Dissertations / Theses on the topic 'Biotecnologia microbiana'

Orientadora : Profa. Dra. Adriane B. P. Medeiros<br>Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba,14/11/2014<br>Bibliografia: fls. 102-105<br>Resumo: Este trabalho teve como objetivo a determinação das melhores condições para o desenvolvimento de um processo viável de produção biotecnológica de vanilina a partir de fermentação por microrganismos. Foram testados protocolos para estabelecimento do cultivo de tecidos e células de Vanilla planifolia a serem utilizadas nos cocultivos com as cepas bacterianas. Um dos protocolos testados para o cultivo de tecidos foi apropriado para a germinação das plantas e estabelecimento da cultura vegetal, porém para o estabelecimento da cultura de células ainda não foi possível ajustar um protocolo viável. Para análise da tolerância das bactérias aos compostos, as cepas foram cultivadas em meio contendo diferentes concentrações dos mesmos e a biomassa foi determinada por densidade óptica. Para os estudos da produção de vanilina foi feito um DCCR e as amostras dos experimentos foram analisadas em HPLC e utilizadas para o desenvolvimento de um método colorimétrico para detecção de vanilina. Com relação à tolerância dos compostos testados Amycolatopsis orientalis foi capaz de crescer em concentrações de 1,0 a 5,0 g/L de isoeugenol e não foi capaz de crescer no meio com vanilina a 5,0 g/L. Bacillus subtilis MLPB cresceu apenas na presença de isoeugenol a 2,0 e 5,0 g/L e vanilina 0,5 g/L. Três cepas isoladas, M1, M2 e M3, cresceram com isoeugenol e apresentaram crescimento para a vanilina inclusive na concentração de 5 g/L e para o ácido ferúlico e eugenol. Considerando a capacidade de produção de vanilina para A. orientalis e B. subtilis a taxa de inóculo não foi um fator significativo na determinação das variáveis testadas e o melhor tempo para a adição dos precursores foi estabelecido em 12 horas após o inicio da fermentação. Amycolatopsis orientalis apresentou a melhor produção média utilizando eugenol como precursor com acumulo de 46,02 mg/L de vanilina em meio contendo 0,3 g/l de precursor adicionado após 36 horas do início do cultivo, 7% de inóculo e 15 g/L de glicose, inclusive com melhor taxa de bioconversão 15,34%. Bacillus subtilis MLPB utilizando o isoeugenol como precursor a 10 g/L alcançou uma produção média de 214,56 mg/L ± 6,84 de vanilina com uma taxa de bioconversão de 2,22 %. As cepas M1, M2 e M3 foram capazes de bioconverter todos os precursores estudados neste trabalho, porém os melhores valores foram para o isoeugenol nos três casos. O máximo de produção de vanilina foi de 125,66 mg/L para a cepa M1 e taxa de bioconversão de 1,22 %; 372,90 mg/L e bioconversão de 3,61 % para M2 e 262,61 mg/L e bioconversão de 2,57 % para M3. Os resultados obtidos nas fermentações feitas com 1 a 10 g/L de isoeugenol com a cepa M2 mostraram maior produção (596,88 mg/L) de vanilina com a maior concentração do precursor (10 g/L), melhor eficiência molar foi obtida com a concentração de 1g/L de isoeugenol (15,69%) e a melhor viabilidade econômica foi verificada com a utilização de 5,5 g/L de isoeugenol, a qual apresentou saldo líquido de R$ 0,66 por litro de fermentado.<br>Abstract: This study aimed to identify the best conditions for the development of a viable process of biotechnological production of vanillin from fermentation by microorganisms. Protocols were tested for tissue culture is established and Vanilla planifolia cells to be used in cocultures with bacterial strains. One of the protocols tested for tissue culture was suitable for plant emergence and establishment of plant culture, but to the cell culture establishment has not yet been possible to set a viable protocol. For analysis of bacterial tolerance to the compounds of the strains were cultured in medium containing different concentrations of the same and the biomass was determined by optical density. For the production of vanillin was made a CCRD studies and experiments samples were analyzed on HPLC and used for the development of a colorimetric detection method for vanillin. With regard to tolerance of Amycolatopsis orientalis compounds tested was able to grow at concentrations of 1.0 to 5.0 g / L of isoeugenol and was not able to grow in medium with vanillin 5.0 g / L. Bacillus subtilis MLPB grew only in the presence of isoeugenol and 5.0 to 2.0 g / l vanillin and 0.5 g / L. Three strains, M1, M2 and M3, grew up with isoeugenol and grew to vanillin including the concentration of 5 g / L and ferulic acid and eugenol. Whereas vanillin production capacity for A. orientalis and B. subtilis inoculum rate was not a significant factor in determining the variables tested and the best time for addition of the precursors was set at 12 hours after initiation of fermentation. Amycolatopsis orientalis had the best average production using eugenol as a precursor with accumulation of 46.02 mg / L vanillin in medium containing 0.3 g / l precursor added after 36 hours of initial plating 7% inoculum and 15 g / L glucose, including better bioconversion 15.34%. using Bacillus subtilis MLPB as a precursor isoeugenol to 10 g / L reached an average production of 214.56 mg / L ± 6.84 with a bioconversion of vanillin 2.22%. The strains M1, M2 and M3 were able to bioconvert all precursors studied in this work, but the best values were isoeugenol for the three cases. The maximum vanillin production was 125.66 mg / L to M1 and bioconversion strain of 1.22%; 372.90 mg / L and 3.61% for bioconversion M2 and 262.61 mg / L and 2.57% for bioconversion M3. The results of the fermentations carried out with 1 to 10 g / L M2 with isoeugenol strain showed higher production (596.88 mg / L) of vanillin with the highest concentration of the precursor (10 g / L) molar better efficiency was obtained with the concentration of 1 g / L of isoeugenol (15.69%) and higher profitability was verified with the use of 5.5 g / L of isoeugenol, which had a net balance of R $ 0.66 per liter of fermented.

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Saartje Hermalsteens<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica<br>Made available in DSpace on 2018-08-14T02:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LopezGarzon_CamiloSixto.pdf: 3882684 bytes, checksum: 507e1d93e97fc4494726832b744c6cf8 (MD5) Previous issue date: 2009<br>Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o estabelecimento de um processo de produção de lipídeos microbianos a partir de fontes renováveis, particularmente xilose, carboidrato derivado do processo de hidrólise de bagaço de cana-de-açucar e que em breve deverá estar disponível para fermentação. Inicialmente foi verificada a influência da fonte de nitrogênio e a relação inicial carbono-nitrogênio sobre o processo de acúmulo delipídeos utilizando duas linhagens características. A utilização de sulfato de amônio juntocom extrato de levedura em uma relação C/N de 50 g/g foi adequada para o processo de produção de lipídeos. A seguir, 25 leveduras oleaginosas foram testadas quanto a sua capacidade de assimilação de xilose e produção de lipídeos. A produtividade de produção de lipídeos e elevado rendimento energético da levedura Lipomyces starkeyi DSM 70296 permitiram sua escolha para as etapas posteriores. Estudos de inibição por substrato foram desenvolvidos e diferentes modelos matemáticos foram ajustados aos dados experimentais. O modelo de Mulchandani representou adequadamente a cinética de inibição. Um modelo do cultivo em batelada simples foi desenvolvido baseado nos dados cinéticos obtidos, o qual foi validado para cultivo com limitação de nitrogênio em biorreator de dois litros. A análise de composição dos lipídeos obtidos mostrou semelhança à de fontes vegetais. Finalmente, dois modos de operação em batelada alimentada foram testados, o modo de alimentação simples aumentou significativamente a produtividade do processo quando comparado ao processo em batelada simples convencional. A alimentação usando pH-amônio/auxostat seguida de alimentação de carbono dobrou a concentração celular final obtida nos modos anteriores, mantendo níveis de acúmulo aceitáveis. Assim, um processo de produção de lipídeos a partir de pentoses foi viabilizado, adicionalmente o lipídeo produzido atende as especificações necessárias do valor cetano para a produção de biodiesel.<br>Abstract: Studies attempting the establishment of a microbial lipid production process from renewable resources, mainly xylose, were developed. This pentose, obtained from sugar cane bagasse hydrolysis, is expected to be available in large quantities and is going to be used as a substrate in fermentation processes in the near future. Initially, the effects of nitrogen source and initial carbon to nitrogen ratio over the lipid accumulation process were tested using two typical oleaginous strains. The joint use of ammonium sulphate plus yeast extract at an initial C/N ratio of 50 g/g were determined as adequate conditions for induction of lipid production with these yeasts. Subsequently in this work, 25 oleaginous yeasts were tested in order to evaluate the ability to consume xylose and lipid production. As a result of this stage, Lipomyces starkeyi DSM 70296 was selected regarding its highest productivity and energetic yield over all the set of yeasts evaluated. Thus, this strain was used in the development of the later studies. Substrate inhibition studies were developed and several mathematical models were adjusted to the experimental data. The Mulchandani model fitted well the substrate inhibition kinetics. Based on the kinetics obtained in shake flask fermentation, a batch model that represents the behavior of the principal variables in the time was developed. The model proposed was validated successfully using a set of data from two liters bioreactor cultivation. The composition of the obtained lipids was very similar of those from vegetal sources. Finally, two fed-batch operation modes were tested intending to get higher lipid productivities. In this direction, simple carbon fed-batch operation showed better productivities than those obtained from simple batch. Nitrogen fed using the pHamonium/auxostat mode followed by carbon fed duplicated the final cellular concentration obtained in the other modes tested, maintaining an adequate lipid content. Therefore, a process for lipid production was developed, additionally; the lipids obtained attend the cetane value specifications required for biodiesel production.<br>Universidade Estadual de Campi<br>Desenvolvimento de Processos Químicos<br>Mestre em Engenharia Química

