Dissertations / Theses on the topic 'Biomolecular motors'

xiv, 171 p. ; ill. (some col.) A print copy of this title is available through the UO Libraries. Search the library catalog for the location and call number.
Biological molecular motors, which use chemical energy from ATP hydrolysis to generate mechanical force, are involved in a variety of important mechanical processes in eukaryotic cells, such as intracellular transport, cell division and muscle contraction. These motors, which produce motion on the nanoscale, operate in the presence of substantial thermal noise. In this dissertation, two approaches are used to model the physics of nanoscale motors: (1) A theoretically established type of Brownian motor called the "flashing ratchet" is studied. This motor transports diffusive particles in a preferred direction. (2) A coarse-grained mechanical model for the biological molecular motor myosin-V is developed, and used to study the role of Brownian diffusion, and the interaction between chemical and mechanical degrees of freedom, in the transport mechanism of this motor. In chapter III, Brownian dynamics simulations and analytical calculations demonstrate that the average velocity of rigid chains of particles in a flashing ratchet reverses direction in response to changing the size of the chain or the temperature of the heat bath. Recent studies have introduced policies for "closed-loop" control of a flashing ratchet, in which the system is controlled based on information about its internal state (such as the positional distribution of particles). In chapter IV, the effect of time delay on the implementation of closed-loop control of a flashing ratchet is investigated. For a large ensemble, a well-chosen delay time improves the ratchet performance (increasing the velocity) by synchronizing into a quasi-stable mode that takes advantage of the semi-deterministic nature of the time development of average quantities for a large ensemble. I n chapter V, a coarse-grained mechanical model is presented for the transport mechanism of myosin-V, which walks along intracellular filaments. The model is well constrained by experimental data on the mechanical properties of myosin V and on the kinetic cycle. An experimentally motivated model for the intramolecular coordination of the motor's steps is proposed and tested.
Adviser: Heiner Linke

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2008.
Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 164-171). Also available online in Scholars' Bank; and in ProQuest, free to University of Oregon users.

Neuerliche Fortschritte im Verständnis biomolekularer Motoren rücken ihre Anwendung als Nanomaschinen in den Bereich des Möglichen. So könnten sie zum Beispiel als Nanoroboter arbeiten, um in molekularen Fabriken kleine – aber dennoch komplizierte – Strukturen auf winzigen Förderbändern herzustellen, um Netzwerke molekularer Nanodrähte und Transistoren für elektronische Anwendungen zu assemblieren oder sie könnten in adaptiven Materialien patrouillieren und diese, wenn nötig, reparieren. In diesem Sinne besitzen biomolekulare Motoren das Potenzial, die Basis für die Konstruktion, Strukturierung und Wartung nanoskaliger Materialien zu bilden
Recent advances in understanding how biomolecular motors work have raised the possibility that they might find applications as nanomachines. For example, they could be used as molecule- sized robots that work in molecular factories where small, but intricate structures are made on tiny assembly lines, that construct networks of molecular conductors and transistors for use as electrical circuits, or that continually patrol inside “adaptive” materials and repair them when necessary. Thus biomolecular motors could form the basis of bottom-up approaches for constructing, active structuring and maintenance at the nanometer scale

Biomolecular motor based transport reconstituted in synthetic environment has been recently established as a promising component for the development of nanoscale devices. A minimal system consisting of microtubules propelled over a surface of immobilized kinesin motor proteins has been used to transport and manipulate cargo for molecular sorting, analyte detection, and other novel nanotechnological applications. Despite these achievements, further progress of the field and translation of the reported applications to a real-world setting require overcoming several key challenges, such as, development of effective cargo conjugation strategies and precise control of the transport directionality with the reconstituted biomolecular motor systems. The challenge of cargo conjugation is addressed in this thesis through the development of a robust bioorthogonal strategy to functionalize microtubules. The versatility of the developed method is demonstrated by covalently conjugating various types of cargos to microtubules. Further, the effect of the linker length on cargo attachment to microtubules is investigated by attaching cargo to microtubules via linkers of different lengths. By using kinesin-driven transport of microtubules that are covalently conjugated to antibodies, detection of various clinically relevant analytes is demonstrated as proof-of-principle applications for biosensing. Finally, the challenge of gaining control over transport directionality is addressed through topographical guiding of microtubules in nanostructures, and optimization of assay parameters to achieve successful guiding of microtubules. Spatio-temporal analyte concentration, using transport in these nanostructues, is also explored to make the biomolecular-motor based applications more suitable for use real-world point-of-care setting. Taken together, the experimental work in this thesis contributes to the field of nanotechnological applications of biomolecular motors. The developed microtubule functionalization method and understanding of the effect of cargo attachment via linkers provide useful design principles for efficient cargo loading to microtubules. Moreover, establishment of assay components for successful guiding of microtubules in nanostructures is a vital step forward for practical translation of future nanoscale devices.

