri potenziali biomarcatori di danno nervoso meritano di essere considerati. Su queste basi, lo scopo del nostro studio è stato quello di indagare gli effetti legati all'età del trattamento con paclitaxel sul sistema nervoso periferico e i cambiamenti metabolici che potrebbero essere indotti dalla somministrazione di paclitaxel a diverse età. Il nostro progetto comprendeva esperimenti di neurotossicità basati su valutazioni neurofisiologiche, comportamentali e istopatologiche per valutare le alterazioni fenotipiche indotte dalla chemioterapia in relazione all’età in un modello neuropatico di PIPN. Abbiamo inoltre analizzato, attraverso un approccio metabolomico mirato basato sulla cromatografia liquida ad alta prestazione e sulla spettrometria di massa (UPLC-MS), le differenze nei profili dei metaboliti plasmatici ed epatici, al fine di identificare potenziali biomarcatori di sviluppo e progressione della PIPN, in base all'età. Le nostre analisi hanno rivelato che l’età potrebbe essere un potenziale fattore di rischio per una CIPN più severa e dovrebbe essere presa in considerazione in studi futuri per adattare il regime terapeutico e il dosaggio del chemioterapico alla suscettibilità individuale dei pazienti oncologici in età più avanzata. Il nostro studio identifica inoltre per la prima volta molteplici assi metabolici coinvolti nella neurotossicità indotta da paclitaxel, come possibili bersagli molecolari e terapeutici nella PIPN.
Chemotherapy-induced peripheral neuropathy (CIPN) has long represented one of the most relevant neurological side effects of oncological therapies. Nevertheless, despite the progress in drug regimens, the occurrence of troublesome adverse events still affects the efficacy of antineoplastic therapy, leading to the reduction or discontinuation of the treatment. Paclitaxel is an anti-tubulin drug which has emerged as an efficacious antitumor agent in the treatment of different cancers. However, its clinical use is often limited by the onset of paclitaxel-induced peripheral neuropathy (PIPN). Numerous alterations related to aging have been hypothesized to underlie age-related susceptibility to nerve damage. Nevertheless, the results of these studies are inconclusive and other targets, which might be used as potential biomarkers of nerve impairment, deserve to be considered. On these bases, the aim of our study was to investigate the age-related effects of paclitaxel treatment on the peripheral nervous system, and the metabolic changes that might be induced by paclitaxel administration at different ages. Our project included neurotoxicity experiments based on neurophysiological, behavioral and histopathological evaluations to assess age-related chemotherapy-induced phenotypic alterations in a neuropathic model of PIPN. We additionally investigated through a targeted Ultra-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) based metabolomics approach differences in the plasma and liver metabolite profiles in order to identify potential biomarkers of PIPN development and progression, according to age. Our results suggest that age might be a potential risk factor for more severe CIPN, and should be considered in future studies in order to tailor the chemotherapy regimen and dosage on individual susceptibility of older cancer patients. Our study also identifies for the first time multiple related metabolic axes involved in paclitaxel-induced neurotoxicity, as promising molecular and therapeutic targets in PIPN.

Le vescicole extracellulari, che comprendono microvescicole rilasciate dalla membrane plasmatica ed esosomi che originano da corpi multivescicolari, sono vescicole di dimensioni nanometriche ricche di specifiche proteine, lipidi e acidi nucleici. Esse hanno un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare agendo da veicoli di molecole che possono avere una rilevanza sia diagnostica che terapeutica. L’obiettivo principale del progetto è lo sviluppo di un biosensore basato sulla Risonanza Plasmonica di Superficie imaging (SPRi) in grado di rilevare la presenza di vescicole di origine neurale presenti nel plasma umano e di caratterizzarle in base alla presenza e quantità relativa di specifiche molecole di membrana coinvolte nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Abbiamo dimostrato la possibilità di distinguere simultaneamente diverse popolazioni di vescicole extracellulari (neuronali e di origine gliale) circolanti nel plasma periferico e di valutare le differenze nella loro composizione in base alla loro origine cellulare analizzando la presenza e la quantità relativa di un’altra molecola di membrana (ganglioside GM1, che è noto essere coinvolto nella patogenesi dell’Alzheimer). Il biosensore così ottimizzato rappresenta una piattaforma promettente per la caratterizzazione delle vescicole coinvolte in malattie neurodegenerative e per il loro possibile utilizzo come biomarcatori periferici, permettendo un’accurata diagnosi, una corretta stratificazione dei pazienti e un affidabile monitoraggio della progressione della malattia. Inoltre, abbiamo dimostrato la potenzialità della tecnologia SPRi di individuare diversi microRNA per analisi cliniche. Considerando che le vescicole extracellulari contengono microRNA e rappresentano veicoli attraverso cui le cellule possono trasferire le une alle altre messaggi genetici, tale approccio potrebbe essere utilizzato per il miglioramento della rilevazione di biomarcatori periferici trasportati dalle vescicole. Questi risultati hanno dimostrato che la tecnologia SPRi può essere utilizzata per l’identificazione di specifiche componenti biochimiche (proteine, lipidi o microRNA) presenti nelle vescicole extracellulari di origine neurale isolate dal plasma periferico, come biomarcatori di facile accesso andando così ad evitare il prelievo invasivo di liquido cerebrospinale. In parallelo, abbiamo sviluppato un metodo basato sulla spettroscopia Raman per la caratterizzazione biochimica delle vescicole extracellulari che ha la potenzialità di essere utilizzato come metodo di controllo-qualità da svolgere di routine prima dell’utilizzo delle vescicole in vitro o in vivo come agenti terapeutici, dimostrando di essere anche più informativo rispetto ad altre tecniche complementari.
Extracellular vesicles (EVs), including microvesicles shed from the plasma membrane and exosomes originating from multivesicular bodies, are nano-scaled membrane vesicles enriched in specific proteins, lipids and nucleic acids, considered to be crucial intercellular communication vehicles for bioactive molecules with both diagnostic and therapeutic relevance. The main aim of the project is to design a biosensor using Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) in order to detect brain-derived EVs present in human plasma and to characterize them according to the presence and the relative amount of specific membrane molecules involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. We demonstrated the possibility to simultaneously distinguish neuronal and different glial populations of EVs circulating in the peripheral blood and to evaluate differences in their composition according to the cellular origin by analyzing the presence and relative amount of another membrane constituent (GM1, that it’s known to be involved in the pathogenesis of Alzheimer’s disease). The optimized SPRi biosensor represents a promising platform for the characterization of vesicles involved in neurodegenerative diseases and for their possible use as peripheral biomarkers, allowing an accurate diagnosis, a proper stratification of patients and a reliable monitoring of disease progression. Furthermore, we demonstrated the potentiality of using the SPRi technology for the detection of multiple miRNAs for clinical purposes. Considering that EVs contain miRNAs and represent a vehicle through which cells may transfer genetically encoded messages to other cells, this approach could be used for the implementation of the detection of EV-related circulating biomarkers. Our results demonstrated that SPRi technology could be used for the identification of specific biochemical components (proteins, lipids, or miRNAs) of brain-derived EVs obtained from blood as a source of surrogate brain disease-biomarkers of easy access avoiding the invasive collection of cerebrospinal fluid. In parallel, we have developed a method based on Raman spectroscopy for the biochemical characterization of EVs that could be used as a routine quality check method before their in vitro or in vivo use as therapeutic agents being also more informative compared to other complementary techniques.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la più frequente patologia neoplastica primitiva del fegato, il quinto tumore maligno in ordine di frequenza nel mondo e la terza causa di morte correlata a neoplasia maligna. La sua incidenza annuale è in costante crescita. Tra i fattori patologici che influenzano la sopravvivenza dei pazienti con HCC, la dimensione tumorale, il grado e l’invasione vascolare sono alcuni dei più significativi. Pazienti con tumori di piccole dimensioni (< cm. 3) e senza invasione vascolare hanno una sopravvivenza di circa il 50% in 5 anni. Dato che l’invasione vascolare ed il grado sono criteri difficili da valutare su biopsie, la ricerca si è concentrata sullo studio della biologia dell’HCC nella speranza di individuare marcatori molecolari predittivi del comportamento della malattia. In questo studio sono stati selezionati alcuni biomarcatori (alfa-tubulina, beta-tubulina, LAMA3, osteopontina, Ep-CAM, PAK1), associati a una prognosi sfavorevole ed alcuni marcatori recentemente usati come marcatori diagnostici (glipican3, glutamina sintetasi, heat shock protein 70) al fine di verificare se la loro iperespressione ha un potere predittivo sul comportamento dell’HCC. - Materiali e metodi. Per testare la sensibilità e specificità di questi marcatori, abbiamo usato 1) un microarray tissutale “occidentale” costituito da 98 casi di HCC, HCV-correlati e 2) un microarray tissutale “orientale” costituito da 136 casi di HCC, HBV-correlati. - Risultati. Abbiamo rilevato che le tubuline sono gli unici marcatori che si sono rivelati capaci di fornire informazioni prognostiche e consistenti sulle due popolazioni. OPN, Pak1 e Hsp70, singolarmente o combinati, possono predire una prognosi sfavorevole se applicati alla popolazione orientale. Gli altri marcatori devono essere ancora validati con ulteriori studi prima che si possano definire come marcatori prognostici dell’HCC. - Conclusioni. Infine, 1) abbiamo osservato un’espressione differente dei vari marcatori nelle due casistiche; 2) queste differenze sull’espressione dei marcatori può essere un riflesso delle differenze genetiche, eziologiche e epidemiologiche delle 2 popolazioni; 3) i parametri che emergono all’analisi multivariata sono tuttora criteri patologici: grado e angioinvasione macrovascolare, pertanto i nuovi anticorpi che saranno sviluppati dovranno essere confrontati a questi parametri.