Orientador: Ranulfo Monte Alegre<br>Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos<br>Made available in DSpace on 2018-07-20T12:00:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bittar_MariaAssima_M.pdf: 2629105 bytes, checksum: 1241efa399ee2645ddb9efa0313bfb4d (MD5) Previous issue date: 1995<br>Resumo: Saccharomyces lipolytica CCT 0913 foi utilizada em meio de cultura contendo emulsão de óleo solúvel de corte usada como única fonte de carbono, para produção de proteína microbiana (SCP) e redução de Demanda Química de Oxigênio. Foram utilizados dois meios de cultura, um deles contendo (NH4)2SO4 cuja concentração variou de 2,5 a 15 g/l e o outro NH4Cl, cuja concentração variou de 0,1 a 1,5 g/l. No meio contendo (NH4)2SO4 verificou-se a influência do pH inicial (5,0, 5,5 e 6,5) no crescimento celular em erlenmeyers. O melhor resultado, 1,12 g/l de massa celular seca com 31,92% de proteína foi obtido com 15 g/l de (NH4)2SO4, pH 5,5 e 5% de emulsão de óleo solúvel de corte. No meio contendo NH4Cl, as fermentações foram conduzidas em erlenmeyers e fermentadores de 1 e 6 litros. Em fermentador de 6 litros, a porcentagem de emulsão de óleo solúvel de corte variou de 5 a 40% (v/v) no meio de cultura. Com 20% de emulsão de óleo solúvel de corte e 1,0 g/l de NH4Cl foi possível produzir 3,19 g/l de massa celular seca e reduzir a DQO do meio de cultura de 6188 para 4596 mg/l.<br>Abstract: A medium containing used cutting oil emulsion as carbon source was used by Saccharomyces lipolytica CCT 0913 for microbial protein production (SCP) and Chemical Oxygen Demand (COD) removal. It was utilized two culture medium, one of them containing (NH4)2SO4 its concentration was studied in the range of 2.5 to 15 g/1. In the other, containing NH4Cl, concentration was changed in the range of 0.1 to 1.5 g/1. In the medium containing (NH4)2SO4 it was verified the initial pH influence (5.0, 5.5 e 6.5) in cellular growth in erlenmeyers flasks. The best result (1.12 g/1 of cellular dried mass with 31.92% of protein) was obtained with 15 g/1 of (NH4)2SO4, initial pH 5.5 and 5% of cutting oil emulsion. With medium containing NH4Cl the fermentations were carried out in erlenmeyers and fermentors of 1 and 6 liters. In the 6 liter fermentor the percentage of cutting oil emulsion was changed in the range of 5 to 40% (v/v) in the culture medium. With 20% of cutting oil emulsion and 1.0 g/1 of NH4Cl it was possible to produce 3.19 g/1 of cellular dried mass and to reduce the medium COD from 6188 to 4596 mg/1.<br>Mestrado<br>Mestre em Engenharia de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-23Bitstream added on 2014-06-13T19:43:48Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_crp_dr_arafcf.pdf: 7653632 bytes, checksum: 9661b8f40f394a9e28c5c8784c39c064 (MD5)<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)<br>Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)<br>PROPG<br>O presente trabalho teve como objetivo estudar quatro espécies relacionadas no Projeto BIOTAFAPESP, as quais têm se destacado quanto às atividades farmacológicas: Byrsonima fagifolia Niedenzu, Byrsonima crassa Niedenzu, Indigofera truxillensis Kunth e Indigofera suffruticosa Miller. Foram realizados ensaios de mutação gênica reversa utilizando-se as linhagens TA98, TA100, TA97a e TA102 de Salmonella typhimurium, com ausência e presença do sistema metabólico de ativação. Foram avaliados extratos, frações e algumas substâncias isoladas, a saber: a) B. crassa: amentoflavona, substância isolada do extrato metanólico; b) B. fagifolia: extrato metanólico e clorofórmico, frações acetato e aquosa, ácido gálico, galato de metila, ácido quínico e o ácido 3,4- digaloilquínico; c) I. truxillensis e I.suffruticosa: extrato metanólico e clorofórmico, frações de alcalóides, flavonóides e de glicerolipídeos, além das substâncias índigo, indirubina e o kaempferol- 3,7-diraminosídeo. Foi também avaliada a isatina, molécula precursora dos alcalóides índigo e indirubina. As atividades anti-bacteriana, anti-Leishmania, citotóxica e fitoestrogênica foram avaliadas para substâncias isoladas. Os ensaios de atividade fitoestrogênica foram realizados através do método de e-screen, utilizando-se células tumorais MCF7. Os ensaios de atividade citotóxica (células MCF-7) foram realizados pela técnica de sulforadamina-B. Os ensaios anti- Leishmania (L. amazonensis) também foram relizados com as técnicas de MTT (sal de tetrazólio) e contagem manual em câmara de Neubauer. A atividade anti-bacteriana foi avaliada através das técnicas de difusão em agar e microdiluição, com as bactérias Staphylococcus aureus ATTC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922. Estudos anteriores evidenciaram o potencial...<br>The present work aimed to investigate four related species in the project BIOTA-FAPESP which are notable for their pharmacological activities: Byrsonima fagifolia Niedenzu Byrsonima crassa Niedenzu, Indigofera truxillensis Kunth and Indigofera Indigofera suffruticosa Miller. Tests of reverse gene mutation were performed using TA98, TA100, TA97 and TA102 strains of S. typhimurium in the absence and presence of metabolic activation system. Extracts, fractions and some isolated compounds were evaluated: a) B. fagifolia: methanolic and chloroformic extracts, acetate and aqueous fractions, gallic acid, methyl gallate, quinic acid and 3,4-digaloilquinico derivative. b) I. truxilensis and I.suffruticosa: chloroformic and methanolic extracts, fractions of alkaloids, flavonoids and glicerolipides, and also the indigo, indirubin and kaempferol-3,7-diraminosídeo substances. The isatin, precursor molecule of alkaloids indigo and indirubin was also evaluated. The antimicrobial, antiparasitic, cytotoxic and phytoestrogenic activities were evaluated for natural isolated substances. The phytoestrogenic activity assays were performed using the e-screen method, using MCF7 tumor cells. Trials of cytotoxic activity (MCF-7 cells) were done using sulforadamina-B. The anti-Leishmania tests (L. amazonensis) were also performed with some alkaloids and flavonoids, using MTT techniques (tetrazolium salt) and manual counting in a Neubauer chamber. Antimicrobial activity was evaluated using disc diffusion techniques and microdilution with S. aureus ATTC 25923 and E. coli ATCC 25922 bacterias. The mutagenic activity assays showed positive results only for the methanol extract of I. truxilensis (strain TA98) and for the alkaloids indirubin and indigo isolated from this specie and I. suffruticosa, in addition to isatin. This precursor is also noted... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Eliana Aparecida Varanda<br>Banca: Denise Crispim Tavares<br>Banca: Miriam Sannomiya<br>Banca: Lourdes Campaner dos Santos<br>Banca: Taís Maria Baub<br>Resumo: O presente trabalho teve como objetivo estudar quatro espécies relacionadas no Projeto BIOTAFAPESP, as quais têm se destacado quanto às atividades farmacológicas: Byrsonima fagifolia Niedenzu, Byrsonima crassa Niedenzu, Indigofera truxillensis Kunth e Indigofera suffruticosa Miller. Foram realizados ensaios de mutação gênica reversa utilizando-se as linhagens TA98, TA100, TA97a e TA102 de Salmonella typhimurium, com ausência e presença do sistema metabólico de ativação. Foram avaliados extratos, frações e algumas substâncias isoladas, a saber: a) B. crassa: amentoflavona, substância isolada do extrato metanólico; b) B. fagifolia: extrato metanólico e clorofórmico, frações acetato e aquosa, ácido gálico, galato de metila, ácido quínico e o ácido 3,4- digaloilquínico; c) I. truxillensis e I.suffruticosa: extrato metanólico e clorofórmico, frações de alcalóides, flavonóides e de glicerolipídeos, além das substâncias índigo, indirubina e o kaempferol- 3,7-diraminosídeo. Foi também avaliada a isatina, molécula precursora dos alcalóides índigo e indirubina. As atividades anti-bacteriana, anti-Leishmania, citotóxica e fitoestrogênica foram avaliadas para substâncias isoladas. Os ensaios de atividade fitoestrogênica foram realizados através do método de e-screen, utilizando-se células tumorais MCF7. Os ensaios de atividade citotóxica (células MCF-7) foram realizados pela técnica de sulforadamina-B. Os ensaios anti- Leishmania (L. amazonensis) também foram relizados com as técnicas de MTT (sal de tetrazólio) e contagem manual em câmara de Neubauer. A atividade anti-bacteriana foi avaliada através das técnicas de difusão em agar e microdiluição, com as bactérias Staphylococcus aureus ATTC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922. Estudos anteriores evidenciaram o potencial... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: The present work aimed to investigate four related species in the project BIOTA-FAPESP which are notable for their pharmacological activities: Byrsonima fagifolia Niedenzu Byrsonima crassa Niedenzu, Indigofera truxillensis Kunth and Indigofera Indigofera suffruticosa Miller. Tests of reverse gene mutation were performed using TA98, TA100, TA97 and TA102 strains of S. typhimurium in the absence and presence of metabolic activation system. Extracts, fractions and some isolated compounds were evaluated: a) B. fagifolia: methanolic and chloroformic extracts, acetate and aqueous fractions, gallic acid, methyl gallate, quinic acid and 3,4-digaloilquinico derivative. b) I. truxilensis and I.suffruticosa: chloroformic and methanolic extracts, fractions of alkaloids, flavonoids and glicerolipides, and also the indigo, indirubin and kaempferol-3,7-diraminosídeo substances. The isatin, precursor molecule of alkaloids indigo and indirubin was also evaluated. The antimicrobial, antiparasitic, cytotoxic and phytoestrogenic activities were evaluated for natural isolated substances. The phytoestrogenic activity assays were performed using the e-screen method, using MCF7 tumor cells. Trials of cytotoxic activity (MCF-7 cells) were done using sulforadamina-B. The anti-Leishmania tests (L. amazonensis) were also performed with some alkaloids and flavonoids, using MTT techniques (tetrazolium salt) and manual counting in a Neubauer chamber. Antimicrobial activity was evaluated using disc diffusion techniques and microdilution with S. aureus ATTC 25923 and E. coli ATCC 25922 bacterias. The mutagenic activity assays showed positive results only for the methanol extract of I. truxilensis (strain TA98) and for the alkaloids indirubin and indigo isolated from this specie and I. suffruticosa, in addition to isatin. This precursor is also noted... (Complete abstract click electronic access below)<br>Doutor