A major challenge in nanotechnology is the controlled transport of cargo on the nanometer scale. A promising approach to this problem is the use of molecular motors of the cellular cytoskeleton. The aim of this work was to develop a method to characterize the behavior of filamentous nanoshuttles – specifically of motor protein-driven microtubules – in three dimensions (3-D). The main requirements to meet were low impact on the nanotransport system, high spatial and temporal resolution, and versatility. Furthermore, this method was intended to be used to address open questions in the field of nanotransport. In particular, it was firstly attempted to characterize cargo transport in a system currently favored by most studies in the field, where nanoshuttles are powered by the microtubule motor best understood so far – the plus-end-directed kinesin-1. Secondly, the goal was to further the understanding of potential counter-players of kinesin-1 in nanotransport applications - the much less well understood microtubule minus-end-directed motor proteins 22S dynein and the kinesin-14 non-claret disjunctional (ncd). A novel method to study the linear forward motion as well as the axial motion of filamentous nanoshuttles, which are driven by motors of the cell cytoskeleton, has been introduced. The method uses fluorescence interference-based 3-D nanometer tracking of quantum dots as optical probes that are attached to the nanoshuttles. While other recently reported 3-D tracking techniques based on dual-focus imaging offer similar sensitivity, the method here can be easily performed on any standard epi-fluorescence microscope, even with arc lamp illumination, and additionally holds the potential to retrieve absolute height values. It is strongly suggested that the ease of use might help to spread this valuable and versatile tool for a variety of applications, including studies of interactions between single molecules or even intramolecular changes. Specifically, 3-D tracking has been used to visualize and analyze the rotation of microtubules around their longitudinal axis when they are propelled on a motor protein-coated surface. This geometry called gliding assay is currently favored for most proof-of-principle studies that investigate the use of biomolecular motors for transport of nanoscale cargo with the goal to assemble and manipulate nanostructures. The suitability of the method has been proven for kinesin-1 gliding assays, where knowledge of properties of both, microtubules and kinesin-1, allowed a very precise prediction of microtubule rotation, which was matching the actual measured values very well. The microtubule rotation in kinesin-1 gliding assays has turned out to be robust against the attachment of small cargo in the shape of quantum dots (diameter ∼20 nm), but also against the reduction of electrostatic interactions between microtubules and kinesin-1 by cleavage of the tubulin E-hook. The situation was dramatically different when large cargo (beads with diameter of ∼3 µm) was attached to microtubules. In this case, filament rotation was stopped, but otherwise the impact on motility was surprisingly low. In particular, the velocity of the gliding microtubules only decreased to a negligible degree. This shows that in principle microtubules driven by processive motors like kinesin-1 can make flexible, responsive and effective molecular shuttles for nanotransport applications. In addition, the results might indicate that in vivo kinesin-1 molecules, which transport cargo along microtubules, can likewise flexibly respond to an axial force by deviating from their path parallel to the protofilament axes. Two microtubule minus-end-directed motors that might be employed to counteract kinesin-1 in engineered nanotransport systems are dynein and ncd. Both motors have been found to be capable of generating torque causing short-pitched microtubule rotation in gliding motility assays. The results for 22S dynein helped to resolve controversial findings of earlier reports about the ability of 22S dynein to generate torque. However, it turned out difficult to establish conditions where the movement of the dynein-driven nanoshuttles was homogeneous and reproducible. In contrast, motility in ncd gliding assays looks much more promising. The obtained results supported previous reports of torque generation by ncd. Moreover, a strong dependence of rotational pitches of gliding microtubules on ATP concentration was found. The reason could be that ncd motors in the nucleotide-free microtubule-bound state impede the forward movement of gliding microtubules stronger than the axial motion. To fully understand the nature of this effect, further research is required. Most likely, this will substantially contribute to the understanding of ncd function in vivo. Furthermore, the possibility of tuning the rotation of microtubules acting as nanoshuttles might provide a means to increase control of processes like cargo-loading and unloading
