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Dissertations / Theses on the topic 'Biosenseurs'
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Markova, Olga. "Les biosenseurs fluorescents pour l'analyse de cellules vivantes." Aix-Marseille 2, 2008. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2008AIX22103.pdf.
Full textAbstract:
Flurorescent sensors become a powerful tool for non invasive monitoring of intracellular ion concentrations and intracellular protein localisation. In our work we study properties of genetically encoded C1 sensors 'C1-sensor", that is a CFP-YFP based construct, "Biosensor-GlyR" that is a GlyR channel with C1-Sensor incorporated into intracellular domain, proposed method for application of this proteins to measurements of intracellular C1 in different cell types, identify sensitivity to C1 and estimate chloride concentration in cell lines and primary hippocampal cultures. In the second part of our work we reveal intracellular dynamics of hippocalcin, a member of neuronal calcium sensors protein family, tagged with yellow fluorescent protein. We identify spatial temporal characteristics of Ca2+ dependent hippocalcin translocations in process of hippocampal neurons that support the idea of hippocalcin role in a decoding of short place specific calcium signals in neurons<br>Les senseurs fluorescents deviennent un instrument puissant pour la mesure non-invasive de la concentration des ions intracellulaires et pour la localisation des protéines intracellulaires. Notre travail consiste à étudier les propriétés d'un senseurs C1- codés génétiquements, le 'C1-Sensor', qui est une construction CFP-YFP, et celles du 'Biosensor-GlyR', qui est un canal GlyR fusionné avec le C1-Sensor. Nous avons caractérisé les propriétés spectrales de ces senseurs, mesuré leurs sensibilité au C1- et évalué la [C1-]i dans des cellules CHO et des cultures hippocampales primaires. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons trouvé et décrit les caractéristiques temporelles et spatiales de la translocation de l'hippocalcin marqué par EYFP. Ce résultat laisse à penser que cette protéine permet de faire le décodage rapide des signaux calciques à des endroits spécifiques dans les neurones
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Chinestra, Patrick. "Conception de biosenseurs des protéines RhoA, RhoB, RhoC." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/1715/.
Full textAbstract:
Notre équipe s'intéresse à la compréhension des mécanismes de dérégulation des voies de signalisation cellulaire dans la survenue et la maintenance des processus tumoraux, ainsi que leurs conséquences dans la réponse aux thérapies antitumorales. Nous nous intéressons particulièrement aux protéines Rho et à leurs régulateurs. Ils interviennent dans les voies de signalisation des récepteurs cellulaires conduisant à des modifications de l'adhérence, de la prolifération, de la motilité et de la balance survie/mort cellulaire. Les protéines RhoA, RhoB et RhoC sont des petites GTPases passant d'un état actif (liées au GTP) à un état inactif (liées au GDP) et dont l'homologie est proche de 85%. La surexpression des protéines RhoA et RhoC a été décrite dans un grand nombre de tumeurs; à l'inverse, on observe une diminution de l'expression de RhoB dans le mélanome et dans le cancer du poumon. La conception de fragments d'anticorps sélectifs de la conformation active des Rho, appelés biosenseurs, permettant d'évaluer l'activation de ces protéines in situ dans des coupes de tissus sains et cancéreux, pourrait aboutir à un usage pronostique de ces outils voire à la définition de nouveaux marqueurs thérapeutiques et permettrait de répondre à des questions plus fondamentales comme leurs localisations cellulaire, leur rôle dans la migration cellulaire, leur activation spatio-temporelle. A partir du scFvC1 sélectif de la conformation active des trois protéines RhoA, RhoB et RhoC et isolé précédemment dans l'équipe, nous avons créé une banque secondaire par mutagénèse aléatoire et opéré une sélection par phage display avec un objectif double : 1°) augmenter l'affinité du scFvC1 pour améliorer ses capacités d'interaction avec les protéines Rho actives natives en vue d'améliorer ses performances en immunohistologie ainsi que pour une utilisation intracellulaire. 2°) sélectionner des variants spécifiques de chaque Rho malgré leur très forte homologie. Nous montrons que la stratégie mise en œuvre permet d'augmenter l'affinité des scFv et de modifier leur sélectivité puisqu'un variant se lie préférentiellement à RhoA et RhoC. De plus, contrairement au svFvC1, ces scFv sont immunoprécipitants pour les Rho actives produites dans des cellules eucaryotes. En parallèle, nous avons mis au point une méthodologie permettant le marquage d'un scFv anti-RhoB obtenu au laboratoire, par l'action d'un dérivé fluorescent de la biotine sur une intéine exprimée en fusion C-terminale du scFv. Ceci permettra d'améliorer les techniques immunohistologiques avec des biosenseurs fluorescents<br>Our team is interested in understanding the mechanisms of deregulation of cell signaling pathways in the development and maintenance of tumor processes and their consequences in response to anti-tumor therapies. We focuse on Rho proteins as well as on their regulators. They are involved in signaling pathways of cell receptors leading to changes in adhesion, proliferation, motility and balance survival / cellular death. RhoA, RhoB and RhoC are small GTPases switching from an active state (GTP-bound) to an inactive state (GDP-bound) and the homology of which is close to 85%. Overexpression of RhoA and RhoC protein has been described in many tumors; in contrast, there was a decreased expression of RhoB in melanoma and lung cancer. Engineering antibody fragment specific of Rho active conformations, namely biosensors, would allow in situ assessment of these proteins activation in healthy or tumour samples. These tools could be further developed towards diagnosis or prognosis usage, or could even define novel therapeutics markers and be used to answer more fundamental question as their cellular localization, their role in cell migration, or their spatio-temporal activation. Starting from the scFvC1 previously isolated in the group and which is selective for RhoA, RhoB and RhoC active conformations, we have created by random mutagenesis a second library and performed a phage display selection with two aims: 1°) increase the C1 scFv affinity to enhance its interaction potential with active native Rho proteins in order to improve its performance in immuno-histology or to use it as an intracellular antibody. 2°) select variants with a selectivity towards strictly only one of the three Rho excluding the others despite their strong homology. We show that our strategy allowed an affinity increase of scFv and also a selectivity modulation as one variant preferentially binds RhoA and C. Moreover, in contrast to scFvC1 these scFvs immuno-precipitate active endogenous Rho Proteins in eukaryotic cells. In parallel, we have established a method allowing the labelling of an anti-RhoB scFv from the lab, by fusing it to an intein that induce covalent binding of a biotin fluorescent analogue. This approach will improve immuno-histological techniques using fluorescent biosensors
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Onfroy, Lauriane. "Développement de biosenseurs BRET prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments anti-tumoraux." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30071/document.
Full textAbstract:
Beaucoup de médicaments anticancéreux entrainent à plus ou moins long terme une cardiotoxicité, dont les mécanismes moléculaires restent encore très mal connus. Aujourd'hui, peu de moyens existent pour prédire, au stade du développement préclinique, le potentiel cardiotoxique de ces molécules. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le principe de transfert d'énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour créer des biosenseurs de l'activité des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe IB. En effet, ces protéines kinases ubiquitaires sont des cibles pharmacologiques majeures de part leur implication dans les phénomènes cancéreux, et sont également importantes pour l'homéostasie cardiaque. Ainsi, elles pourraient constituer une cible cardiaque des agents anticancéreux participant au développement de la cardiotoxicité. Les PI3K-IB sont des hétérodimères formés d'une sous-unité catalytique (C) p110y associée à une sous-unité régulatrice (R) dont il existe deux isoformes, p87 et p101. Pour développer le senseur PI3Ky, un donneur (Rluc8) et un accepteur (GFP2) d'énergie BRET ont été fusionnés en position N- ou C-terminale de chacune des sous-unités C et R (senseur intermoléculaire). Après vérification de l'expression cellulaire de ces constructions dans les cellules HEK293T, les interactions entre les différentes paires de senseurs BRET (8 combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche d'un couple capable de refléter l'activation de la PI3K. Nos résultats démontrent des interactions spécifiques basales entre les sous-unités C et R des couples p110y-p87 et p110y-p101. Par contre, aucune des conditions de stimulations testées (nature du récepteur, concentrations de ligand, temps de stimulation, stœchiométrie des senseurs) n'a permis de détecter des modulations du signal BRET. La présence de co-activateurs connus de la PI3Ky tels que les protéines Ras ou les protéines G hétérotrimériques n'a pas non plus aidé à la modulation du signal BRET. Nous avons ensuite tenté de créer un senseur indirect de l'activité de la PI3Ky en mesurant par BRET les interactions entre les sous-unités de PI3K et des protéines G (décrites dans la littérature) lors de l'activation de la PI3Ky. Étonnamment, les résultats révèlent une pré-association basale entre les sous-unités de la PI3Ky et celles des protéines G mais sans détection de modulation significative de signal BRET après stimulation. En conclusion, nous n'avons pu établir un biosenseur BRET de l'activité de la PI3Ky en mesurant les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques. Ainsi, l'absence de modulations détectables du signal BRET après stimulation entre les deux sous-unités pré-complexées pourrait rendre compte d'un mécanisme d'activation impliquant des changements conformationnels plutôt qu'une association-dissociation physique. Dans le futur, l'étiquetage intramoléculaire des sous-unités C ou R avec les deux sondes BRET pourrait peut-être mieux détecter ces conformations et l'activité de la PI3Ky. D'un point de vue fondamental, l'existence de pré-complexes PI3Ky-protéines G pourraient également rendre compte d'une régulation spatio-temporelle plus fine et spécifique de la kinase, en accord avec les récents concepts de modules de signalisation préformés<br>Cardiotoxicity is a recognized long-term consequence of a lot of anticancer drugs, but its mechanisms are not well-known. To date, the cardiotoxic potential of anticancer drugs is difficult to predict during preclinical studies due to the lack of appropriate tools. In this context, the aim of this thesis project was to develop biosensors, based on the use of bioluminescent resonance energy transfer (BRET) principle, to measure class IB phosphoinositide-3-kinases (PI3K) activity. Indeed, these ubiquitous kinases are major pharmacological oncotargets due to their participation in cancer development, but they also have a preponderant role in cardiac homeostasis. Thus, they could represent cardiac targets for anticancer drugs participating in the development of cardiotoxicity.PI3K-IB are heterodimers of a catalytic subunit (C) p110y and a regulatory subunit (R) p87 or p101. To develop the PI3Ky sensor, BRET energy donor (Rluc8) and acceptor (GFP2) were fused at the N-terminal or C-terminal of each subunit (intermolecular sensor). After expression control of each probe in HEK293T cells, the interactions between C and R subunits for all BRET pairs (8 combinations) were studied, in living cells in real time, so to find one able to sense PI3Ky activation. Our results indicated specific basal interaction between C and R subunits from p110y-p87 and p110y-p101 pairs. However, none of the stimulation conditions tested (receptor nature, ligand concentration, stimulation kinetics and biosensor stoichiometry) allowed the detection of BRET signal modulation. Further addition of p110y co-activators such as Ras proteins or heterotrimeric G proteins, did not improve BRET modulation. We then tried to create an indirect BRET sensor of PI3Ky activity by measuring the interaction between PI3K and G proteins subunits, known to occur during PI3Ky activation. Surprisingly, results highlighted a basal pre-association of PI3Ky and G protein subunits without BRET modulations upon PI3Ky stimulation.In conclusion, we failed to create a BRET biosensor of the PI3Ky activity based on the measure of the interaction between the catalytic and regulatory subunits. However, the pre-association of PI3K subunits without BRET modulation could reflect a mechanism of PI3Ky activation based on conformationals changes of the complex between C and R subunits rather than physical association-dissociation. In the future, intramolecular labeling of the C or R subunit with the two BRET probes could better detect conformational changes and therefore PI3Ky activity. From a fundamental standpoint, the existence of PI3Ky-G proteins pre-complexes could reflect a specific spatio-temporal fine-tuning of the PI3K activity, in agreement with recent concept of preformed cell signaling platforms
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Ollivier, Matthias. "Développement de nouveaux biosenseurs fluorescents pour l'étude dynamique de la signalisation purinergique." Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT024/document.
Full textAbstract:
En dehors de son rôle de stockage de l’énergie cellulaire, l’adénosine-triphosphate (ATP) est également une molécule de signalisation extracellulaire qui agit sur deux familles de récepteurs, les récepteurs métabotropiques P2Y et les récepteurs ionotropiques P2X. Dans le système nerveux central, les récepteurs P2X et la signalisation purinergique sont impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques comme la modulation de la transmission synaptique et la communication neurone-glie ainsi que dans diverses pathologies telles que les douleurs chroniques, l’épilepsie ou les maladies neurodégénératives. Enregistrer l’activité des récepteurs P2X in situ reste aujourd’hui encore difficile de par la paucité des outils pharmacologiques et de par les propriétés biophysiques particulières de ces récepteurs canaux. De surcroit, les mécanismes de libération de l’ATP sont encore mal caractérisés et la détection de cette molécule dans l’espace extracellulaire est limitée par la faible résolution spatio-temporelle des techniques disponibles. A ce jour, il n’existe aucune méthode satisfaisante permettant de suivre l’activité des récepteurs P2X ou détecter la libération d’ATP en temps réel. Pour pallier à ces manques, nous avons développé de nouveaux outils fluorescents basés sur la fusion du rapporteur calcique GCaMP6s aux récepteurs P2X.Notre étude montre d’abord que ces biosenseurs P2X-GCaMP6s sont capables de rapporter spécifiquement et dynamiquement, en fluorescence, l’activité des récepteurs P2X dans différentes lignées cellulaires (HEK, astrocytes, macrophages), ainsi que dans des neurones hippocampiques en culture. Dans un deuxième temps, l’outil P2X2-GCaMP6s a été modifié afin de créer un biosenseur de haute affinité pour l’ATP extracellulaire. Deux mutants, dont l’affinité apparente est de l’ordre de la centaine de nanomolaire, ont permis de détecter et de quantifier une libération d’ATP endogène. En combinant l’utilisation de ces biosenseurs avec des approches pharmacologiques et génétiques, nous avons montré que lors d’un choc hypotonique l’activation du canal VRAC LRRC8 contribue à la libération d’ATP par les cellules HEK et par des monocytes humains différenciés en macrophages. Enfin, nous avons montré que la libération d’ATP lors du gonflement des cellules déclenchait le phénomène de régulation du volume cellulaire, permettant aux cellules de retrouver leur volume initial.Ces biosenseurs fluorescents permettent donc de visualiser de façon dynamique l’activité des récepteurs P2X et la libération d’ATP. Ces outils étant compatibles avec des approches in vivo, ils devraient permettre une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires de la communication purinergique<br>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) is an extracellular signaling molecule acting on two major classes of membrane receptors, metabotropic P2Y receptors and ionotropic P2X receptors. In the central nervous system, P2X receptors are involved in diverse functions such as modulation of synaptic transmission or neuron-glia communication and are implicated in different pathologies including chronic pain, epilepsy or neurodegenerative diseases. Recording P2X receptor activity is difficult because of the paucity of pharmacological tools and because P2X receptors are prone to desensitization. In addition, measuring extracellular ATP concentration is challenging since the mechanisms and the source of ATP are still poorly characterized. In addition, classical ATP detecting approaches have clear spatial and temporal limitations. As a consequence, following P2X activity and visualizing or quantifying ATP release in real time remains challenging. To overcome these issues, we developed new fluorescent biosensors based on the fusion of the fluorescent calcium reporter GCaMP6s to P2X receptors.We first determined that fluorescence specifically reports on the activity of the P2X2 channel in different cell line (HEK, astrocytes, macrophages) and in primary culture of hippocampal neurons. We next engineered P2X2 receptor to create high affinity ATP biosensors. We identified two mutants with EC50s for ATP in the 100 nanomolar range that allow for the detection and the quantification of endogenous ATP release evoked by cell swelling. Using pharmacological approaches and knock-out cells, we demonstrated the implication in ATP release of the recently identify volume-regulated anion channel, LRRC8A in HEK cells and differentiated human macrophages. Finally, we provided evidence that the LRRC8-dependant ATP release is necessary for the cellular regulation of volume decrease after swelling.Our results show that these fluorescent ATP biosensors can be used to dynamically track P2X channel activity and can be used in vivo to decipher the molecular mechanisms involved in purinergic signaling
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Pelosse, Martin. "Biosenseurs reposant sur l'AMPK et le FRET pour l'analyse du métabolisme énergétique : AMPFret." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV057/document.
Full textAbstract:
La protéine kinase activée par AMP (AMPK) est un senseur ubiquitaire du statut énergétique de la cellule eucaryote. Elle est exprimée sous la forme d'un complexe hétérotrimèrique comprenant les sous unités catalytique (α) et régulatrices (β et γ). Ce large complexe protéique (130kDa), fonctionne comme un hub central de la signalisation cellulaire, régulateur du métabolisme énergétique et au-delà. La (dé)régulation de l'AMPK est impliquée dans de nombreuses pathologies et l'AMPK apparait comme une cible de choix pour développer de nouveaux médicaments contre le diabète de type 2. Une fois activée, l'AMPK va restaurer l'homéostasie énergétique en diminuant le métabolisme demandeur d'énergie (anabolisme) et en stimulant le métabolisme produisant le l'énergie (catabolisme). In vivo, l'AMPK est activée par des mécanismes multiples et complexes permettant la fine régulation de son activité lors de différentes situations de stress métaboliques. Premièrement, l'activité de l'AMPK est modulée de manière systémique par phosphorylation et déphosphorylation de la sous unité α (par des kinases et phosphatases en amont respectivement). De plus, l'attachement d'AMP et d'ADP à la sous unité γ augmente la phosphorylation de l'AMPK. Deuxièmement, l'AMPK est activée de manière allostérique par l'AMP qui se lie à sous unité γ lors de chutes du ratio ATP/AMP. Tous ces mécanismes requièrent une communication entre les sous unités α et γ, mais un modèle consensus complet de l'activation de l'AMPK est toujours manquant. Se basant sur différentes études structurales, d'autres et nous-mêmes avons proposé un changement de conformation induit par AMP au sein de l'hétérotrimère AMPK. Afin de mieux élucider ce mécanisme, nous avons tiré profit de ces changements conformationels pour imaginer et créer un hétérotrimère d'AMPK permettant de suivre directement et en temps réel l'état de conformation de l'AMPK par FRET. Une limite importante lors du développement de complexes multiprotéiques est l'augmentation exponentielle de la quantité de travail liée à la modification et la combinaison de nombreux gènes hétérologues lors du remaniement de ces complexes protéiques et de leurs productions. Nous avons utilisé la technologie ACEMBL, qui exploite des techniques de recombinaisons homologues, pour faciliter la révision rapide et itérative de la production et de l'analyse fonctionnelle, après ingénierie, de complexes multi protéiques. Le senseur fluorescent génétiquement codé ainsi crée, et nommé AMPfret, a la propriété de rapporter les changements de conformation induits par les nucléotides ayant lieu au sein de l'AMPK. De plus, les changements de signal FRET corrèlent avec l'activation allostérique de l'AMPK. Le senseur répond à de faible concentrations en AMP (micromolaire) et a démontré la capacité exclusive qu'a l'ATP, et non l'ATP-Mg, à concurrencer l'AMP. De plus, son utilisation a permis une meilleure compréhension du rôle des sites CBS lors de l'activation allostérique. AMPfret peut aussi être considérer comme un outil de choix pour le criblage de molécules ciblant l'AMPK, et pour le monitoring de l'état énergétique intracellulaire<br>AMP-activated protein kinase (AMPK) is a ubiquitous sensor of cellular energy and nutrient status in eukaryotic cells. It is expressed as heterotrimeric complexes comprising catalytic (α) and regulatory (β and γ) subunits. This large protein complex (130kDa), conserved from yeast to plants and mammals, functions as a central signaling hub and master regulator of energy metabolism and beyond. (Dys)regulation of AMPK signaling has been implicated in various pathologies. In particular, AMPK emerged as a suitable target to develop novel drugs for type II diabetes. Once activated AMPK will attempt to restore the energy homeostasis by down-regulating energy demanding pathways (anabolism) and up-regulating the energy producing ones (catabolism). AMPK is activated in vivo by multiple, complex mechanisms allowing fine tuning of AMPK activity in different situations of metabolic stress. First, AMPK activity is systemically modulated via activating phosphorylation at the α-subunit (by upstream kinases) and inactivating dephosphorylation (by upstream phosphatases). In addition, AMP and ADP binding to the γ-subunit increase AMPK phosphorylation. Second, AMPK is allosterically activated by AMP binding to the γ-subunit when the ATP/AMP ratio is falling. All these mechanisms require close communication between the γ- and α subunits, but a complete consensus model for AMPK activation is still lacking. We and others have proposed an AMP-induced conformational switch within the full-length heterotrimeric AMPK complex based on different, complementary structural studies. To further elucidate this mechanism, we have profited from these structural rearrangements to imagine and engineer an AMPK complex that allows a direct, real-time readout of the AMPK conformational state by fluorescence resonance energy transfer (FRET). A definite bottleneck in engineering multiprotein complexes is the exponential increase in work-load if several heterologous genes need to be altered, engineered and combined for revised protein complex production experiments. We used the ACEMBL technology which harnesses site-specific and homologous recombination techniques in tandem to facilitate rapid, iterative revision of multi-protein complex expressions after engineering and functional analysis of multiprotein complex. The resulting genetically encoded fluorescent biosensor, named AMPfret, can report conformational changes within the AMPK heterotrimer induced by nucleotide binding and the monitored FRET correlates with AMPK allosteric activation. The sensor responds to low micromolar concentrations of AMP, shows the exclusive ability of ATP, but not Mg-ATP, to compete with AMP, and allows insight into the role of CBS domains for allosteric AMPK activation. It may also be a tool of choice for AMPK targeted drug screening, and reporting the intracellular energy state
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Jacob, Pierre. "Unraveling new components of abiotic stress signaling pathways through screening of a biosensor mutant population." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLE042.