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-10-18T12:09:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_frederico_schmitt_kremer.pdf: 1606431 bytes, checksum: 192db9fb559b24dfd0b3038659fdd5b7 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-10-23T11:10:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_frederico_schmitt_kremer.pdf: 1606431 bytes, checksum: 192db9fb559b24dfd0b3038659fdd5b7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)<br>Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-10-23T11:11:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_frederico_schmitt_kremer.pdf: 1606431 bytes, checksum: 192db9fb559b24dfd0b3038659fdd5b7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)<br>Made available in DSpace on 2017-10-23T11:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_frederico_schmitt_kremer.pdf: 1606431 bytes, checksum: 192db9fb559b24dfd0b3038659fdd5b7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-17<br>Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq<br>O advento do sequenciamento de DNA de nova geração (NGS) reduziu significativamente o custo dos projetos de sequenciamento de genomas. Quanto mais fácil é de obter novos dados genômicos, mais acuradas deve ser a etapa de anotação, de forma a se reduzir a perda de informações relevantes e efetuar o acúmulo de erros que possam afetar a acurácia das análises posteriores. No caso dos genomas bacterianos, um grande número de programas para anotação já foi desenvolvido, entretanto, muitos destes softwares não incorporaram etapas para otimizar os seus resultados, como filtragem de proteínas falso-positivas/spurious e a anotação mais completa de RNA não-codificantes. O presente trabalho descreve o desenvolvimento do Genix, uma nova pipeline automatizada que combina a funcionalidade de diferentes softwares, incluindo Prodigal, tRNAscan-SE, RNAmmer, Aragorn, INFERNAL, NCBI-BLAST+, CD-HIT, Rfam e Uniprot, com a intenção de aumentar a afetividade dos resultados de anotação. Para avaliar a acurácia da presente ferramenta, foram usados como modelo de estudo os genomas de referência de Escherichia coli K-12, Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130, Listeria monocytogenese EGD-e e Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Os resultados obtidos pelo Genix foram comparados às anotações originais e as obtidas pelas ferramentas de anotação RAST e BASys, considerando genes novos, faltantes e exclusivos, informações de anotação funcional e predições de ORFs spurious. De forma a se quantificar o grau de acurácia, uma nova métrica, denominada discrepância de anotação foi também proposta. Na análise comparativa o Genix apresentou para todos os genomas o menor valor de discrepância, variando entre 0,96 e 5,71%, sendo o maior valor observado no genoma de L. interrogans, para o qual RAST e BASys apresentaram valores superiores a 14,0%. Além disso, foram identificadas proteínas spurious nas anotações geradas pelos demais programas, e, em menor número, nas anotações de referência, indicando que a utilização do Antifam permite um melhor controle do número de genes falso positivos. A partir dos testes realizados, foi possível demonstrar que o Genix é capaz de gerar anotação com boa acurácia (baixo discrepância), menor perda de genes relevantes (funcionais) e menor número de genes falso positivos.<br>The advent of next-generation sequencing (NGS) significantly reduced the cost of genome sequencing projects. The easier it is to generate genomic data, the more accurate the annotation steps must to be to avoid both the loss of information and the accumulation of erroneous features that may affect the accuracy of further analysis. In the case of bacteria genomes, a range of web annotation software has been developed; however, many applications have not incorporated the steps required to improve the output (eg: false-positive/spurious ORF filtering and a more complete non-coding RNA annotation). The present work describes the implementation of Genix, a new bacteria genome annotation pipeline that combines the functionality of the programs Prodigal, tRNAscan-SE, RNAmmer, Aragorn, INFERNAL, NCBI-BLAST+, CD-HIT, Rfam and UniProt, with the intention of increasing the effectiveness of the annotation results. To evaluate the accuracy of Genix, we used as models of study the reference genomes of Escherichia coli K-12, Leptospira interrogans strain Fiocruz L1-130, Listeria monocytogenes EGD-e and Mycobacterium tuberculosis H37Rv. the results obtained by Genix were compared to the original annotation and to those from the annotation pipelines RAST and BASys considering new, missing and exclusive genes, functional annotation information and the prediction of spurious ORFs. To quantify the annotation accuracy, a new metric, called “annotation discrepancy” was developed. In a comparative analysis, Genix showed the smallest discrepancy for the four genomes, ranging for 0.96 to 5.71%, the highest discrepancy was bserved in the L. interrogans genome, for which RAST and BASys resulted in discrepancies greater than 14.0%. Additionally, several spurious proteins were identified in the annotations generated by RAST and BASys, and, in smaller number, in the reference annotations, indicating that the use of the Antifam database allows a better control of the number of false-positive genes. Based on the evaluations, it was possible to show that Genix is able to generate annotations with good accuracy (low discrepancy), low omission of relevant (functional) genes and a small number of false-positive genes.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-11-23T11:53:28Z No. of bitstreams: 1 OhanaYonaradeAssisCostaDissertacaoparcial2015.pdf: 2702312 bytes, checksum: 31ec065175a2d2c39c8a0c2121900693 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2016-11-23T11:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 OhanaYonaradeAssisCostaDissertacaoparcial2015.pdf: 2702312 bytes, checksum: 31ec065175a2d2c39c8a0c2121900693 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31<br>The interest in biofuels started in the 2000s, due to a greater concern with the production of cleaner and renewable energy sources needed to decrease global dependency on fossil fuels. Brazil is the largest producer of sugar cane and the second largest producer of ethanol. Although the process is already well established, microbial contamination can be an obstacle, resulting in decreased productivity. The aim of this work was to study the microbial diversity of contaminants in six stages of ethanol production process using classical microbiology techniques and cultureindependent techniques. Triplicate samples from different stages of ethanol production were collected: sugarcane juice, mixed juice, clarified juice, evaporated juice, must and wine. Each sample was diluted and plated on four culture media: PCA, MRS and YPD CZAPEK. The colonies were counted, isolated and stored in glycerol at -80?? C. DNA extraction of samples was done, and the DNA of each one of the replicates of each sample was used for pyrosequencing of Bacteria and Archaea 16S rRNA genes, and Fungi ITS gene. The sequences generated were subjected to bioinformatics analysis using a specific database to the genes. It were isolated and stored in 64 bacteria, 30 yeasts, 20 filamentous fungi, which were identified by Sanger sequencing. The pyrosequecing showed 322 genera for the domain Bacteria, 21 genera for the domain Archaea and 184 genera for the domain Fungi. Among the predominant genera of bacteria in samples of sugarcane juice, mixed juice, clarified juice, evaporated juice and must are Leuconostoc, unclassified Enterobacteriales and unclassified Actinomycetales, while in the wine sample, the predominant genus was Lactobacillus, one of the major contaminants of ethanol production. For the domain Fungi, only sequenced in the sugarcane juice and mixed juice, the predominant groups were Lachancea, unclassified Hypocreales and unclassified Sordariomycetes. For the domain Archaea, also sequenced only in the sugarcane juice and mixed juice, the predominant group was unclassified Soil Crenarchaeotic group. Rarefaction curves showed that the samples of sugarcane juice, mixed juice and clarified juice did not have diversity at the genus level covered, and for sugarcane juice and mixed juice samples, the diversity was not covered in any of the domains, showing that further studies involving the diversity of these samples are needed.<br>O interesse na produ????o de biocombust??veis se iniciou na d??cada de 2000, devido a uma maior preocupa????o com a produ????o de fontes de energia mais limpas e renov??veis, necess??rias para diminui????o da presente depend??ncia mundial dos combust??veis f??sseis. O Brasil ?? o maior produtor mundial de cana-de-a????car e o segundo produtor mundial de etanol. Embora o processo de produ????o do etanol esteja bem estabelecido, a contamina????o microbiana pode ser um obst??culo, gerando diminui????o da produtividade. O objetivo desse trabalho foi estudar a diversidade microbiana de contaminantes em seis etapas do processo de produ????o de etanol utilizando t??cnicas de dependentes e independentes de cultivo. Amostras triplicadas de diferentes est??gios da produ????o de etanol foram coletadas: caldo da cana crua, caldo misto, caldo clarificado, caldo evaporado, mosto e vinho. Cada amostra foi dilu??da e semeada em quatro meios de cultura: PCA, MRS, CZAPEK e YPD. As col??nias foram contadas, isoladas e armazenadas em glicerol a -80??C. Foi feita a extra????o de DNA das amostras, e o DNA das replicatas de cada amostra foi utilizado para o pirosequenciamento dos genes do RNAr 16S dos dom??nios Bacteria e Archaea e da regi??o ITS do reino Fungi. As sequ??ncias geradas foram submetidas a an??lise bioinform??tica utilizando-se banco de dados espec??ficos para os genes em quest??o. Foram isolados, armazenados e identificados por sequenciamento de Sanger 64 bact??rias, 30 leveduras e 18 fungos filamentosos. O pirosequenciamento demonstrou a presen??a de 322 g??neros/grupos n??o classificados para o dom??nio Bacteria, 21 g??neros/grupos n??o classificados para o dom??nio Archaea e 184 para o reino Fungi, no total. Entre os g??neros de bact??rias predominantes nas amostras de caldo da cana crua, caldo misto, caldo clarificado, caldo evaporado e mosto est??o Leuconostoc, Enterobacteriales n??o classificados e Actinomycetales n??o classificados, enquanto que na amostra de vinho, o g??nero predominante ?? Lactobacillus, um dos maiores contaminantes da produ????o de etanol. Para o reino Fungi, sequenciado apenas no caldo da cana crua e no caldo misto, foram predominantes os grupos Lachancea, Hypocreales n??o classificados e Sordariomycetes n??o classificados. Para o dom??nio Archaea, tamb??m sequenciado apenas no caldo da cana crua e no caldo misto, predominaram sequ??ncias n??o classificadas do Soil Crenarchaeotic Group. As curvas de rarefa????o mostraram que as amostras de caldo da cana crua, caldo misto, caldo clarificado n??o tiveram sua diversidade coberta em n??vel de g??nero, sendo que para as amostras de caldo da cana crua e caldo misto a diversidade n??o foi coberta em nenhum dos dom??nios, de modo que s??o necess??rios mais estudos envolvendo a diversidade dessas amostras.