Eine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie ist der kontrollierte und präzise Transport von nanoskaligen Objekten. Der Einsatz von molekularen Motoren des zellulären Zytoskeletts hat sich dabei als vielversprechender Ansatz erwiesen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Entwicklung einer Methode, um das Verhalten von filamentartigen Nanotransportern - speziell von Mikrotubuli, die durch Motorproteine über Oberflächen bewegt werden - in drei Dimensionen (3-D) zu charakterisieren. Die Hauptkriterien waren dabei eine geringe Störung des zu untersuchenden Systems, hohe räumliche und zeitliche Auflösungen sowie die generelle Anwendbarkeit für Einzelmolekülstudien. Ein weiteres Ziel war es, die entwickelte Methode zur Beantwortung offener Fragen bezüglich des Nanotransports mittels Zytoskelett-basierter Motoren einzusetzen. Insbesondere sollte das System aus Mikrotubuli und dem Motorprotein Kinesin-1, welches für die meisten aktuellen Studien zum Thema Nanotransport herangezogen wird, untersucht werden. Schließlich sollten neue Erkenntnisse über weniger gut erforschte Motorproteine, speziell über 22S Dynein und das Kinesin-14 „Non-claret disjunctional“ (Ncd), gewonnen werden. Beide Motoren könnten in Nanotransportsystemen als Gegenspieler von Kinesin-1 agieren. In der vorliegenden Arbeit wird eine neuartige, auf Fluoreszenz-Interferenz basierende 3-D Nanometertrackingmethode beschrieben. Auf deren Grundlage wird es möglich, die Bewegung von einzelnen fluoreszenten Partikeln nahe einer reflektierenden Oberfläche mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich zu verfolgen. Im Vergleich zu anderen kürzlich vorgestellten 3-D Techniken, welche auf bifokaler optischer Mikroskopie basieren und ähnliche Genauigkeiten zulassen, ist die hier vorgestellte Methode mit deutlich geringerem Aufwand auf der Basis eines herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskops umsetzbar. Dabei kann die Fluoreszenzanregung wahlweise mit einer Bogenlampe oder einem Laser erfolgen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, nicht nur Differenzwerte (wie bei bifokaler Mikroskopie), sondern absolute Werte in der Höhendimension zu messen. Im Ergebnis wurde ein mit geringem Aufwand umsetzbares, gleichwohl hochgradig genaues und vielseitig einsetzbares Werkzeug geschaffen, welches ideal für Studien der Interaktionen von Einzelmolekülen oder auch intramolekularer Dynamik geeignet ist. Mit Hilfe der hier vorgestellten 3-D Trackingmethode wurden die Rotationen von Mikrotubuli um ihre Längsachse während des Gleitens auf mit Motorproteinen besetzten Oberflächen analysiert. Diese Geometrie wird derzeit bevorzugt in Studien eingesetzt, welche den Einsatz von biomolekularen Motoren für den Transport von nanoskaligen Objekten untersuchen und das Ziel verfolgen, Nanostrukturen zu erzeugen und zu manipulieren. Die Ergebnisse zu Rotationen von Mikrotubuli, welche über mit Kinesin-1 besetzte Oberflächen bewegt werden, sind konsistent mit (i) der Eigenschaft von Kinesin-1 sich entlang der Protofilamente von Mikrotubuli zu bewegen und (ii) der Superhelixstruktur von in vitro rekonstituierten Mikrotubuli. Dies belegt die Eignung der Methode für die Charakterisierung von Nanotransportsystemen. Die Rotation von Mikrotubuli, welche durch Kinesin-1 angetrieben werden, hat sich sowohl beim Transport von kleinen Objekten in Form von Quantum Dots (Durchmesser ca. 20 nm) als auch bei der Reduktion elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Kinesin-1 und Mikrotubuli durch Verdau der Tubulin-C-Termini als stabil erwiesen. Ein vollkommen anderes Bild ergab sich für den Transport von großen Objekten (Durchmesser ca. 3 µm). In diesem Fall wurde die Rotation der Filamente angehalten. Unerwarteterweise war jedoch die Vorwärtsbewegung der Mikrotubuli und insbesondere deren Geschwindigkeit kaum betroffen. Dies zeigt, daß Mikrotubuli, welche von prozessiven Motoren wie Kinesin-1 angetrieben werden, das Potential zu responsiven, flexiblen und effektiven molekularen Shuttles besitzen. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, daß Kinesin-1-Moleküle, welche in vivo Frachten entlang von Mikrotubuli transportieren, auf seitwärts gerichtete Kräfte reagieren können, indem sie von ihrem intrinsisch vorgegebenen Pfad parallel zur Protofilamentachse des Mikrotubulus abweichen. Zwei Motoren, die sich im Gegensatz zu Kinesin-1 in Richtung des Minus-Endes von Mikrotubuli bewegen, sind 22S Dynein und Ncd. Sie sind somit als Gegenspieler von Kinesin-1 in Nanotransportsystemen prädestiniert. Beide Motoren können, ebenso wie Kinesin-1, die Translokation von Mikrotubuli über Oberflächen sowie damit verbundene Rotationen von Mikrotubuli verursachen. Im Gegensatz zu Kinesin-1 tritt die Rotation unabhängig von einer Superhelixstruktur der Mikrotubuli auf. Die Ergebnisse für 22S Dynein lösen Widersprüche zwischen früheren Studien auf, indem sie belegen, daß dieser Motor Rotationen von Mikrotubuli erzeugen kann. Jedoch scheint es unter Verwendung von 22S Dynein nicht möglich zu sein, Bedingungen zu schaffen, unter welchen sich Mikrotubuli in geeigneter Weise als Nanoshuttles homogen und reproduzierbar bewegen. Der Einsatz von Ncd ist hier deutlich erfolgversprechender. Die in diesem Falle erlangten Erkenntnisse bezüglich der Erzeugung von Rotationen von Mikrotubuli decken sich mit früheren Studien. Ein bislang unbekannter, bemerkenswerter Effekt ist dabei ein Rückgang in der Länge der Rotationsperioden mit sinkender ATP-Konzentration. Die mit dem heutigen Wissensstand über den mechanochemischen Zyklus von Ncd konsistente Erklärung ist, daß Ncd-Motoren im nukleotidfrei an Mikrotubuli gebundenen Zustand die Vorwärtskomponente der Bewegung von gleitenden Mikrotubuli stärker hemmen als die Rotationskomponente. Möglicherweise kann die sich hieraus ergebende Möglichkeit der Regulierung der Rotation von Mikrotubuli dazu eingesetzt werden, das Be- und Entladen von Nanoshuttles zu steuern