Introduction - HCC ranks among the most lethal cancer in the world with rising incidence. Attempts have been made to predict prognosis in patients with HCC using histopathological features. Tumour grade, size, number of lesions, micro and macrovascular invasion have been correlated with tumor relapse and patient’s survival. However, despite the several therapeutic options today available (tumor ablation, resection, transplantation, chemotherapy and the recent medical therapy with biological drugs) , HCC treatment is largely dictated by gross macroscopic features such as the tumor size and the number of lesions. Thus there is a consistent need to identify tissue biomarkers as individual fingerprints to predict individual. In recent years the interest in molecular biomarkers of HCC genesis and progression has grown, both in terms of prognostic significance and of potential therapeutic targets. We have therefore selected a number of proteins involved in critical cell functions such as staminality, differentiation, adhesion, motility and vascular invasion with the purpose of identify a phenotypic profile able to predict HCC outcome. - Methods. Two tissue microarrays ( a western set composed of 98 HCV-correlated HCC cases and an eastern set composed of 136 HBV-correlated HCC cases) with clinicopathological information (aetiology, age, sex, grade, stage, micro and macro-vascular invasion, and patient’s follow up) was used to test the immunocytochemical expression of the following antigens: Ep-CAM, LAMA3, Osteopontin, PAK1, alpha- and beta-tubulin, CK19, GS, HSP70 e GPC3. - Results. Our data showed that tubulins are the only markers able to reveal prognostic information in both western and eastern population. Osteopontina, Pak1 and HSP70, singularly or associated with each other, are able to predict an unfavorable outcome in the eastern patients; the other markers should be validated with other studies. - Conclusions. Finally, 1) we observe different markers expression profile in the two different populations; 2) it may be a reflection of genetic, aetiology and epidemiology differences between the two populations; 3) grade and macroscopic vascular invasion are still the strongest pathological criteria on the multivariate analysis, so the new antibodies to be developed should be compared to these parameters.

Background. The Spondyloarthritis (SpA) are a group of a multifactorial diseases characterised by a complex interplay between an inherited background and environmental factors that lead to immune response dysregulation and inflammation of the joints, mainly the sacro-ileal. Different from rheumatoid arthritis, there are no specific biomarkers for disease activity in the SpA that could be used in clinical practice. New biomarkers discovery could be helpful for early diagnosis, monitoring of disease activity, as well as for prognosis, outcome measures, and for assessing treatment efficacy. In SpA patients, macrophages infiltrating the inflamed joints, derive from circulating monocytes, express not only inflammatory cytokines, like TNF-α, IL-1β or TGF-β, but also enzymes causing tissue destruction and remodelling, like metalloproteinases. Metalloproteinases (MMPs), MMP3 in particular, have been reported to be highly expressed in synovial tissue and in peripheral blood of SpA patients. Recent studies have showed that MMP8 and MMP9, in particular, are produced by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) if they are stimulated by calprotectin (S100A8/S100A9 heterodimer). The SpA synovial tissue is characterized by an increased vascularization and an infiltrate composed of nucleated polymorphs, macrophages and lymphocytes. In these cells calcium signals are essential for various cellular functions, including proliferation, differentiation, apoptosis, and gene transcription. The aims of this work are to investigate whether the TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 and MMP9 mRNA expression levels and intracellular calcium ([Ca2+]i) fluxes variations in PBMCs might be associated with SpA. Methods. The study population comprised 64 patients with a diagnosis of SpA (39 males and 25 females; mean age±standard deviation: 39.5±13.2 years) and 100 healthy controls (58 males and 42 females; mean age±standard deviation: 46.68.5). Among patients, 26 (40.6%) had diagnosis of Ankylosing Spondylitis (AS), (modified New York criteria) and 38 (59.3%) had a diagnosis of Psoriatic Arthritis (PsA) (CASPAR criteria). Blood samples were collected and complete blood count, CRP, ESR, uric acid, ALT and glucose were evaluated. Relative quantification (Real Time PCR) of TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 and MMP9 mRNA were performed. Intracellular calcium ([Ca2+]i) fluxes were studied in patients and controls monocyte cells by a fluorescent microscope. Results. The mRNA expression levels in PBMCs of TNF-α, IL-1β, TGF-β were similar in AS and PsA patients when compared to controls. The variations of TNF-α, TGF-β and IL-1β were correlated each other. TNF-α mRNA expression levels also show a significant correlation if patient’s relatives with SpA where found (t=-2.5386, p=0.013). MMP8 and MMP9 mRNA expression levels did not vary between controls and patients, nor they were related to disease clinical activity indices. S100A9 mRNA expression did not vary, the expression of S100A8 (F=3.29, p=0.039) was reduced in PsA patients. S100A8 and S100A9 expression levels were significantly correlated with circulating inflammatory cells and S100A8 was correlated with CRP and ESR. Monocytes from healthy controls had evident and frequent ([Ca2+]i) oscillations, while SpA patients monocytes did not. The percentage of cells exhibiting ([Ca2+]i) oscillations profile was significantly lower in AS with respect to controls (F=6.15, p=0.003). The percentage of monocytes with intracellular calcium oscillations and the studied molecules were not correlated with the type of therapy or of drug used. Conclusions. SpA associates with a reduced expression of the inflammatory S100A8 calcium binding protein and with a decreased intracellular calcium fluxes in patients' cells compared to healthy subjects, suggesting that the presence of the disease affects the "on-off" mechanisms that regulate the concentration of intracellular calcium.