Orientador: Denise Bevilaqua<br>Banca: Ana Teresa Lombardi<br>Banca: Paulo Teixeira Lacava<br>Resumo: A demanda crescente de metais como ferro, cobre, entre outros ocasionou o esgotamento progressivo dos depósitos minerais ; de tal modo que as companhias minera doras desenvolver am tecnologias alternativas aos métodos convencionalmente aplicados para a recuperação e extração de metais valiosos partir de minerais de baixo teor e outras fontes de metais polimetálicos como minerais de ferro que contem metais de base associados . Uma dessa s alternati vas é a biomineração que utiliza principalmente microrganismos procariontes e eucariontes para acelerar a dissolução oxidativa de minerais sulfetados presentes em minér i os de baixo teor produzindo a solubilização de metais associados; esta biotecnologia é atualmente usada apenas para processar minérios reduzidos e rejeitos minerais uma vez que a maioria destes minerais são sulfetados. No entanto, muitos metais de valor econ ômico também são encontrados em minerais que são parcial ou totalmente oxidados como as lat eritas de cobre ou níquel, minerais que não são susceptíveis à dissolução oxidativa; portanto, os minerais de ferro férrico contidos nes ses minérios não podem ser pr ocessados oxidativamente, pois estes compostos são susceptíveis de serem reduzidos por processos biológicos, derivando na solubilização de metais associados . Microrganismos acidófilos tais como Acidithiobacillus ferrooxidans podem catalisar a redução dissimilatória de íons férrico s na ausência de oxigênio para acelerar a solubilização destes metais. Estud os recentes têm mostrado que ess a nova abordagem pode ser utilizada para extrair metais tais como níquel e cobre a partir d e minérios oxidados a uma velocidade mais elevada do que pode ser conseguido por processos oxidativos. Neste trabalho, foram realizados ensaios de redução biológica de íons férrico s acoplado a oxidação anaeróbia de enxofre elementar em um biorreator...<br>Abstract: The growing demand for metals such as iron, copper, and others has caused the gradual exhaustion of mineral deposits; such a way that the mining companies have developed technologies alternative to the methods conventionally applied for the recovery and e xtraction of valuable metals from low grade minerals and other sources of polymetallic metals such as iron minerals which contains base metals associated . One such alternative is the biomining which uses mainly microorganisms prokaryotes and eukaryotes to accelerate the oxidative dissolution of sulphide minerals present in low grade ores producing solubilization of associated metals; This biotechnology is currently used only to process reduced ores and minerals tailings since most of these minerals are sulp hides. However, many metals of economic value are also found in minerals that are partially or fully oxidized like copper or nickel laterites, minerals that are not susceptible to oxidative dissolution; therefore, the mineral ferric iron contained in these ores can not be oxidatively processed, since these compounds are capable of being reduced by biological processes, deriving the associated solubilizing metals. Acidophilic microorganisms such as Acidithiobacillus ferrooxidans can catalyze the dissimilator y reduction of ferric iron in the absence of oxygen to accelerate the solubilization of these metals. Recent studies have shown that this new approach can be used to extract metals such as copper and nickel from oxide ores at a higher speed than can be ach ieved by oxidative processes. In this work were carried out biological reduction tests of ferric iron coupled anaerobic oxidation of elemental sulfur in an automated bioreactor 2 L with temperature, agitation and pH constant in anaerobic conditions using a n iron ore and a pure culture of facul tative anaerobic bacterium At. ferrooxidans. The sample was provided by the Vale Technology...<br>Mestre

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T13:16:42Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - LUISA CARVALHO ANDRADE.pdf: 1905703 bytes, checksum: d26c7953ce5663f0aca0a866c5701328 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T12:52:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - LUISA CARVALHO ANDRADE.pdf: 1905703 bytes, checksum: d26c7953ce5663f0aca0a866c5701328 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2017-07-06T12:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - LUISA CARVALHO ANDRADE.pdf: 1905703 bytes, checksum: d26c7953ce5663f0aca0a866c5701328 (MD5)<br>FAPESB<br>A Baía de Todos os Santos (BTS), segunda maior baía do Brasil, abriga grande diversidade de ambiente, flora e fauna, porém pouco se sabe sobre sua diversidade microbiológica e seu potencial de bioprospecção. Este trabalho teve por objetivo a busca de novas substâncias antimicrobianas, capazes de inibir o crescimento de bactérias patogênicashumanas e de animais marinhos, isolados do solo de cinco praias da BTS. No total foram isoladas 107 bactérias das quais dez apresentaram produção de substâncias antimicrobianas. Após o sequenciamento verificou-se que dos dez isolados, somente oito foram de fato identificadas molecularmente, sendo sete destes membros da família Bacillaceae, grupo ao qual pertencem diversas produtoras de substâncias antimicrobianas. Entre os isolado que apresentaram produção de substâncias inibidoras do crescimento constatou-se que os isolados 21, 50 e 54 tinham maior poder de inibição. O extrato destes três isolados foi confeccionado através da acidificação do sobrenadante livre de células, isolado após o período de incubação. Os extratos do isolado 21 e do isolado 50 foram capazes de inibir a bactéria Klebsiella rizophyla, e o extrato 21 conseguiu ainda inibir a Vibrio vulnificus. Após verificação molecular através de primers específicos de sete substâncias antimicrobianas produzidas por Bacillus, constatou-se que os isolados 21 e 50 são produtores da substância ericina.<br>The All Saints´s Bay (BTS), the second largest bay in Brazil, where can be founded great diversity of flora and fauna including diversity of landscapes, but unknown about their microbial diversity and potential to bioprospecting. This study aimed to search for new antimicrobial substances that can be able to inhibit the growth of human pathogenic bacterias and marine animals, isolated from sediment from five BTS beaches. Was isolated a total of 107 bacterias where 10 showed antimicrobial substances production. After 16S sequencing, was found that from the ten isolates, only eight were identified by amplification PCR and seuqencing, seven members of the Bacillaceae family, where antimicrobial substances belonging this group are known. It was found that the isolates numbers 21, 50 and 54 had a greater power of inhibition. The extract of these three strains was made by acidification of the cell-free supernatant, isolated after the incubation period. The extracts of the isolate 21 and 50 were able to inhibit the bacteria Kocuria rhizophyla , and the same extract could also inhibit Vibrio vulnificus. In advance, was realized a molecular bioprospecting using specific molecular primers from conserved regions belongs to seven antimicrobial substances produced by Bacillus. It was found that the isolates 21 and 50 are Erycina producing.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T12:27:38Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - Luiz Lázaro.pdf: 1338858 bytes, checksum: 269d38d39fa68af0cd603b45d636eb6a (MD5)<br>Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T14:32:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - Luiz Lázaro.pdf: 1338858 bytes, checksum: 269d38d39fa68af0cd603b45d636eb6a (MD5)<br>Made available in DSpace on 2017-06-29T14:32:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - Luiz Lázaro.pdf: 1338858 bytes, checksum: 269d38d39fa68af0cd603b45d636eb6a (MD5)<br>As Bactérias redutoras de sulfato (BRS) são responsáveis pela corrosão de tubos de metal e estruturas de transporte de óleo em estações de petróleo (corrosão induzida por micro-organismos – CIM). Além da corrosão, a produção de sulfeto de hidrogênio por estas bactérias produz um fenômeno denominado de acidificação do óleo (souring). Para inibir a ação das BRS, o glutaraldeído tem sido utilizado em poços de petróleo como biocida, mas seu uso apresenta determinados inconvenientes, tais como contaminação das águas subterrâneas, bem como os efeitos adversos da exposição ocupacional. Como uma alternativa para a utilização de biocidas, a utilização de micro-organismos e/ou os seus bioprodutos para tentar inibir a ação das BRS mostrou-se como uma alternativa ambientalmente mais segura em vários processos industriais, por exemplo, na indústria do petróleo, na qual os micro-organismos e seus bioprodutos (biossurfactantes) podem ser usados na recuperação melhorada de petróleo e como agentes de inibição microbiana. A detecção e quantificação de bactérias redutoras de sulfato (BRS), em poços de petróleo, utilizando-se hibridação fluorescente in situ (FISH) e DAPI (4,6-dicloroamino fenol indol) são ferramentas muito úteis para o controle destas comunidades ao longo de um período de tempo, a fim de avaliar a sua distribuição temporal e espacial. O presente trabalho teve como finalidades: a detecção e quantificação de BRS em amostras de água produzida de petróleo, de modo a avaliar a influência de micro-organismos que produzem biossurfactantes na inibição do crescimento de BRS e, assim, inibir a produção de sulfeto de hidrogênio.