Studying dynamics of proteins in their biological milieu such as water is interesting because of their strong absorption in the terahertz range that contain information on their global and sub-global collective vibrational modes (conformational dynamics) and global dynamical correlations among solvent water molecules and proteins. In addition, water molecules dynamics within protein solvation layers play a major role in enzyme activity. However, due to the strong absorption of water in the gigahertz-to-terahertz frequencies, it is challenging to study the properties of the solvent dynamics as well as the conformational changes of protein in water. In response, we have developed a highly sensitive megahertz-to-terahertz dielectric spectroscopy system to probe the hydration shells as well as large-scale dynamics of these biomolecules. Thereby, we have deduced the conformation flexibility of proteins and compare the hydration dynamics around proteins to understand the effects of surface-mediated solvent dynamics, relationships among different measures of interfacial solvent dynamics, and protein-mediated solvent dynamics based on the complex dielectric response from 50 MHz up to 2 THz by using the system we developed. Comparing these assets of various proteins in different classes helps us shed light on the macromolecular dynamics in a biologically relevant water environment.
Doctor of Philosophy

Déterminer la structure 3D des protéines expérimentalement est une tâche très lourde et coûteuse, qui peut s'avérer parfois impossible à réaliser. L'arrivée massive de données provenant des programmes de séquençage à grande échelle impose de passer d'une approche biochimique à une approche bioinformatique, et nécessite en particulier de développer des méthodes de prédiction sur des séquences.
Cette thèse propose l'exploration de deux nouvelles pistes pour progresser dans la résolution de prédiction de ponts disulfures dans les protéines. Cette liaison covalente stabilise et contraint fortement la conformation spatiale de la protéine et la connaissance des positions où elle intervient peut réduire considérablement la complexité du problème de la prédiction de la structure 3D. Pour cela, nous utilisons dans un premier temps, l'inférence grammaticale et plus particulièrement les langages de contrôle introduit par Y. Takada, puis dans un deuxième temps, la programmation logique inductive.
Diverses expériences visent à confronter un cadre théorique d'apprentissage et des algorithmes généraux d'inférence grammaticale régulière à une application pratique de prédiction d'appariements spécifiques au sein d'une séquence protéique. D'autres expérimentations montrent que la programmation logique inductive donne de bons résultats sur la prédiction de l'état oxydé des cystéines en inférant des règles interprétables par les biologistes. Nous proposons un algorithme d'induction heuristique dont l'idée est d'effectuer plusieurs phases d'apprentissage en tenant compte des résultats obtenus aux phases précédentes permettant ainsi de diminuer considérablement la combinatoire dans les espaces d'hypothèses logiques en construisant des règles de plus en plus discriminantes.