Introduzione. Le Spondiloartriti (SpA) sono un gruppo di malattie multifattoriali caratterizzate da una complessa interazione tra fattori genetici ed ambientali che determinano una disregolazione del sistema immunitario e l’attivazione di processi infiammatori a livello articolare, in particolar modo nelle articolazioni sacro-iliache. A differenza dell’artrite reumatoide, nelle SpA non esistono dei biomarcatori specifici di attività di malattia che vengono utilizzati nella pratica clinica. Pertanto, la ricerca di nuovi biomarcatori potrebbe essere d’ausilio per una diagnosi precoce e per un adeguato monitoraggio dell’attività di malattia, oltre che essere impiegati come fattori prognostici, misure di outcome e strumenti di valutazione dell’efficacia di trattamento.Nei pazienti con SpA, i macrofagi che infiltrano le articolazioni e che derivano principalmente dai monociti circolanti non esprimono solo citochine infiammatorie come TNF-α, IL-1β o TGF-β ma anche enzimi coinvolti nel rimodellamento tissutale come le metallo proteinasi di matrice (MMPs). La metalloproteinasi di matrice 3 (MMP-3), infatti, è riconosciuta come una molecola altamente espressa nel tessuto sinoviale e nel sangue periferico dei pazienti con SpA. Studi recenti hanno evidenziato che le metallo proteinasi di matrice 8 e 9 (MMP8 e MMP9) vengono prodotte dalle cellule mononucleate derivate da sangue periferico (PBMCs) quando vengono stimolate da calprotectina (eterodimero formato dalle proteine S100A8 e S100A9).Vi è poi una crescente evidenza del ruolo patogenetico nelle Spa svolto dalle cellule appartenenti all’immunità innata quali macrofagi, mastociti e neutrofili; il tessuto sinoviale dei pazienti con SpA infatti è caratterizzato da una elevata vascolarizzazione e quindi da una forte infiltrazione delle cellule immunitarie. In queste cellule i segnali di calcio intracellulare sono essenziali nella regolazione di numerose funzioni cellulari incluse proliferazione, differenziazione, apoptosi e trascrizione genica. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di analizzare i livelli di espressione genica delle molecole TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 e MMP9 e di valutare se le variazione dei flussi di calcio intracellulare ([Ca2+]i) nei PBMCs potrebbero essere associati alla presenza di SpA. Metodi.La popolazione studiata comprendeva 64 pazienti con diagnosi di SpA (età media ± deviazione standard: 39.5 ± 13.2 anni; 39 maschi, 25 femmine) e 100 controlli sani (età media ± deviazione standard: 46.6 ± 8.5 anni; 58 maschi, 42 femmine). Tra i pazienti, 26 (40.6%) presentavano spondilite anchilosante (AS) e 38 (59.3%) artrite psoriasica (PsA), con diagnosi formulata sulla base dei criteri rispettivamente di New York e CASPAR. Per ciascun soggetto arruolato, sono stati raccolti i dati demografici e fisiologici, la storia clinica e familiare. Sono stati raccolti poi, campioni di sangue, al fine di valutare l’emocromo e la VES, e di determinare i livelli di PCR, acido urico, prealbumina, alanina aminotransferasi (ALT) e glucosio. Per ciascun soggetto è stata effettuata un’analisi di espressione genica relativa (Real Time PCR) di TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 e MMP9. La determinazione dei flussi di calico intracellulare ([Ca2+]i) nei pazienti e nei controlli è stata effettuate mediante microscopio ad epifluorescenza. Risultati. I livelli di espressione genica relativa nei PBMCs delle citochine infiammatorie of TNF-α, IL-1β, TGF-β erano simili nei pazienti con AS e PsA se comparati ai livelli di espressione nei controlli sani. Le variazioni dei livelli di espressione di TNF-α, TGF-β e IL-1β correlavano tra di loro. I livelli di espressione di TNF-α però risultavano correlati in maniera diretta, nei pazienti, con la presenza di una familiarità per la malattia (t=-2.5386, p=0.013). I livelli di espressione di MMP8 e MMP9 non risultavano essere associati con la diagnosi di SpA e non correlavano con gli indici clinici di attività di malattia.Anche i livelli di espressione di S100A9 non risultavano essere associati con la diagnosi di SpA mentre i livelli di espressione di S100A8 (F=3.29, p=0.039) erano ridotti nei pazienti con PsA.I livelli di espressione di S100A8 e S100A9 correlavano in maniera significativa con il numero di cellule infiammatorie circolanti e S100A8 correlava con i valori di PCR e VES. Dall’analisi dei dati ottenuti dai controlli sani e dai pazienti risultava evidente come la maggior parte dei monociti dei soggetti di controllo presentassero pulsazioni regolari di calcio intracellulare a differenza delle cellule ottenute da pazienti.I pazienti affetti da AS presentavano una ridotta percentuale di monociti con oscillazioni dei flussi di calcio intracellulare rispetto ai controlli sani (F=6.15, p=0.003). La percentuale di monociti con variazione di calcio intracellulare e l’ espressione delle molecole studiate non risultavano essere correlati ne con il tipo di terapia ne con il tipo di farmaco utilizzato. Conclusioni. In conclusione, I risultati di questo studio hanno evidenziato che nei pazienti con SpA vi è una ridotta espressione della proteina legante calcio S100A8 e vi è un decremento dei flussi di calcio intracellulare rispetto ai controlli sani, suggerendo che la presenza della malattia influenza i meccanismi "on-off" che regolano la concentrazione di calcio intracellulare.

Background: The clinical course of patients with glioblastoma is burdened with a poor prognosis. Furthermore, the hypercoagulable state associated with this cancer and the possible thromboembolic complications (VTE) may significantly worsen the prognosis. Moreover, the absence of tumor markers in glioblastoma makes the follow-up of these patients strictly dependent on the neuroimaging examination that might be controversial. Circulating tumor-derived microparticles (MPs), that are present in various types of tumors, associated with prothrombotic activity, were also found in the plasma of patients with glioblastoma. Objective: To evaluate the first postoperative thromboembolic complications after surgery for brain tumor in a sample of patients. To determine the relationship between circulating microparticles (MPs) and thromboembolism. To assess the relationship between MPs and progression of disease in patients treated for newly diagnosed glioblastoma in order to evaluate the possible use of MPs as markers of disease. Materials and methods: In 57 patients, without TEV and subjected to neurosurgical intervention for glioblastoma and meningioma, blood levels of D-Dimer before surgery and III and VII days after surgery were assayed. All patients received the same antithrombotic prophylaxis and lower extremities ultrasonography before surgery and seven days after surgery. We measured baselines levels of MPs and procoagulant activity in a second group of 25 patients treated for newly diagnosed GBM and we compared these data with a group of 75 healthy controls. We assayed MPs 1, 4 and 7 months after surgery, and we examined the possible occurrence of thromboembolic complications and disease progression. All patients underwent adjuvant treatment according to the protocol Stupp within 6 weeks after surgery. Results: In the first group of patients, VTE complication occurred in 17.5 % of patients without clinical signs or symptoms. The D-dimer level significantly increased in the basal sample, in third and seventh postoperative days in patients who developed VTE compared to those who did not develop VTE. In the second group of patients, circulating MPs and prothrombotic activity were significantly increased in patients compared to healthy controls. These counts were also significantly higher in patients who developed VTE compared to those who did not have this complication. Similarly, the circulating MPs were higher in patients who went against disease progression compared to stable controls. Conclusions: In the first post-operative period, the D-Dimer plasmatic levels’ trend can help in the diagnosis of VTE in the absence of clinical signs or symptoms. The increase of circulating MPs correlates with VTE strengthening the hypothesis of a prothrombotic role of these particles. The increase of circulating MPs in patients with progression of the disease seems suggest their possible use as tumoral markers.