La biofiltración ha demostrado ser una tecnología exitosa para la eliminación del H2S y del NH3 de las corrientes de gases contaminadas. El tema asume relevancia pues se establece como tecnología limpia y sostenible. Debido a su organización los biofiltros son considerados ecosistemas artificiales complejos en donde las variables ambientales y la composición de la comunidad están estrictamente relacionadas y de ellas depende el éxito del proceso. La diversidad de bacterias y la dinámica de la comunidad son elementos importantes del componente biológico aunque su conocimiento es aún muy limitado. Para comprenderlo mejor se necesitan perfiles poblacionales elaborados mediante herramientas de biología molecular tales como la pirosecuenciación e hibridación con fluorescencia in situ (FISH). Este fue el eje temático de la presente tesis: Estudiar la composición y la dinámica de comunidades de Eubacteria de biofiltros percoladores mediante pirosecuenciación 454-Roche (tag-454). También se procedió a optimización de protocolos FISH. Para ambas herramientas se evaluó la cobertura de la diversidad y su efectividad para el estudio y seguimiento del componente biológico.Se estudiaron dos sistemas de desulfuración de biogás, uno aerobio y otro anóxico, y un tercer sistema de tratamiento de corrientes ricas en NH3. Los resultados obtenidos demostraron que la comunidad fue capaz de sostenerse bajo las condiciones de operación probadas. En el biofiltro de desulfuración aerobia ocurrió un cambio drástico en la composición de la microbiota en función de la acidificación del medio (pH; 7-2.5), y que la pérdida de diversidad fue compensada por la eficacia de las poblaciones acidófilas. En el biofiltro anóxico los cambios poblacionales no afectaron, en general, en el rendimiento de la desulfuración del biogas, y la actividad de Sedimenticola fue determinante para el éxito del sistema. En el biofiltro percolador de NH3 se comprobó los efectos combinados de tiempos de residencia con diferentes concentraciones de entrada del gas. Las alteraciones en dichos parámetros produjeron cambios significativos en la comunidad nitrificante. Las condiciones favorecieron el crecimiento de Comamonas, Nitrosomonas (AOB) y Nitrobacter (NOB). Fue interesante encontrar una presencia marcada de bacterias desnitrificantes, cosa que no perjudicó al rendimiento de la nitrificación. En los estudios con tag-454 se encontró dificultad a la hora de asignar identidad a secuencias, lo que se justificó por la longitud insuficiente de los fragmentos y por la falta de cobertura de las bases de datos. De todos modos los resultados indicaron que la diversidad fue representada adecuadamente, permitiendo una cobertura muy buena de las distintas comunidades hecho que corrobora la efectividad de la aproximación. El trabajo de optimización de la FISH se enmarca en el conocimiento previo de la diversidad microbiológica a la hora de elegir sondas y se comprobó la influencia de la autofluorescencia del S0 sobre el recuento de células. Los resultados mostraron que la elección de los fluorocromos fue fundamental para eliminar la autofluorescencia de las partículas de S0 que originaban datos sobre-estimados de abundancia relativa.<br>Biofiltration has proved to be a successful technology for removal of H2S and NH3 from the contaminated gases. The subject assumes significance as it is established as a clean and sustainable technology. Due to its organization biofilters are considered complex artificial ecosystems, where environmental variables and community composition are strictly related and on them depends the success of the process. The bacterial diversity and community dynamics are very important elements of the biological component, but their knowledge is still very limited. To better understand it, populational profiles elaborated by tools such as molecular biology and genomic DNA pyrosequencing of fluorescence in situ hybridization (FISH) are required. This was the theme of this thesis: To study the composition and dynamics of Eubacteria communities in three trickling biofilters using the 454-Roche (tag-454). FISH protocols were also optimized. Two systems of biogas desulphurization were studied, one aerobic and one anoxic, plus a third system for treatment of currents rich in NH3 . The acquired results showed the ability of the community to sustain itself under the tested operational conditions. In the aerobic biofilter desulfurization it occurred a drastic change in the composition of the microbiota in terms of environmental acidification; (pH; 7-2.5), and that biodiversity loss was offset by the effectiveness of acidophilic populations. In the anoxic biofilter, changes did not affect the population in general, the performance of biogas desulfurization and Sedimenticola activity was crucial to the success of the anoxic desulfurization. In the NH3 trickling biofilter, it was proved the combined effects of residence time and different concentrations of gas entrance. Alterations in said parameters produced meaningful changes in the nitrifying community. The resulting conditions favored the growth of the Comamonas, Nitrosomonas (AOB) and Nitrobacter (NOB). It was interesting to find a strong presence of denitrifying bacteria, which did not affect the nitrification performance. In studies using tag-454, the difficulty of assigning identity to the readings of some of the found sequences, which was justified by the insufficient length of the fragments and the lack of databases coverage. Regardless, the results indicated that the diversity represented the 95% of similarity, and in the end there was a very good coverage of different communities. The relative abundance data allowed the explanation of the dynamics of said communities, fact that corroborates the approximation’s efficiency. The optimization of work by FISH relays in prior knowledge of microbial diversity when choosing probes, and proved the influence of the S0 autofluorescence over the cell count. The results showed that the choice of fluorochromes was fundamental to eliminate the autofluorescence of S0 particles that originated over-estimated data of relative abundance.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana, 2017.<br>Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-12T18:15:10Z No. of bitstreams: 1 2017_NevildeMariaRiseloSales.pdf: 912257 bytes, checksum: 1c2717817be921131678d366e9a63581 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-20T15:35:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NevildeMariaRiseloSales.pdf: 912257 bytes, checksum: 1c2717817be921131678d366e9a63581 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2018-02-20T15:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NevildeMariaRiseloSales.pdf: 912257 bytes, checksum: 1c2717817be921131678d366e9a63581 (MD5) Previous issue date: 2018-02-20<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).<br>Uma crescente preocupação com os danos ao meio ambiente iniciou-se em 1960, que culminou em um grande impacto nas décadas seguintes e atualmente é um assunto de relevância e repercussão na sociedade mundial. A Organização das Nações Unidas incentiva projetos que visam a redução e reutilização de rejeitos orgânicos ou não e uma das propostas é a reutilização destes por meio do emprego de metodologias biotecnológicas economicamente viáveis para sua utilização. Dentre as categorias de resíduos sólidos orgânicos destacam-se os domiciliares e os agroindustriais, uma vez que geram um grande volume de resíduos. Durante o processo de produção de um fertilizante, ocorre a produção de um rejeito sólido que poderia conter o carboidrato β-glucana em sua composição. Este polissacarídeo está presente em fungos, bactérias e cereais e, devido às suas propriedades bioativas, é utilizado na prevenção e tratamento de doenças como dislipidemias, diabetes e câncer, assim como atua no sistema imune auxiliando no combate a patógenos como bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Neste contexto, o presente estudo propõe o desenvolvimento de uma metodologia simples e de baixo custo para obtenção de β-glucana ativa oriunda de um resíduo agroindustrial denominado Fração II. Para a extração, procedimentos físicos e químicos foram utilizados e após a purificação e a quantificação enzimática obteve-se 7,3 gramas de glucanas totais e destas, 6,9 gramas foram de β-glucanas e 0,4 gramas de α-glucanas. As análises de ressonância magnética nuclear corroboraram com os resultados obtidos indicando espectros característicos dos polissacarídeos previamente observados. Para avaliar a atividade biológica do carboidrato, um ensaio anti-proliferativo foi feito e resultados equivalentes aos relatados na literatura foram observados nos ensaios, evidenciando uma inibição de crescimento bacteriano com valores estatisticamente significativos (p < 0,0005) nas cepas Escherichia coli e Staphylococcus aureus. O presente trabalho demonstrou que a metodologia desenvolvida foi eficaz e de baixo custo no isolamento de β-glucanas biologicamente ativas e que a Fração II pode ser utilizada para obtenção destes polissacarídeos.