Full textAbstract:
Les stress ont un impact majeur sur l'agriculture. Les études réalisées jusqu'à présent portent majoritairement sur des stress simples, appliqués indépendamment dans des conditions de culture idéales. Cependant, les combinaisons de stress sont la norme dans les champs et la réponse aux combinaisons de stress ne peut être extrapolée à partir de l'addition des réponses aux stress simples. Une analyse bioinformatique de banques de données de transcriptomique a permis d’identifier un gène (HSFA2) répondant a de multiple stress, isolés ou combinés. La présente thèse a pour but de découvrir les mécanismes contrôlant l'expression d’HSFA2. Deux stratégies ont alors été mise en oeuvre. Dans un premier temps, les facteurs capables de fixer une région promotrice d’HSFA2 ont été étudiés par système de « simple hybride levure ». Dans un second temps, une lignée transgénique biosenseur de l’activité d’HSFA2 a été produite et mutagénéisée. De nombreux mutants ont été sélectionnés sur la base d’une expression constitutive du biosenseur. La capacité des mutants sélectionnés à résister à une combinaison de stress chaleur et de stress lumière a ensuite été analysée. L’identification des mutations causales par séquençage du génome entier a permis, dans certains cas, de déterminer quels étaient les loci responsables des résistances observées. En particulier, deux mutations conférant une large résistance seront discutées<br>Stresses represent the major cause of yield loss in modern agriculture. Previously, the majority of studies concern simplified, single stress situations, whereas in the field, stresses are complex and most often occurring in combinations. However, multiple stress response cannot be extrapolated from single stress responses added together. Bioinformatic analysis of transcriptomic data banks allowed us to identify a gene (HSFA2) involved in multiple stress responses. The work presented here aimed at discovering the mechanisms controlling HSFA2 expression. Two strategies were used.First, factors able to bind a region of HSFA2 promoter were studied through a “yeast one hybrid” system. Secondly, a transgenic biosensor of HSFA2 activity line was produced and mutagenized. A great number of mutants were selected on the basis of showing a constitutive activation of the biosensor. Resistance potentials to a combination of heat and high light stresses were then determined. Causal mutations identification through whole genome sequencing allowed, in some cases, to determine which were the loci responsible for the resistance traits. In particular, two mutations confering broad spectrum stress resistance will be discussed
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Peyressatre, Marion. "Développement de biosenseurs fluorescents et d’inhibiteurs pour suivre et cibler CDK5/p25 dans le glioblastome." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONT3513/document.
Full textAbstract:
CDK5 est une protéine kinase exprimée de façon ubiquitaire et activée principalement dans le système nerveux central, ou elle joue un rôle important dans la transmission synaptique, la guidance axonale et la migration cellulaire, la plasticité synaptique et le développement neuronal. CDK5 est associée à la protéine p35 au niveau de la membrane cellulaire, et activée par clivage calpaine-dépendant de cette dernière en p25, ce qui conduit à la relocalisation de CDK5/p25 dans le cytoplasme cellulaire. CDK5/p25 phosphoryle de nombreux substrats dont la protéine Tau, contribuant ainsi à l’apparition de plaques neurofibrillaires responsable des pathologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson, lorsqu’elle est hyperactivée. Plus récemment, l’expression et l’hyperactivation de CDK5 a été décrite comme impliquée dans le développement de cancers et en particulier de tumeurs cérébrales. Toutefois aucune approche ne permet actuellement de détecter et de mesurer l’activité de CDK5/p25 directement dans des cellules vivantes, au sein des tissus et des tumeurs concernées, dû à un manque d’outils fiables et sensibles pour quantifier les changements dynamiques de son activité kinase. Par ailleurs, peu d’inhibiteurs sont actuellement disponibles pour inhiber CDK5/p25, de manière spécifique, la plupart ciblant la poche de fixation de l’ATP.Le premier objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur d’activité fluorescent de nature peptidique appelé CDKACT5 qui rapporte l’activité kinase de CDK5/p25 recombinante et dans des extraits cellulaires de manière dynamique et réversible suivant stimulation ou inhibition de cette kinase. Une fois caractérisé et validé in vitro, le biosenseur a été appliqué à la détection d’altérations de CDK5/p25 dans différentes lignées cellulaires de glioblastome dans des essais fluorescents d’activité kinase. Enfin CDKACT5 a été introduit dans des cellules neuronales vivantes afin de suivre les changements dynamiques d’activité de CDK5/p25 par microscopie de fluorescence et vidéo microscopie.Le deuxième objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur fluorescent conformationnel dans le but d’identifier des inhibiteurs non compétitifs de l’ATP ciblant la boucle d’activation de CDK5. Le biosenseur CDKCONF5 a été exploité pour réaliser un criblage haut débit de trois chimiothèques de petites molécules. Les touches identifiées ont été validées et caractérisées in vitro, pour déterminer leur potentiel inhibiteur dans des tests d’activité kinase et de prolifération cellulaire, ainsi que leur mécanisme d’action. Ces molécules constituent des candidats prometteurs pour une chimiothérapie sélective du glioblastome<br>CDK5 is a protein kinase ubiquitously expressed but mainly activated in the central nervous system, where it plays an important role in neuronal functions such as synaptic transmission, axonal guidance and migration, synaptic plasticity and neuronal development. CDK5 is associated with p35 protein at the cell membrane, then activated by calpain-mediated cleavage of p35 into p25, which promotes relocalization of CDK5/p25 into the cytoplasm. CDK5/p25 phosphorylates a wide variety of substrates including Tau, thereby contributing to appearance of neurofibrillary plaques responsable for neurodegenerative pathologies such as comme Alzheimer’s et Parkinson’s, when hyperactivated. More recent studies suggest that CDK5 expression and hyperactivation are involved in glioblastoma during cell invasion and CDK5 expression has been reported to be correlated with the pathological grade of gliomas. However there are currently no tools available to monitor CDK5/p25 activity in its native cellular environment, in tissues or in tumours, due to an overall lack of reliable tools to quantify dynamic changes in its kinase activity in a sensitive and continuous fashion. Furthermore, few inhibitors are currently available to target CDK5/p25 in a specific fashion and most of them are ATP competitive inhibitors.The first goal of my thesis was to develop a fluorescent peptide biosensor named CDKACT5, that specifically reports on recombinant CDK5/p25 and on endogenous CDK5 activity in cell extracts in a dynamic and reversible fashion following stimulation or inhibition of this kinase. Once validated in vitro, this biosensor was applied to detect alterations in CDK5/p25 activity in different glioblastoma cell lines in fluorescent kinase activity assays. Finally CDKACT5 was introduced into cultured neuronal cells to monitor dynamic changes in CDK5/p25 activity by fluorescence imaging and time-lapse microscopy.The second goal of my thesis project consisted in developing a conformational fluorescent biosensor to identify non-ATP competitive inhibitors targeting the activation loop of CDK5. CDKCONF5 was implemented to perform a high throughput screen of three small molecule libraries. The hits identified were validated and characterized to determine their inhibitory potential in kinase activity and proliferation assays, as well as their mechanism of action. These compounds constitute promising for selective chemotherapy in glioblastoma
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Kurzawa, Laetitia. "Développement de biosenseurs peptidiques fluorescents pour la détection des Cdk-cyclines dans les cellules vivantes." Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20086.
Full textAbstract:
Chez les eucaryotes supérieurs, la progression ordonnée du cycle cellulaire est régie par une dizaine de kinases Cdk-cyclines. Les altérations génétiques ou épigénétiques impliquant des oncogènes ou des gènes codant pour des suppresseurs de tumeurs sont souvent associées à l'expression ou l'activation aberrante des Cdks, favorisant ainsi la prolifération cellulaire incontrôlée et notamment le développement de cancers. Malgré la pertinence oncogénique et thérapeutique de ces protéines, leur détection est restée jusqu'à présent limitée à des méthodes indirectes et invasives. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer un biosenseur peptidique fluorescent permettant de reconnaître spécifiquement les Cdk-cyclines. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, le biosenseur a été délivré efficacement dans les cellules. La mise au point d'une quantification ratiométrique du signal a par ailleurs permis d'évaluer l'abondance relative des Cdk-cyclines endogènes. Deux variants plus spécifiques de certains complexes ont pu être développés. Enfin, d'autres versions du biosenseur ont quant à elles permis d'évaluer sa biodistribution in vivo et de mettre au point un essai cellulaire en vue d'un criblage de petites molécules ayant un effet sur l'abondance relative des Cdk-cyclines<br>Cdk-cyclins represent key regulators of cell cycle progression among superior eukaryotes. Genetic and epigenetic alterations involving oncogenes or tumor suppressor genes are often associated with aberrant expression or activation of Cdks, leading to the sustained proliferation of cells and by the way to the development of cancers. Despite the oncogenic and therapeutic relevance of these proteins, their detection has so far remained limited to indirect and invasive methods. My Ph.D. thesis work aimed in this context at developing peptidic fluorescent biosensors that specifically recognize Cdk-cyclins. Combined to cell-penetrating peptides, the biosensor was efficiently delivered into cells. Following the development of the signal ratiometric quantification, the relative abundance of endogenous Cdk-cyclins was directly evaluated in living cells. Two other variants, that are more specific towards specific Cdk-cyclin complexes, were also designed. Finally, the development of novel versions of the biosensor allowed us to evaluate its biodistribution in vivo and to set up a cell-based assay to screen small molecules having an effect on Cdk-cyclin relative abundance
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Caland, Fabrice. "Décomposition tensorielle de signaux luminescents émis par des biosenseurs bactériens pour l'identification de Systèmes Métaux-Bactéries." Phd thesis, Université de Lorraine, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00934507.
Full textAbstract:
La disponibilité et la persistance à l'échelle locale des métaux lourds pourraient être critiques notamment pour l'usage futur des zones agricoles ou urbaines, au droit desquelles de nombreux sites industriels se sont installés dans le passé. La gestion de ces situations environnementales complexes nécessitent le développement de nouvelles méthodes d'analyse peu invasives (capteurs environnementaux), comme celles utilisant des biosenseurs bactériens, afin d'identifier et d'évaluer directement l'effet biologique et la disponibilité chimique des métaux. Ainsi dans ce travail de thèse, nous avons cherché à identifier, à l'aide d'outils mathématiques de l'algèbre multi-linéaire, les réponses de senseurs bactériens fluorescents dans des conditions environnementales variées, qu'il s'agisse d'un stress engendré par la présence à forte dose d'un métal ou d'une carence nutritive engendrée par son absence. Cette identification est fondée sur l'analyse quantitative à l'échelle d'une population bactérienne de signaux multidimensionnels. Elle repose en particulier sur (i) l'acquisition de données spectrales (fluorescence) multivariées sur des suspensions de biosenseurs multicolores interagissant avec des métaux et sur (ii) le développement d'algorithme de décomposition tensoriels. Les méthodes proposées, développées et utilisées dans ce travail s'efforcent d'identifier " sans \textsl{a priori} " (\textsl{a minima}), la réponse fonctionnelle de biosenseurs sous différentes conditions environnementales, par des méthodes de décomposition de tenseurs sous \hyphenation{con-train-tes} des signaux spectraux observables. Elles tirent parti de la variabilité des réponses systémiques et permettent de déterminer les " sources " élémentaires identifiant le système et leur comportement en fonction des paramètres extérieurs. Elles sont inspirées des méthodes CP et PARALIND . L'avantage de ce type d'approche, par rapport aux approches classiques, est l'identification unique des réponses des biosenseurs sous de faibles contraintes. Le travail a consisté à développer des algorithmes efficaces de séparations de sources pour les signaux fluorescents émis par des senseurs bactériens, garantissant la séparabilité des sources fluorescentes et l'unicité de la décomposition. Le point original de la thèse est la prise en compte des contraintes liées à la physique des phénomènes analysés telles que (i) la parcimonie des coefficients de mélange ou la positivité des signaux "source", afin de réduire au maximum l'usage d'a priori ou (ii) la détermination non empirique de l'ordre de la décomposition (nombre de sources). Cette posture a permis aussi d'améliorer l'identification en optimisant les mesures physiques par l'utilisation de spectres synchrones ou en apportant une diversité suffisante aux plans d'expériences. L'usage des spectres synchrones s'est avéré déterminant à la fois pour améliorer la séparation des sources de fluorescence, mais aussi pour augmenter le rapport signal sur bruit des biosenseurs les plus faibles. Cette méthode d'analyse spectrale originale permet d'élargir fortement la gamme chromatique des biosenseurs fluorescents multicolores utilisables simultanément. Enfin, une nouvelle méthode d'estimation de la concentration de polluants métalliques présents dans un échantillon à partir de la réponse spectrale d'un mélange de biosenseurs non-spécifiques a été développée.
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Prevel, Camille. "Développement de biosenseurs fluorescents et d’inhibiteurs pour suivre et cibler CDK4/cycline D dans le mélanome." Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONT3505/document.
Full textAbstract:
Les CDK/cyclines jouent un rôle majeur dans la progression du cycle cellulaire et dans le maintien de la prolifération des cellules cancéreuses, constituant ainsi des biomarqueurs clés et des cibles pharmacologiques attractives. Plus particulièrement, l’activité de CDK4/cycline D, kinase responsable de la progression de la phase G1 et de la transition G1/S, est dérégulée dans de nombreux cancers dont le mélanome. Cette hyperactivation est associée à des mutations, à l’amplification ou à la surexpression de CDK4, cycline D, p16INK4a ou encore pRb.Comme aucune approche sensible et directe n’existe pour évaluer l’activité de CDK4/cycline D dans des conditions physiologiques et pathologiques, le premier objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur fluorescent permettant d’étudier cette kinase in vitro et in cellulo. Une fois caractérisé et validé in vitro, le biosenseur a été appliqué à la détection d’altérations de CDK4/cycline D dans des biopsies de peau humaine et de xénogreffes de mélanome dans des essais fluorescents d’activité kinase, ainsi que dans des cellules cancéreuses vivantes par microscopie de fluorescence et vidéo microscopie.Par ailleurs, peu d’inhibiteurs sont actuellement disponibles pour inhiber CDK4/cycline D et la plupart d’entre eux ciblent la poche de fixation de l’ATP. C’est pourquoi le second objectif de ma thèse a consisté à identifier des inhibiteurs non compétitifs de l’ATP, soit par élaboration rationnelle de peptides, soit par criblage de petites molécules. A cette fin, deux biosenseurs fluorescents ont été développés qui permettent d’identifier respectivement des composés ciblant l’interface entre CDK4 et cycline D ou des inhibiteurs allostériques capables de perturber la dynamique conformationnelle de CDK4. Des essais de criblage par fluorescence réalisés avec ces biosenseurs ont conduit à l’identification de touches qui ont été validées et caractérisées in vitro et dans des essais de prolifération cellulaire, et qui constituent des candidats prometteurs pour une chimiothérapie sélective du mélanome<br>CDK/cyclins play a central role in coordinating cell cycle progression, and in sustaining proliferation of cancer cells, thereby constituting established cancer biomarkers and attractive pharmacological targets. In particular, CDK4/cyclin D, which is responsible for coordinating cell cycle progression through G1 into S phase, is a relevant target in several cancers including melanoma, associated with mutation of CDK4, cyclin D, p16INK4a and pRb.As there are no sensitive and direct approaches to probe CDK4/cyclin D activity in physiological and pathological conditions, the first goal of my thesis has consisted in engineering a fluorescent biosensor to probe this kinase in vitro and in cellulo. Once characterized and validated in vitro, the biosensor was applied to detect CDK4/cyclin D alterations in biopsies from human skin and melanoma xenografts in fluorescence-based activity assays, and in living cancer cells by fluorescence microscopy and timelapse imaging.Moreover, only few inhibitors are currently available to target CDK4/cyclin D and most of them bind the ATP pocket. As such, the second major goal of my thesis project has consisted in identifying non-ATP competitive inhibitors, either through rational design of peptides or by screening small molecule libraries. To this aim, two fluorescent biosensors were engineered which discriminate compounds that target the interface between CDK4 and cyclin D, or that perturb the conformational dynamics of CDK4, respectively, from ATP-pocket binding compounds. Fluorescence-based screening assays performed with these biosensors lead to identification of hits, which were validated and characterized in vitro and in cell proliferation assays, and which constitute promising candidates for selective chemotherapy in melanoma
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Blond, Pascale. "Conception, réalisation et développement de biosenseurs par spectroscopie infrarouge grâce à de nouveaux calix[4]arènes fonctionnalisés." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2021. https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/331632/4/Table.pdf.
Full textAbstract:
RésuméLes biosenseurs sont fort utilisés dans beaucoup de domaines, notamment dans celui du diagnostic médical. Ils permettent de détecter, de quantifier et de caractériser des biomarqueurs souvent protéiques. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourrier (FTIR) est un transducteur optique particulièrement bien adapté, par exemple pour la détection des amyloses. Celles-ci sont des maladies (comme la maladie d’Alzheimer, le prion et la maladie de Parkinson) caractériséespar l’agrégation et l’accumulation de protéines qui changent de conformation. Dans ce contexte, l’étude des conformations, grâce à la spectroscopie FTIR qui distingue les structures secondaires des protéines investiguées, est importante pour suivre l’évolution de ces maladies.Notre projet a donc consisté à développer une nouvelle interface pour des biosenseurs par spectroscopie IR, basée sur une stratégie innovante :le greffage de calixarènes. En effet, la fonctionnalisation chimique du matériau de support reste toujours un des principaux défis pourle développement de biosenseurs, car la performance du dispositif en dépend directement. Nous avons choisi de développer le biosenseur sur du germanium, car cet élément est un matériau de support idéal pour l’analyse par spectroscopie FTIR. Voici en quelques lignes une traversée du chemin qui m’a permis de réaliser ce projet.A. Caractérisation des calixarènes greffés par spectroscopie IRLa fonctionnalisation de surfaces via le greffage covalent de calix[4]arènes sur divers supports a été réalisée dans notre laboratoire. Différentes techniques d’analyse ont été utilisées pour la caractérisation des surfaces modifiées (l’électrochimie, la spectroscopie photoélectriqueà rayons X, la microscopie à force atomique, l’éllipsométrie, la spectroscopie UV-VIS). L’adaptabilité de la spectroscopie infrarouge pour la caractérisation des calixarènes greffés est la première vérification réalisée dans le cadre de notre travail. En premier lieu, les spectresd’absorbance IR de nanoparticules d’or portant des calix[4]arènes ont été caractérisés. Ensuite, ces mêmes calix[4]arènes, et d’autres, ont été greffés sur des surfaces de germanium et leurs spectres d’absorbance IR ont été entièrement caractérisés.B. Inhibition des phénomènes d’adsorption non spécifiqueLe greffage de calix[4]arènes sur germanium a été validé par d’autres techniques d’analyse (l’électrochimie, les angles de contact, etc.). Afin d’utiliser cette stratégie innovante dans le cadre de la biodétection, elle doit remplir certains critères, dont l’inhibition des phénomènes d’adsorption non spécifique sur les surfaces. Une diminution de cette adsorption parasite a étéobtenue à plus de 85 % sur germanium.C. Conception du biosenseurUn certain nombre de propriétés validées (la stabilité, la nature et la répartition des groupes fonctionnels, etc.), la stratégie a ensuite montré son intérêt dans le domaine de la biodétection. Une preuve du concept a d’abord été réalisée sur des surfaces de germanium avec un coupled’affinité modèle :la biotine (élément de reconnaissance) et la streptavidine.En parallèle, cette même stratégie a été utilisée pour une reconnaissance du L-tyrosinamide par résonance plasmonique de surface ou par une microbalance à cristal quartz durant un stage de recherche à Grenoble. Pour les deux reconnaissances, l’immobilisation du récepteur a principalement été réalisée via un couplage de type peptidique. D’autres immobilisations ont été réalisées notamment la bioconjugaison d’un dérivé thiol sur une surface calix-maléimide.D. Détection de biomarqueurs liés à la maladie d’Alzheimer Pour valoriser au mieux cette recherche, le biosenseur développé a été utilisé avec succès dans une expérience directement liée à la maladie d’Alzheimer.<br>AbstractBiosensors are widely used in many fields, especially in that of medical diagnosis. They allow the detection, quantification and characterization of often protein biomarkers.Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) is an optical transducer particularly well suited, for example for the detection of amyloidosis. These are diseases (like Alzheimer's disease, prion and Parkinson's disease) characterized by the aggregation and accumulation of proteins that change their conformation. In this context, the study of conformations, thanks to the FTIR spectroscopy, which distinguishes the secondary structures of the proteins investigated, is important to follow the evolution of those diseases.Our project therefore consisted in developing a new interface for biosensors using the IR spectroscopy, based on an innovative strategy: the grafting of calixarenes. Indeed, the chemical functionalization of the support material still remains one of the main challenges for thedevelopment of biosensors, the performance of the device directly depending on it. We chose to develop the biosensor on germanium, because that element is an ideal support material for analysis by FTIR spectroscopy. Here is in a few lines a reminder of the path that allowed me tocarry out this project.A. Characterization of grafted calixarenes by IR spectroscopyThe functionalization of surfaces via the covalent grafting of calix[4]arenes on various supports was carried out in our laboratory. Different analytical techniques have been used for the characterization of the modified surfaces (electrochemistry, X-ray photoelectricspectroscopy, atomic force microscopy, ellipsometry, UV-VIS spectroscopy). The adaptability of infrared spectroscopy for the characterization of grafted calixarenes is the first verification carried out in our work. First, the IR absorbance spectra of gold nanoparticles bearingcalix[4]arenes were characterized. Then, those same calix[4]arenes, and others, were grafted onto germanium surfaces and their IR absorbance spectra were fully characterized.B. Inhibition of non-specific adsorption phenomenaThe grafting of calix[4]arenes on germanium has been validated by other analytical techniques (electrochemistry, contact angles, etc.). In order to use this innovative strategy for biodetection, it must meet certain criteria, including the inhibition of non-specific adsorptionphenomena on surfaces. A decrease in this spurious adsorption was obtained with more than 85% on germanium.C. Design of the biosensorOnce a certain number of properties (stability, nature and distribution of functional groups, etc.) had been validated, the strategy then showed its interest in the field of biodetection. A proof of concept was first performed on germanium surfaces with a model affinity couple:biotin (recognition element) and streptavidin. In parallel, this same strategy was used for a recognition of L-tyrosinamide by surfaceplasmon resonance or by a quartz crystal microbalance during a research internship in Grenoble. For both recognitions, immobilization of the receptor was mainly achieved via peptide-type coupling. Other immobilizations were carried out, in particular the bioconjugation of a thiolderivative on a calix-maleimide surface.D. Detection of biomarkers linked to Alzheimer's diseaseTo make the most of this research, the biosensor developed was used with success in an experiment directly linked to Alzheimer's disease.<br>Doctorat en Sciences<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Vandame, Pauline. "Utilisation et développement de biosenseurs FRET pour la mesure d'actvités kinases in vivo au cours du cycle cellulaire." Thesis, Lille 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LIL10082/document.