Presupposti dello studio: Il decorso dei pazienti affetti del glioblastoma è gravato da una prognosi infausta. Inoltre, l’alterato assetto coagulativo che si associa a questa neoplasia e le possibili complicanze di natura tromboembolica (TEV) possono peggiorarne sensibilmente la prognosi. L’assenza di makers tumorali nel glioblastoma, inoltre, rende il follow-up dei pazienti strettamente dipendente dagli esami di neuroimaging che talvolta possono risultare di difficile interpretazione. Microparticelle plasmatiche di derivazione neoplastica (MPs), descritte in diversi tipi di neoplasie ed associate ad attività procoagulante, sono state riscontrate nei pazienti affetti da glioblastoma. Scopo dello studio: Valutare la complicanza tromboembolica nell’immediato post operatorio dopo intervento per neoplasia cerebrale in un campione di pazienti. Determinare la relazione tra complicanze tromboemboliche e MPs circolanti e valutare la correlazione tra MPs e progressione di malattia nei pazienti trattati per glioblastoma di nuova diagnosi per comprendere il possibile utilizzo delle MPs come markers di malattia. Materiali e metodi: In 57 pazienti, esenti da TEV e sottoposti ad intervento neurochirurgico per glioblastoma o meningioma, sono stati dosati i livelli ematici di D-Dimero preoperatoriamente, in III e in VII giornata postoperatoria. A tutti i pazienti è stata somministrata la medesima profilassi antitrombotica, preoperatoriamente e in VII giornata post operatoria è stato effettuato un EcoDoppler venoso. In un secondo gruppo di 25 pazienti trattati per GBM di prima diagnosi sono state dosate le MPs circolanti basali e quantificata l’attività coagulativa rispetto ad un gruppo di 75 controlli sani. Sono state dosate le MPs a controlli seriati preoperatoriamente, a 1, 4 e 7 mesi dopo la chirurgia ed esaminata l’eventuale insorgenza di complicanze tromboemboliche e di progressione di malattia. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a terapia adiuvante secondo il protocollo Stupp entro 6 settimane dall’intervento. Risultati: Nel primo gruppo di pazienti la complicanza tromboembolica si è verificata nel 17.5% dei pazienti in assenza di segni o sintomi clinici. Il D-Dimero è risultato significativamente aumentato nel prelievo basale, in III ed in VII giornata nei pazienti che hanno sviluppato TEV rispetto a quelli che non l’hanno sviluppata con un trend in progressivo aumento. Nel secondo gruppo di pazienti le MPs circolanti e l’attività procoagulante sono risultate significativamente aumentate rispetto ai controlli sani. Tali dosaggi erano significativamente più elevati nei pazienti che hanno sviluppato una TEV rispetto a quelli che non hanno avuto tale complicanza. Allo stesso modo le MPs circolanti erano più elevate nei pazienti che sono andati incontro a progressione di malattia rispetto ai controlli stabili. Conclusioni: Nell’immediato post operatorio l’andamento del D-Dimero può aiutare nella diagnosi di TEV in assenza di segni o sintomi evidenti. L’aumento delle MPs circolanti correla con la comparsa di TEV rafforzando l’ipotesi del ruolo procoagulante di queste particelle. L’aumento delle MPs nei pazienti con progressione di malattia, inoltre, sembra suggerire il loro possibile utilizzo come markers di malattia.

Lo scompenso cardiaco a frazione d’eiezione preservata è responsabile del 50% dei casi di insufficienza cardiaca. Obiettivo di questo studio è stato valutare nei pazienti con quadro di scompenso cardiaco a frazione d’eiezione preservata i seguenti end-point: 1- correlazione esistente tra specifici biomarkers e parametri ecocardiografici e di risonanza magnetica, al fine di individuare la diversa espressione strutturale e funzionale di uno scompenso cardiaco a frazione d’eiezione preservata 2- capacità di specifici fattori clinici, bioumorali e strutturali di predire gli eventi ad un anno, in particolare mortalità per tutte le cause e ri-ospedalizzazione per scompenso, così da identificare precocemente i pazienti a maggior rischio e poter intraprendere tempestivamente una strategia preventiva. La valutazione ecocardiografica della funzione diastolica e il dosaggio di biomarcatori espressione di rimodellamento ventricolare (sT2, GAL-3, GDF-15), turn-over della matrice extracellulare, stato infiammatorio (GDF-15, IL-6) , disbiosi (ossido di trimetilamina, TMAO) appare d’ausilio nella diagnosi e nella definizione della prognosi di pazienti con HFpEF; l’individuazione delle correlazioni esistenti tra tali parametri consentirebbe inoltre un’ulteriore definizione dell’espressione strutturale e clinica di quelli che potrebbero essere definiti differenti “fenotipi” di una condizione eterogenea quale è lo scompenso cardiaco a frazione d’eiezione preservata. Lo studio mediante risonanza magnetica potrebbe fornire importanti informazioni aggiuntive sul rimodellamento ventricolare, in particolare sulla presenza di fibrosi diffusa.

Obiettivo di questa tesi di dottorato è la messa a punto di sistemi di analisi dell’espressione genica basati sulla tecnologia dei microarrays per l’identificazione di potenziali biomarcatori genomici quali geni candidati per la comprensione della patogenesi molecolare, e la predittività fenotipica in una malattia monogenica, la Fibrosi Cistica e una patologia complessa ad eziologia multifattoriale, il cancro della prostata. In particolare, per quanto concerne la fibrosi cistica, lo studio ha riguardato l’analisi dell’espressione genica in due linee cellulari di epitelio bronchiale (CuFi1 F508del/F508del; CuFi3 F508del/R553X). A tal fine abbiamo ideato e utilizzato un oligoarray a bassa densità (CF-chip) contenente 144 geni selezionati in accordo a specifici criteri biochimici. Il maggior numero di geni trovati differenzialmente espressi in CuFi3 (26 su un totale di 38) suggerisce come la presenza di un allele di classe 1 (R553X) determini una maggiore alterazione del pattern di espressione genica rispetto alla sola presenza di alleli di classe II (F508del). Relativamente al cancro della prostata, lo studio è stato focalizzato all’identificazione di biomarcatori genomici propri di pattern specifici di espressione per la valutazione prognostica e terapeutica di cellule tumorali, androgeno-responsive (LNCaP) e non responsive (DU145), trattate con farmaci (acido valproico e dutasteride). Abbiamo osservato che l’acido valproico (VPA), un inibitore dell’istone deacetilasi (HDAC), promuove nelle LNCaP una differenziazione di tipo neuroendocrina caratterizzata da un aumento nell’espressione dell’enolasi neurone-specifica (NSE), una diminuzione di PSA e dell’espressione del recettore degli androgeni (AR), suggerendo un ruolo di tale farmaco nella risposta agli androgeni. Inoltre l’analisi del profilo di espressione genica usando un microarray a bassa densità (Androchip 1) contenente 103 geni coinvolti nell’omeostasi del cancro della prostata, ha mostrato che VPA è in grado di modulare l’espressione di differenti geni del metabolismo degli androgeni. Gli effetti cellulari e molecolari del trattamento con Dutasteride, un potente inibitore delle due isoforme della 5α-reduttasi (tipo I e tipo II ), nelle due linee cellulari umane di carcinoma prostatico LNCaP e DU145 sono stati investigati mediante lo sviluppo di un chip a bassa densità (Androchip 2) con 190 geni coinvolti nel pathway degli androgeni. I nostri risultati mostrano che la Dutasteride è in grado di ridurre la vitalità e la proliferazione in entrambe le due linee cellulari testate. Tuttavia il trattamento farmacologico è in grado di indurre un’alterazione del profilo dell’espressione genica esclusivamente nella linea cellulare LNCaP che, a differenza delle DU145, è androgeno responsiva e AR positiva. In conclusione, è interessante osservare che il nostro studio ci ha portato ad identificare biomarcatori genomici che proprio nella variazione dei livelli di espressione genica possono costituire dei veri e propri nuovi biomarcatori di interesse nella diagnostica e nella prognosi delle malattie mendeliane e complesse.