Durant cette thèse, nous avons travaillé sur l'adaptation des algorithmes d'inférence grammaticale pour la recherche des propriétés communes à un ensemble de protéines. L'inférence grammaticale positive cherche à générer, à partir d'un ensemble de mots appartenant à un langage cible particulier inconnu, une représentation grammaticale qui est "optimale" par rapport à ce langage, c'est-à-dire qui rassemble et organise les particularités des mots du langage. Nous avons utilisé le diagramme de Taylor, qui classe les acides aminés suivant leurs propriétés physico-chimiques, pour construire, sous forme de treillis, un ordre sur les groupes d'acides aminés. Nous avons aussi développé une méthode d'inférence (SDTM) qui calcule les meilleurs alignements locaux entre les paires de protéines suivant un score fondé à la fois sur cet ordre et sur les propriétés statistiques de l'ensemble de protéines donné. Le résultat est une machine séquentielle proche de celle de Mealy avec des sorties réduites à "accepte" et "rejette". L'algorithme commence par construire le plus grand automate reconnaissant exactement les mots du langage et le généralise par fusions successives des paires de transitions correspondant aux acides aminés appariés dans les alignements sélectionnés. Les expérimentations ont montré l'intérêt de cette combinaison de méthodes importées de la découverte de motifs et de l'inférence grammaticale.

碩士
國立成功大學
工程科學系碩博士班
94
How molecular motors that function at nano scale convert chemical energy from adenosine triphosphate(ATP) into mechanical force and motion is the one of the main themes of modern biology. Dynein, a protein enzyme, alternates between binding and unbinding with microtubule in motion. This paper used two-states model to investigate the movement behaviors of molecular motor. The Fokker-Planck equation was used to analyze how potential influens molecular motor. We use a numerical algorithm that presented by Wang, et al. to study of biomolecular transport processes. In the algorithm a continuous Markov process is discretized as a jump process and the jump rates are derived from local solutions of the continuous system. We used the algorithm solved by Matlab 7.0 to calculate the mean velocities, the effective diffusion coefficient and the randomness parameter of the molecular that subjected to external load or not.Analytical results of this study are discussed to provide further insight into the chemomechanical theory of molecular motor.

Biomolecular motor based transport reconstituted in synthetic environment has been recently established as a promising component for the development of nanoscale devices. A minimal system consisting of microtubules propelled over a surface of immobilized kinesin motor proteins has been used to transport and manipulate cargo for molecular sorting, analyte detection, and other novel nanotechnological applications. Despite these achievements, further progress of the field and translation of the reported applications to a real-world setting require overcoming several key challenges, such as, development of effective cargo conjugation strategies and precise control of the transport directionality with the reconstituted biomolecular motor systems. The challenge of cargo conjugation is addressed in this thesis through the development of a robust bioorthogonal strategy to functionalize microtubules. The versatility of the developed method is demonstrated by covalently conjugating various types of cargos to microtubules. Further, the effect of the linker length on cargo attachment to microtubules is investigated by attaching cargo to microtubules via linkers of different lengths. By using kinesin-driven transport of microtubules that are covalently conjugated to antibodies, detection of various clinically relevant analytes is demonstrated as proof-of-principle applications for biosensing. Finally, the challenge of gaining control over transport directionality is addressed through topographical guiding of microtubules in nanostructures, and optimization of assay parameters to achieve successful guiding of microtubules. Spatio-temporal analyte concentration, using transport in these nanostructues, is also explored to make the biomolecular-motor based applications more suitable for use real-world point-of-care setting. Taken together, the experimental work in this thesis contributes to the field of nanotechnological applications of biomolecular motors. The developed microtubule functionalization method and understanding of the effect of cargo attachment via linkers provide useful design principles for efficient cargo loading to microtubules. Moreover, establishment of assay components for successful guiding of microtubules in nanostructures is a vital step forward for practical translation of future nanoscale devices.