<br>In 1960, a concern for environmental damage began, which culminated in a major impact in the 1970s and is currently a subject of relevance and repercussion in world society. The United Nations encourages projects and programs aimed at the reduction and reuse of organic waste. One of the widespread proposals on the reuse of these is the use of economically viable biotechnological methodologies and products for their use. Among the categories of organic solid waste are the domiciliary and agro-industrial ones, due to the large volume generated. In the process of producing a fertilizer, in a Brazilian agroindustry, the production of a residue that, hypothesis, would have the β-glucan carbohydrate. This polysaccharide is present in fungi, bacteria and cereals and due to its bioactive properties, it is used in the prevention and treatment of diseases such as dyslipidemias, diabetes and cancer, as well as it acts in the immune system helping to fight against pathogens such as Gram-negative bacteria and Gram -positive. In this context, the present study proposes the development of a simple and low-cost methodology to obtain active β-glucan from an agro-industrial residue called Fraction II. Physical and chemical procedures were used for the extraction and purification and the enzymatic quantification measured a yield of 7.3 grams of total glucans and of these, 6.9 grams were β-glucans and 0.4 grams α-glucans. The 13C and 1H NMR analyzes corroborated the results obtained in the enzymatic quantification showing spectra characteristic of these polysaccharides. To evaluate the biological activity, an antibacterial assay was performed and results equivalent to those reported in the literature were observed, evidencing an inhibition of bacterial growth with statistically significant values (p < 0.0005) in the strains Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The present work demonstrated that the methodology developed was efficient in the extraction and purification of the macromolecules and that the Fraction II can be used as raw material to obtain biologically active β-glucans.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Molecular<br>Neste trabalho de investigação pretendeu-se desenvolver e validar um método que permitisse a enumeração quantitativa de bactérias mesófilas e fungos, que crescem sob condições aeróbias, em lotes, não estéreis, de vários produtos (Cloridrato de Minociclina, Cloridrato de Tetraciclina, Cloridrato de Limeciclina e Cloridrato de Oxitetraciclina.), por aplicação do procedimento harmonizado pelas farmacopeias dos Estados Unidos, Europa e Japão, de acordo com o método de filtração por membrana. A adequação do método de neutralização das propriedades antimicrobianas para cada antibiótico foi demonstrada pela eficácia do neutralizador e a ausência de toxicidade do mesmo para os microrganismos. Os resultados foram expressos em termos de TAMC (contagem microbiana total) e TYMC (contagem total de leveduras e bolores). Validou-se o método de neutralização para os produtos não estéreis Cloridrato de Limeciclina, Cloridrato de Tetraciclina e Cloridrato de Oxitetraciclina, para os fungos Aspergillus brasiliensis e Candida albicans. Os resultados mostraram que também foi possível validar o método de neutralização para o Cloridrato de Minociclina com o micorganismo A.brasiliensis.<br>This study aimed to develop and validate an effective methodology that allow for the quantitative enumeration of mesophilic bacteria and fungi growing under aerobic conditions, in nonsterile batches, of the several products (Minocycline hydrochloride, Tetracycline hydrochloride, Oxitetracycline hydrochloride and Limecycline hydrochloride), by the implementation of the procedure harmonized by the pharmacopoeias of the United States, Europe and Japan, according to the method by membrane filtration. The suitability of the method for neutralizing antimicrobial properties to each antibiotic is demonstrated by neutralizer efficacy and lack of toxicity for microrganisms. The method for the neutralization of the non-sterile products Lymecycline hydrochloride, Oxytetracycline hydrochloride and Tetracycline hydrochloride to the fungi Candida albicans and Aspergillus brasiliensis was validated. In the case of Minocycline hydrochloride the method for the neutralization was validated to the A. brasiliensis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015<br>Made available in DSpace on 2016-04-19T04:02:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015Bitstream added on 2016-05-24T17:24:48Z : No. of bitstreams: 1 337985.pdf: 1641582 bytes, checksum: 6b2aefe942dc02f273844ee8b6cde2e6 (MD5)<br>O carvão mineral é o combustível, não renovável, de maior abundância no globo terrestre, e responsável por grande parte do consumo energético mundial. Um dos principais impactos gerados pela exploração do carvão mineral é a drenagem ácida de mina (DAM). A DAM geralmente ocorre quando o mineral de interesse nas operações de extração encontra-se associado a sulfetos e ao ferro piritoso, cujos materiais de origem, sob influência de componentes bióticos e abióticos, ocasionam acidificação dos recursos hídricos e liberam elementos potencialmente tóxicos nos ecossistemas afetados. Este cenário compromete o uso e a ocupação do solo, mesmo depois de cessadas as atividades de mineração. Atualmente, métodos tradicionais de atenuação e controle da DAM envolvem procedimentos que apresentam resultados incipientes ou de baixa eficiência. Neste contexto, este estudo utilizou metodologia inovadora com base em biocarvão e bactérias redutoras de sulfato (BRS), para mitigar a acidez e a presença de contaminantes nas águas da DAM na região carbonífera de Criciúma, Santa Catarina, Sul do Brasil. O biocarvão, produto oriundo de pirólise, apresenta elevada alcalinidade, alta área superficial específica e, portanto, afinidade por adsorção de componentes químicos, além de servir como nicho para a colonização de microrganismos. Neste estudo, biorreatores foram montados com biocarvão oriundo da pirólise de cama de aviário (400 °C) e fontes de BRS (70% do volume do reator) na proporção 4:1 (v/v). Foram avaliadas as seguintes fontes de inóculo de BRS: lodo de esgoto doméstico, sedimento de DAM e esterco bovino. Os biorreatores foram avaliados quinzenalmente durante um período de seis meses. Foram realizadas a caracterizações de comunidades de bactérias totais e de BRS, monitoramento do pH da água, temperatura e potencial redox, presença de coliformes e os teores de elementos-traço e sulfato. Após 30 dias de funcionamento dos biorreatores, Al, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Pb e Zn estavam abaixo dos níveis aceitáveis de acordo com CONAMA (Conselho responsável qualidade da água do Brasil), e não foram detectados coliformes. Dentre as fontes de inóculo de BRS o esterco bovino proporcionou uma redução de 41% na concentração de sulfato (382,4 mg/L inicial) na água de DAM após 180 dias de tratamento. As análises moleculares por DGGE mostraram diferenças na comunidade de BRS em cada um dos tratamentos avaliados, indicando que a fonte de inóculo teve participação decisiva no tratamento da DAM. Os resultados indicaram que a metodologia de emprego de biocarvão enriquecido com populações bacterianas é eficiente na redução de elementos-traço e de sulfato em águas de DAM.<br><br>Abstract : Coal is the non-renewable fuel in greater abundance on the globe, responsible for much of the world's energy consumption. One of the main impacts generated by the exploitation of coal is acid mine drainage (AMD). AMD usually occurs when the mineral of interest in mining operations is associated with pyritic sulfides and iron, whose source materials, under the influence of biotic and abiotic components, cause acidification of water sources releasing potentially toxic elements in the affected ecosystems. This scenario affects the use and occupation of the land, even after ceased the mining activities. Currently, traditional methods for the mitigation and control of AMD involve procedures that have incipient results or low efficiency. In this context, this study employed innovative methodology, based on biochar and sulfate-reducing bacteria (BRS), to mitigate the acidity and the presence of contaminants in AMD waters in the coal-mining region of Criciúma, Santa Catarina, southern Brazil. Biochar, a product originated from pyrolysis, generally presents high alkalinity, high specific surface area and, therefore, high affinity for the adsorption of chemical components, while serving as niche for the colonization of microorganisms. In this study, bioreactors containing poultry-litter derived biochar (400 °C) enriched with BRS (70% of reactor volume) in a 4:1 ratio (v/v) were evaluated. BRS sources included domestic sewage sludge, AMD sediment and cow manure. The reactors were evaluated fortnightly for a period of six months. Evaluations included the characterization of communities of total bacteria and BRS, monitoring of the water pH, temperature, oxide-reduction potential, presence of coliforms and levels of trace elements and sulfate. Among the sources of BRS inoculum, cow manure stood out since it caused a 41% reduction in sulfate concentration (382.4 mg/L initial) in the water after 180 days of treatment. DGGE molecular analysis showed different BRS communities in each of the treatments tested, indicating that the inoculum source is of vital importance in AMD treatment. The results indicate that the use of biochar enriched with BRS is effective in the reduction of sulfate and trace elements in AMD waters.