Obiettivi principali di questa tesi di dottorato sono lo studio dell’espressione genica e del profilo citogenetico, basato sulla tecnologia dei microarrays, per l’identificazione di potenziali biomarcatori genomici quali geni candidati per la comprensione della patogenesi molecolare del tumore della prostata, in linee primarie ottenute da campioni di carcinoma prostatico dopo rimozione chirurgica e lo studio degli eventuali geni differenzialmente espressi nelle colture primarie in linfociti estratti da sangue periferico di pazienti affetti da carcinoma prostatico e non trattati farmacologicamente, allo scopo di verificare se l’espressione differenziale è riscontrata anche nel sangue. E’ stato costruito un array a bassa densità costituito da 205 geni (“androchip”) selezionati sulla base del loro provato o potenziale ruolo nella cancerogenesi del carcinoma prostatico relazionati al pathway degli androgeni. E’ stata osservata un’alterata espressione dei geni coinvolti nella progressione verso l’androgeno indipendenza (BCL2, CALR e VIM) e nel contempo una diminuzione del gene PKC-beta, marcatore delle fasi iniziali della progressione del tumore. Inoltre è stato riscontrato un elevato aumento dell’espressione del gene NQO1. Questo gene è in grado di trasformare un farmaco anti tumorale, il β-lapacone, nella sua forma attiva e pertanto potrebbe essere un gene chiave nelle scelte terapeutiche da parte dei clinici. D’altro canto, dopo gli esperimenti di a-CGH non si è riscontrata alcuna anomalia a carico del corredo genomico delle linee primarie analizzate ad eccezione della perdita del cromosoma Y riscontrata in una linea primaria su dieci analizzate, prima con la piattaforma a BAC e confermata con la piattaforma Agilent a oligonucleotidi. Per quanto riguarda lo studio dei biomarcatori nel sangue di pazienti affetti da carcinoma prostatico, sono stati analizzati i geni NQO1, PKC-beta, BCL2 e ERBB2. Nel complesso i nostri dati hanno mostrato una effettiva variazione dell’espressione dei quattro geni esaminati. in particolare abbiamo riscontrato, in alcuni pazienti, una diminuzione dell’espressione di PCK-beta, gene ipo-espresso nelle primissime fasi della malattia e un aumento di espressione del gene ERBB2, gene correlato ad androgeno indipendenza e metastasi. In conclusione, questo lavoro ha portato all’individuazione di marcatori di prognosi sfavorevole in linee primarie ottenute da pazienti con carcinoma prostatico e all’identificazione e alla conferma del potenziale ruolo del gene ERBB2 come marcatore di prognosi nel sangue.
The aims of this study where to investigate expression profiles of genes related to androgen signaling and to screen genomic alterations in primary epithelial cultures derived from tissue explanted from patients undergoing radical prostatectomy to better understanding the rule of androgen pathway and of genomic copy number changes in the development and progression of prostate cancer. Moreover, we investigated expression profiles of selected genes (NQO1, PKC-beta, BCL2 e ERBB2) in circulating blood cells of prostate cancer patients to discover new biomarkers for diagnostic purposes. To carry out these aims we developed a low density home made oligonucleotide-array composed of 205 genes selected on the basis of their proved or potential role in prostate cancerogenesis related to androgen signalling (“AndroChip”), and we carried out array-based comparative genomic hibridization (aCGH) on primary epithelial cultures derived from tissue explanted from patients undergoing radical prostatectomy. After microarray experiments, considering only genes resulted significant in all primary cancer cell lines and whose differential expression had a threeshold>±1,5, we identified a total of 15 genes. In summary, we observed differential expression of genes (BCL2, CALR e VIM) able to confer androgen- independent growth and down regulation of PKC-beta gene that may be down-regulated at an early stage in the pathogenesis of prostate cancer. Moreover, we found over expression of NQO1 gene. High levels of NQO1 gene expression have been observed in many cancers as compared to normal tissues of the same origin. NQO1 bioactivates an anti-cancer agent, Beta-lapachone and so this gene could be exploitable target for the treatment of cancer cells that overexpress this enzyme. After aCGH experiment, we did not reveal genomic imbalances in 9 of the 10 samples examined. In one semple we detected the loss of the Y chromosome. These results demonstrate that no specific genomic biomarkers are detectable for early stage prostatic cancer. Moreover, we studied NQO1, PKC-beta, BCL2 e ERBB2 expression by RT-PCR real-time in peripheral blood mononuclear cell fraction samples of 7 patients with prostate cancer. All thogether, our results showed an differential expression profiles of examinated genes. In particular, we found down regulation of PCK-beta and up regulation of ERBB2. In conclusion, this study allowed to identify prognosis biomarkers in primary cell lines and confirmed that ERBB2 gene can be use as prognosis marker in blood.

Razionale: i test di imaging possono essere utilizzati per ottenere biomarcatori di composizione corporea. Imaging nella valutazione della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) Per capire il ruolo dei biomarcatori di imaging nella valutazione della NAFLD, è stata condotta una revisione sistematica per valutare le linee guida, concentrandosi sugli approcci di screening nei pazienti ad alto rischio. Delle 14 linee guida incluse, quelle britanniche e quelle del Nord America avevano i punteggi più alti. Applicando un algoritmo di valutazione basato su queste linee guida, 272 pazienti consecutivi con diabete di tipo 2 sono stati prospetticamente stratificati sulla base dei test di funzionalità epatica (LFT) e di scores di steatosi/fibrosi, generando 106 (39%) invii all’epatologo e 32 (11,8%) invii a biopsia epatica. Le 14 biopsie eseguite sono risultate in 12 NASH e 1 fibrosi significativa. Un algoritmo simile è stato applicato a 3 coorti prospettiche di pazienti HIV (totale 1534 pazienti), 313 (20,4%) con diabete o obesità, richiedendo quindi lo screening NAFLD. Tra questi 313 pazienti, 123 (39,3%) sono stati indirizzati all'epatologo. L’estensione dell'algoritmo anche a pazienti con altre comorbidità metaboliche (totale 1062 pazienti), richiederebbe l’invio all’epatologo in 341 (32,1%) pazienti. Una seconda revisione sistematica con l'obiettivo di valutare l'accuratezza dell'imaging rispetto alla biopsia nella diagnosi di NASH ha compreso 58 studi e diverse tecniche di imaging, con l'ecografia e la RM (elastografia e tecniche non elastografiche) che davano i risultati più promettenti (AUROC 0.80- 1), ma derivanti da singoli studi senza validazione indipendente. In uno studio prospettico 18 pazienti NAFLD inviati a biopsia (4 fibrosi significative e 15 NASH) sono stati sottoposti a ecografia con US-Fatty Liver Index e Shear Wave Elastography e RM epatica multiparametrica senza mezzo di contrasto. L’US ha dimostrato una scarsa performance nella diagnosi di NASH (sensibilità 50%, specificità 25%), ma ha permesso di escludere fibrosi significativa. Il T1-mapping in RM ha dimostrato sensibilità-specificità del 67%-79% per fibrosi e del 38%-80% per NASH. Steatosi epatica in pazienti oncologici In uno studio retrospettivo di 283 pazienti con cancro del retto in stadio II-IV, 90 (31,8%) avevano steatosi epatica alla TC baseline. La prevalenza di metastasi epatiche sincrone (LM) era maggiore nei pazienti con steatosi, ma l'incidenza di LM metacrone era simile. In una piccola analisi di 63 pazienti senza steatosi al basale e trattati con chemioterapia neoadiuvante, il danno epatico indotto dalla chemioterapia (definito sulla base di TC e LFT) era associato a maggiore incidenza di LM e peggiore sopravvivenza. Sarcopenia e grasso ectopico -COVID-19 In uno studio di 318 pazienti COVID-19 che hanno eseguito la TC torace al pronto soccorso, la densità del muscolo pettorale, le aree di tessuto adiposo totale, viscerale e intermuscolare (TAT, IVA e IMAT) all’altezza di T7-T8 sono state misurate retrospettivamente. Nei modelli multivariati, la diminuzione della densità muscolare, l'aumento di TAT, IVA e IMAT erano fattori di rischio per ricovero e ventilazione meccanica o morte. Parte dell'effetto dell'età sulla morte era mediato dalla sarcopenia. Linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) In uno studio retrospettivo su 116 pazienti con DLBCL, lo skeletal muscle index (SMI) e la densità (SMD) e l'IMAT a livello di L3 e della coscia prossimale (PT) sono stati ottenuti dalla TC baseline. Una bassa qualità (L3-SMD), ma non una bassa quantità muscolare (L3-SMI), era associata alla cessazione precoce della terapia, e a più brevi OS/PFS. Nei modelli multivariati, L3-SMD è rimasta associata a OS e l'aumento di PT-IMAT era un fattore prognostico sfavorevole per OS/PFS.