Full textAbstract:
L’implication et les rôles de la PKA et de la MAPK/ERK lors de la division cellulaire, ont fait l’objet de nombreuses études. Pourtant les profils spatio-temporels des activités de ces kinases au cours des différentes étapes du cycle et notamment lors de la mitose sont controversés et restent à éclaircir. Le but de ce travail a été la détermination de ces profils grâce à l’utilisation et au développement d’outils moléculaires basés sur des propriétés de la fluorescence, capables de rapporter l’activité kinase in vivo, qui sont appelés biosenseurs FRET. Nous avons mis en évidence que l’activité de PKA augmente lors de la mitose pour ensuite chuter rapidement lors de la cytokinèse dans les cellules HeLa. Lors de la métaphase et de l’anaphase, l'activité de PKA est particulièrement élevée à proximité des chromosomes et ce, indépendamment d’une relocalisation de ses sous-unités catalytiques. De plus, l’utilisation d’inhibiteur de PKA conduit à l’apparition de phénotypes mitotiques aberrants, indiquant le rôle essentiel de cette augmentation d’activité dans le maintien de l’intégrité du génome. Ces phénotypes sont similaires à ceux décrits pour des perturbations de l’activité de MAPK/ERK. Le développement d’un biosenseur FRET optimisé pour les mesures d’activité de MAPK/ERK nous a permis de déterminer que son activité globale ne varie pas lors de la mitose mais connait en revanche une diminution forte et très brève lors de la cytokinèse. L’inhibition de PKA induit une augmentation sensible de la phosphorylation de MAPK/ERK, ce qui pourrait suggérer ainsi un lien entre les activités de ces deux protéines dans la répartition correcte du matériel génétique lors de la mitose<br>Even if the roles and contribution of PKA and MAPK/ERK in cell cycle have been the topic of several studies, the spatio-temporal profiles of their activities are still controversial and remain to be clarified. The aim of my PhD was to highlight those activity profiles during the cell cycle in HeLa cells, by using or developing new molecular tools, based on fluorescence properties that are able to report kinase activity in vivo and named FRET-based biosensors.The use of these biosensors allowed us to reveal that PKA activity increased at the onset of mitosis and stayed high until the completion of cytokinesis. During metaphase and anaphase, this activity was especially high in the close vicinity of the condensed chromosomes, independently of any concomitant relocalization of PKA catalytic sub-units within the cell. Moreover inhibition of PKA activity during mitosis lead to improper mitotic phenotype (i.e. : misalignment of the DNA on the spindle, precocious segregation of part of the chromosomes), pointing out the essential role of the activity increase in genetic stability. Those observed phenotypes are similar to those described upon experimental modifications of the MAPK/Erk activity level. By means of the development of a new improved MAPK/Erk activity biosensor, we showed that its global activity does not change during mitosis, but goes through a brief and strong decrease during cytokinesis. As the inhibition of PKA induces a noticeable increase of MAPK/Erk phosphorylation, those results could suggest a link between those two kinases activities in the correct distribution of the DNA to daughter cells during mitosis
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Parrello, Damien. "Conception de biosenseurs fluorescents multicolores pour l'identification in vivo des interactions bio-physicochimiques dans les systèmes minéral-bactérie." Thesis, Université de Lorraine, 2014. http://www.theses.fr/2014LORR0362/document.
Full textAbstract:
Le monitoring des écosystèmes terrestres nécessite une connaissance approfondie des interactions entre microorganismes, minéraux et métaux dans les sols. Afin d'évaluer in vivo la disponibilité de métaux tel que le fer dans des systèmes bactéries-minéraux, une approche basée sur l’utilisation de biosenseurs bactériens fluorescents et d’une analyse spectroscopique non-invasive a été explorée. Ce travail a notamment conduit à la construction chez Pseudomonas aeruginosa de fusions génétiques couplant des promoteurs régulés par le fer à des rapporteurs fluorescents multicolores. Les souches obtenues ont été utilisées comme senseur de la disponibilité du fer constitutif de différents minéraux (Nontronites). La réponse de ces biosenseurs bactériens a été étudiée en couplant la spectroscopie de fluorescence à balayage synchrone (SFS) à la décomposition canonique polyadique Candecomp / Parafac (CP). Avec des plans d’expérience privilégiant la diversité des réponses, le couplage SFS-CP garantit une estimation conjointe et rapide de l’expression de plusieurs promoteurs d’intérêts, y compris dans des milieux auto-fluorescents. Cette méthode originale permet, entre autres, de s’affranchir des problèmes liés aux recouvrements spectraux des protéines fluorescentes et fournit une estimation robuste et précise de la réponse des biosenseurs. Appliquée à d’autres plans d’expériences, elle démontre également que la bio-dissolution des nontronites par P. aeruginosa est assurée par la production de sidérophores et contrôlée par la cristallochimie des feuillets des smectites, notamment par la distribution des atomes de fer(III) entre les tétraèdres et les octaèdres<br>Monitoring terrestrial ecosystems requires a better understanding of the interactions between microorganisms, minerals and metals in the environment. To assess in vivo availability of metals such as iron in bacteria-mineral system, an approach based on whole-cell fluorescent biosensors and non-invasive spectroscopy was explored. This work led to the construction in Pseudomonas aeruginosa of a set of gene fusions coupling iron-regulated promoters to multicolour fluorescent reporters. The recombinant strains were used as sensors of structural iron availability in nontronites NAu-1 and NAu-2. The response of these biosensors was studied by coupling synchronous fluorescence spectroscopy (SFS) with canonical polyadic Candecomp/Parafac (CP) decomposition. On the basis of experimental designs favouring response diversity, the coupled SFS-CP method guarantees a joint estimate of gene expression from multiple promoters, even in highly fluorescent media. This novel method can solve the issue of spectral bleed-through of fluorescent proteins and provides a means to integrate multiple signals from combinations of whole-cell fluorescent bioreporters. In addition, we could show using SFS-CP that P. aeruginosa indirectly mobilize Fe(III) from nontronites primarily through the production of pyoverdine siderophore. The structural Fe(III) present on the edges of NAu-2 rather than NAu-1 particles appears to be more bioaccessible, suggesting that the distribution of Fe, in the tetrahedron and/or in the octahedron sites, governs the solubilization process
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Delépine, Baudoin. "Computer-aided design (CAD) tools for bioproduction and biosensing pathway engineering." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLE032/document.
Full textAbstract:
Les récentes avancées en biologie des systèmes et en biologie synthétique contribuent déjà au fleurissement d'applications en ingénierie métabolique visant une bioproduction renouvelable de composés chimiques. Nous pouvons entrevoir un futur où des microbes serait conçus à la carte afin de valoriser n'importe quelle source de carbone en n'importe quel composé d'intérêt. Si la route est longue avant l'accomplissement d'un tel objectif, son parcours devrait en être grandement facilité par l'exploitation de méthodes d'ingénierie déjà éprouvées dans d'autres disciplines. On s'attend entre autre à ce que l'utilisation de logiciels de Conception Assistée par Ordinateur (CAO) diminue le temps et l’expertise nécessaires à la construction de voies métaboliques n'existant pas dans la nature. La première partie de cette thèse est dédiée à notre méthode de prédiction de voies métaboliques et à ses implémentations. Nous décrivons tout particulièrement RetroPath2.0, un outil de prédiction de réseaux de réactions mettant l'accent sur les applications de rétrosynthèse, et qui est construit pour être facilement extensible par la communauté. Dans la seconde partie, nous détaillons l'intérêt des biosenseurs intracellulaires pour l'ingénierie métabolique et introduisons SensiPath; une application web qui exploite un outil de prédiction de réactions pour concevoir des circuits métaboliques permettant la biodétection de composés pour lesquels aucun biosenseur direct n'est connu. Dans l'ensemble, cette thèse propose que les outils de bioCAO devraient permettre de révéler la créativité de leurs utilisateurs et encourager l'exploration de nouvelles applications<br>Advances in systems and synthetic biology are fueling our ability to develop successful metabolic engineering applications for the sustainable production of bio-based chemicals. We can envision a future in which designer cells could be engineered to transform any carbon source into any target compound. This daunting task will be achieved by leveraging methods that proved themselves in other engineering disciplines. Among those, the use of Computer Aided Design(CAD) softwares is expected to reduce the amount of time and expert knowledge needed to design de novo metabolic pathways. The first part of this thesis is dedicated to our pathway prediction algorithm and its CAD implementations. Most notably, we will present RetroPath2.0, a versatile reaction network prediction framework focused on retrosynthesis that is built to be easily extensible by the community. In the second part, we will highlight the interest of intracellular biosensors for metabolic engineering and introduce SensiPath, a web application that uses a reaction prediction engine to design biosensing circuits for compounds for which no direct biosensors are known. Altogether, this thesis proposes that bioCAD tools should focus on empowering users’ creativity and encourage them to explore original applications
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Sanchez, Colline. "Biosenseurs fluorescents appliqués à l’étude de la fonction du réticulum sarcoplasmique dans le couplage excitation-contraction du muscle squelettique." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1164.
Full textAbstract:
La cascade d’évènements permettant la contraction de la fibre musculaire striée squelettique en réponse à l’activité électrique de sa membrane plasmique est regroupée sous le terme de couplage excitation-contraction (EC). Le couplage EC a lieu au niveau des triades, domaines nanoscopiques au niveau desquels les invaginations transversales de la membrane plasmique (tubules-T) sont en contact étroit avec deux citernes terminales adjacentes de réticulum sarcoplasmique (RS). Plus précisément, lors de l’excitation d’une fibre musculaire, un potentiel d’action se propage dans toute la surface de la membrane plasmique et en profondeur de la cellule via les tubules-T. Cette dépolarisation y est détectée par les protéines membranaires sensibles au potentiel Cav1.1 qui en retour, par couplage mécanique, déclenchent l’ouverture des canaux calciques du RS que sont les récepteurs de la ryanodine de type 1 (RYR1s). Ceci est à l’origine de l’augmentation massive de Ca2+ intracellulaire qui déclenche l’activation des myofilaments et donc la contraction. La compréhension des mécanismes de contrôle et de régulation des canaux RYR1s reste encore aujourd’hui limitée. En particulier, la mesure de l’activité physiologique de ces canaux dans la fibre musculaire intacte est toujours réalisée de manière très indirecte. Par ailleurs le rôle éventuel de variations de potentiel de la membrane du RS pendant l’activité musculaire n’a jamais été révélé. Une connaissance approfondie de ces phénomènes est pourtant essentielle à la compréhension de la fonction musculaire squelettique normale et pathologique. Dans ce contexte, l’objectif général de mon projet de thèse a été de mettre au point et utiliser des biosenseurs fluorescents localisés spécifiquement à la membrane des citernes terminales du RS de fibres musculaires différenciées – par leur fusion à une séquence d’adressage appropriée. Grâce à la combinaison des techniques d’électrophysiologie et d’imagerie de la fluorescence des biosenseurs sur fibres musculaires isolées, nous avons pu étudier l’activité du RS au cours de la fonction musculaire. Plus particulièrement, mon travail de thèse aborde deux problèmes biologiques principaux : le potentiel de membrane du RS et la signalisation calcique du RS au cours du couplage EC. Le premier objectif a visé à caractériser les changements de potentiel de la membrane du RS pendant l’activation du couplage EC. Pour cela, nous avons utilisé des biosenseurs de FRET de la famille Mermaid. Nos résultats montrent qu’il n’y a pas de changement substantiel du potentiel transmembranaire du RS pendant l’activation du couplage EC. Ces données confirment – pour la première fois en condition physiologique – que le flux de Ca2+ à travers les canaux RYR1s est équilibré par des contre-flux ioniques compensatoires qui permettent le maintien du potentiel de membrane du RS. Ceci assure la pérennité du flux de Ca2+ et contribue à l’efficacité du couplage EC. Le deuxième objectif a visé à détecter les variations de concentration en Ca2+ à proximité immédiate des canaux RYR1s. Pour cela, nous avons utilisé le biosenseur fluorescent sensible au Ca2+ GCamP6f. Le biosenseur adressé à la membrane du RS fournit un accès unique à l’activité individuelle de populations distinctes de canaux RYR1s au sein de différentes triades d’une même fibre musculaire. Au-delà de la caractérisation détaillée des propriétés des sondes GCaMP6f dans cette préparation, nos résultats montrent la stupéfiante synchronisation de l’activité de libération de Ca2+ des triades d’une même fibre musculaire au cours du couplage EC. Les résultats ouvrent des perspectives particulièrement intéressantes pour les études de situations pathologiques d’altération de l’activité des canaux RYR1s<br>Excitation-contraction (EC) coupling in skeletal muscle corresponds to the sequence of events through which muscle fiber contraction is triggered in response to plasma membrane electrical activity. EC coupling takes place at the triads; these are nanoscopic domains in which the transverse invaginations (t-tubules) of the surface membrane are in closed apposition with two adjacent terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum membrane (SR). More precisely, EC coupling starts with action potentials fired at the endplate, propagating throughout the surface membrane and in depth into the muscle fiber through the t-tubules network. When reaching the triadic region, action potentials activate the voltage-sensing protein Cav1.1. In turns, Cav1.1 directly open up the type 1 ryanodine receptor (RYR1) in the immediately adjacent SR membrane, through intermolecular conformational coupling. This triggers RYR1-mediated SR Ca2+ release which produces an increase in cytosolic Ca2+ triggering contraction. Current understanding of the mechanisms involved in the control and regulation of RYR1 channels function is still limited. One reason is related to the fact that detection of RYR1 channel activity in intact muscle fibers is only achieved with indirect methods. Also, whether SR the membrane voltage experiences changes during muscle activity has so far never been experimentally assessed. Yet, deeper knowledge of these processes is essential for our understanding of muscle function in normal and disease conditions. In this context, the general aim of my PhD project was to design and use fluorescent protein biosensors specifically localized at the SR membrane of differentiated muscle fibers, by fusing them to an appropriate targeting sequence. Thanks to a combination of single cell physiology and biophysics techniques based on electrophysiology and biosensor fluorescence detection, we were able to study the SR activity during muscle fiber function. Specifically, my PhD work focused on two major issues: SR membrane voltage and SR calcium signaling during EC coupling. The first aim of my work was to characterize SR membrane voltage changes during muscle fiber activity. For this, we used voltage sensitive FRET-biosensors of the Mermaid family. Results show that the SR trans-membrane voltage experiences no substantial change during EC coupling. This provides the first experimental evidence, in physiological conditions, for the existence of ion counter-fluxes that balance the charge deficit associated with RYR1-mediated SR Ca2+ release. Indeed, this process is essential for maintaining the SR Ca2+ flux upon RYR1 channels opening and thus critically important for EC coupling efficiency. The second objective of my work aimed at detecting the changes in Ca2+ concentration occurring in the immediate vicinity of the RYR1 Ca2+ release channels during muscle fiber activation. For this, we took advantage of one member of the recent generation of genetically encoded Ca2+ biosensor: GCaMP6f. The SR-targeted biosensor provides a unique access to the individual activity of RYR1 channels populations within distinct triads of a same muscle fiber. Beyond allowing a detailed characterization of the biosensor properties in this preparation, results highlight the remarkable uniformity of SR Ca2+ release activation from one triad to another, during EC coupling. These results open up stimulating perspectives for the investigation of disease conditions associated with defective behavior of RYR1 channels
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Présent, Romain. "Biodisponibilité et dynamique de partition de métaux traces aux interphases microbiennes : effets de complexation intracellulaire et application aux biosenseurs bactériens." Thesis, Université de Lorraine, 2018. http://www.theses.fr/2018LORR0181/document.
Full textAbstract:
La biodisponibilité d'un métal pour un organisme donné correspond à la fraction de ce métal qui est potentiellement bioadsorbable et/ou biointernalisable. Elle dépend de la composition physicochimique du milieu, de la nature des surfaces biologiques considérées et elle est modulée par la réponse cellulaire des organismes. Dans un contexte environnemental, l’analyse des processus contrôlant la bioassimilation des métaux est essentielle pour une prédiction fiable de leur biodisponibilité et toxicité. Dans ce manuscrit sont détaillés des développements théoriques et expérimentaux visant à comprendre la dynamique de partition de contaminants métalliques aux interfaces microbiennes et les déterminants de leur biodisponibilité selon une approche qui dépasse les cadres thermodynamiques classiques (modèle BLM). Après une partie introductive et une revue de l'état de l'art, le troisième chapitre de cette thèse est dédié à l'élaboration d'un formalisme pour l'évaluation quantitative de la bio-partition hors-équilibre de métaux traces aux interfaces biologiques. Ce modèle théorique est basé sur les expressions des flux de contaminants depuis la solution extracellulaire vers la surface biologique par diffusion/conduction, des flux d'internalisation et excrétion à travers la membrane, et il tient compte de la cinétique de déplétion des métaux en solution. Le formalisme intègre par ailleurs les processus de complexation intracellulaire des métaux sur la base d'un mécanisme d'Eigen généralisé. Dans le quatrième chapitre, des souches d'Escherichia coli ont été génétiquement modifiées pour (i) limiter leurs capacités d'excrétion des métaux et (ii) sur-exprimer des protéines intracellulaires ayant une forte affinité pour ces métaux. Des données expérimentales issues de suivis cinétiques de déplétion de Cd(II) réalisées à différentes fractions volumiques en bactéries ont permis de conforter avec succès les bases de la théorie élaborée dans cette thèse pour la partition de métaux à des biointerfaces molles chargées. Un dernier chapitre est consacré à l’évaluation quantitative de la réponse de biosenseurs luminescents en présence de métaux. Ce formalisme décrit la façon avec laquelle la dérivée temporelle des biosignaux dépend de la dynamique d’internalisation du métal, de la cinétique de formation de complexes intracellulaires régulateurs des processus de transcription et de leurs stabilités, et des processus de bio-sorption passive. Une confrontation avec des données expérimentales issues de biosenseurs sensibles au cadmium a permis de mettre en évidence l’inapplicabilité des modèles d’équilibre de biodistribution des métaux, et de prédire la réponse des biosenseurs à des variations de la salinité du milieu, de la concentration cellulaire et de la concentration bulk de métaux<br>Bioavailability of metal ions toward living organisms refers to the metal fraction they potentially adsorb and/or internalize. It is governed by the physicochemical medium composition, the nature of the biological surface considered and it is further mediated by the cellular response of the organisms. Within an environmental context, a fine understanding of the processes controlling metal biouptake is mandatory to predict bioavailability and toxicity of metallic contaminants. Here are detailed theoretical and experimental developments to broaden our knowledge on dynamic partitioning of metallic contaminants at microbial interfaces beyond the standard thermodynamic representation (BLM model). After an introduction and a state of the art section, the third chapter is devoted to the elaboration of a rationale for the evaluation of the processes governing metal biouptake under relevant out-of-equilibrium conditions. The formalism expresses the fluxes of contaminants from bulk medium to the biosurface via conductive diffusion, the biouptake and excretion fluxes with account of metal depletion kinetics in the extracellular medium. It also includes chemodynamics of intracellular metal complexation as described by a generalized Eigen scheme. In the fourth chapter, strains of \textit{Escherichia coli} were genetically modified to limit metal excretion ability and overexpress strong intracellular proteinaceous chelators. Quantitative interpretation of metal depletion kinetic data confort the bases of the theory developed in this PhD work on metal partitioning at soft charged biointerfaces. The final chapter deals with a development of a theoretical framework for understanding -on a mechanistic level- the response of metal-sensitive whole-cell bioreporters. The theory explicitly deciphers how the time derivative of bioreporters signal intensity is governed by the dynamics of metal biouptake, by the formation kinetics and stability of the intracellular complexes acting as transcriptional regulators, and by passive biosorption. The model predictions are successfully collated with cadmium detection data collected with genetically modified Escherichia coli luminescent bioreporters that exhibit various lipopolysaccharidic surface structures. The analysis dismisses the applicability of thermodynamic metal biopartitioning models and it clearly defines the physicochemical medium composition in line with optimum biosensing of the bioavailable metal fraction
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Koch, Mathilde. "Computational modeling to design and analyze synthetic metabolic circuits." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS467/document.
Full textAbstract:
Les buts de cette thèse sont doubles, et concernent les circuits métaboliques synthétiques, qui permettent de détecter des composants chimiques par transmission de signal et de faire du calcul en utilisant des enzymes. La première partie a consisté à développer des outils d’apprentissage actif et par renforcement pour améliorer la conception de circuits métaboliques et optimiser la biodétection et la bioproduction. Pour atteindre cet objectif, un nouvel algorithme (RetroPath3.0) fondé sur une recherche arborescente de Monte Carlo guidée par similarité est présenté. Cet algorithme, combiné à des règles de réaction apprises sur des données et des niveaux différents de promiscuité enzymatique, permet de focaliser l’exploration sur les composés et les chemins les plus prometteurs en bio-rétrosynthèse. Les chemins obtenus par rétrosynthèse peuvent être implémentés dans des cellules ou des systèmes acellulaires. Afin de concevoir le meilleur milieu pour optimiser la productivité du système, une méthode d’apprentissage actif qui explore efficacement l’espace combinatoire des composants du milieu a été développée.La deuxième partie a consisté à développer des méthodes d’analyse, pour générer des connaissances à partir de données biologiques, et modéliser les réponses de biocapteurs. Dans un premier temps, l’effet du nombre de copies de plasmides sur la sensibilité d’un biocapteur utilisant un facteur de transcription a été modélisé. Ensuite, en utilisant des systèmes acellulaires qui permettent un meilleur contrôle des variables expérimentales comme la concentration d’ADN, l’utilisation des ressources a été modélisée pour assurer que notre compréhension actuelle des phénomènes sous-jacents est suffisante pour rendre compte du comportement du circuit, en utilisant des modèles empiriques ou mécanistiques. Couplés aux outils de conception de circuits métaboliques, ces modèles ont ensuite permis de développer une nouvelle approche de calcul biologique, appelée perceptrons métaboliques.Dans l’ensemble, cette thèse présente des outils de conception et d’analyse pour les circuits métaboliques synthétiques. Ces outils ont été utilisés pour développer une nouvelle méthode permettant d’effectuer des calculs en biologie synthétique<br>The aims of this thesis are two-fold, and centered on synthetic metabolic circuits, which perform sensing and computation using enzymes.The first part consisted in developing reinforcement and active learning tools to improve the design of metabolic circuits and optimize biosensing and bioproduction. In order to do this, a novel algorithm (RetroPath3.0) based on similarity-guided Monte Carlo Tree Search to improve the exploration of the search space is presented. This algorithm, combined with data-derived reaction rules and varying levels of enzyme promiscuity, allows to focus exploration on the most promising compounds and pathways for bio-retrosynthesis. As retrosynthesis-based pathways can be implemented in whole cell or cell-free systems, an active learning method to efficiently explore the combinatorial space of components for rational media optimization was also developed, to design the best media maximizing cell-free productivity.The second part consisted in developing analysis tools, to generate knowledge from biological data and model biosensor response. First, the effect of plasmid copy number on sensitivity of a transcription-factor based biosensor was modeled. Then, using cell-free systems allowing for broader control over the experimental factors such as DNA concentration, resource usage was modeled to ensure our current knowledge of underlying phenomenons is sufficient to account for circuit behavior, using either empirical models or mechanistic models. Coupled with metabolic circuit design, those models allowed us to develop a new biocomputation approach, called metabolic perceptrons.Overall, this thesis presents tools to design and analyse synthetic metabolic circuits, which are a novel way to perform computation in synthetic biology
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Girard, Léa. "Quorum Sensing in Vibrio spp. : AHL diversity, temporal dynamic and niche partitioning." Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066650/document.