A major challenge in nanotechnology is the controlled transport of cargo on the nanometer scale. A promising approach to this problem is the use of molecular motors of the cellular cytoskeleton. The aim of this work was to develop a method to characterize the behavior of filamentous nanoshuttles – specifically of motor protein-driven microtubules – in three dimensions (3-D). The main requirements to meet were low impact on the nanotransport system, high spatial and temporal resolution, and versatility. Furthermore, this method was intended to be used to address open questions in the field of nanotransport. In particular, it was firstly attempted to characterize cargo transport in a system currently favored by most studies in the field, where nanoshuttles are powered by the microtubule motor best understood so far – the plus-end-directed kinesin-1. Secondly, the goal was to further the understanding of potential counter-players of kinesin-1 in nanotransport applications - the much less well understood microtubule minus-end-directed motor proteins 22S dynein and the kinesin-14 non-claret disjunctional (ncd). A novel method to study the linear forward motion as well as the axial motion of filamentous nanoshuttles, which are driven by motors of the cell cytoskeleton, has been introduced. The method uses fluorescence interference-based 3-D nanometer tracking of quantum dots as optical probes that are attached to the nanoshuttles. While other recently reported 3-D tracking techniques based on dual-focus imaging offer similar sensitivity, the method here can be easily performed on any standard epi-fluorescence microscope, even with arc lamp illumination, and additionally holds the potential to retrieve absolute height values. It is strongly suggested that the ease of use might help to spread this valuable and versatile tool for a variety of applications, including studies of interactions between single molecules or even intramolecular changes. Specifically, 3-D tracking has been used to visualize and analyze the rotation of microtubules around their longitudinal axis when they are propelled on a motor protein-coated surface. This geometry called gliding assay is currently favored for most proof-of-principle studies that investigate the use of biomolecular motors for transport of nanoscale cargo with the goal to assemble and manipulate nanostructures. The suitability of the method has been proven for kinesin-1 gliding assays, where knowledge of properties of both, microtubules and kinesin-1, allowed a very precise prediction of microtubule rotation, which was matching the actual measured values very well. The microtubule rotation in kinesin-1 gliding assays has turned out to be robust against the attachment of small cargo in the shape of quantum dots (diameter ∼20 nm), but also against the reduction of electrostatic interactions between microtubules and kinesin-1 by cleavage of the tubulin E-hook. The situation was dramatically different when large cargo (beads with diameter of ∼3 µm) was attached to microtubules. In this case, filament rotation was stopped, but otherwise the impact on motility was surprisingly low. In particular, the velocity of the gliding microtubules only decreased to a negligible degree. This shows that in principle microtubules driven by processive motors like kinesin-1 can make flexible, responsive and effective molecular shuttles for nanotransport applications. In addition, the results might indicate that in vivo kinesin-1 molecules, which transport cargo along microtubules, can likewise flexibly respond to an axial force by deviating from their path parallel to the protofilament axes. Two microtubule minus-end-directed motors that might be employed to counteract kinesin-1 in engineered nanotransport systems are dynein and ncd. Both motors have been found to be capable of generating torque causing short-pitched microtubule rotation in gliding motility assays. The results for 22S dynein helped to resolve controversial findings of earlier reports about the ability of 22S dynein to generate torque. However, it turned out difficult to establish conditions where the movement of the dynein-driven nanoshuttles was homogeneous and reproducible. In contrast, motility in ncd gliding assays looks much more promising. The obtained results supported previous reports of torque generation by ncd. Moreover, a strong dependence of rotational pitches of gliding microtubules on ATP concentration was found. The reason could be that ncd motors in the nucleotide-free microtubule-bound state impede the forward movement of gliding microtubules stronger than the axial motion. To fully understand the nature of this effect, further research is required. Most likely, this will substantially contribute to the understanding of ncd function in vivo. Furthermore, the possibility of tuning the rotation of microtubules acting as nanoshuttles might provide a means to increase control of processes like cargo-loading and unloading.