Rationale: Imaging tests may be used to obtain different biomarkers describing body composition. Imaging in Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) assessment To understand which role imaging biomarkers may have in NAFLD assessment, firstly a systematic review was conducted to appraise NAFLD guidelines, focusing on screening approaches in high-risk patients. Of the 14 guidelines included, British and North America guidelines had the highest scores. By applying a NAFLD assessment algorithm based on these guidelines, 272 consecutive type-2 diabetes patients at their first diagnosis were prospectively enrolled and stratified based on liver function tests (LFT) and steatosis/fibrosis scores, generating 106 (39%) hepatologist referrals and 32 (11.8%) liver biopsy referrals. The 14 biopsies performed resulted in 12 steatohepatitis and 1 significant fibrosis. A similar algorithm was applied to 3 prospective cohorts of HIV patients (total 1534 patients), 313 (20.4%) with diabetes or obesity, thus requiring NAFLD screening. Among these 313 patients, 123 (39.3%) were referred to the hepatologist. When extending the algorithm also to patients with other metabolic comorbidities (total 1062 patients), 341 (32.1%) would require hepatologist referral. A second systematic review with the aim of evaluating accuracy of imaging vs biopsy in diagnosing steatohepatitis (NASH) among NAFLD patients included 58 studies and several imaging techniques, with US and MR elastography and non-elastographic techniques having the most promising results (AUROC 0.80-1), but results derived mostly from single studies without independent validation. In an ongoing prospective study, 18 high-risk NAFLD patients referred for liver biopsy (4 significant fibrosis and 15 NASH) were enrolled and underwent US including US-Fatty Liver Index (US-FLI) and Shear Wave Elastography (SWE), and multiparametric liver non-contrast-enhanced MR. US resulted in poor accuracy for NASH diagnosis (sensitivity 50%, specificity 25%), but ruled out significant fibrosis. MR-T1 mapping resulted in 67% sensitivity and 79% specificity for significant fibrosis, and 38% sensitivity and 80% specificity for NASH. Fatty Liver in oncologic patients In a retrospective study including 283 stage II-IV rectal cancer patients, 90 (31,8%) patients had baseline CT-defined liver steatosis. The prevalence of synchronous liver metastasis (LM) was higher in patients with steatosis (19% vs 13%), but the incidence of metachronous LM was similar, without any significant association. In a small analysis of 63 patients without baseline steatosis and treated with neoadjuvant chemotherapy, chemotherapy-induced liver damage (defined based on CT and LFT) was associated with higher incidence of LM and worst survival. Sarcopenia and ectopic fat -COVID-19 In a study including 318 consecutive COVID-19 patients who performed chest CT scan at emergency room, pectoralis muscle density, total, visceral, and intermuscular adipose tissue areas (TAT, VAT, and IMAT) at T7-T8 vertebrae were retrospectively measured. In multivariate models, decreased muscle density, increased TAT, VAT, and IMAT were risk factors for hospitalization and mechanical ventilation or death. Part of the effect of age on death was mediated by sarcopenia. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) In a retrospective study of 116 consecutive DLBCL patients, skeletal muscle index (SMI) and density (SMD) and IMAT at L3 vertebra and proximal thigh (PT) were obtained from baseline CT scan. Low muscle quality (L3-SMD), but not low muscle quantity (L3-SMI), was associated with early therapy termination, shorter overall and progression-free survivals (OS, PFS). In multivariable models, L3-SMD remained associated with OS, and increasing PT-IMAT was a poor prognostic factor for OS/PFS.

Wilson’s disease, SAPHO syndrome and Hereditary angioedema are three rare disorders characterized by a wide spectrum of different clinical manifestations, which involve several organs and apparatus, making the diagnosis extremely difficult. In this study, the salivary proteome and peptidome of subjects affected by these pathologies has been investigated using mass spectrometry, through an integrated top-down and bottom-up platform, and compared with groups of healthy controls, with the aim to assess whether qualitative and quantitative variations of salivary proteins and peptides could be associated to the immune derangement distinctive of each disease and in order to have suggestions on potential specific salivary biomarkers. The analysis of the salivary proteome from patients affected by Wilson’s disease allowed to characterize new oxidized proteoforms of S100A8 and S100A9 and two fragments of the polymeric immunoglobulin receptor named ASVD and AVAD. Higher levels of these proteins and peptides observed in the patients are most likely connected to the oxidative stress, the activation of the inflammatory processes, and the hepatic damage caused by the altered copper transport and its subsequent accumulation in the organism, which is at the origin of the pathology. The observed increase of the level of α-defensins 2 and 4 may give a contribution to the development of the disease by the improvement of the free copper. The proteome of patients affected by SAPHO syndrome revealed a significant decrease of cystatins, histatins, and aPRPs, which are involved in the protection against infections, suggesting a reduced ability of these subjects to contrast bacteria colonization, in particular P. acnes which is a possible trigger of this disease. In particular, the lower levels of histatins and the higher frequency of S100A12 observed in patients with respect to controls, may be connected with the dysregulation of the innate immunity and the neutrophil response typical of SAPHO syndrome. Cystatin SN abundance decrease correlated with the disease duration, suggesting its reduced production during the chronic phase of the ~ 5 ~ disease, while histatins showed positive correlation with serum levels of the C reactive protein. In saliva of Hereditary angioedema patients, the increased percentage of peptides generated by the proteolytic cleavage by metalloproteinases indicates the intense metalloproteinase activity possibly connected to the activation of inflammatory pathways. Interestingly, in consideration of the possible role of cystatin B in enhancing the production of nitric oxide, and the higher salivary levels measured in the patients, we suggest that cystatin B may give a contribution to the vasodilatation and the vasopermeability responsible for the oedema formation, which is the main feature of this pathology. In conclusion, the results obtained in these studies clearly highlighted that the salivary proteome showed some features specific of the three pathologies. Even though these results have been obtained in a small cohort of patients, due to the difficult recruitment of subjects affected by rare disorders, and need further validation by using orthogonal techniques, they strongly suggest that saliva, with easy and non-invasive collection characteristics, could be a biofluid suitable for diagnostic applications.