Full textAbstract:
Chez les Vibrio spp., le QS est impliqué dans de nombreuses fonctions comme la colonisation de niche écologiques, les stratégies de survie ou encore la virulence. Cependant, pour la majorité des espèces de Vibrio, la diversité des AHLs produites reste largement sous-estimée et l'étude du QS est encore limitée à quelques espèces modèles ou pathogènes. Toutefois, dans les environnements aquatiques, ces espèces sont minoritaires et les espèces les plus abondantes ne sont que très peu étudiées. Nos résultats ont révélé une importante diversité d'AHLs mais aussi, de façon surprenante, une hétérogénéité dans les phénotypes de production d'AHL au sein d'une même espèce de Vibrio. Pour la première fois, nous avons mis en évidence qu'une même souche de Vibrio pouvait présenter des phénotypes de production d'AHLs différent au cours du temps et une approche statistique a révélé l'implication de certains déterminants biotiques et abiotiques dans ces variations temporelles. Par ailleurs, une approche à micro-échelle a révélé une structuration des populations de Vibrio en unités fonctionnelles constituées de souches phylogénétiquement proches qui partagent des niches écologiques spécifiques et des comportements sociaux. Nos résultats ont mis en évidence que les modalités de communication pouvaient être hétérogènes suggérant l'absence d'un langage commun au sein de ces unités fonctionnelles. En conclusion, ce travail de thèse a permis d'apporter de nouvelles connaissances sur le QS chez les Vibrio dans l'environnement marin, de la souche à la population, et propose une vision intégrée des mécanismes de régulation de la production d'AHLs dans l'environnement<br>Quorum sensing is an important mechanism among Vibrio species and is involved in many vital functions such as niche colonization, survival strategies or virulence. However, AHL diversity still largely underestimated for the majority of Vibrio species and the current knowledge on AHL-mediated QS is limited to a few pathogenic or bioluminescent species. Nonetheless, these species are weakly abundant in seawater while dominant species in the environment are poorly studied. Our results revealed a unexpected diversity of AHL molecules but also a quite surprising intra-species diversity of AHL production phenotypes. For the first time, we showed that different isolates of a single genotype switched between different AHL production phenotypes among time and we revealed the potential involvement of abiotic and biotic parameters in these variations. However, it appears that when studied at a microscale, Vibrio populations are showing a functional structuration in ecological units consisting of phylogenetically close strains sharing habitat and social traits. In this context, it was necessary to determine if these different AHL production phenotypes were associated to different micro-habitats in the water column. We did not demonstrate that a common language was spoken within ecological populations. This thesis work provide new insights on AHL-mediated QS among a broader range of species and among Vibrio populations and depicts the potential impact of multiple aspects of marine environments on AHL production
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Yapo, Cédric. "Adaptations de la cascade de signalisation AMPc/PKA dans le striatum au cours de la maladie de Parkinson et de son traitement par la L-DOPA : étude par imagerie de biosenseurs sur un modèle animal Detection of phasis dopamine by D1 and D2 striatal medium spiny neurons Switch-like PKA responses in the nucleus of striatal neuron." Thesis, Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS603.
Full textAbstract:
Les signaux neuromodulateurs induisent une adaptation des fonctions neuronales par le biais de mécanismes d’intégration dynamiques complexes. Parmi les voies de signalisation intracellulaires, celle de l’AMPc/PKA joue un rôle essentiel dans la réponse cellulaire à la dopamine. Pour analyser ces processus d’intégration, nous combinons l’imagerie de biosenseurs dans des préparations ex vivo de tranches de cerveau de souris avec de la modélisation de la signalisation intracellulaire dans les neurones D1 et D2 striataux. Dans une première partie de mon travail de thèse, nous analysons la dynamique de la signalisation striatale en réponse à des stimulations dopaminergiques transitoires telles celles associées aux récompenses. Nous montrons par imagerie que, contrairement à ce qui est communément admis, les récepteurs D2 à la dopamine permettent la détection de dopamine phasique au niveau de l’AMPc. De plus, les simulations suggèrent que les neurones D2 pourraient détecter une diminution du niveau de dopamine tonique, indicateur d’une situation aversive chez l’animal. Ce travail a fait l’objet d’une publication (Yapo et al., J. Physiol 2017). Dans une deuxième partie, nous avons analysé l’effet dans le noyau de ces stimulations dopaminergiques rapides. En comparaison avec les neurones du cortex, nous montrons que les neurones du striatum disposent d’un mécanisme de contrôle en-avant (“feed forward”) qui renforce les réponses PKA nucléaires. Cette situation originale, à l’opposé des rétrocontrôles homéostatiques habituels en biologie, amène à une réponse du noyau tout ou rien, extrêmement sensible. Nous pensons que ce mécanisme est impliqué dans la détection des signaux dopaminergiques transitoires. Ce travail a été publié dans un article (Yapo et al., J Cell Science 2018). Enfin une troisième partie, sous forme de résultats préliminaires, consistait à analyser l’adaptation des neurones du striatum à la perte des afférences dopaminergiques, caractéristique de la maladie de Parkinson. Nous avons observé l’hypersensibilité à la dopamine affectant les neurones D1, largement décrite dans la littérature. De plus, nous montrons que les neurones du striatum présentent une activité phosphodiestérase accrue. Une meilleure compréhension de ces adaptations pathologiques pourrait mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques<br>Neuromodulatory signals trigger adaptations in neuronal functions via complex integrative properties. Among the various existing intracellular signaling pathways, the cAMP/PKA cascade plays a critical role in the cellular response to dopamine. To analyze these integrative processes, we combine biosensor imaging in mouse brain slices with in silico modelisation of the intracellular signaling in D1 and D2 medium-sized spiny neurons. In a first part of my thesis work, we analyze the dynamics of cAMP/PKA signaling in striatal neurons stimulated by transient dopaminergic signals, such as those associated with reward. With imaging we show that the dopamine D2 receptors can sense phasic dopamine signals at the level of cAMP, a thought that has been argued for long. Moreover in silico simulations suggest that D2 spiny neurons could sense the interruptions in tonic dopamine levels associated with aversion in the animal. This work was published in (Yapo et al., J Physiol 2017). In a second part, we analyzed the effect of such brief dopaminergic signals on the nuclear PKA-dependent signaling. In comparison to cortical neurons, we show that the striatal neurons display a positive feedforward mechanism which strengthens the nuclear responses. This peculiar situation, which contrasts with the usual homeostatic feedback mechanisms found in biology, leads to all-or-nothing and extremely sensitive responses. We believe that this mechanism allows for the detection of transient dopaminergic signals. This work was published in (Yapo et al., J Cell Science 2018). Lastly a third part, that will be introduced as preliminary data, consisted in analyzing the adaptations of the striatal neurons following a dopamine depletion, such as the one found in Parkinson’s disease. We observed in our mouse model an hypersensitivity of the D1 spiny neurons to dopamine, already described by other groups. Additionally we show that striatal neurons display an increased phosphodiesterase activity. A better understanding of these pathological adaptations could lead to the emergence of new therapeutic strategies
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Murat, Pierre. "Utilisation de gabarits peptidiques pour le contrôle de l'auto-assemblage de dérivés de la guanine : des tétrades de guanines aux quadruplexes d'acides nucléiques." Phd thesis, Grenoble, 2010. http://www.theses.fr/2010GRENV050.
Full textAbstract:
Il est connu depuis presque 50 ans que, dans certaines conditions, les dérivés de guanosine peuvent former des tétrades. Ces tétrades résultent de l'arrangement coplanaire de quatre guanines reliées par des liaisons hydrogène de type Hoogsteen. Ces motifs particuliers représentent un modèle pertinent pour l'étude des phénomènes d'auto-assemblage et de synthèses non covalentes via la formation de liaisons hydrogène. Dans la première partie de ce manuscrit nous décrirons comment l'utilisation d'un gabarit peptidique peut contraindre la formation d'une telle organisation. L'introduction de contraintes conformationnelles permet de contrôler la formation de tétrades de guanines synthétiques dans l'eau sans la présence de cation normalement nécessaire pour stabiliser de tels édifices. Deux architectures ont été développées et caractérisées et les études effectuées permettent de comprendre les phénomènes intervenant dans la structuration de ces tétrades synthétiques. Il est également connu que les acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires particulières, connues sous le nom de quadruplexes d'acides nucléiques, formées par l'empilement de tétrades de guanines. Ces motifs particuliers interviennent dans de nombreux phénomènes biologiques (maintenance des régions télomériques, activation des oncogènes,. . . ) et représentent des cibles intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses. Néanmoins l'étude des phénomènes de reconnaissance de ces motifs par de petites molécules organiques est perturbée par des phénomènes de polymorphisme inhérent aux motifs quadruplexes. Nous proposons dans un deuxième chapitre, le développement de mime de quadruplexe basé sur l'utilisation d'un gabarit peptidique pour le contrôle de la présentation de courtes séquences nucléotidiques et le développement d'architectures présentant une topologie contrôlée. Un intérêt tout particulier a été apporté à l'étude de l'interaction de petites molécules organiques avec de tels motifs par SPR. Les expériences réalisées confirment que l'approche employée peut être utilisée pour comprendre les interactions mises en jeu et sélectionner des ligands de quadruplexes performants<br>It is known for almost 50 years, that guanosine derivatives can form tetrads under specific conditions. Guanine tetrads, which are formed by the coplanar arrangement of four guanines through the formation of Hoogsteen hydrogen bonds, represent a relevant model for the study of molecular self-assembly processes and non covalent synthesis. In the first part of this manuscript, we will describe how a peptidic scaffold can be used to constrain the formation of a tetrad. The introduction of conformational constraints allows the control of the formation of synthetic guanines tetrads in water in the absence of cations to stabilize the structure. Two architectures have been synthesized and characterized and the results highlight the different phenomena that allow the formation of synthetic tetrads. It is also known that guanine rich nucleic acids sequences can form particular secondary structures, known as G-quadruplexes. These motifs represent relevant target for the development of new anticancer therapies since they are involved in a lot of biological events (telomere maintenance, oncogene activation. . . ). However the study of the interaction between small organic molecules and such motifs are difficult due to their high polymorphism. We propose in a second chapter the design and the synthesis of G-quadruplexes mimics based on the covalent attachment of short nucleic acids sequences on a peptidic scaffold, which allow the control of the topologies of the so-obtained quadruplexes. The study of the interactions of small organic molecules with these mimics has been performed by SPR studies. This approach appears to be very interesting to understand the interactions that are involved in the recognition of quadruplexes and the selection of new G4 ligands
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Mariani, Louise-Laure. "Biosensor imaging of dopamine and glutamate signaling in striatal projection neurons in a mouse model of dopamine depletion." Thesis, Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS511.
Full textAbstract:
La maladie de Parkinson (MP) est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. Les traitements symptomatiques s’appuient principalement sur le remplacement de la dopamine (DA). Le traitement par L-DOPA, particulièrement efficace initialement, se complique à long terme par des fluctuations et dyskinésies. Les mécanismes de la plasticité striatale anormale sous-tendant l’apparition de ces dyskinésies sont mal compris. Le but de ce projet était d’identifier les anomalies des voies de signalisation dans les neurones de projection du striatum en l’absence de DA. Nous avons utilisé chez des souris avec lésion ou non des neurones DA par la 6-OHDA, des biosenseurs permettant l’étude de voies de signalisation en imagerie cellulaire multiphotonique de neurones vivants dans des tranches corticostriatales. Nous avons d’abord mis au point ce modèle combinant injection stéréotaxique de toxine et de vecteur viral chez des souris adultes. Dans certaines expériences nous avons étudié spécifiquement les réponses des neurones de projection striataux des voies directe (NPSd) ou indirecte (NPSi) en utilisant des biosenseurs activés par la recombinase Cre et des lignées transgéniques exprimant spécifiquement cette enzyme dans l’une ou l’autre population. Nous avons utilisé des biosenseurs FRET pour mesurer l’activité de la kinase dépendante de l’AMPc (PKA, sonde AKAR3) ou ERK (extracellular signal-regulated kinase, sonde EKAR-EV) et le senseur calcique GcAMP6S pour le Ca2+ libre cytosolique avec une bonne résolution spatiale et temporelle. Nous avons modulé pharmacologiquement les récepteurs de la DA, du glutamate et de l’adénosine, ainsi que les activités des kinases et phosphodiestérases. Nous avons observé que la lésion augmentait les réponses ERK à la stimulation des récepteurs D1 de la DA dans les NPSd. Nous avons montré une augmentation des réponses PKA dans ces neurones pouvant être liée à une augmentation de la protéine G stimulatrice d’adénylyle cyclase, Gαolf, ainsi qu’à une inhibition des phosphodiestérases. L’imagerie calcique a mis en évidence une augmentation de l’activité spontanée des NPSd et, de manière inattendue, de la sensibilité à la stimulation des récepteurs AMPA du glutamate des NPSi. En conclusion notre travail utilise pour la première fois l’imagerie biphotonique par biosenseurs dans le striatum dépourvu de DA de souris adulte. Il met en évidence des déficits multiples et distincts de la signalisation dans les deux populations de neurones de projection du striatum et suggère des mécanismes possibles de ces altérations<br>Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer’s disease. There is currently no cure for PD. Symptomatic drug therapy essentially relies on dopamine (DA) replacement therapy. The spectacular antiparkinsonian effect of levodopa in PD is however hampered by long-term complications, motor fluctuations and dyskinesia in all patients at some time during the disease course. The mechanisms of the maladaptive striatal plasticity leading to dyskinesia are not well understood. The aim of this project was to identify the dysregulations of signaling pathways in striatal projection neurons (SPN) in the absence of dopamine. We used a mouse model of lesion of DA neurons with 6-OHDA and virally transduced biosensors to monitor signaling pathways in live neurons with two-photon imaging of corticostriatal slices. We focused our attention on extracellular signal-regulated kinase (ERK), cAMP-dependent protein kinase (PKA) and Ca2+ which are known to be altered in the absence of DA. We first set up a reliable experimental model in adult mice, successfully combining 6-OHDA and viral vector in the same unilateral stereotactic injection into the dorsal striatum. In some experiments we targeted the biosensor expression to specific neuronal populations using Cre-dependent “flexed” biosensors. We used mice expressing Cre under the control of the D1 DA receptor (D1R) promoter to target specifically striatal projection neurons of the direct pathway (dSPNs) or the adenosine A2A receptor (A2AR) to target SPNs of the indirect pathway (iSPNs). We used fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors EKAR-EV and AKAR-3 to monitor ERK and PKA activities, respectively. We also monitored cytosolic free Ca2+ with the genetically encoded calcium indicator GCaMP6S. We used pharmacological tools to modulate glutamate, DA, and adenosine receptors as well as phosphodiesterases (PDE) and kinases activities. We observed that the DA lesion increased ERK responsiveness to stimulation of D1R. Since ERK activation depends on both cAMP and Ca2+ signals, we then investigated these two pathways. We observed an increased activation of PKA in response to D1R but not A2AR. We explored the mechanism of this increased sensitivity using mice deficient for Gαolf, the G protein that couples striatal receptors to adenylyl cyclase. We provided evidence that increased levels of Gαolf contributed to enhanced D1 responses after 6-OHDA lesions and identified a deficit in PDE activity in D1 neurons that was likely to amplify this effect. By monitoring Ca2+ signals we showed an increased spontaneous activity of D1 neurons in lesioned mice. However, unexpectedly the Ca2+ responses to stimulation of AMPA glutamate receptors were increased in iSPNs and not dSPNs. In conclusion, our work using for the first time 2-photon biosensor imaging in the DA-depleted striatum of adult mice confirms and extends previous observations on signaling dysregulations in the absence of DA. It reveals distinct cell type-specific alterations of cAMP, Ca2+ and ERK responses in the two populations of SPNs and suggests possible mechanisms for these alterations
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Murat, Pierre. "Utilisation de gabarits peptidiques pour le contrôle de l'auto-assemblage de dérivés de la Guanine : Des tétrades de guanines aux quadruplexes d'acides nucléiques." Phd thesis, Université de Grenoble, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00540497.
Full textAbstract:
Il est connu depuis presque 50 ans que, dans certaines conditions, les dérivés de guanosine peuvent former des tétrades. Ces tétrades résultent de l'arrangement coplanaire de quatre guanines reliées par des liaisons hydrogène de type Hoogsteen. Ces motifs particuliers représentent un modèle pertinent pour l'étude des phénomènes d'auto-assemblage et de synthèses non covalentes via la formation de liaisons hydrogène. Dans la première partie de ce manuscrit nous décrirons comment l'utilisation d'un gabarit peptidique peut contraindre la formation d'une telle organisation. L'introduction de contraintes conformationnelles permet de contrôler la formation de tétrades de guanines synthétiques dans l'eau sans la présence de cation normalement nécessaire pour stabiliser de tels édifices. Deux architectures ont été développées et caractérisées et les études effectuées permettent de comprendre les phénomènes intervenant dans la structuration de ces tétrades synthétiques. Il est également connu que les acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires particulières, connues sous le nom de quadruplexes d'acides nucléiques, formées par l'empilement de tétrades de guanines. Ces motifs particuliers interviennent dans de nombreux phénomènes biologiques (maintenance des régions télomériques, activation des oncogènes, ...) et représentent des cibles intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses. Néanmoins l'étude des phénomènes de reconnaissance de ces motifs par de petites molécules organiques est perturbée par des phénomènes de polymorphisme inhérent aux motifs quadruplexes. Nous proposons dans un deuxième chapitre, le développement de mime de quadruplexe basé sur l'utilisation d'un gabarit peptidique pour le contrôle de la présentation de courtes séquences nucléotidiques et le développement d'architectures présentant une topologie contrôlée. Un intérêt tout particulier a été apporté à l'étude de l'interaction de petites molécules organiques avec de tels motifs par SPR. Les expériences réalisées confirment que l'approche employée peut être utilisée pour comprendre les interactions mises en jeu et sélectionner des ligands de quadruplexes performants.
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Pedrazzani, Mélanie. "Microscopie de fluorescence rapide et optique adaptative pour l'étude fonctionnelle tridimensionnelle in vivo des réseaux neuronaux impliqués dans la mémoire chez Drosophila melanogaster." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLS226/document.
Full textAbstract:
L’utilisation de techniques de microscopie optique de plus en plus performantes a permis des avancées considérables en neurobiologie. Néanmoins, la population de neurones mise en jeu lors de la formation de la mémoire, ainsi que sa dynamique restent à ce jour très peu connues. L’objectif de la thèse est de développer puis d’utiliser deux types de microscopies originales couplées à des sondes fluorescentes de dernière génération (sondes calciques G-CaMP6f et sonde voltage ArcLight) pour l’étude in vivo des réseaux neuronaux impliqués dans la mémorisation chez la drosophile. Le choix du modèle Drosophila melanogaster pour cette étude neurobiologique est justifié par plusieurs atouts uniques : un cerveau peu volumineux, des capacités d’apprentissage remarquables, la possibilité d’analyser un réseau neuronal dans sa globalité avec une résolution cellulaire et la disponibilité d’outils génétiques très perfectionnés pour son étude. Le premier type de microscopie conçu est celui dite à illumination structurée de type HiLo permettant d'obtenir une coupe optique en profondeur. Nous avons alors étudié le rôle de divers récepteurs, tels que les récepteurs dopaminergiques et gabaergiques dans la transmission de l'information punitive jusqu'aux neurones des corps pédonculés. Nous avons également mis en évidence une non-homogénéité spatiale des neurones de type α/β des corps pédonculés en termes d’excitation et d’inhibition en réponse à une stimulation punitive pour une profondeur d’analyse d'environ 10 à 20 µm. Cette profondeur limite étant imposée par les aberrations, nous avons alors implémenté une boucle d’optique adaptative dans notre microscope. Cela a permis de réaliser des analyses morphologiques jusqu’à 50 µm de profondeur. Le second type de microscopie développé est la microscopie multiconfocale de type « spinning disk » dans le but d’imager l’ensemble des corps cellulaires des neurones des corps pédonculés. Le développement de ce projet n'est pas achevé, ce qui n’a pas encore permis de répondre à des questions biologiques d’intérêt<br>Cellular and neural network dynamics involved in memory formation remain poorly known despite the progress brought by advanced optical microscopies to neurobiology. The use of Drosophila melanogaster as a model organism constitute one of the most promising approaches due to its unique features: a small brain size, outstanding learning capabilities, very powerful genetic tools and the possibility to analyze a whole neural network with a cellular resolution. To this aim, we implemented two types of optical fluorescence microscopes coupled to cutting-edge fluorescent biosensors, calcic G-CaMP6f and voltage ArcLight probes. We used HiLo structured illumination, a technique able to provide axial optical sectioning, deep in the brain, to study the role of dopaminergic and gabaergic molecular receptors in the transmission of aversive stimulus to mushroom bodies neurons. We also evidenced a non-uniform response of type α/β mushroom bodies neurons under electrical stimulation at 10 to 20 µm depth of analysis. To penetrate deeper in the brain, we added an adaptive optics feedback loop into our microscope in order to overcome aberrations issues. We were then able to rebuild optical sections down to 50 µm depth. The second type of microscopy we developed is a multiconfocal microscope using spinning disk. The aim was to image all the mushroom bodies neurons, at the level of their cell bodies, with a cellular resolution. Since this project is at its beginning, it did not allow us to answer to advanced biological questions yet
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Triffaux, Eleonore. "Interfacial study of a sensing platform for MDM2, based on the self-assembly of a p53 peptide on a gold electrode." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2015. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/217746.