Eine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie ist der kontrollierte und präzise Transport von nanoskaligen Objekten. Der Einsatz von molekularen Motoren des zellulären Zytoskeletts hat sich dabei als vielversprechender Ansatz erwiesen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Entwicklung einer Methode, um das Verhalten von filamentartigen Nanotransportern - speziell von Mikrotubuli, die durch Motorproteine über Oberflächen bewegt werden - in drei Dimensionen (3-D) zu charakterisieren. Die Hauptkriterien waren dabei eine geringe Störung des zu untersuchenden Systems, hohe räumliche und zeitliche Auflösungen sowie die generelle Anwendbarkeit für Einzelmolekülstudien. Ein weiteres Ziel war es, die entwickelte Methode zur Beantwortung offener Fragen bezüglich des Nanotransports mittels Zytoskelett-basierter Motoren einzusetzen. Insbesondere sollte das System aus Mikrotubuli und dem Motorprotein Kinesin-1, welches für die meisten aktuellen Studien zum Thema Nanotransport herangezogen wird, untersucht werden. Schließlich sollten neue Erkenntnisse über weniger gut erforschte Motorproteine, speziell über 22S Dynein und das Kinesin-14 „Non-claret disjunctional“ (Ncd), gewonnen werden. Beide Motoren könnten in Nanotransportsystemen als Gegenspieler von Kinesin-1 agieren. In der vorliegenden Arbeit wird eine neuartige, auf Fluoreszenz-Interferenz basierende 3-D Nanometertrackingmethode beschrieben. Auf deren Grundlage wird es möglich, die Bewegung von einzelnen fluoreszenten Partikeln nahe einer reflektierenden Oberfläche mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich zu verfolgen. Im Vergleich zu anderen kürzlich vorgestellten 3-D Techniken, welche auf bifokaler optischer Mikroskopie basieren und ähnliche Genauigkeiten zulassen, ist die hier vorgestellte Methode mit deutlich geringerem Aufwand auf der Basis eines herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskops umsetzbar. Dabei kann die Fluoreszenzanregung wahlweise mit einer Bogenlampe oder einem Laser erfolgen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, nicht nur Differenzwerte (wie bei bifokaler Mikroskopie), sondern absolute Werte in der Höhendimension zu messen. Im Ergebnis wurde ein mit geringem Aufwand umsetzbares, gleichwohl hochgradig genaues und vielseitig einsetzbares Werkzeug geschaffen, welches ideal für Studien der Interaktionen von Einzelmolekülen oder auch intramolekularer Dynamik geeignet ist. Mit Hilfe der hier vorgestellten 3-D Trackingmethode wurden die Rotationen von Mikrotubuli um ihre Längsachse während des Gleitens auf mit Motorproteinen besetzten Oberflächen analysiert. Diese Geometrie wird derzeit bevorzugt in Studien eingesetzt, welche den Einsatz von biomolekularen Motoren für den Transport von nanoskaligen Objekten untersuchen und das Ziel verfolgen, Nanostrukturen zu erzeugen und zu manipulieren. Die Ergebnisse zu Rotationen von Mikrotubuli, welche über mit Kinesin-1 besetzte Oberflächen bewegt werden, sind konsistent mit (i) der Eigenschaft von Kinesin-1 sich entlang der Protofilamente von Mikrotubuli zu bewegen und (ii) der Superhelixstruktur von in vitro rekonstituierten Mikrotubuli. Dies belegt die Eignung der Methode für die Charakterisierung von Nanotransportsystemen. Die Rotation von Mikrotubuli, welche durch Kinesin-1 angetrieben werden, hat sich sowohl beim Transport von kleinen Objekten in Form von Quantum Dots (Durchmesser ca. 20 nm) als auch bei der Reduktion elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Kinesin-1 und Mikrotubuli durch Verdau der Tubulin-C-Termini als stabil erwiesen. Ein vollkommen anderes Bild ergab sich für den Transport von großen Objekten (Durchmesser ca. 3 µm). In diesem Fall wurde die Rotation der Filamente angehalten. Unerwarteterweise war jedoch die Vorwärtsbewegung der Mikrotubuli und insbesondere deren Geschwindigkeit kaum betroffen. Dies zeigt, daß Mikrotubuli, welche von prozessiven Motoren wie Kinesin-1 angetrieben werden, das Potential zu responsiven, flexiblen und effektiven molekularen Shuttles besitzen. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, daß Kinesin-1-Moleküle, welche in vivo Frachten entlang von Mikrotubuli transportieren, auf seitwärts gerichtete Kräfte reagieren können, indem sie von ihrem intrinsisch vorgegebenen Pfad parallel zur Protofilamentachse des Mikrotubulus abweichen. Zwei Motoren, die sich im Gegensatz zu Kinesin-1 in Richtung des Minus-Endes von Mikrotubuli bewegen, sind 22S Dynein und Ncd. Sie sind somit als Gegenspieler von Kinesin-1 in Nanotransportsystemen prädestiniert. Beide Motoren können, ebenso wie Kinesin-1, die Translokation von Mikrotubuli über Oberflächen sowie damit verbundene Rotationen von Mikrotubuli verursachen. Im Gegensatz zu Kinesin-1 tritt die Rotation unabhängig von einer Superhelixstruktur der Mikrotubuli auf. Die Ergebnisse für 22S Dynein lösen Widersprüche zwischen früheren Studien auf, indem sie belegen, daß dieser Motor Rotationen von Mikrotubuli erzeugen kann. Jedoch scheint es unter Verwendung von 22S Dynein nicht möglich zu sein, Bedingungen zu schaffen, unter welchen sich Mikrotubuli in geeigneter Weise als Nanoshuttles homogen und reproduzierbar bewegen. Der Einsatz von Ncd ist hier deutlich erfolgversprechender. Die in diesem Falle erlangten Erkenntnisse bezüglich der Erzeugung von Rotationen von Mikrotubuli decken sich mit früheren Studien. Ein bislang unbekannter, bemerkenswerter Effekt ist dabei ein Rückgang in der Länge der Rotationsperioden mit sinkender ATP-Konzentration. Die mit dem heutigen Wissensstand über den mechanochemischen Zyklus von Ncd konsistente Erklärung ist, daß Ncd-Motoren im nukleotidfrei an Mikrotubuli gebundenen Zustand die Vorwärtskomponente der Bewegung von gleitenden Mikrotubuli stärker hemmen als die Rotationskomponente. Möglicherweise kann die sich hieraus ergebende Möglichkeit der Regulierung der Rotation von Mikrotubuli dazu eingesetzt werden, das Be- und Entladen von Nanoshuttles zu steuern.