L’attuale gold standard diagnostico nella routine clinica utilizzato per escludere la natura maligna di noduli tiroidei, è rappresentato dalla valutazione morfologica del materiale ottenuto da biopsie. Tuttavia, non sempre è possibile arrivare ad una diagnosi citologica affidabile e circa il 20-30% dei noduli risultano “inderterminati per malignità”. I pazienti con questa diagnosi vengono quindi sottoposti a tiroidectomia totale e dopo l’analisi istologica post-operatoria l’80% circa di essi risultano essere benigni. L’impatto dell’operazione sul paziente è rilevante poiché le funzioni fisiologiche della tiroide dovranno essere sostituite cronicamente con l’utilizzo di farmaci, il cui costo, in aggiunta a quello dell’operazione, ha un peso sul bilancio sanitario. Negli ultimi anni, nel campo della ricerca biomedica, grande attenzione è stata riposta verso l’analisi proteomica e verso la sua potenziale applicazione nella ricerca di nuovi biomarcatori, determinanti nel discriminare noduli benigni da maligni in modo da minimizzare la diagnosi di malignità indeterminata. La spettrometria di massa è uno degli strumenti più importanti per ottenere informazioni riguardanti la composizione molecolare di un campione, la presenza di biomolecole e la loro abbondanza. Tra i diversi approcci proteomici in grado di identificare alterazioni molecolari di diversi tipi di lesioni, la tecnica di Imaging MALDI-MSI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Mass Spectrometry Imaging) ha guadagnato sempre più spazio e interesse. MALDI-MSI rappresenta una tecnologia ideale che permette di esplorare la distribuzione spaziale di biomolecole nel tessuto integrando informazioni molecolari e quelle tradizionali morfologiche. Visti i recenti risultati ottenuti tramite l’analisi MALDI-MSI di campioni di tessuto tiroideo nell’identificazione di segnali proteomici in grado di discriminare casi benigni da maligni, l’idea che è nata è stata quella di applicare per la prima volta questo tipo di analisi a campioni citologici ottenuti da biopsie di noduli tiroidei. Prima di poter applicare la tecnica MALDI allo studio clinico, il protocollo di analisi è stato ottimizzato per evitare problemi di degradazione, fenomeni di alterazioni o contaminazioni e formazione di artefatti. Due diversi problemi tecnici quali i) l’interferenza dell’emoglobina a causa dell’elevata vascolarizzazione dell’organo e ii) la stabilità del campione nel tempo prima dell’analisi da un punto di vista morfologico e proteomico, sono stati affrontati e risolti in due studi pianificati come parte del progetto di tesi. In origine lo studio clinico per l’identificazione di potenziali cluster di segnali con proprietà discriminanti prendeva in considerazione un ampio numero di campioni di noduli tiroidei ma, a causa del lento arruolamento di casi maligni per la loro natura rara, la tesi contiene solo i risultati di un analisi preliminare. 18 soggetti sono stati arruolati per il training set (9 noduli benigni e 9 maligni). Il modello di regressione logistica penalizzato (LASSO) è stato costruito su un set di dati di 81 regioni di interesse, in accordo con l’identificazione morfologica operata dal patologo per evitare false informazioni derivanti da cellule diverse dai tirociti. Il modello di classificazione è stato validato su 11 pazienti con diversi tipi di lesioni (i.e. benigna, indeterminata e maligna). I risultati sono molto promettenti e sottolineano la possibilità di introdurre MALDI-MSI come uno strumento complementare nella caratterizzazione diagnostica delle lesioni tiroidee. Sono inoltre stati esaminati gli indici di similarità più utilizzati tra i numerosi profili di spettri ed è stata proposta una nuova misura. Uno studio di simulazione di spettri di massa è stato poi implementato per identificare le migliori misure di similarità in termini di performance, da applicare per comparare profili proteomici.
The actual gold standard to exclude the malignant nature of thyroid nodules in the clinical routine is represented by thyroid Fine Needle Aspirations (FNAs) biopsies. Thyroid FNAs are safe and cost-effective. Approximately the 20-30% of cases have an indeterminate for malignancy final report. These patients undergo diagnostic (and not therapeutic) thyroidectomy, but after surgery the 80% of these thyroid nodules are benign. This overtreatment has of course important consequences in the quality of life of the patients and high healthcare costs. The application of -omics techniques might have a potential role in the research for new diagnostic markers able to discriminate benign from malignant nodules, thus minimizing the challenging cases of indeterminate for malignancy. Mass spectrometry is one of the most important analytical tools able to obtain information regarding the molecular composition of a sample, the presence of biomolecules and their abundance. Among the different proteomics approaches able to extract the molecular alterations of the different type of specimen’s lesion, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Mass Spectrometry Imaging (MSI) was strongly emerging. MALDI-MSI represents an ideal technology that enables to explore the spatial distribution of biomolecules within tissue, integrating molecular and traditional morphological information while preserving the integrity of the analysed tissue. Various studies applied MALDI-MSI technology for prognostic purposes and for in real time diagnostic setting, showing the usefulness, advantages and applicability of MALDI-MSI in different fields of pathology. Due to the promising results recently obtained with MALDI-MSI in the identification of proteomic signals able to differentiate between benign and malignant cases from the analysis of thyroid tissue after surgery , the idea was to apply for the first time MALDI-MSI on real thyroid FNAs biopsies. Preliminary to the clinical study, the protocol for the proteomic MALDI-MSI analysis was optimised to avoid degradation, alteration phenomena, contamination and artefacts formation. The methodological improvement of the protocol in a complicated field as thyroid cytological specimens played an important role in this study. Challenging technical aspects, such as i) the interference of haemoglobin due to the high vascularization of the thyroid organ and ii) the stability of the samples over time before the analysis from a morphological and proteomic point of view, were overcome through two studies that were planned and analysed as part of the thesis. The clinical study for the detection of the potential cluster of signals with discriminant capability was originally planned to involve a large sample of thyroid nodules, however, due to the slow enrolment rate of malignant cases, the thesis contains only the results of a preliminary analysis. Eighteen subjects contributed to the training set with 9 benign and 9 malignant thyroid nodules. The statistical model was based on data of 81 specific region of interest, according to the morphological triage performed by the pathologist in order to overcome false information deriving from non thyrocytes cells. The validation phase was performed on 11 patients with different type of lesions (i.e. benign, indeterminate and malignant). Results are very promising and highlight the possibility to introduce MALDI-MSI as a complementary tool for the diagnostic characterization of thyroid lesions. A methodological aspect that emerged from the peculiarity of the proteomic analysis was also investigated. A review of the most used indices for the assessment of the similarity between mass spectra profiles was performed and a new measure was proposed. A simulation study was implemented in order to identify the best similarity measure to use in comparing proteomic profiles.