Full textAbstract:
Ce travail porte sur l’étude électrochimique et par microscopie de fluorescence in situ de l’auto-assemblage, sur électrode d’or, de monocouches d’aptamères peptidiques de la protéine p53 en vue de la détection de la protéine MDM2. L’utilisation de nouvelles sondes de reconnaissance moléculaire telles que les aptamères peptidiques a été considérée en tant qu’alternative à l’utilisation d’anticorps. Les aptamères peptidiques sont des séquences synthétiques de peptide se liant à la protéine cible avec une affinité et une spécificité élevées. La première partie de ce travail porte sur l’étude électrochimique de l’interface modifiée résultant de diverses procédures d’immobilisation. Des mesures en présence du marqueur rédox [Ru(NH3)6]3+ ont démontré l’immobilisation de la sonde peptidique à la surface d’or et ont permis l’évaluation relative de la densité de sondes adsorbées à la surface respectivement à la méthode d’immobilisation considérée. Par ailleurs, des mesures en présence du couple rédox [Fe(CN)6]3-/4- ont mis en évidence une inhibition drastique du transfert d’électron dans le cas de monocouches composées exclusivement du peptide. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la détection de la protéine MDM2. Trois interfaces modifiées ont été envisagées soit deux monocouches mixtes de peptide et de 4-mercaptobutan-1-ol, ce dernier jouant le rôle de diluant, adsorbés en une ou en deux étape(s), et une monocouche uniquement composée de peptide. L’utilisation de la spectroscopie d’impédance électrochimique en présence du couple rédox [Fe(CN)6]3-/4- comme méthode de détection a mis en exergue la pertinence de cette dernière interface pour la détection. En effet, l’inhibition du transfert d’électron préalablement identifiée est fortement amoindrie suite à l’interaction avec la protéine cible. Une gamme de détection s’étendant de ~1 à 60 ng mL-1 et une limite de détection de 0,69 ng mL-1 ont été obtenues. Cette performance est comparable à celle des kits ELISA commerciaux. La fiabilité et la spécificité de la réponse ont été vérifiées par le biais de contrôles négatifs sur trois protéines, en l’occurrence le fibrinogène, le cytochrome c et l’albumine de sérum bovin, et validées par des mesures complémentaires de microbalance à cristal de quartz.La troisième partie de ce travail est consacrée à l’étude, par microscopie de fluorescence in situ, de l’organisation de la monocouche résultant des trois procédures d’auto-assemblage précitées. Ces mesures ont permis la mise en évidence d’une distribution hétérogène de la densité en sondes, et plus particulièrement la présence d’agrégats. Ceux-ci ne peuvent être désorbés de la surface par l’application de potentiels même très négatifs (-1,450 V vs Ag<br>Doctorat en Sciences<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Courbet, Alexis. "Engineering autonomous and programmable biosensors through synthetic biology : integrating multiplexed biomarker detection and biomolecular signal processing into next-generation diagnostics." Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONT3513.
Full textAbstract:
Les promesses de la médecine de précision dépendent de nouvelles solutions technologiques pour le diagnostic. Dans l’aire post-génomique, les approches de biologie synthétique pour la médecine apportent de nouvelles façon de sonder, monitorer et interfacer la physiopathologie humaine. Émergeant en tant que champ scientifique mature dont la transition clinique s’accélère, la biologie synthétique peut être utilisée pour appliquer des principes d’ingénierie afin de concevoir et construire des systèmes biologiques comprenant des spécifications cliniques. Une application particulièrement intéressante est de développer des outils diagnostiques polyvalents, programmables et intelligents étroitement interconnectés avec la thérapie. Cette thèse présente de nouveaux concepts et approches d’ingénierie pour concevoir des dispositifs biosynthétiques capable d’interfacer les maladies humaines dans des échantillons cliniques en exploitant du traitement de signal au niveau biomoléculaire, à la lumière d’un besoin croissant en termes de capacités et de robustesse. Cette thèse s’intéresse en premier lieu à l’ingénierie de circuits synthétiques de gènes, reposant sur les portes logiques à integrases, pour intégrer des opérations modulaires et programmables de biodétéction de biomarqueur associées à des algorithmes de décisions au sein de population de bactéries. Elle s’intéresse ensuite à des méthodologies systématiques dites bottom-up, pour programmer des protocellules synthétiques microscopiques, capables d’exécuter des opérations de biodétéction médicale et de biocomputation. Nous décrivons le développement de méthodes simples de fabrications microfluidique associées à des solutions pour implémenter des opérations Booléenne complexes en utilisant de circuits biochimiques synthétiques. Cette contribution s’élargit aussi à la caractérisation de l’espace de conception de protocellules à l’aide d’approches de design assisté par ordinateur, ainsi que à l’analyse de preuves mathématiques et biologiques pour l’utilisation de protocellules comme des dispositifs universels de calcul. L’articulation des principes biologiques fondamentaux avec les implications médicales concernant les dispositifs biosynthétiques développés dans ce travail, a été jusqu’à la validation clinique, et initie de nouveaux modèles pour le développement de diagnostics de nouvelle génération. Ce travail prévoit que la biologie synthétique est en train de préparer le future de la médecine, en supportant et accélérant le développement de diagnostics avec de nouvelles capacités, apportant un progrès biotechnologique direct depuis le laboratoire de biologie clinique jusqu’au patient<br>The promise for real precision medicine is contingent on novel technological solutions to diagnosis. In the post-genomic era, synthetic biology approaches to medicine provide new ways to probe, monitor and interface human pathophysiology. Emerging as a mature field increasingly transitioning to the clinics, synthetic biology can be used to apply engineering principles to design and build biological systems with clinical specifications. A particularly tantalizing application is to develop versatile, programmable and intelligent diagnostic devices closely interconnected with therapy. This thesis presents novel engineering concepts and approaches to design synthetic biological devices interfacing human diseases in clinical samples through biomolecular digital signal processing, in light of a need for dramatic improvements in capabilities and robustness. It addresses primarily the engineering of synthetic gene circuits through integrase based digital genetic amplifiers and logic gates, to integrate modular and programmable biosensing of biomarkers and diagnostic decision algorithms into bacteria. It then investigates systematic bottom-up methodologies to program microscale synthetic protocells performing medical biosensing and biocomputing operations. We demonstrate streamlined microfluidic fabrication methods and solutions to implement complex Boolean operation using integrated synthetic biochemical circuits. This contribution also extends to the characterization of protocell design space through novel computer assisted design frameworks, as well as the analysis of mathematical and biological evidence for universal protocellular biocomputing devices. The articulation of biological governing principles and medical implications for the synthetic devices developed in this work was further validated in the clinic, and initiates new models towards next-generation diagnostics. This work envisions that synthetic biology is preparing the future of medicine, supporting and speeding up the development of diagnostics with novel capabilities to bring direct improvement in biotechnologies from the clinical lab to the patient
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Trouiller, Anne-Juliette. "Préparation de nanobiosenseurs à base d'aptamères." Thesis, Poitiers, 2016. http://www.theses.fr/2016POIT2297/document.
Full textAbstract:
L'une des stratégies mise en œuvre pour améliorer la prise en charge thérapeutique des patients concerne le développement d'outils diagnostiques sensibles et spécifiques. Les aptamères sont des oligonucléotides artificiels obtenus par SELEX avec une très haute affinité ainsi qu'une excellente spécificité pour leurs cibles. L'immobilisation de ces motifs de reconnaissance moléculaire à la surface de nanomatériaux tels que des nanoparticules d'or (AuNPs), dont les propriétés optiques et électroniques sont uniques, permet d'amplifier le signal généré par l'interaction du ligand avec sa cible. Deux systèmes de biosensing ont été élaboré en fonctionnalisant des AuNPs avec des aptamères, l'un dirigé contre la thrombine et le second dirigé contre une marque épigénétique portée par une protéine histone. La réduction des sels d'or aurique précurseurs a été réalisée en présence de PEG4 et a conduit à l'obtention d'une population homodisperse de AuNPs sphériques d'un diamètre moyen de 14 nm et présentant une isotropie de taille et de forme. Ces AuNPs ont ensuite été fonctionnalisées par des bras espaceurs de longueur variable constitués d'unités tétraéthylène glycol successives reliées entre elles par des ponts éthers ou triazoles. L'acide lipoique a été utilisé comme motif d'ancrage à la surface des AuNPs via une liaison covalente Au-S et a été couplé aux différents bras espaceurs via une réaction de Steglich. Les linkers étaient porteurs d'un groupement terminal azoture afin de réaliser le couplage par chimie-click avec les aptamères. La stratégie de détection de la thrombine utilisait les propriétés de quenching de fluorescence des AuNPs alors que la détection de l'histone était colorimétrique et mettait à profit l'effet de résonance plasmonique de surface des nanoparticules d'or<br>Improving patients therapeutic care needs the development of sensitive and specific diagnostic tools. Aptamers are synthetic oligonucleotides obtained by SELEX with a very high affinity and excellent specificity for their targets. Grafting of these molecular recognition patterns onto nanomaterials such as gold nanoparticles (GNPs), which unique optical and electronic properties, can amplify the signal induce by the interaction between the ligand and its target. Two biosensing systems have been developed by GNP functionalization with aptamers, one is directed against thrombin and the second against an epigenetic mark carried by a histone protein. Gold precursors was reduced in the presence of PEO4 and led to a homodisperse population of spherical GNP with an average diameter of 14 nm and an isotropy of size and shape. GNP were functionalized with tetraethylene glycol units interconnected by ether or triazoles bridges as a linker. Lipoic acid was used as an anchor moiety onto gold surface via a covalent Au-S bond and was coupled to the spacer through a Steglich reaction. The linkers were functionalized with an azide group to perform the coupling with aptamers by click chemistry. The thrombin sensing strategy used the fluorescence quenching properties of GNPs while the histone detection involved the gold nanoparticle plasmon resonance surface effect
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Sizaire, Florian. "Développement d’un criblage automatisé de l’activité kinase d’un biosenseur Aurora A par FLIM." Thesis, Rennes 1, 2019. http://www.theses.fr/2019REN1B033.
Full textAbstract:
La surexpression d’Aurora A est un marquer majeur de certains cancers épithéliaux. Ce gène code pour la kinase multifonctionnelle Aurora A et son activation est requise pour l’entrée et la progression vers la mitose. Jusqu'à présent, aucun inhibiteur de cet oncogène n'a été approuvé par la FDA et il est donc primordial d'identifier de nouvelles molécules. Notre équipe a développé un biosenseur FRET (Forster Resonance Energy Transfer) pour l’activité kinase d’Aurora A, constitué de la kinase entière flanquée de deux fluorophores, une GFP et une mCherry. Le changement de conformation d’Aurora A lorsqu’elle est activée rapproche les fluorophores et augmente l’efficacité du FRET. Il est ainsi possible de suivre l’activation d’Aurora A dans les cellules vivantes exprimant le biosenseur à des niveaux endogènes. Nous pouvons mesurer le FRET en utilisant la technique de FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) grâce à un microscope développé dans l’équipe et appelé fastFLIM. Mes travaux de thèse ont consisté à développer une stratégie de criblage robuste et automatisée en combinant les capacités du fastFLIM et le biosenseur d’activité d’Aurora A. Cette stratégie basée sur une automatisation des acquisitions et de l’analyse de données a permis de cribler une banque de molécules en plaque 96 puits afin de trouver de potentielles inhibiteurs de l’activité kinase d’Aurora A. De plus, j’ai participé à la validation du biosenseur pour un suivi de l’activité kinase dans des cellules vivantes en montrant que les variations de FRET mesurées correspondent bien à l’état de phosphorylation d’Aurora A sur le résidu Thréonine 288, marqueur de son activation. Enfin, j’ai participé à l’élaboration de nouvelles techniques de microscopie pour suivre l’activité du biosenseur. Pour cela, j’ai utilisé un biosenseur de type homoFRET avec l’enjeu de pouvoir utiliser plusieurs biosenseurs dans un contexte multiplex. J’ai aussi utilisé la technique de 2c-FCCS (2-colors Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy) sur le biosenseur Aurora A afin de pouvoir mesurer le FRET dans des régions où celui-ci est faiblement exprimant et dont la mesure de durée de vie de fluorescence n’est pas possible par le FLIM. Ainsi, mes travaux de thèse s’inscrivent dans la tendance à développer une microscopie quantitative et autonome avec comme enjeu d’apporter un grande nombre de données phénotypiques<br>Overexpression of Aurora A is a major marker of some epithelial cancers. This gene encodes the multifunctional Aurora A kinase and its activation is required for entry and progression to mitosis. So far, no inhibitor of this oncogene has been approved by the FDA and it is therefore essential to identify new molecules. Our team developed a Forster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensor for Aurora A kinase activity, consisting of the entire kinase flanked by two fluorophores, a GFP and a mCherry. The conformational change of Aurora A when it is activated brings the fluorophores closer and increases FRET efficiency. It is thus possible to follow the activation of Aurora A in living cells expressing the biosensor at endogenous levels. We can measure FRET using FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) technique using a microscope developed in the team called fastFLIM. My thesis work consisted of developing a robust and automated screening strategy by combining the capabilities of fastFLIM and the Aurora A activity biosensor. This strategy based on automation of acquisitions and data analysis allowed to screen a library of 96-well plate molecules for potential inhibitors of Aurora A kinase activity. In addition, I participated in the validation of the biosensor for kinase activity monitoring in living cells, showing that the FRET variations measured correspond to the phosphorylation state of Aurora A on the Threonine 288 residue, a marker of its activation. Finally, I participated in the development of new microscopy techniques to monitor the activity of the biosensor. For that, I used a homoFRET biosensor with the challenge of being able to use several biosensors in a multiplex context. I also used the 2c-FCCS (2-color Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy) technique on the Aurora A biosensor to measure FRET in regions where it is weakly expressing and whose lifetime measurement of Fluorescence is not possible by FLIM. Thus, my thesis work is part of the trend to develop a quantitative and autonomous microscopy with the challenge of providing a large number of phenotypic data
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Pellerano, Morgan. "Développement d'un biosenseur fluorescent d'un mutant de p53 sujet à l'agrégation dans les cancers." Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT053.
Full textAbstract:
P53 est un suppresseur de tumeur qui joue un rôle clé dans la régulation de la transcription, la réparation de l'ADN, l'instabilité génétique, la sénescence, la régulation du cycle cellulaire et l'apoptose. Cette protéine, normalement nucléaire, se lie à l’ADN et régule la transactivation. Cependant, elle est souvent mutée dans les tumeurs humaines, entraînant une inactivation fonctionnelle et une prédisposition au cancer. Les mutants p53 se peuvent-être de deux catégories des mutants de « contact » ou « conformationnel ». Ces derniers entraînant des changements de conformation pouvant induire une agrégation de la protéine de type amyloïde. Des études récentes ont montré que l’agrégation de p53 pouvait être efficacement reversée, rétablissant ainsi la fonction de p53 chez la souris. Les approches de diagnostic actuelles basées sur le séquençage génétique permettent d'identifier le statut mutationnel de p53, mais ne renseignent pas sur son statut conformationnel. Le but de ma thèse est de développer un biosenseur peptidique fluorescent qui reconnaît et rend compte des mutants conformationnels de p53 exprimés dans des cancers humains. Nous avons caractérisé et optimisé la réponse de ce biosenseur par conjugaison avec différentes sondes sensibles à l'environnement. Nous avons également étudié leur capacité à signaler de manière sélective le mutant R248Q de p53 in vitro à l’aide de formes recombinantes de protéines p53 de type sauvage et mutantes, ainsi que de lysats de lignées cellulaires de cancer du poumon exprimant p53 de type sauvage (A549), le mutant R248Q (PC9) ou p53 - / - (H1299). Après avoir établi les conditions de travail optimales et les limites du biocapteur in vitro, nous avons appliqué ce biosenseur à l’imagerie de cellules vivantes par microscopie à fluorescence, après avoir procédé à l’internalisation cellulaire facilitée par un peptide vecteur (ou CPP : Cell Penetrating Peptide) afin d’établir son potentiel pour de futures applications de diagnostic et thérapeutiques. Nous avons de plus vérifié la réponse du biosenseur à l'expression induite de mutants conformationnels de p53, ainsi qu'à sa régulation négative, à la fois in vitro et dans des cellules vivantes<br>P53 is a tumour suppressor that plays a key role in transcriptional regulation, DNA repair, genetic instability, senescence, cell cycle regulation and apoptosis. This normally nuclear protein tetramerizes to bind DNA and regulate transactivation. However it is often mutated in human tumours, leading to functional inactivation and predisposing to cancer. p53 mutants are distinguished as “contact” or “structural”, the latter resulting in conformational changes which may induce amyloid-like protein aggregation. Recent studies have shown p53 aggregation may be effectively reversed thereby restoring p53 function in mice. Current diagnostic approaches based on genetic sequencing allow to identify the mutational status of p53, but do not inform on its conformational status. The aim of my thesis is to develop a fluorescent peptide biosensor that recognizes and reports on conformational mutants of p53 expressed in human cancers. We have characterized and optimized the response of this biosensor through conjugation to different environmentally-sensitive probes. We have further investigated their ability to report selectively on the R248Q mutant of p53 in vitro using recombinant forms of wildtype and mutant p53 proteins as well as lysates from lung cancer cell lines that express wild-type p53 (A549), the R248Q mutant (PC9), or p53 - / - (H1299). Having established the optimal working conditions and limitations of the biosensor in vitro, we applied this biosensor to image living cells by fluorescence microscopy, following facilitated cellular internalization by a cell-penetrating peptide, so as to establish its potential for therapeutic perspectives. We are further monitoring response of the biosensor to induced expression of conformational mutants of p53, as well as to its downregulation, both in vitro and in living cells
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Fioravanti, Antonella. "Epigenetic mechanisms and post-translational modifications play a key role in the cell cycle regulation of Alphaproteobacteria." Thesis, Lille 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LIL10088/document.
Full textAbstract:
Chez l’organisme modèle Caulobacter crescentus, de nombreux régulateurs sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous présentons la découverte de l’interaction fonctionnelle entre GcrA et la N6-adenosine méthyltransférase CcrM. La combinaison d’expériences de biochimie, de biophysique, d’immuno-précipitation de la chromatine et de génétique nous a permis de révéler que GcrA est une protéine dimérique qui se fixe à l’ADN, et qui montre une affinité préférentielle, à la fois in vitro et in vivo, pour les promoteurs qui ont été méthylés. Nous avons montré que le complexe GcrA/promoteur recrute l’ARN polymérase. Comme ce processus est également observée avec les orthologues de GcrA présents chez d’autres Alphaproteobacteria, nous avons conclu que GcrA est le membre d’une nouvelle classe de régulateurs transcriptionnels. Enfin, nous avons découvert que GcrA interagit également avec une protéine récemment caractérisée et appelée GipX. Une protéine essentielle, qui pourrait jouer un rôle dans la régulation de l’activité de GcrA et dans la biosynthèse de la paroi bactérienne. Enfin, concernant l’étude du phospho-relai responsable de l’activation du principal régulateur CtrA, nous décrivons également la structure protéique de ChpT ainsi que le développement d’un biosenseur capable de détecter les niveaux de phosphorylation in vivo. Ce biosenseur utilise le FRET et est basé sur la capacité des régulateurs de réponses à se dimériser lorsqu’ils sont phosphorylés. Ces résultats ouvrent la possibilité d’utiliser cette méthode pour l’étude de la phosphorylation des régulateurs de réponse dans d’autres modèles bactériens<br>In model organism Caulobacter crescentus many regulators are involved in the control of cell cycle progression. In this thesis we present the discovery of the interaction between the cell cycle regulator GcrA and the N6-adenosine methyltransferase. Using a combination of ChIP-Seq biochemical and biophysical experimentation and genetics we showed that GcrA is a dimeric DNA-binding protein that targets promoters with CcrM methylation sites. We showed that the complex GcrA/promoter recruits the RNA polymerase. Since methylation-dependent DNA-binding is also observed with GcrA orthologs from other Alphaproteobacteria, we conclude that GcrA is a member of a new class of transcriptional regulators that function as molecular effectors of a methylation-dependent epigenetic switch that regulates gene expression. We discovered that GcrA is also able to interact with a newly characterized protein, named GcrA Interacting Protein X (GipX), that has an essential role in Caulobacter and that may play a role in the regulation of GcrA activity and cell wall metabolism. Regarding the phosphorelay that drives to the activation of the master regulator CtrA, the structure of ChpT, the factor together with CckA responsible for CtrA phosphorylation, was solved. A biosensor able to detect the phosphorylation level of CtrA in vivo is also described in this thesis. This sensor based on FRET exploits the ability of response regulators to dimerize upon phosphorylation. These results open the possibility to use this method to study the phosphorylation of response regulators in other bacterial systems
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Betolngar, Dahdjim-Benoît. "Développement d’un nouveau couple de protéines fluorescentes pour le FRET : Validation et application à un biosenseur d’activité kinase A." Thesis, Paris 11, 2015. http://www.theses.fr/2015PA112068/document.