Biological macromolecules can rearrange interdomain orientations when binding to various partners. Interdomain dynamics serve as a molecular mechanism to guide the transitions between orientations. However, our understanding of interdomain dynamics is limited because a useful description of interdomain motions requires an estimate of the probabilities of interdomain conformations, increasing complexity of the problem.

Staphylococcal protein A (SpA) has five tandem protein-binding domains and four interdomain linkers. The domains enable Staphylococcus aureus to evade the host immune system by binding to multiple host proteins including antibodies. Here, I present a study of the interdomain motions of two adjacent domains in SpA. NMR spin relaxation experiments identified a 6-residue flexible interdomain linker and interdomain motions. To quantify the anisotropy of the distribution of interdomain orientations, we measured residual dipolar couplings (RDCs) from the two domains with multiple alignments. The N-terminal domain was directly aligned by a lanthanide ion and not influenced by interdomain motions, so it acted as a reference frame to achieve motional decoupling. We also applied {\it de novo} methods to extract spatial dynamic information from RDCs and represent interdomain motions as a continuous distribution on the 3D rotational space. Significant anisotropy was observed in the distribution, indicating the motion populates some interdomain orientations more than others. Statistical thermodynamic analysis of the observed orientational distribution suggests that it is among the energetically most favorable orientational distributions for binding to antibodies. Thus, the affinity is enhanced by a pre-posed distribution of interdomain orientations while maintaining the flexibility required for function.

The protocol described above can be applied to other biological systems in general. Protein molecule calmodulin and RNA molecule trans-activation response element (TAR) also have intensive interdomain motions with relative small intradomain dynamics. Their interdomain motions were studied using our method based on published RDC data. Our results were consistent with literature results in general. The differences could be due to previous studies' use of physical models, which contain assumptions about potential energy and thus introduced non-experimental information into the interpretations.

Dissertation

The most critical biochemistry in an organism supports the central dogma of molecular biology: transcription of DNA to RNA and translation of RNA to peptide sequence. Proteins are then responsible for catalyzing, regulating and ensuring the fidelity of transcription and translation. At the heart of these processes lie selective biomolecular interactions and specific dynamics that are necessary for complex formation and catalytic activity. Through advanced biophysical and computational methods, it has become possible to probe these macromolecular dynamics and interactions at the molecular and atomic levels to tease out their underlying physical bases. To the end of a more thorough understanding of these physical bases, we have performed studies to probe the motions and interactions intrinsic to the function of biomolecular complexes: modeling the dual-base flipping strategy of alkylpurine glycosylase D, dynamically tracing evolution and epistasis in the 3-ketosteroid family of nuclear receptors, discovering the allosteric and conformational aspects of transcription regulation in liver receptor homologue 1, leveraging specific contacts in tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2 for the development of novel inhibitor scaffolds, and detailing the experimentally observed connection between solvation and sequence-specific binding affinity in PU.1-DNA complexes at the atomic level. While each study seeks to solve system-specific problems, the collection outlines a general and broadly applicable description of the biophysical motivations of biochemical processes.

The use of ethanol as an additive to gasoline fuel is becoming a common phenomenon. It helps solve the energy crisis and environmental issues that fossil fuel has brought about. However, when dissolved in motor oil, ethanol would dilute motor oil and drastically change its lubrication properties, in the same manner as gasoline dilution. Since ethanol has higher boiling point than gasoline, it takes longer time to be cooked away from the oil, causing more severe changes to motor oil properties. In this work, a new analytical method is presented to study the behaviour of ethanol/oil system. Seven motor oil formulations provided by Italian group E.n.i. are tested regarding their performance in resisting ethanol dilution. The tests are conducted in microcapillaries within which ethanol droplet dissolves in motor oil phase under 40oC or 60oC. Mathematical model is developed to study the shrinkage kinetics of ethanol droplets. And, the mass transfer coefficients of ethanol transporting to different oil formulations are obtained. Similar experiments are conducted on hexadecane and new and used Shell SAE 5W-30 motor oil to discover the difference between motor oil and pure hydrocarbon and the difference between new motor oil and used motor oil. It was found through hexadecane tests and Shell motor oil tests that hydrocarbons with shorter chain length were less capable of resisting ethanol dilution; old motor oil are slower in dissolving ethanol than new oil; and, suspected ethanol-soot complex may form in old motor oil, which might corrode engine parts.
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