Background. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is one of the most common idiopathic interstitial lung diseases characterized by progressive lung scarring and a very poor overall prognosis with a median survival of 2-3 years. Despite extensive research efforts, the etiopathogenesis and pathophysiology of IPF are still little understood and consequently only slight improvement has been made for appropriate management and effective therapies. Some advances have been made in understanding the multiple interrelated pathogenic pathways underlying IPF and the disease is now considered to result from complex interactions among genetic, epigenetic, transcriptional, post-transcriptional, metabolic and environmental factors. Thus, the discovery and validation of theranostic biomarkers are necessary to enable a more precise and earlier diagnosis of IPF and to improve the prediction of future disease behavior. Usual interstitial pneumonia (UIP) is the histopathological pattern of IPF characterized by spatial/temporal heterogeneous histological lesions. Fibroblastic focus (FF) areas include fibroblasts and myofibroblasts arranged in a linear fashion with a pale staining matrix, with metaplastic epithelial cells lining on top of them. They are usually detected in the transitional area from dense scarring to normal lung and are considered an “active” component in IPF pathogenesis. Aim of the research. The main goal of the present PhD research project was the identification of crucial biomarkers in IPF pathogenesis by extracting RNA from FF areas (FF plus metaplastic epithelial cells lining FF). The main steps of the study were the following: 1) validation of a protocol for the isolation of FF areas by laser microdissection of formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissues of IPF patients and controls; 2) total RNA extraction, quality and quantity evaluation; 3) creation of cDNA libraries starting from the extracted RNAs; 4) transcriptomic analysis by a Next-Generation Sequencing (NGS) approach (RNA-sequencing; RNA-Seq); 5) validation of the biomarker emerged from the transcriptomic analysis in a more extensive (retrospective) cases series using immunohistochemistry. Material and Methods. Total RNA was extracted from fibroblastic focus areas isolated with laser microdissection in 10 FFPE IPF lung tissues: 8 from lung transplanted patients and 2 from surgical biopsy. Microdissected fibroblastic focus areas from 2 patients with recurrent pneumothorax were also analyzed and considered as controls. The RNA was extracted using a modified protocol which provides an overnight tissue incubation at 43°C with 10 μl proteinase K. RNA was then preserved by adding RNase inhibitors at the end of the extraction procedure. This was a custom-made protocol (RNeasy® FFPE kit; Qiagen, Hilden, Germany) with additional procedures optimized during my PhD research study. The final RNAs quality and quantity were valuated with an Agilent RNA 6000 Pico Kit using a 2100 Bioanalyzer instrument. Quality was expressed as DV200 (percentage of RNA fragments > 200 nucleotides). Libraries were obtained with the SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit pico input mammalian of Takara Bio. DNA library was sequenced with a paired-end sequencing 2x150 bp on a HiSeq 4000 System sequencer of Illumina. MUC5B immunohistochemistry (clone 4A10-H2; 1:200, Novus Biologicals, Centennial, Colorado, USA) was performed in 44 interstitial lung disease (ILD) cases (39 UIP/IPF and 5 ILD with no UIP pattern) and 6 controls (5 spontaneous pneumothorax and 1 emphysema) following the antibody manufacturer's protocol using a Leica Bond-III Autostainer. Results. Considering the whole population the mean quantity of extracted RNA was 2992.8 pg/µl±2473 (mean ± SD), ranging from 840 pg/µl to 7530 pg/µl. Quality evaluation showed 42% of total cases with a medium/high quality (DV200>50%). In all cases molecular analyses were performed and final libraries were obtained with a concentration ranging from 3.4 to 22.6 ng/ul and a mean cDNA fragment length of 289 nucleotides. RNA-Seq analysis showed that 323 genes were differentially expressed in UIP/IPF cases than controls: 14 of them were up-regulated and 309 down-regulated. The most significant up-regulated gene was MUC5B, the other up-regulated genes were those involved in epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and epithelial carcinogenesis process. Gene Ontology Enrichment Analysis (GOEA) was performed to identify the most enriched Gene Ontology (GO) categories for the down-regulated genes. We found that extracellular matrix structure and organization were the principally down-regulated pathways. The overexpressed gene MUC5B was validated by immunohistochemistry. MUC5B was expressed only in IPF/UIP and ILDs, never in control group. The MUC5B expression was mainly detected in metaplastic epithelial cells lining: a) honeycomb areas, b) other alveolar spaces and c) in the metaplastic epithelial cells lining FF. Interestingly, a gradient of MUC5B expression was detected both in IPF/UIP and ILDs samples where MUC5B was overexpressed in lower lobes. Interestingly, MUC5B was overexpressed in upper and middle lobes of IPF/UIP compared with the same lobes of other ILDs. Conclusion. The principal results obtained from the present research study offer interesting insights into the complex molecular system signature of IPF: 1) adequate quantity and quality of RNA was extracted from microdissected FF areas of FFPE IPF lung tissues. The quantity/quality of RNA was suitable to create cDNA libraries for transcriptomic analysis by RNA-seq: this represents an important step forward in tissue molecular investigation of this disease characterized by high tissue heterogeneity. Only a very few papers in the literature have used lung FFPE tissue for molecular analysis, in particular, this molecular approach on specific affected IPF tissues has not previously used. 2) Comparative analysis performed on selected areas found an overexpression of epithelial proliferation/cancer progression and EMT transcripts: this highlights the crucial role of metaplastic epithelial cells that are the key actors also in the FF areas, considered the active injured lesion in IPF. 3) The up-regulated transcript MUC5B, validated also by immunohistochemistry, confirms the crucial role of this mucin in the disease. Indeed previous works, mainly performed in blood samples, had highlighted the importance of this gene in the disease. Selective regulation of MUC5B in experimental models could open up an entire line of investigation that could bring us closer to understanding regulation of MUC5B and providing novel therapeutic options.

The aim of this work was to study: 1) the welfare in breeders of clam (Venerupis philippinarum and Venerupis decussata) using different biomarkers (cortisol, stress oxidative biomarkers, detoxification enzymes); 2) the reproduction and the larval development of these molluscs. The first study evaluated the variation of cortisol in clams subjected to the following stress conditions: anoxia and fasting. The study evidenced a tendency in the increase of cortisol in the animals under anoxia and a decrease in the animals under fasting conditions. In a successive work was evaluated the general morphology and the oxidative stress response in clams sampled at different sites of the Venice Lagoon. The histological evaluation revealed the presence of the parasite Perkinsus olseni in animals from all sites, with an intense immunitary response of the hosts. The hemocytes, that participate at the infiammatory response, showed an intense immunopositivity to several antibodies of the oxidative stress. The bivalve molluscs are often used as biondicator of environmental pollution, so we decided to evaluate the expression of two genes involved in the detoxification process of xenobiotics, in animals treated with different concentrations of benzo(a)pyrene. The expression of GSTr evidenced a significant increase of mRNA in the animals treated with the highest dose, but the analysis of CYP4 expression did not evidence differences among treatments. In treated animals, the histopatological analysis revealed an increase of a particular type of cells involved in the detoxification process of molluscs called brown cells. In the second part of the work we investigated about the reproduction of these bivalves using an histological approach to evaluate the gonad maturation and a radioimmunoassay method to analyse the sex steroids variation. The steroids progesterone, 17β-estradiol and testosterone resulted involved in the gonad maturation of the clams. The histological analysis revealed a different time of maturation of the two species of clams. The study of the larval development revealed useful information about the larval management.
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare: 1) lo stato di benessere in riproduttori di vongola Venerupis philippinarum e Venerupis decussata con l’utilizzo di biomarcatori (cortisolo, marcatori di stress ossidativo, enzimi di detossificazione); 2) la riproduzione e i primi stati larvali di questi molluschi. La prima sperimentazione ha valutato la variazione del cortisolo in vongole sottoposte a due tipi di stress: anossia e digiuno. E’ stata evidenziata una tendenza all’aumento del cortisolo negli animali sottoposti ad anossia e una diminuzione negli animali a digiuno. In un successivo lavoro sono stati valutati la morfologia generale e la risposta allo stress ossidativo in vongole campionate in vari siti della Laguna di Venezia. L’analisi istologica ha rivelato la presenza del parassita Perkinsus olseni negli animali di tutti i siti con un intensa risposta immunitaria da parte dell’ospite. Gli emociti implicati nella risposta immunitaria, hanno mostrato una immunopositività agli anticorpi dello stress ossidativo. Nell’intento di individuare dei marcatori di stress, visto che i molluschi bivalvi sono spesso utilizzati come bioindicatori dell’inquinamento ambientale, si è deciso di valutare l’espressione di alcuni geni (CYP4-GSTr) implicati nei processi di depurazione degli xenobiotici, in animali sottoposti a differenti dosi di benzo(a)pirene. L’analisi dell’espressione del GSTr ha mostrato un aumento significativo dell’mRNA negli animali sottoposti alla dose maggiore, ma l’analisi dell’espressione del CYP4 non ha evidenziato differenze tra i trattamenti. Su questi animali, l’analisi istopatologica ha evidenziato, negli animali trattati, un incremento di un tipo particolare di cellule coinvolte nei processi di detossificazione nei molluschi chiamate brown cells. Per quanto riguarda lo studio sulla riproduzione di questi bivalvi, è stata condotta un’analisi istologica per valutare la maturazione gonadica e una analisi radioimmunologica per determinare la variazione degli steroidi sessuali in animali pescati in natura e stabulati presso l’impianto di Veneto Agricoltura alle condizioni previste dal protocollo dell’Azienda per la produzione di larve di vongola, al fine di ottenere informazioni per eventualmente migliorarlo. Gli steroidi sessuali testosterone, estradiolo e progesterone sono risultati essere implicati nello sviluppo gonadico delle vongole. L’analisi istologica ha evidenziato differenti tempi di maturazione delle gonadi delle due specie di Venerupis analizzate. Lo studio sullo sviluppo larvale ha permesso di fornire informazioni utili sui tempi di sviluppo dei primi stadi larvali.