Full textAbstract:
Les protéines kinases A (PKA) sont des enzymes qui catalysent la phosphorylation de résidus sérine ou thréonine. L’activité des PKA peut être mesurée in cellulo grâce aux biosenseurs AKAR (A-Kinase Activity Reporter). AKAR est composé de 4 modules: la séquence substrat des PKA, un domaine de liaison aux acides aminés, et 2 protéines fluorescentes pouvant interagir par FRET (Förster Resonant Energy Transfer). La phosphorylation de la séquence consensus par la PKA et l’interaction de l’acide aminé phosphorylé avec le module senseur provoque une modification de la conformation d’AKAR et une augmentation du FRET entre les 2 protéines fluorescentes.L’objectif initial de ce travail était de produire un biosenseur AKAR basé sur un nouveau couple de protéines fluorescentes plus performantes, et insensibles au pH. Ce biosenseur devant à terme être utilisable en imagerie ratiométrique, et en FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Ainsi nous avons mis au point une nouvelle version d’AKAR: AqAKARCit. Cette version exploite la protéine Aquamarine, l'une des meilleures protéines cyan disponibles aujourd'hui, avec un rendement quantique de 89%, un déclin de fluorescence mono-exponentiel, et une insensibilité au pH dans tout le domaine physiologique. Les résultats obtenus en FLIM avec cet AqAKARCit ont permis des améliorations notables en stabilité et sensibilité.Une version baptisée AqAKARTagRFP a été construite, dans laquelle l’accepteur est une protéine fluorescente orange permettant une meilleure séparation spectrale entre donneur et accepteur et insensible aux variations de pH. Les étapes de caractérisations de AqAKARTagRFP ont été accomplies en FLIM, et en ratiométrie. AqAKARTagRFP permet d'obtenir de bonnes réponses en FRET par ratiométrie, mais reste difficilement utilisable en FLIM en raison d'une dynamique de réponse limitée. La sensibilité du biosenseur a été améliorée par une modification de l'ancrage de l'Aquamarine. Les modifications apportées à cette version nommée AqEAKARTagRFP la place au niveau des biosenseurs AKAR les plus performants actuellement disponibles.Les mesures de sensibilité au pH d’ AqEAKARTagRFP réalisées en FLIM ont révélé une insensibilité au pH du biosenseur sur une étendue de pH jamais atteinte jusqu’à présent. Cependant, en ratiométrie, on note malgré tout une sensibilité détectable aux pHs fortement acides (pH ≤ 6), ce qui ne permettra pas de l'utiliser pour l'imagerie ratiométrique de compartiments cellulaires acides. Un contrôle négatif non phosphorylable AqEAKARmutTagRFP a été étudié. Ce contrôle présente les mêmes variations de signal en réponse à des changements imposés de pH intracellulaire, révélant que ces variations sont indépendantes de l’activité PKA.L'étude de tandems CFP-Cit et Aq-Cit dépourvus de la partie senseur nous à permis d'analyser le comportement de FRET des couples cyan/jaune en fonction du pH. Un modèle décrivant ce comportement a été créé et appliqué à AKAR.Les expériences complémentaires faites sur CFPAKARCit sont en accord avec nos simulations mais la construction AqAKARCit révèle du FRET résiduel à pH acide que notre modèle numérique ne prévoit pas. Une sensibilité aux pH acides de la partie senseur d’AKAR qui provoquerait un changement de conformation du biosenseur et une augmentation de FRET pourrait expliquer ce phénomène.Ce travail de thèse a permis la mise au point d’un nouveau couple de protéines fluorescentes par le FRET insensibles au pH. Ce couple va permettre une meilleure caractérisation des sensibilités des biosenseurs existants comme nous l’avons montré avec AKAR. Ce couple de protéines fluorescentes pourra également être utilisé dans des compartiments cellulaires acides, par exemple pour étudier des interactions protéine/protéine. Enfin, grâce à une meilleure séparation spectrale en excitation et en émission, ce couple peut être utilisé dans des applications plus exigeantes comme la microscopie biphotonique<br>Protein kinase A (PKA) are enzymes which catalyze the phosphorylation of serine or threonine residues. The activity of PKA can be measured in cellulo through AKAR biosensors (A-Kinase Activity Reporter). AKAR consists of 4 modules: the PKA substrate sequence, a phospho-amino binding domain, and two fluorescent proteins that can interact by FRET (Förster Resonant Energy Transfer). After action of the PKA, the interaction between the phophorylated amino acid and the phospho-amino binding domain causes a change in the conformation of AKAR and an increase in FRET between the two fluorescent proteins.The initial objective of this work was to produce an AKAR biosensor based on a new pair of improved fluorescent proteins, and insensitive to pH. This biosensor to eventually be used in ratiometric imaging and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). So we developed a new version of AKAR: AqAKARCit. This version uses the Aquamarine protein, one of the best cyan proteins available today, with a quantum yield of 89%, a near mono-exponential fluorescence decay, and insensitive to pH throughout the physiological range. The results obtained with this AqAKARCit allowed significant improvements in stability and sensitivity.A version called AqAKARTagRFP was built, in which the acceptor is an orange fluorescent protein allowing better spectral separation between donor and acceptor and insensitive to pH variations. The characterization of AqAKARTagRFP was performed in FLIM, and ratiometry. AqAKARTagRFP provides good answers in FRET by ratiometry but remains difficult to use in FLIM due to limited dynamic responses. The sensitivity of the biosensor has been improved by modification of the anchoring of Aquamarine. Changes to this version named AqEAKARTagRFP place it at the most efficient AKAR biosensors currently available.The pH-responsive measures of AqEAKARTagRFP made in FLIM showed insensitivity to pH on a range never reached so far. However, in ratiometry, there is still a detectable sensitivity to highly acidic pHs (pH ≤ 6), which will not allow to use it for ratiometric imaging of cellular acidic compartments. A negative unphosphorylatable control AqEAKARmutTagRFP was studied. This control presents the same signal variations in response to changes imposed on intracellular pH, revealing that these variations are independent of PKA activity.The study of the CFP-Cit and Aq-Cit tandems devoid of the sensor part allowed us to analyze the behavior of cyan / yellow FRET pairs regarding the pH. A model describing this behavior was created and applied to AKAR. Additional experiments on CFPAKARCit are in agreement with our simulations but AqAKARCit reveals residual FRET at acidic pHs that our numerical model does not predict. A sensitivity to acidic pH of the sensor module of AKAR which would cause a conformational change in the biosensor and an increase in FRET could explain this phenomenon.This thesis has allowed the development of a new pair of fluorescent proteins for FRET imaging insensitive to pH. This couple will allow better characterization of existing biosensors sensibilities as we have shown with AKAR. This pair of fluorescent proteins may also be used in acidic cellular compartments, for example to study protein / protein interactions. Finally, through improved spectral separation in excitation and in emission, this pair can be used in more demanding applications such as biphoton microscopy
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Déméautis, Claire. "Développement de nouvelles méthodes pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseur FRET par microscopie de fluorescence quantitative." Thesis, Rennes 1, 2016. http://www.theses.fr/2016REN1B035/document.
Full textAbstract:
La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation<br>Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations
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Castro, Arias Juan Manuel. "Towards a Plasmonic and Electrochemical Biosensor Integrated in a Microfluidic Platform." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS020/document.
Full textAbstract:
Au cours de ma thèse, j'ai développé un procédé de fabrication spécifique capable de produire un biocapteur qui combine deux techniques de biodétection différentes, la réponse plasmonique basée sur la résonance de plasmon de surface localisée (LSPR) et la réponse électrochimique. Les méthodes et les résultats qui sont présentés dans ce manuscrit ont été définis pour converger vers un dispositif fluidique unique combinant ces deux approches de détection différentes. Afin de trouver la configuration permettant l'excitation des résonances plasmoniques, la géométrie des nanocavités MIM (métal/isolant/métal) en réseau de lignes interdigitées a été optimisée par des simulations électromagnétiques. La fabrication par nanoimpression douce assistée UV (SoftUV-NIL) a été optimisée et, finalement, la caractérisation optique de ces nanocavités a été comparée avec succès aux simulations théoriques. Parallèlement à la réalisation de ce dispositif nanostructuré, des dispositifs électrochimiques fluidiques plus simples qui intègrent des microélectrodes classiques ont également été développés. L'objectif était d'abord de développer une chimie innovante pour le couple « biotine/streptavidine » et de comprendre ensuite comment les paramètres fluidiques peuvent affecter l'efficacité de capture des biomolécules. Ce manuscrit se termine par une discussion sur le rôle des paramètres fluidiques concernant l’efficacité de la biodétection sur la base de la théorie de Squires<br>During my thesis, I worked on the development of a specific fabrication process able to produce a device that combines two different biodetection techniques, plasmonic response based on Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) and electrochemical response. Methods and results that are presented in this manuscript were defined to converge towards a unique fluidic device combining these two different sensing approaches. This device integrates interdigitated array of MIM nanocavities. In order to find the easier working configuration allowing the excitation of plasmonic resonances, their geometry has been optimized through electromagnetic simulations. The fabrication of these dual devices has been optimized based on Soft-UV NIL and, finally, optical characterization of these nanocavities has been successfully compared with theoretical simulations. In parallel to this challenging goal, simpler fluidic electrochemical devices that integrate conventional microelectrodes have also been developed. The goal was first to develop an innovative chemistry for the couple biotin/streptavidin and secondly to learn how fluidic parameters can affect the capture efficiency of molecules. This manuscript ends with a discussion on the role of the fluidic parameters on the biodetection efficiency based on the theory of Squires
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Mackiewicz, Nicolas. "Assemblages hybrides à base de nanotubes de carbone : applications à la catalyse, l'optique et la biologie." Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112281.
Full textAbstract:
Au cours de ce travail de thèse, nous avons exploré diverses propriétés des nanotubes de carbone via leurs assemblages avec des molécules d’intérêt et nous les avons mises en valeur dans des applications très variées. Dans un premier temps nous avons utilisé les nanotubes comme support pour l’élaboration d’électrodes dans les piles à combustible et plus particulièrement pour l’oxydation de l’éthanol. Nous avons développé une méthode originale et efficace visant à déposer de manière homogène des nanoparticules métalliques à la surface des nanotubes et des performances extraordinaires ont été obtenues. Nous avons également fonctionnalisé les nanotubes dans le but construire un biosenseur capable de détecter une molécule biologique. Pour cela nous avons adopté comme stratégie de greffer sur les nanotubes des molécules portant des ligands du nickel permettant ainsi l’accroche spécifique de protéine recombinantes étiquetées avec un tag histidine. Les nanotubes possèdent de propriétés électroniques que nous avons mis à profit pour construire un hybride donneur-accepteur avec un intercalant de l’ADN. Au cours de cette étude nous avons mis en œuvre différentes stratégies visant à cliver l’ADN et à mettre en évidence un transfert électronique photoinduit entre les deux entités. Aussi, nous avons fonctionnalisé les nanotubes dans le but d’améliorer leurs performances pour développer de nouveaux systèmes de protection efficace de la vision. Une des approches employées repose sur la fonctionnalisation des nanotubes avec des fullerènes. Enfin, nous avons associé les nanotubes avec des séquences d’oligonucléotides capables de cibler la surface de cellules cancéreuses<br>During this thesis work, we have explored various properties of carbon nanotubes via their assembly with molecules of interest and we used them in a wide variety of applications. At first we used nanotubes as a support for the development of electrodes in fuel cells and more particularly for the oxidation of ethanol. We have developed a new and effective method for depositing homogeneous metal nanoparticles on the surface of nanotubes and outstanding performance were obtained. We also functionalized nanotubes in order to build a biosensor capable of detecting biological molecules. To reach this goal we have adopted a strategy aiming at grafting on nanotubes molecules bearing nickel chelating agent allowing a specific hanging of recombinant protein labelled with a histidine tag. The nanotubes have electronic properties that we have used to build a donnor-acceptor hybrid with a DNA intercalant. In this study we have implemented various strategies to cleave DNA and to highlight a photoinduced electronic transfer between the two entities. Also, we functionalised nanotubes in order to improve their performance and to develop new systems for effective protection of the vision against laser beam. One of the approaches used is based on the functionalization of nanotubes with fullerenes. Finally, we associate nanotubes with oligonucleotide sequences capable of targeting the surface of cancer cells
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Goffinet, Marine. "Conception et obtention d'un anticorps spécifique des formes activées des Rho GTPases." Toulouse 3, 2007. http://thesesups.ups-tlse.fr/64/.
Full textAbstract:
Les protéines Rho A, B et C dont l'activité est régulée par l'échange GDP/GTP seraient impliquées dans la tumorigenèse. Même si la surexpression dans les tumeurs des protéines Rho est largement démontrée et qu'il est établi que seule la forme activée est capable d'entraîner la transmission des signaux, seules quelques études ont corrélé l'activation des protéines Rho à la gravité des cancers. Nous avons identifié par " phage display " un scFv (C1) capable de distinguer spécifiquement la conformation activée (liée au GTP) des protéines Rho A, B et C. L'anticorps soluble C1 exprimé en fusion avec la partie N-terminale de la protéine pIII du phage (C1-N1N2) s'associe spécifiquement aux protéines Rho activées endogènes des cellules HeLa (immunofluorescence). Cette propriété originale permettra, en association avec les anticorps non conformationnels anti-RhoA et anti-RhoB d'analyser l'activation des Rho dans le développement tumoral<br>The Rho GTPases A, B and C proteins, members of the Rho family whose activity is regulated by GDP/GTP cycling, function in many cellular pathways controlling proliferation and have recently been implicated in tumorigenesis. Although overexpression of Rho GTPases has been correlated with tumorigenesis, only their GTP-bound forms are able to activate the signalling pathways implicated in tumorigenesis. Thus, the focus of much recent research has been to identify biological tools capable of quantifying the level of cellular GTP-bound Rho, or determining the subcellular location of activation. However useful, these tools used to study the mechanism of Rho activation still have limitations. The aim of the present work was to employ phage display to identify a conformationally-specific single chain fragment variable (scFv) that recognizes the active form of Rho GTPases and is able to discriminate the activated (GTP bound) form of Rho in endogenous settings. After five rounds of phage selection using a constitutively activated mutant of RhoB (RhoBQ63L), three scFvs (A8, C1 and D11) were selected for subsequent analysis. Further biochemical characterization was pursued for the single clone, C1, exhibiting an scFv structure. C1 was selective for the GTP-bound form of RhoA, RhoB, as well as RhoC, and failed to recognize GTP-loaded Rac1 or Cdc42, two other members of the Rho family. Soluble C1 expressed in fusion with the N-terminal of phage protein pIII (scFv C1-N1N2) specifically associated with GTP-loaded recombinant RhoA and RhoB via immunoprecipitation, and endogenous activated Rho in HeLa cells as determined by immunofluorescence. We identified an antibody, C1-N1N2, specific for the GTP-bound form of RhoB from a phage library, and confirmed its specificity towards GTP-bound RhoA and RhoC, as well as RhoB. The success of C1-N1N2 in discriminating activated Rho in immunofluorescence studies implies that this new tool, in collaboration with currently used RhoA and B antibodies, has the potential to analyze Rho activation in cell function and tumor development
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Van, Ngoc. "Development of fluorescent biosensors for probing CDK/Cyclin activity in vitro and in cellulo." Thesis, Montpellier 2, 2013. http://www.theses.fr/2013MON20171.
Full textAbstract:
Les Kinases cycline-dépendantes (CDK / cyclines) jouent un rôle majeur dans la régulation de la progression du cycle cellulaire et la prolifération des cellules cancéreuses, et constituent ainsi des cibles d'intérêt pour le développement de stratégies de diagnostic et thérapeutiques anticancéreuse. L'objectif de cette étude a consisté à développer une famille de biosenseurs fluorescents pour mesurer l'activité des CDK/ cycline in vitro, in cellulo et in vivo.Nous avons conçu et développé un biosenseur polypeptidique sensible à l'environnement comprenant une séquence substrat des CDKs, qui est marquée avec une sonde fluorescente sensible à l'environnement à proximité du site de phosphorylation, et un domaine de liaison phospho-amino acide, qui se lie à la séquence du substrat lorsqu'il est phosphorylé, ce qui modifie l'environnement de la sonde fluorescente et conduit par conséquent à l'augmentation de la fluorescence. Plusieurs variants de ce premier biosenseur CDKACT ont été développés. Les biosenseurs ont d'abord été caractérisés in vitro en utilisant plusieurs complexes CDK / cycline recombinants et avec des CDK / cyclines endogènes à partir d'extraits cellulaires, induisant des changements dynamiques de l'intensité de fluorescence, qui ont été mesurés en temps réel. Nous avons caractérisé la spécificité de ces biosenseurs pour les kinases CDK/ cycline par rapport à d'autres kinases (Plk1, Plk3, CIV, PKA, MAPK). En outre ces biosenseurs permettent de mesurer des différences dans l'activité des CDK/Cyclines entre différentes lignées cellulaires saines et cancéreuses. Enfin, nous avons mis en place les conditions pour internaliser ces biosenseurs dans des cellules vivantes grâce à des formulations de peptides pénétrants, afin de mesurer l'activité des CDK / cycline en temps réel. L'imagerie time-lapse et la quantification ratiométrique de fluorescence de la sonde sensible à l'environnement par rapport à une sonde fluorescente standard a permis de suivre l'activité des CDK/ cycline au cours du cycle cellulaire de cellules en division, des cellules ne se divisant pas et des cellules traitées avec des inhibiteurs des CDK / cycline. Les biosenseurs ont également été utilisé pour établir des conditions nécessaires à réaliser un criblage haut débit et des essais d'imagerie in vivo dans des modèles de souris comportant des xénogreffes<br>Cyclin-dependent kinases (CDK/Cyclins) play central roles in regulation of cell cycle progression and proliferation of cancer cells, thereby constituting attractive targets for development of cancer diagnostics and therapeutics. The objective of this study consisted in developing a family of fluorescent biosensors to probe CDK/Cyclin activity in vitro, in cellulo and in vivo. To this aim, we designed and engineered an environmentally sensitive polypeptide sensor consisting of a CDK substrate sequence labelled with an environmentally-sensitive dye proximal to the phosphorylation site, and a phospho-amino acid binding domain, which binds the substrate sequence when it is phosphorylated, thereby altering the environment of the fluorescent probe and consequently leading to fluorescence enhancement. Several variants of this first CDKACT biosensor were further engineered. The biosensors were first characterized in vitro using several recombinant CDK/Cyclin complexes and endogenous CDK/Cyclins from cell extracts, inducing dynamic changes in fluorescence intensity, which were measured in real-time. We further characterized the specificity of these biosensors for CDK/Cyclin kinases as opposed to other kinases (Plk1, Plk3, CIV, PKA, MAPK). We further applied CDK biosensors to measure CDK/Cyclin kinase activity between different healthy and cancer cell lines. Finally, we established conditions to deliver the biosensors into living cells thanks to cell-penetrating peptide formulations, to monitor CDK/Cyclin activity in real time. Time-lapse imaging and ratiometric quantification of fluorescence of the environmentally sensitive probe over that of a fluorescent standard allowed to monitor CDK/Cyclin activity throughout the cell cycle of dividing cells, non-dividing cells and cells treated with CDK/Cyclin inhibitors. The biosensors were further applied to establish conditions for a high throughput screen and an in vivo imaging assay using xenografted mouse models
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Vinay, Manon. "Phagosensor : Un outil rapide et discriminant de détection de bactéries pathogènes dans les eaux." Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM4007.
Full textAbstract:
La qualité de l'eau est une préoccupation majeure pour la santé publique et la préservation de l'environnement. Nous proposons d’utiliser les phages comme des biosenseurs pour détecter les pathogènes humains ou animaux présents dans les eaux de surface, un outil nommé Phagosensor.La mise au point d’un phagosensor prototype a permis d’optimiser la détection des bactéries par cytométrie en flux. Les résultats montrent que cet outil est extrêmement rapide, sensible, et très spécifique. L’outil phagosensor permet de détecter des bactéries cibles présentes dans un environnement complexe tel que l’eau de mer.Le prototype fonctionnel a servi de base à la construction de phagosensors spécifiques de bactéries pathogènes. Les résultats montrent que la stratégie développée à partir du prototype peut être rapidement transposée à la détection de pathogènes tel que Salmonella. Le séquençage de novo et l’annotation des génomes de trois phages isolés de l’environnement permettront la construction de nouveaux phagosensors spécifiques de souches d’E. coli pathogènes.Cette stratégie a été adaptée à la détection d’un signal luminescent post-infection en utilisant les phages recombinants portant l’opéron luxCDABE. Les bactéries infectées sont rapidement détectables.L’ensemble de ces résultats démontre que la stratégie développée est applicable à la construction de phagosensor sur demande pour une détection rapide, sensible et spécifique des bactéries d’intérêt que ce soit en fluorescence ou en luminescence. La détection dans l’eau de mer suggère, qu’à terme, des outils pourront être conçus pour la détection de bactéries pathogènes dans d’autres matrices telles que le sang ou les aliments<br>Water quality is a major concern for public health and natural environment preservation. We propose to use phages to develop biosensor tools able to detect human and animal pathogens present in water. The construction of a phagosensor prototype using an optimized genetic engineering strategy, infection and detection conditions, allowed the specific detection of bacteria. The results show that detection is fast, specific and highly sensitive. Moreover, the phagosensor tool detects target bacteria in a complex environment such as seawater. Phagosensors specific of pathogenic bacteria were constructed following the strategy developed for the prototype. Results show that the strategy we designed can be successfully transposed to detect pathogens such as Salmonella. De novo sequencing and genomes annotation of three phages isolated from the environment were carried out to develop phagosensors that are specific of pathogenic E. coli. This technology was then adapted to detect a luminescent signal arising post-infection using genetically modified phages carrying the entire luxCDABE operon. The bacteria infected with the lux recombinant phages were rapidly detected by luminescence emission. Together, these results demonstrate that our technology can be applied to construct various phagosensors adapted to the detection of different bacterial species of interest and using at least two output signals. These tools allow a rapid, specific and highly sensitive detection that are close to the European guideline. Efficient bacterial detection in seawater suggests that phagosensors could be developed to detect pathogenic bacteria in other matrices such as blood or food
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Avet, Charlotte. "Étude des mécanismes contrôlant l'efficacité et la spécificité de la signalisation du récepteur de la GnRH : identification et rôle de la protéine partenaire SET." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA11T091.
Full textAbstract:
La fonction de reproduction est sous le contrôle de la neurohormone hypothalamique GnRH qui régule la synthèse et la libération des gonadotropines hypophysaires. La GnRH agit par l’intermédiaire d’un récepteur couplé aux protéines G exprimé à la surface des cellules gonadotropes, le récepteur de la GnRH (RGnRH). Ce récepteur, chez les mammifères, a la particularité d’être dépourvu de queue C terminale ce qui le rend insensible aux systèmes classiques de désensibilisation. Ainsi, les mécanismes qui régulent l’efficacité et la spécificité de sa signalisation demeurent mal connus. Nous avons recherché des partenaires d’interaction du RGnRH, jusqu’alors inconnus, avec l’idée que ces protéines en interagissant avec les domaines intracellulaires du récepteur influenceraient son couplage aux voies de signalisation. Nos travaux ont permis d’identifier le premier partenaire d’interaction du RGnRH : la protéine SET. Par des expériences de « GST pull down », nous avons montré que SET interagit directement avec le RGnRH via le premier domaine intracellulaire du récepteur. Cette interaction implique des séquences riches en acides aminés basiques sur le récepteur et les domaines N- et C-terminaux de SET. Nous avons également montré, par co-immunoprécipitation, que le RGnRH dans sa conformation native interagit avec la protéine SET dans les cellules gonadotropes alphaT3-1 et, par immunocytochimie, que les deux protéines colocalisent à la membrane plasmique. En développant au laboratoire des outils biosenseurs permettant de mesurer avec une grande sensibilité et en temps réel les variations intracellulaires de calcium et d’AMPc, nous avons mis en évidence que le RGnRH se couple non seulement à la voie calcique mais aussi à la voie AMPc dans la lignée alphaT3-1, apportant pour l’AMPc la première démonstration d’un tel couplage. En utilisant différentes stratégies expérimentales visant à diminuer ou au contraire favoriser l’interaction du récepteur avec SET (ARN antisens, peptide correspondant à la première boucle intracellulaire du récepteur, surexpression de SET), nous avons montré que SET induit une réorientation de la signalisation du RGnRH de la voie calcique vers la voie AMPc. Nos résultats concernant l’activité du promoteur du gène du Rgnrh nous conduisent à postuler que SET pourrait favoriser l’induction par la GnRH de gènes régulés via la voie AMPc et notamment celui codant le RGnRH. Nos travaux mettent également en évidence que la GnRH régule non seulement l’expression de la protéine SET dans les cellules gonadotropes mais aussi son degré de phosphorylation favorisant ainsi sa relocalisation dans le cytoplasme des cellules alphaT3-1. Ceci suggère que la GnRH exerce une boucle de régulation permettant d’amplifier l’action de SET sur la signalisation de son propre récepteur. Enfin, nous avons mis en évidence que l’expression de SET est fortement augmentée dans l’hypophyse au moment du prœstrus chez le rat, apportant ainsi la première démonstration d’une variation de SET dans un contexte physiologique. Étant donné que le couplage du RGnRH à la voie de signalisation AMPc est augmenté au moment du prœstrus, nos résultats suggèrent que SET pourrait jouer un rôle important in vivo en favorisant ce couplage à ce stade particulier du cycle œstrien<br>Reproductive function is under the control of the hypothalamic neurohormone GnRH, which regulates the synthesis and the release of pituitary gonadotropins. GnRH acts on a G-protein coupled receptor expressed at the surface of pituitary gonadotrope cells, the GnRH receptor (GnRHR). This receptor, in mammals, is unique because it is devoided of the C terminal tail, which makes it insensitive to classical desensitization processes. Therefore, the mechanisms that regulate the efficacy and the specificity of its signaling are still poorly known. We searched for interacting partners of GnRHR with the idea that these proteins by interacting with the intracellular domains of the receptor could influence receptor coupling to its signaling pathways. Our work identified the first interacting partner of GnRHR: the protein SET. By GST pull down assays, we showed that SET interacts directly with GnRHR through the first intracellular loop of the receptor. This interaction involves sequences enriched in basic amino acids in the receptor and both N- and C terminal domains of SET. We also showed, by co-immunoprecipitation, that GnRHR in its native conformation interacts with the endogenous SET protein in gonadotrope alphaT3-1 cells and, by immunocytochemistry that the two proteins colocalize at the plasma membrane. By developing in the laboratory biosensors tools that allow to measure with high sensitivity and in real-time intracellular variations in calcium and cAMP concentrations, we demonstrated that GnRHR couples not only to the calcium pathway but also to the cAMP pathway in alphaT3-1 cell line, providing for cAMP the first demonstration of such coupling. Using several experimental strategies to reduce or increase receptor interaction with SET (small interfering RNA, peptide corresponding to the first intracellular loop of the receptor, overexpression of SET), we have shown that SET induces a switch of GnRHR signaling from calcium to cAMP pathway. Our results concerning the activity of the Gnrhr gene promoter led us to postulate that SET could favor the induction by GnRH of genes regulated through the cAMP pathway, notably those encoding the GnRHR. Our study also showed that GnRH regulates not only SET protein expression in gonadotropes, but also its phosphorylation level leading to its relocation in the cytoplasm of alphaT3-1 cells. This suggests that GnRH induces a regulatory loop to amplify SET action on signaling of its own receptor. Finally, we demonstrated that SET expression is markedly increased in the pituitary gland at prœstrus in female rats, providing the first demonstration of a variation of SET expression in a physiological context. Given that GnRHR coupling to the cAMP pathway is increased at prœstrus, our results suggest that SET may play an important role in vivo by promoting such coupling at this particular stage of the estrus cycle
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Chen, Hai-Lin. "Application, at single-cell level, of FRET for the study of the dynamics of 2-oxoglutarate : a signal for heterocyst development in Anabaena sp. PCC 7120." Thesis, Aix-Marseille, 2016. http://www.theses.fr/2016AIXM4038.
Full textAbstract:
Les métabolismes du carbone et de l’azote sont étroitement coordonnés chez tous les organismes vivants en raison de l’importance de ces deux éléments dans les différents mécanismes physiologiques. Le 2-oxoglutarate (2-OG) est une molécule signal conservée chez tous les organismes et est impliqué dans la balance carbone / azote. Malgré son importance, il n’existe pas d’outil permettant de mesurer la concentration de 2-OG à l’échelle cellulaire. Pour combler cette carence, nous avons utilisé Anabaena sp. PCC 7120 pour construire un système de quantification du 2-OG in vitro et in vivo. Cette bactérie appartient au groupe des cyanobactéries qui contribuent aussi bien au cycle du carbone via la photosynthèse qu’au cycle de l’azote via leur métabolisme.Au cours de ma thèse, j’ai construit différents types de biosenseurs au 2-OG en utilisant les techniques de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Ces biosenseurs sont capables de mesurer le 2-OG in vitro et permettent de le détecter in vivo en utilisant l’analyse à l’échelle de la cellule unique et la microscopie en temps réel. Nous avons découvert l’existence de variations dynamiques du 2-OG au niveau des filaments et le profil formé semble correspondre au futur profil de développent cellulaire. En raison de la conservation du rôle régulateur du 2-OG dans de nombreuses activités cellulaires, le biosenseur développé durant ma thèse pourrait être appliqué à une grande variété d’organismes dont les bactéries, les plantes, les animaux et les humains<br>Carbon and nitrogen metabolisms are tightly coordinated in all living organisms because of the importance of the two elements in the physiology. 2-oxoglutarate (2-OG) is a signal conserved in all living organisms involved in the balancing between carbon and nitrogen metabolisms; however, despite its importance, it is currently impossible to measure 2-OG in each cells under different conditions when 2-OG is subject to variations Cyanobacteria contribute to global carbon cycle by oxygenic photosynthesis as well as to global nitrogen cycle through their nitrogen metabolism and in this study, we used the cyanobacterium Anabaena PCC 7120 as a model, to construct a system for the quantification of 2-OG in vitro and in vivo.. During my thesis, I took the advantages of the FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) techniques and constructed several 2-OG biosensors that can adequately detect 2-OG levels in vitro in a quantitative manner. I tested their performance for the detection of 2-OG in vivo by using single-cell analysis and time-lapse microscopy. We found that 2-OG display dynamic changes at single-cell basis, and these variations are strongly correlated to cell differentiation activities. The 2-OG biosensors developed during my thesis can be applied in a wide range of organisms, including other bacteria, plants, animals, and human, because of the conserved roles of 2-OG in regulating a variety of cellular activities
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Banach-Latapy, Agata. "Monitoring dynamic changes of glutathione redox state in subcellular compartments of human cells : a novel approach based on rxYFP biosensors." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112346.
Full textAbstract:
La biologie des réactions redox est particulièrement difficile à étudier de par la compartimentation spatiale mais aussi cinétique des différents systèmes redox cellulaires. Les biosenseurs codés génétiquement, incluant la «redox-sensitive Yellow Fluorescent Protein» (rxYFP) sont une manière de contourner les limitations des méthodes conventionnelles de mesure du couple glutathion/glutathion disulfure (GSH/GSSG). Cette étude présente l’utilisation des biosenseurs rxYFP pour analyser les états redox dans des différents compartiments cellulaires, et leur dynamique en réponse au stress dans les cellules humaines. La rxYFP exprimée soit dans le cytosol, le noyau ou la matrice mitochondriale de cellules HeLa s’est révélée sensible aux changements de l’état redox intracellulaire provoqué par des traitements aussi bien réducteurs qu’oxydants. La rxYFP est capable de détecter des différences de l’état redox, entre les compartiments, mais aussi entre différentes lignées cellulaires. Les senseurs exprimés dans des kératinocytes humain de l’épiderme HEK001 ont réagi au stress induit par les UVA, de façon dose-dépendante, mais pas au stress induit par les UVB. De plus, ces senseurs ont pu détecter les changements redox induits par des faibles doses (30 µM) ainsi que par des doses modérées (100 µM) de peroxyde d’hydrogène (H2O2), de façon dynamique et spécifique des compartiments cellulaires. La rxYFP exprimé dans la matrice mitochondriale a montré une vitesse d’oxydation plus élevée que les senseurs rxYFP exprimés dans le cytosol ou le noyau, ce qui est attribuable à un pH local plus basique. De plus, la déplétion en GSH provoquée par un traitement au buthionine sulphoximine (BSO) a affecté spécifiquement le potentiel redox mitochondrial mais pas cytosolique ni nucléaire. Ces observations soutiennent l’idée que l’état redox du GSH mitochondrial est maintenu et régulé de façon indépendante par rapport à celui du cytosol ou du noyau. Nous avons également montré que dans les cellules humaines, les sondes rxYFP réagissent de façon prédominante avec le GSH/GSSG, puisque la déplétion en GSH ralentit la vitesse d’oxydation de la rxYFP en réponse à un traitement par H2O2. De plus, grâce à l’utilisation des sondes rxYFP et à l’analyse de l’état redox des antioxydants cellulaires, nous démontrons que l’oxydation des thiols se produit après l’activation des caspases au cours de l’apoptose induite par TRAIL. L’ensemble de nos données montrent la robustesse des senseurs rxYFP pour la mesure des changements d’état redox dans les cellules humaines. En complément d’autres senseurs redox ainsi que des méthodes conventionnelles de mesure des états redox, les senseurs rxYFP ciblés aux différents compartiments cellulaires sont un nouvel outil pour étudier l’homéostasie redox dans les cellules de mammifères, et permettent l’étude de l’état redox du glutathion et de la dynamique des changements redox avec une grande précision<br>The kinetic and spatial separation of redox systems renders redox biology studies a particularly challenging field. Genetically encoded biosensors including the glutathione-specific redox-sensitive yellow fluorescent protein (rxYFP) may provide an alternative way to overcome the limitations of conventional glutathione/glutathione disulfide (GSH/GSSG) redox measurements. This study describes the use of rxYFP sensors for investigating compartment-specific steady redox states and their dynamics in response to stress in human cells. RxYFP expressed either in the cytosol, nucleus or mitochondrial matrix of HeLa cells was responsive to the intracellular redox state changes induced by reducing as well as oxidizing agents. Compartment-targeted rxYFP sensors were able to detect different steady state redox conditions between the cytosol, nucleus and mitochondrial matrix as well as between the cell lines. These sensors expressed in human epidermal keratinocytes HEK001 responded to stress induced by UVA radiation in a dose-dependent manner but not to UVB radiation. Furthermore, rxYFP sensors were able to sense dynamic and compartment-specific redox changes caused by low dose (30 µM) and moderate dose (100 M) hydrogen peroxide (H2O2). Mitochondrial matrix-targeted rxYFP displayed a greater dynamics of oxidation in response to a H2O2 challenge than the cytosol- and nucleus-targeted sensors, largely due to a more alkaline local pH environment. Similarly, the depletion of glutathione induced by buthionine sulphoximine (BSO) affected selectively mitochondrial redox potential without inducing changes in cytosol and nucleus. Furthermore, using rxYFP probes and cellular antioxidants redox state analysis, we show that oxidation of thiols occurs after activation of caspases during TRAIL-induced apoptosis. These observations support the view that mitochondrial glutathione redox state is maintained and regulated independently from that of the cytosol and nucleus. We also showed that in human cells the rxYFP probes react predominantly with glutathione since the glutathione depletion slows down the dynamics of rxYFP oxidation in response to H2O2. Taken together, our data show the robustness of the rxYFP sensors to measure compartmental redox changes in human cells. Complementary to existing redox sensors and conventional redox measurements, compartment-targeted rxYFP sensors provide a novel tool for examining mammalian cell redox homeostasis, permitting high resolution readout of steady glutathione state and dynamics of redox changes
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Marshall, Gregory M. "Étude électro-optique de l'interface n-alcanethiols GaAs(001) les phénomènes de surface et les applications en bio-détection à base de photoluminescence." Thèse, Université de Sherbrooke, 2011. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/1956.
Full textAbstract:
Semiconductor surfaces coupled to molecular structures derived from organic chemistry form the basis of an emerging class of field-effect devices. In addition to molecular electronics research, these interfaces are developed for a variety of sensor applications in the electronic and optical domains. Of practical interest are self-assembled monolayers (SAMs) comprised of n-alkanethiols [HS(CH[subscript 2])[subscript n]R], which couple to the GaAs(001) surface through S-GaAs covalent bond formation. These SAMs offer potential functionality in terms of the requisite sensor chemistry and the passivation effect such coupling is known to afford. In this thesis, the SAM-GaAs interface is investigated in the context of a photonic biosensor based on photoluminescence (PL) variation. The scope of the work is categorized into three parts: i) the structural and compositional analysis of the surface using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), ii) the investigation of electronic properties at the interface under equilibrium conditions using infrared (IR) spectroscopy, the Kelvin probe method, and XPS, and iii) the analysis of the electro-optic response under steady-state photonic excitation, specifically, the surface photovoltage (SPV) and PL intensity. Using a partial overlayer model of angle-resolved XPS spectra in which the component assignments are shown to be quantitatively valid, the coverage fraction of methyl-terminated SAMs is shown to exceed 90%. Notable among the findings are a low-oxide, Ga-rich surface with elemental As present in sub-monolayer quantities consistent with theoretical surface morphologies. Modal analysis of transmission IR spectra show that the SAM molecular order is sufficient to support a Beer-Lambert determination of the IR optical constants, which yields the observation of a SAM-specific absorbance enhancement. By correlation of the IR absorbance with the SAM dipole layer potential, the enhancement mechanism is attributed to the vibrational moments added by the electronic polarizability in the static field of the SAM. Lastly, the surface Fermi level position is determined by XPS and is used to interpret SPV results in terms of a thiol-induced reduction of the surface cross-section for minority carrier-capture. Numerical analysis confirms this result based on the carrier transport theory of PL intensity by means of a reduction of the surface recombination velocity.
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Demes, Elsa. "Etude in vivo des variations de [NO₃⁻] et de pH dans le compartiment cytosolique de cellules de garde et caractérisation fonctionnelle de deux transporteurs vacuolaires de type CLC chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS019/document.
Full textAbstract:
De nombreux processus physiologiques tels que les mouvements stomatiques, l’absorption des nutriments, l’élongation cellulaire et la signalisation cellulaire impliquent des flux d’anions entre les membranes plasmique et vacuolaire des cellules végétales. Ces flux ioniques sont régulés par des canaux et transporteurs membranaires. Les canaux ioniques transportent passivement les ions au travers des membranes selon le gradient électrochimique. Les transporteurs actifs permettent le transport contre le gradient électrochimique de l’ion transporté induisant son accumulation dans un compartiment cellulaire. Dans les cellules végétales, le gradient de H+ entre différents compartiments constitue la principale source d’énergie couplée par les symports et les antiports au transport de NO₃⁻ et Cl⁻. Au cours de ma thèse, j’ai analysé ces flux ioniques avec deux approches. Une première approche a consisté en l’étude fonctionnelle par électrophysiologie de deux protéines membranaires, AtCLCc et AtCLCg impliquées dans le transport d’anions. Dans une deuxième approche, un biosenseur, clopHensor a été exprimé chez A. thaliana et a permis de mesurer simultanément la [NO₃⁻] et le pH cytosoliques in vivo. Les cellules de garde ont été choisies comme modèle cellulaire pour l’étude de la dynamique in vivo de la [NO₃⁻]cyt et du pH. Nous avons mis en évidence que la [NO₃⁻]cyt est influencée par les conditions extracellulaires dans ces cellules. Enfin l’expression de clopHensor en plantes KO pour un antiport NO₃⁻/H⁺ vacuolaire, AtCLCa, et d’un canal anionique de la membrane plasmique, SLAC1, nous a permis d’étudier la contribution de deux membranes dans la régulation de [NO₃⁻] et du pH cytosolique. Les travaux menés ont permis de visualiser l’activité de canaux et de transporteurs d’anions et H⁺ in vivo et de quantifier leur impact sur l’homéostasie du cytosol<br>Many physiological processes like stomata aperture, nutrient up-take, cellular elongation and cell signalling involve anion fluxes at the two main membranes, the plasma and vacuolar membranes of plant cells. Specialized membrane proteins form active and passive anion transport systems mediating and regulating anion fluxes. Ion channels are passive transport systems mediating ion fluxes across membranes along the electrochemical gradient. Whereas active transporters work against the electrochemical gradient of the transported ion allowing its accumulation into a cellular compartment. In plant cells, the H⁺ gradient is the main energy source of antiporters and symporters that couple the transport of anions like NO₃⁻ and Cl⁻ to the transport of H⁺. In the presents work, we aimed at analysing anion and H⁺ fluxes at two levels. First, we used an electrophysiological approach to study the functional properties of two anion transport systems acting at the vacuolar membrane, AtCLCc and AtCLCg. We also expressed a biosensor, clopHensor in A. thaliana to dynamically measure in vivo the [NO₃⁻] and pH of the cytosol. We chose stomata guard cells as a cellular model to study these fluxes. Our results illustrate the in vivo dynamics of cytosolic [NO₃⁻] and pH variations in the cytosol of guard cells. Our data show that in guard cells the cytosolic [NO₃⁻] is highly influenced by the extracellular [NO₃⁻]. At last, clopHensor’s expression in plants KO for the vacuolar NO₃⁻/H⁺ antiporter AtCLCa and for the plasma membrane anion channel SLAC1 allowed us to dissect the role of the two membranes in controlling the variation of cytosolic [NO₃⁻] and pH. This work enabled to visualize the activity of an anion channel (SLAC1) and of a NO₃⁻/H⁺ antiporter (AtCLCa) in vivo and to quantify the impact of anion and proton fluxes on cytosolic homeostasis of guard cells
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Misticone, Stanislas. "Mécanismes post-traductionnels contrôlant la conformation, la localisation et la signalisation du suppresseur de tumeurs PTEN." Sorbonne Paris Cité, 2015. http://www.theses.fr/2015USPCC151.
Full textAbstract:
PTEN restreint la voie PI3K/Akt via son activité à l'encontre du PIP3 et régule de nombreuses fonctions cellulaires. L'altération de mécanismes contrôlant l'expression et les fonctions de PTEN est observée dans les cancers. L'étude de la manière dont ces mécanismes sont déréglés est essentielle pour comprendre la dérégulation de PTEN dans les cancers. Nous avons développé un biosenseur de PTEN basé sur le BRET intramoléculaire pour suivre ses changements de conformation. Des changements de BRET indiquant un réarrangement conformationnel ont été observés suite à des mutations perturbant les interactions intramoléculaires de PTEN mais aussi suivant l'activation de PTEN par différents signaux. Ainsi, le biosenseur représente un nouvel outil pour mesurer des changements fonctionnels dynamiques dans les cellules vivantes. Le gène PTEN est la cible de nombreuses mutations faux sens dans les cancers. Nous avons examiné les changements associés à une mutation de la lysine 254 située au sein d'un site de SUMOylation de PTEN. Le mutant K254E abroge la SUMOylation et provoque un changement de conformation de PTEN. Cela résulte en une augmentation de la poly-ubiquitination de PTEN réduisant sa stabilité mais aussi en une accumulation nucléaire accrue via l'augmentation de sa mono-ubiquitination. PTEN K254E présente un défaut de recrutement membranaire résultant en une perte de sa capacité à inhiber la voie PI3K/Akt et la prolifération, malgré une activité préservée in vitro. Nos résultats montrent comment une mutation n'affectant pas l'activité catalytique peut altérer les fonctions de PTEN en impactant sa conformation, ses modifications post-traductionnelles et sa localisation<br>PTEN restrains the PI3K/Akt pathway through its activity against PIP3 and regulates numerous cellular functions. Alterations of mechanisms that control PTEN expression and function are observed in cancers. Molecular definition of how these mechanisms go awry is essential to understand PTEN downregulation in cancers. We developped an intromolecular BRET biosensor to follow dynamic PTEN conformationnal change. Changes in BRET indicating conformational rearrangement were observed following mutations that disrupt intramolecular PTEN interaction and also following signal-dependent PTEN activation. The biosensor thus represents a new tool to probe dynamic PTEN functional change in live cells. The PTEN gene is targeted by numerous missense mutations in cancers. We investigated the changes associated with a mutation of the lysine 254 localized inside of a PTEN SUMOylation site. The K254E mutant abrogates SUMOylation and provokes a conformational switch in PTEN. This results in increased PTEN polyubiquitination, which reduces PTEN stability, but also augments its nuclear accumulation through enhanced monoubiquitination. PTEN K254E displays defective plasma membrane-targeting resulting in loss of capacity to inhibit the PI3K/Akt pathway and cellular proliferation, despite displaying intact catalytic activity in vitro. Our results show how a non-catalytic mutant can alter PTEN function by impacting PTEN conformation, post-translational modification and subcellular localisation
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Hayek, Mahmoud. "Le Quorum Sensing chez la bactérie marine Shewanella woodyi : Rôle dans l'émission de luminescence et dans la formation du biofilm." Thesis, Toulon, 2018. http://www.theses.fr/2018TOUL0008/document.
Full textAbstract:
Le « quorum sensing » (QS) est un moyen de communication bactérienne impliquant des petites molécules appelées auto-inducteurs qui au-delà d’un certain seuil de concentration induisent une synchronisation de l’expression génétique au sein de la communauté bactérienne. Ce mécanisme est impliqué dans plusieurs processus bactériens tels que la luminescence, la formation du biofilm, ce qui en fait une cible privilégiée pour l’inhibition du biofilm bactérien nuisible aux activités humaines. Plusieurs systèmes QS ont été identifiés ; les plus étudiés sont le système AHL (acyl homoserine lactone) et le système AI2 (auto inducteur 2). L’objectif principal de cette thèse est de caractériser le(s) système(s) QS de Shewanella woodyi, une bactérie marine luminescente capable de coloniser rapidement une surface et de former un biofilm. L’utilisation de biosenseurs de référence et des expériences de LC-MS ont montré que S. woodyi synthétise la C8-HSL et l’AI2. La mutation des gènes impliqués dans la synthèse ou la détection des HSL abolit la luminescence mais n’affecte pas la formation du biofilm. De plus, le système AI2 ne semble pas impliqué dans la luminescence et la formation de biofilm de S. woodyi. L’absence d’un récepteur d’AI2 suggère que cette molécule n’a pas un rôle régulateur et qu’elle ne serait qu’un produit secondaire du métabolisme cellulaire. Ce travail a donc permis de caractériser les 2 principaux systèmes QS de S. woodyi et pourrait permettre d’en faire un nouveau biosenseur marin<br>Quorum sensing (QS) is a bacterial communication system involving small molecules called autoinducers which above a threshold concentration, induce the synchronization of genes expression within the bacterial community. This mechanism is involved in several bacterial processes such as luminescence and biofilm formation, making it a preferred target for the inhibition of bacterial biofilm harmful to human activities. Several QS systems have been identified; the most studied ones are the AHL system (acylhomoserine lactone) and the AI2 system (autoinducer 2). The main objective of this thesis is to characterize the QS system (s) of Shewanella woodyi, a luminescent marine bacterium able to rapidly colonize a surface and form a biofilm. The use of reference biosensors and LC-MS experiments have shown that S. woodyi synthesizes C8-HSL and AI2. The mutation of the genes involved in the synthesis or detection of HSL abolishes luminescence but does not affect the biofilm formation. Moreover, the AI2 system does not appear to be involved in the luminescence and biofilm formation of S. woodyi. The absence of an AI2 receptor suggests that this molecule does not have a regulatory role and that it is only a secondary product of cellular metabolism. This work has allowed the characterization of the 2 main QS systems of S. woodyi, which could make this strain a new marine biosensor
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Gheghiani, Lilia. "Mécanisme de contrôle de l'entrée en mitose par Polo-like kinase 1 (PlK1)." Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066385/document.
Full textAbstract:
L'exigence principale du cycle cellulaire est une coordination étroite entre l'achèvement du processus de réplication et l'entrée des cellules en mitose, afin de maintenir l'intégrité génétique, l'identité et à la survie cellulaire. Toutes les cellules somatiques exécutent de manière reproductible une phase G2 intermédiaire, d'une durée constante pendant les divisions cellulaires successives au sein d'un type cellulaire donné. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent précisément sa durée au cours d'un cycle cellulaire non perturbé, restent mal caractérisés. La kinase Cycline B1-Cdk1, facteur universel permettant l'entrée en mitose, est sous le contrôle, chez les mammifères, d'un ensemble de régulateurs directs, les kinases inhibitrices Wee1 et Myt1 et les phosphatases activatrices Cdc25A, B et C. Son activation soudaine, en fin de phase G2, révèle qu'une modification rapide de l'équilibre entre ses régulateurs opposés prend place par des mécanismes moléculaires qui restent à élucider. Dans ce cadre, j'ai étudié le rôle potentiel de la kinase Polo-like kinase 1 (Plk1) pour l'initiation de l'activation de Cycline B1-Cdk1. Bien que les rôles de Plk1 au cours de la mitose soient bien caractérisés, sa contribution dans la régulation de l'entrée des cellules en mitose reste controversée. Au niveau moléculaire, Plk1 phosphoryle au moins in vitro, plusieurs régulateurs de Cycline B1-Cdk1, tels que Cdc25B & C, et Wee1 et Myt1. Cependant, il reste largement inconnu si ces événements de phosphorylation se produisent in vivo et s'ils contribuent de manière significative au processus de l'activation de Cycline B1-Cdk1 permettant l'entrée en mitose<br>A main requirement of the cell cycle is a tight coordination between the completion of the replication process and entry into mitosis in order to maintain genetic integrity and the identity and survival of cell progeny. All somatic cells reproducibly execute an intermediate G2 phase of constant duration during successive cell divisions in a given cell type. However the molecular mechanisms controlling precisely its duration during unperturbed cell cycle remains poorly characterized. In this context, the main objective of my PhD project was to decipher signaling pathways controlling entry into mitosis during normal cell cycles as well as their spatiotemporal regulation. CyclinB1-Cdk1, the universal master mitotic driver, is under the control of direct inhibitors (Wee1 and Myt1) and activators (Cdc25A, B and C). Previously, it was determined that CyclinB1-Cdk1 is suddenly activated in very late G2 phase, suggesting that a rapid modification in the equilibrium between its opposite regulators is reproducibly taking place in late G2 by poorly elucidated mechanisms. During my PhD, I investigated the potential role of Polo-like kinase 1 (Plk1) in the initial activation of CyclinB1-Cdk1. Even though its roles during mitosis are well characterized, its contribution for the regulation of entry into mitosis remains controversial. At the molecular level, Plk1 was shown to phosphorylate at least in vitro, several regulators of CyclinB1-Cdk1 including Cdc25B&C, and Wee1 and Myt1. However, it remains largely unknown if these phosphorylation events are taking place in vivo and whether they significantly contribute to the activation process of CyclinB1-Cdk1 leading to mitotic entry
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Libis, Vincent. "New inputs for synthetic biological systems." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC127/document.
Full textAbstract:
Les chercheurs en biologie de synthèse programment l’ADN pour construire des systèmes biologiques capables de répondre à certaines conditions de manière prédéfinie. Cette capacité pourrait avoir un impact sur plusieurs domaines, de la médecine à la fermentation industrielle. Le traitement de signal par des circuits biologiques synthétiques est en train d’être démontré à large échelle, mais hélas la variété des signaux d’entrée capables de contrôler ces circuits est pour l’instant limitée. Ce manque de diversité est un obstacle majeur au développement de nouvelles applications car en général chaque application requiert une réponse à des signaux de nature particulière qui lui sont spécifiques. Cette thèse cherche à apporter des solutions au manque de signaux d’entrée appropriés contrôlant les circuits biologiques en développant deux nouvelles stratégies d’induction. La première stratégie vise à étendre la diversité chimique des signaux d’entrée. A l’inverse des approches existantes, qui reposent sur la modification des systèmes de détections naturels tels que les riboswitchs ou les facteurs de transcription allostériques, j’ai cherché ici à modifier directement des molécules préalablement non-détectables afin de les rendre détectables par les systèmes de détection actuels. Pour ce faire, la transformation chimique des molécules cibles est réalisée in situ grâce à l’expression de voies métaboliques synthétiques dans la cellule. Afin de pouvoir utiliser cette stratégie de manière systématique, j’ai employé la conception assistée par ordinateur et puisé dans l’ensemble des réactions biochimiques connues afin de prédire des voies de détections pour de nouvelles molécules. J’ai ensuite implémenté in vivo plusieurs prédictions qui ont permis à E. coli de détecter de nouveaux composés. Au-delà de l’intérêt de cette méthode en biotechnologie, cela montre que le métabolisme peut jouer un rôle dans le transfert d’information, en plus de son rôle dans le transfert de matière et d’énergie, ce qui soulève la question de l’utilisation potentielle de cette stratégie de détection par la nature. Un second axe présente une façon d’épargner l’utilisation d’inducteurs chimiques pour les programmes biologiques simples, et propose d’utiliser des inducteurs biologiques à la place. Lorsqu’une seule étape d’induction ou de répression de gènes est nécessaire, comme c’est le cas en fermentation industrielle, je propose de remplacer la coûteuse étape d’induction chimique par l’infection simultanée de toutes les cellules d’une population par des particules virales capables d’injecter en temps réel l’ensemble des informations nécessaires pour déclencher l’activité biologique recherchée. A des fins de fermentation, j’ai développé des particules virales modifiées qui reprogramment dynamiquement le métabolisme d’une large population de bactérie au moment opportun et les forcent à produire des molécules à haute valeur ajoutée<br>Synthetic biologists program DNA with the aim of building biological systems that react under certain conditions in a predefined way. This ability could have impact in several fields, from medicine to industrial fermentation. While the scalability of synthetic biological circuits in terms of signal processing in now almost demonstrated, the variety of input signals for these circuits is limited. Because each application typically requires a circuit to react to case-specific molecules, the lack of input diversity is a major obstacle to the development of new applications. Two axis are developed over the course of this thesis to try to address input-related problems. The main axis consists in a new strategy aiming at systematically and immediately increasing the chemical diversity of inputs for synthetic circuits. Current approaches to expand the number of potential inputs focus on re-engineering sensing systems such as riboswitches or allosteric transcription factors to make them react to previously non-detectable molecules. On the contrary, here we developed a method to transform the non-detectable molecules themselves into molecules for which sensing systems already exist. These chemical transformations are realized in situ by expressing synthetic metabolic pathways in the cell. In order to systematize this strategy, we leveraged computer-aided design to predict ways of detecting new molecules by digging into all known biochemical reactions. We then implemented several predictions in vivo that successfully enabled E. coli to detect new chemicals. Aside from the interest of the method for biotechnological applications, this shows that in addition to transferring matter and energy, metabolism can also play a role in transferring information, raising the question of potential occurrences of this sensing strategy in nature. A second axis introduce a way to exempt simple programs from the need for a chemical input, and explore the use of a biological input instead. In situations where a single timely induction or repression of multiple genes is required, such as in industrial fermentation processes, we propose to replace expensive chemical induction by simultaneous infection of all the members of a growing population of cells with viral particles inputting in real-time all the necessary information for the task at hand. In the context of fermentation, we developed engineered viral particles that can dynamically reprogram the metabolism of a large population of bacteria at the optimal stage of growth and force them to produce value-added chemicals
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Longo, Johan. "Design of biomechanocatalytic surfaces : modulations of enzymatic activity through macromolecular conformational changes." Thesis, Strasbourg, 2014. http://www.theses.fr/2014STRAE022/document.
Full textAbstract:
Depuis plusieurs années, une nouvelle génération de matériaux appelés “matériaux intelligents” et définis par leur capacité d’adaptation à leur environnement, est intensément développée. Des systèmes sensibles à différents stimuli tels que le pH, la lumière, ou encore une force mécanique, impliquée dans un grand nombre de processus naturels, comme l’adhésion et la prolifération cellulaire, ont été rapportés. Ce travail de thèse a ainsi été dédié au développement de matériaux mécano-sensibles. Plus précisément de matériaux transformant une contrainte mécanique en un signal chimique, en mimant le processus physique utilisé par la nature, à savoir des changements conformationnels de protéines. Nous avons donc cherché à atteindre ce but en greffant covalemment des protéines ou des enzymes sur un substrat élastomère. Etirer le substrat devant induire des modifications de structure des protéines, conduisant ainsi à des modulations de leurs propriétés<br>Since many years, a new generation of materials called « smart materials » and defined by their capacity to adapt to their environment is intensively developed. Systems sensitive to different stimuli such as pH, light or ionic strength have been reported. One of these stimuli can also be a mechanical force which is involved in many reactions in nature such as, cells adhesion and proliferation, tissues growing or even plants developments. The aim of my thesis was dedicated to the elaboration of mechano-responsive materials. More precisely, materials that transform a stretching constraint into a chemical signal by mimicking the physical processes used by nature, namely protein conformational changes. We planned to achieve this goal by covalently grafting proteins or enzymes onto a stretchable substrate or incorporating them into cross-linked polymer networks. Stretching these materials should induce protein conformational changes leading to modifications of their properties
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Hayek, Mahmoud. "Le Quorum Sensing chez la bactérie marine Shewanella woodyi : Rôle dans l'émission de luminescence et dans la formation du biofilm." Electronic Thesis or Diss., Toulon, 2018. http://www.theses.fr/2018TOUL0008.
Full textAbstract:
Le « quorum sensing » (QS) est un moyen de communication bactérienne impliquant des petites molécules appelées auto-inducteurs qui au-delà d’un certain seuil de concentration induisent une synchronisation de l’expression génétique au sein de la communauté bactérienne. Ce mécanisme est impliqué dans plusieurs processus bactériens tels que la luminescence, la formation du biofilm, ce qui en fait une cible privilégiée pour l’inhibition du biofilm bactérien nuisible aux activités humaines. Plusieurs systèmes QS ont été identifiés ; les plus étudiés sont le système AHL (acyl homoserine lactone) et le système AI2 (auto inducteur 2). L’objectif principal de cette thèse est de caractériser le(s) système(s) QS de Shewanella woodyi, une bactérie marine luminescente capable de coloniser rapidement une surface et de former un biofilm. L’utilisation de biosenseurs de référence et des expériences de LC-MS ont montré que S. woodyi synthétise la C8-HSL et l’AI2. La mutation des gènes impliqués dans la synthèse ou la détection des HSL abolit la luminescence mais n’affecte pas la formation du biofilm. De plus, le système AI2 ne semble pas impliqué dans la luminescence et la formation de biofilm de S. woodyi. L’absence d’un récepteur d’AI2 suggère que cette molécule n’a pas un rôle régulateur et qu’elle ne serait qu’un produit secondaire du métabolisme cellulaire. Ce travail a donc permis de caractériser les 2 principaux systèmes QS de S. woodyi et pourrait permettre d’en faire un nouveau biosenseur marin<br>Quorum sensing (QS) is a bacterial communication system involving small molecules called autoinducers which above a threshold concentration, induce the synchronization of genes expression within the bacterial community. This mechanism is involved in several bacterial processes such as luminescence and biofilm formation, making it a preferred target for the inhibition of bacterial biofilm harmful to human activities. Several QS systems have been identified; the most studied ones are the AHL system (acylhomoserine lactone) and the AI2 system (autoinducer 2). The main objective of this thesis is to characterize the QS system (s) of Shewanella woodyi, a luminescent marine bacterium able to rapidly colonize a surface and form a biofilm. The use of reference biosensors and LC-MS experiments have shown that S. woodyi synthesizes C8-HSL and AI2. The mutation of the genes involved in the synthesis or detection of HSL abolishes luminescence but does not affect the biofilm formation. Moreover, the AI2 system does not appear to be involved in the luminescence and biofilm formation of S. woodyi. The absence of an AI2 receptor suggests that this molecule does not have a regulatory role and that it is only a secondary product of cellular metabolism. This work has allowed the characterization of the 2 main QS systems of S. woodyi, which could make this strain a new marine biosensor
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Daudu, Dimitri. "Caractérisation des récepteurs aux cytokinines de type CHASE-Histidine Kinase chez le pommier : vers une utilisation de leur application biotechnologique." Thesis, Tours, 2016. http://www.theses.fr/2016TOUR3806.
Full textAbstract:
Les cytokinines sont des hormones régulant de nombreux processus physiologiques. Elles sont en particulier impliquées dans certaines interactions plantes-microorganismes pathogènes. Leur perception est assurée par les récepteurs Histidine Kinases (HK) dont la fonction est prédominante dans la transduction de signaux moléculaires et environnementaux. Ce travail a permis une caractérisation complète des cinq récepteurs aux cytokinines de type CHASE-Histidine Kinase (MdCHK) et d’un osmosenseur (MdHK1) chez le pommier, espèce d’intérêt économique soumise à l’attaque de nombreux pathogènes. La combinaison d’approches moléculaires et bio-informatiques a révélé les particularités fonctionnelles et les rôles spécifiques des MdCHK. Ces connaissances ont permis de sélectionner une souche de levures exprimant le récepteur MdCHK2 en tant que biosenseur de cytokinines. Ce nouvel outil biotechnologique optimisé pour la détection rapide de cytokinines a conduit à la mise en évidence d’une production de ces composés par Erwinia amylovora, bactérie pathogène du pommier. Le criblage de bactéries pathogènes humaines grâce au biosenseur a également révélé leur production par Staphylococcus aureus et Streptococcus agalactiae. Afin d’optimiser ce biosenseur, une approche mécanistique de MdCHK2 a été entreprise et dévoile l’importance de certains domaines dans ses spécificités de perception<br>Cytokinins are hormones regulating numerous physiological processes. They are particularly involved in some plant-pathogen interactions. Their perception is ensured by Histidine Kinase (HK) receptors which play a prevailing role in transducing molecular and environmental signals. This work enabled the full characterization of the five cytokinin CHASE-Histidine Kinase receptors (MdCHK) and the osmosensor (MdHK1) in apple tree, a species of economic interest subjected to many pathogen attacks. Combining molecular and bioinformatics approaches led us to reveal the functional features and specific roles of the MdCHK. This knowledge allowed us to select a yeast expressing the MdCHK2 receptor as a cytokinin biosensor. This new biotechnological tool optimized for fast cytokinin detection led us to expose the production of such molecules in Erwinia amylovora, a pathogenic bacterium of apple. Screening human pathogenic bacteria with the biosensor also unveiled their production in Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae. In order to optimize this biosensor, we initiated a mechanistic approach on MdCHK2 and showed the importance of some domains in its perception specificities
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Toussaint, Maxime. "Exploitation et exploration de la diversité génétique d’une population naturelle de Streptomyces issue d’un micro-habitat sol." Thesis, Université de Lorraine, 2018. http://www.theses.fr/2018LORR0027/document.
Full textAbstract:
Les Streptomyces possédent un large arsenal enzymatique ayant des rôles importants dans le sol. Au cours de cette thèse, nous avons exploré leur diversité génétique, fonctionnelle et écologique à partir de collections provenant de sols forestiers. Ainsi, l’exploration du potentiel cellulolytique et la capacité à détecter des sucres libérés lors de l’attaque du bois par des champignons lignivores a permis de créer un biosenseur dont l’exploitation pourrait constituer un nouvel outil normatif pour la détection de la dégradation du bois. Suite à une approche de génomique comparative réalisée entre des isolats sympatriques, nos résultats ont permis de démontrer que des souches phylogénétiquement très apparentées présentaient de grandes différences en termes de présence/absence de gènes, suggérant une vitesse d’évolution rapide du génome accessoire au sein de la population. Ces gènes, souvent associés à des éléments potentiellement transférables, a souligné un rôle important du transfert horizontal pour la diversification de la population. Par une approche d’écologie réverse, la fonction prédite de certains de ces gènes a également pu être corrélée avec un rôle écologique potentiel. Ainsi, l’un des clusters de gènes variables identifié était impliqué dans la production de métabolites secondaires et pourrait constituer un bien commun pour la population. Nos résultats ont confirmé la grande diversité métabolique des Streptomyces (et leur utilité à des fins appliquées), mais indique également qu’une diversification rapide entre souches proches, aurait un rôle écologique important au niveau des populations naturelles de Streptomyces<br>Streptomyces are known to possess a large enzymatic arsenal which can have important roles in the soil. During this thesis, we explored their genetic, functional and ecological diversity using collections from forest soils. Thus, the exploration of their cellulolytic potential and their ability to detect complex sugars released by wood during lignivorous fungi attacks has led to the creation of a biosensor whose exploitation could constitute a new normative tool for the detection of the degradation of wood. Subsequent to comparative genomic approach carried out between sympatric isolates, our results also demonstrated that phylogenetically highly related strains exhibited large differences in the presence / absence of genes, suggesting a rapid rate of evolution of the population accessory genome. These genes, often associated with potentially transferable elements, underlined important role of horizontal transfer for population diversification. Using a reverse ecology approach, the predicted function of some of these genes could also be correlated with a potential ecological role. Thus, one of the variable gene clusters identified by genome analysis was involved in the production of secondary metabolites and would constitute a common good for the population. All of our results confirm the wide metabolic diversity of Streptomyces (and their utility for applied purposes), but also indicates that this diversification would be rapid between nearby strains and would have an important ecological role in the natural populations of Streptomyces
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Autour, Alexis. "Amélioration et criblages de propriétés d'ARN aptamères fluorogènes en systèmes microfluidiques." Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ057.
Full textAbstract:
Les ARN (Acide RiboNucléique) remplissent de nombreuses fonctions clés dans le vivant. Ils peuvent être support de l'information génétique, régulateurs de celle-ci. Visualiser ces molécules au sein d'une cellule représenterait une étape importante vers une meilleure compréhension de la régulation de l'expression des gènes. Les ARN fluorogènes tels que Spinach et Mango sont des outils extrêmement prometteurs pour atteindre cet objectif. Cependant ces deux ARN fluorogènes présentent une brillance limitée. La Compartimentation in vitro assistée par microfluidique (µCIV) est un outil très prometteur dont notre groupe a démontré l’efficacité pour l’évolution d’ARN. Dans le cadre de cette thèse, la µCIV a été adaptée à la sélection d'aptamères d'ARN fluorogènes pour en améliorer les propriétés (surtout la brillance). De plus, l’utilisation conjointe du séquençage haut débit a permis l’optimisation très rapide et semi-automatisée à la fois d’aptamères mais aussi de biosenseurs fluorogènes. Ainsi, cette thèse a permis de mettre en place et d’exploiter des technologies de criblage robustes pour la découverte de nouveaux aptamères d'ARN et de biosenseurs<br>RNA is a key molecule in gene expression and its regulation. Therefore, being able to monitor RNA through live-cell imaging would represent an important step toward a better understanding of gene expression regulation. RNA-based fluorogenic modules are extremely promising tools to reach this goal. To this end, two light-up RNA aptamers (Spinach and Mango) display attractive properties but they suffer from a limited brightness. Since previous work in the group demonstrated the possibility to evolve RNA using microfluidic-assisted in vitro compartmentalization (µIVC), this technology appeared to be well suited to improve light-up aptamers properties by an evolution strategy. Therefore, the µIVC procedure was adapted to fluorogenic RNA aptamers to improve their properties (especially the brightness). Finally, using µIVC in tandem with high-throughput sequencing (NGS) allowed further developing the technology into a more integrated and semi-automatized approach in which RNAs and biosensors are selected by µIVC screening and the best variants identified by a bioinformatics process upon NGS analysis. To summarize, this thesis allowed establishing robust µIVC screening workflows for the discovery of novel efficient light-up RNA aptamers as well as metabolites biosensors