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-11-23T11:36:50Z No. of bitstreams: 1 DaivaDomenechTupinambaDissertacao2015.pdf: 12204296 bytes, checksum: db4048c47ac3f9f47171655f6bfb3e91 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2016-11-23T11:36:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaivaDomenechTupinambaDissertacao2015.pdf: 12204296 bytes, checksum: db4048c47ac3f9f47171655f6bfb3e91 (MD5) Previous issue date: 2015-03-12<br>The Amazon rainforest is home to huge diversity of macro-species. However, little is known about the microbial diversity. The effect of land-use after deforestation is of great importance in the development of public policies. The metagenome were extracted from soils of native forest and an adjacent cultivated area with oil palm and pyrosequencing of 16S rRNA genes of archaea communities present in those soils was used for phylogenetic characterization of the archaeal microbiota, in an unprecedented characterization of native Amazonian soil and soils cultivated with oil palm. All OTUs of the native forest soils and cultivated area with oil palm were classified into two phyla: Euryarchaeota and Thaumarchaeota. Thaumarchaeota phylum was predominant only in native forest. Euryarchaeota, especially methanogenic archaea, were prevalent in cultivated area with oil palm. Various genera involved in biogeochemical cycles, as AOA and methanogenic archaea, were identified in all samples. In native forest the genera with larger representation were Candidatus Nitrosotalea and Candidatus Nitrososphaera, AOAs. In the cultivated area with oil palm the genus with larger representation was Rice Cluster I. There is a direct correlation between levels of organic matter and total carbon and the diversity of archaea in Amazonian soils. In addition, anthropization also showed impact on this diversity. This is the first study to characterize the microbiota of archaea in Amazonian soils using specific primers and high-throughput sequencing. This work also characterize the archaeal communities in soils cultivated with oil palm with and without symptoms of Fatal Yellowing. The growth of world energy demand and concern with climate changes lead to a worldwide increase in the search for alternative sources of energy. Within this scenario, agroenergy presents itself as a viable alternative. However, there are still several limitations to the production of biofuels, such as efficiency and cost of the production process as well as the quality of the energy feedstock available. Palm oil is one of the most promising sources of oil for biodiesel production in Brazil, and the Fatal Yellowing (FY), a disease with unknown etiology, is limiting the use of palm. From the metagenome extracted from soils associated to oil palms with and without symptoms of FY was used pyrosequencing of 16S rRNA genes of archaeal communities for phylogenetic characterization, in an attempt of an association of some microorganism with FY, and an unprecedented characterization of soils cultivated with oil palms with and without FY. In the comparison among oil palms with and without FY symptoms, the three groups were different among then; group 8 showed higher diversity and had lower coverage. All groups presented two phyla: Thaumarchaeota and Euryarchaeota. There was prevalence of the second in all groups, with an increase in abundance of methanogenic archaea with FY. In the analysis of genera, significant differences between the groups were observed, especially for genera Rice Cluster I and Ca. Nitrosotalea, which showed an increase in abundance directly proportional to the increase of the FY symptoms. The genera Ca. Nitrososphera and Methanocella showed the opposite; a decrease in abundance with the increase of FY symptoms. However, it???s not possible to say that these genera are related to FY. This work is complementary to the study of bacterial microbiota of these soils, already performed; and the study of fungal microbiota, in progress. This is an unpublished study, which will contribute to future studies on the Fatal Yellowing.<br>A floresta Amaz??nica ?? ber??o de enorme diversidade de macroesp??cies. Entretanto, pouco se sabe sobre a diversidade microbiana. O efeito do uso da terra ap??s o desmatamento das florestas ?? de grande import??ncia no desenvolvimento de pol??ticas p??blicas. A partir do metagenoma extra??do do solo de mata nativa Amaz??nica e de uma ??rea adjacente cultivada com dendezeiros foi utilizado o pirosequenciamento do 16S rRNA das comunidades de arqueias presentes nesses solos para caracteriza????o filogen??tica e an??lise comparativa das comunidades de arqueias. Todas as OTUs dos solos de mata nativa e ??rea cultivada com dendezeiros foram classificadas em apenas dois filos: Euryarchaeota e Thaumarchaeota. O filo Thaumarchaeota foi predominante apenas na mata nativa, sendo Euryarchaeota, especialmente arqueias metanog??nicas, predominantes nos solos cultivados com dendezeiros. Diversos g??neros envolvidos com os ciclos biogeoqu??micos, como arqueias oxidadoras de am??nia e metanog??nicas, foram identificados nas duas amostras. Na mata nativa os g??neros classificados que apresentam a maior representa????o foram Candidatus Nitrosotalea e Candidatus Nitrososphaera, AOAs. J?? na ??rea cultivada com dendezeiros o g??nero de maior representa????o foi Rice Cluster I. Foi encontrada um correla????o direta entre os n??veis de mat??ria org??nica e carbono total e a diversidade de arqueias nos solos amaz??nicos. Al??m disso, a antropiza????o tamb??m apresentou impacto sobre essa diversidade. Este ?? o primeiro estudo de caracteriza????o da microbiota de arqueias em solos amaz??nicos usando primers espec??ficos e sequenciamento de alto desempenho. Este trabalho tamb??m caracterizou as comunidades de arqueias em solos cultivados com dendezeiros com e sem sintomas de Amarelecimento Fatal. O crescimento da demanda energ??tica mundial e preocupa????o com as mudan??as clim??ticas levou a um aumento da busca mundial por fontes alternativas de energia, o que est?? levando diversos pa??ses a buscarem na bioenergia uma alternativa. Entretanto, ainda existem diversas limita????es na produ????o de biocombust??veis, seja na efici??ncia e custo do processo produtivo, seja na qualidade das fontes energ??ticas dispon??veis. O dend?? ?? uma das fontes mais promissoras de ??leo para a produ????o de biodiesel no Brasil, sendo o Amarelecimento Fatal, doen??a com fator etiol??gico desconhecido, um limitante no uso do dend??. A partir do metagenoma extra??do dos solos associados a dendezeiros com e sem sintomas de AF foi utilizado o pirosequenciamento do 16S rRNA das comunidades de arqueias para caracteriza????o filogen??tica. Foi realizada uma an??lise comparativa das comunidades de arqueias de solos de dendezeiros com e sem sintomas de AF, numa tentativa de associa????o de algum microrganismo com essa doen??a. Na compara????o entre dendezeiros com e sem sintomas de AF, os tr??s grupos estudados diferiram entre si; o grupo 8 apresentou maior diversidade e obteve menor cobertura. Todos os grupos apresentaram dois filos: Thaumarchaeota e Euryarchaeota. Houve preval??ncia do segundo em todos os grupos, com aumento na abund??ncia de arqueias metanog??nicas com o AF. Na an??lise entre g??neros, foram observadas diferen??as significativas entre os grupos, especialmente para os g??neros Rice Cluster I e Ca. Nitrosotalea, que apresentaram um aumento em suas abund??ncias diretamente proporcional ao aumento dos sintomas do AF. Os g??neros Ca. Nitrososphaera e Methanocella apresentaram uma rela????o inversa; uma queda na abund??ncia com o aumento dos sintomas do AF. Entretanto, n??o se pode afirmar que estes grupos est??o relacionados ao AF. Este trabalho ?? complementar ao estudo da microbiota bacteriana desses solos, j?? realizado; e pelo estudo da microbiota f??ngica, em andamento. Trata-se de um estudo in??dito, que ir?? contribuir para os estudos futuros sobre o Amarelecimento Fatal.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-05T12:59:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final - Diego Montes.pdf: 3792184 bytes, checksum: 932c7d285674a48aa5a90cb88c53dd85 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T15:41:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final - Diego Montes.pdf: 3792184 bytes, checksum: 932c7d285674a48aa5a90cb88c53dd85 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2017-07-03T15:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final - Diego Montes.pdf: 3792184 bytes, checksum: 932c7d285674a48aa5a90cb88c53dd85 (MD5)<br>CAPES<br>As Bactérias redutoras de sulfato (BRS) são de enorme importância do ponto de vista industrial e ambiental. O sulfeto produzido pelas BRS constitui um grande problema para o setor petrolífero por causar da biocorrosão nas instalações e por ser tóxico ao ser humano. O monitoramento dessas bactérias é realizado com frequência a fim de qualificar o tratamento para prevenir a produção de sulfeto. O tratamento comumente utilizado é a injeção de biocidas cuja utilização deve ser proporcional a densidade de BRS a fim de minimizar danos econômicos e ambientais. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver um método indireto, baseado no consumo de aceptores de elétrons (sulfato) para monitorar populações de BRS. A metodologia consistiu, a princípio, no desenvolvimento de um método de análise por cromatográfia de íons que, além do sulfato e nitrato, pode também separar outros 15 ânions como: tungstato, sulfeto, fosfato, molibdato, oxalato, nitrito, cloreto, piruvato, butirato, propionato, acetato, fluoreto, formiato, succinato e citrato. O método de avaliação foi testado para se ajustar aos padrões regidos pelo INMETRO e ANVISA (órgãos brasileiros de regulamentação). Adicionalmente foi realizada a adaptação de um método espectrofotométrico para determinação de sulfato para assim auxiliar o processo cromatográfico. O tempo de corrida no cromatografo foi de 45 minutos que foi inferior ao método fornecido pelo fabricante e com um LD de 574,2 e 127,1 μg L-1 para sulfato e nitrato, respectivamente. As análises espectrofotométricas foram eficientes para medir sulfato e nitrato entre o intervalo de 40 e 200 mg L-1. A associação da cinética microbiana de crescimento e consumo de sulfato foi realizada em cultura pura de BRS e em cultura mista de amostras ambientais. Para testes com cultura pura foi utilizada uma cepa de BRS considerada como modelo experimental para o grupo, a bactéria Desulfovibrio vulgaris. Para testes com cultura mista foram utilizados consórcios microbianos coletados de amostras de água produzida de petróleo e do Rio Camarajipe, Salvador-BA. Foi observado que a D. vulgaris apresentou uma taxa de crescimento de 0,67 h-1 em meio rico contendo sulfato, mas é capaz de crescer na presença de nitrato com taxas próximas de 0,34h-1 e um consumo de nitrato de ≅22mg L-1h-1. Esse resultado ilustra a ineficiência do uso isolado de nitrato para controlar BRS em poços de petróleo. Os testes relacionando a variação da densidade de D. vulgaris em meio de cultura com fonte de carbono e aceptor de eletron (SO4 2-) em concentrações padronizadas demostrou alta correlação linear (R2 ≥ 99%). Esse resultado comprova viabilidade de usar o Modelo de Monod para quantificar biomassa dessa cultura em apenas 12 horas de teste, ao invés de 28 dias como é o caso da técnica de NMP. A sensibilidade do método esta entre as densidades de 102-108 cel/mL. Os resultados foram menos significativos com culturas mistas de BRS provinda de amostras ambientais, mas, os resultados sugerem que ajustes na técnica podem melhorar seu desempenho.<br>Sulphate reducing bacteria (SRB) are of significant environmental and industrial importance. SRB produces significant amounts of sulphite that can cause bio-corrosion on industrial installations and be toxic to humans. Monitoring the presence of such bacteria is an activity frequently required in order to determine treatment and prevent sulphite production during petrol exploration. Injection of biocides is commonly used for this purpose and should be proportional to SRB present in the environment in order to avoid economic and environmental drawbacks. The objective of this work was to develop an indirect method for monitoring SRB population in situ based on the consumption ratios of electron acceptors such as sulphate. First, it was necessary to adapt a chromatographic method for detecting ions such as sulphate and nitrate, but the approach has also showed to be successful for separating 15 other anions such as tungstate, sulphite, phosphate, molibdate, oxalate, nitrite, chlorate, pyruvate, butyrate, propionate, acetate, fluorite, formiate, succinate and citrate. The chromatographic approach is robust to pass the “INMETRO” and “ANVISA”, the Brazilian regulation agencies. Additionally, the chromatographic approach was also tested against a spectrophotometric method for determine sulphate. The chromatographic run achieved was of 45 min only, compared to a longer period suggested by the manufacturer and with a detection limit of 574.2 and 127,1mg l-1 for sulphate and nitrate, respectively. The spectrophotometric approach was efficient for detecting sulfphate and nitrate at the range of 40 to 200mg l-1. Sulphate consumption versus the biomass activity of SRB was first tested using pure culture and later with environmental mixed cultures. Desulfovibrio vulgaris was used as a biological model representing SRB for the tests with pure culture. Two different consortiums were used for testing environmental SRB mixed cultures, one collected at the Camarajipe River, Salvador-BA, and cells grown from industrial produced water obtained from oil wells. It was observed that D. vulgaris showed a growth rate of about 0,67 h-1 in rich media with sulphate as sole electron acceptor, but the culture was also able to grow on nitrate with an average consumption of ≅22mg L-1h-1 and a growth rate of 0.34 h-1. This result suggest the inefficiency of using nitrate as means to control SRB in oil wells once some SRB can utilize it as electron acceptors. Tests correlating the variation of D. vulgaris initial biomass with sulphate consumption rate at standard conditions of carbon source and electron acceptor concentrations showed to be of statistical significance (R2 ≥ 99%). This result strongly support the tested method, which is based on the Monod model, for measuring bacterial biomass within only 12 hours instead of 28 days such as required by the most probable number technique (MPN). The sensitivity of the method was set between 102-108 cel/ml, but the results were less significant when tested with mixed environmental cultures. Nonetheless, the result showed that some adjustment in the technique may improve its performance.

La transglutaminasa (TGasa) és un enzim que catalitza modificacions postraduccionals de proteïnes mitjançant enllaços ε-(γ-glutamil) i ponts covalents d’amida. En plantes, aquest enzim està poc estudiat, i només ha estat clonat el gen TGasa de Zea mays (tgz). Aquesta tesi resumeix la feina feta per desenvolupar un sistema d'expressió utilitzant dos microorganismes recombinants, Escherichia coli (E. coli) i Pichia pastoris (P. pastoris) per produir i caracteritzar l'enzim transglutaminasa (TGZ). Treballs anteriors en E. coli van mostrar que la proteïna recombinant era present principalment en forma de cossos d'inclusió (IBs). Per tal d'obtenir la proteïna en forma activa i soluble, es van optimitzar les condicions d'expressió en E. coli. Es va assajar la coexpressió de xaperones i es va desenvolupar un sistema no clàssic de solubilització de IBs. A més, es va transformar P. pastoris per estudiar la seva expressió i comparar ambdós sistemes. Les metodologies de Taguchi i de la superfície de resposta es van utilitzar per formular un medi de cultiu que, juntament amb el desenvolupament d’una aplicació informàtica per modelar i simular el procés, va permetre establir un cultiu d'alta densitat d'E coli. Els resultats van mostrar que les condicions òptimes per a expressar TGZ en E. coli van ser d’una concentració de IPTG de 100μmol IPTG / g de biomassa seca i un temps d'inducció de 5 h. Aquestes condicions van permetre obtenir un rendiment TGZ de 160 mg / L amb una activitat específica de 450 putrescina pmol / mg TGZ resolubilitzada · h. Es va realitzar una caracterització bioquímica completa de la TGZ obtinguda mitjançant E. coli. Es va posar a punt un sistema de cultiu d'alta densitat cel·lular en P. pastoris i es va expressar TGZ amb èxit. La reacció de reticulació de TGZ a la caseïna es va estudiar, i el resultat va ser igual que la reacció de la caseïna per TGZ expressada en E. coli. Es va obtenir una producció de 480 mg / L de proteïna total amb una activitat de 4000 pmol putrescina / mg de proteïna total · h. Aquests resultats indiquen que també es va establir un procediment eficaç per expressar TGZ en P. pastoris.<br>La transglutaminasa (TGasa) es una enzima que cataliza modificaciones postraduccionales de proteínas mediante enlaces ε- (γ-glutamil) y puentes covalentes de amida. En plantas, esta enzima está poco estudiada, y sólo ha sido clonado el gen TGasa de Zea mays (tgz). Esta tesis resume el trabajo realizado para desarrollar un sistema de expresión utilizando dos microorganismos recombinantes, Escherichia coli (E. coli) y Pichia pastoris (P. pastoris) para producir y caracterizar la enzima transglutaminasa (TGZ). Trabajos anteriores en E. coli mostraron que la proteína recombinante estaba presente principalmente en forma de cuerpos de inclusión (IBs). Con el fin de obtener la proteína en forma activa y soluble, se optimizaron las condiciones de expresión en E. coli. Se ensayó la coexpresión de chaperonas y se desarrolló un sistema no clásico de solubilización de IBs. Además, se transformó P. pastoris para estudiar su expresión y comparar ambos sistemas. Se utilizaron las metodologías de Taguchi y de la superficie de respuesta para formular un medio de cultivo que, junto con el desarrollo de una aplicación informática para modelar y simular el proceso, permitieron establecer un cultivo de alta densidad de E. coli. Los resultados mostraron que las condiciones óptimas para expresar TGZ en E. coli fueron de una concentración de IPTG de 100μmol IPTG / g de biomasa seca y un tiempo de inducción de 5 h. Estas condiciones permitieron obtener un rendimiento TGZ de 160 mg / L con una actividad específica de 450 putrescina pmol / mg TGZ resolubilizada · h. Se realizó una caracterización bioquímica completa de la TGZ obtenida mediante E. coli. Se puso a punto un sistema de cultivo de alta densidad celular en P. pastoris y se expresó TGZ con éxito. La reacción de reticulación de TGZ en la caseína se estudió, y el resultado fue igual que la reacción de la caseína por TGZ expresada en E. coli. Se obtuvo una producción de 480 mg / L de proteína total con una actividad de 4000 pmol putrescina / mg de proteína total · h. Estos resultados indican que también se estableció un procedimiento eficaz para expresar TGZ en P. pastoris.<br>Transglutaminase (TGase) is an enzyme that catalyzes post-translational protein modifications by ε-(γ-glutamyl) links and covalent amide bonds. In plant, this enzyme is poorly studied and only the Zea mays TGase gene (tgz) has been cloned. This thesis summarizes the work done to develop an expression system using two recombinant microorganisms, Escherichia coli (E. coli) and Pichia pastoris (P. pastoris) to produce and characterize the enzyme transglutaminase (TGZ). Previous works expressing TGZ in E. coli showed that the recombinant protein was mainly present as inclusion bodies (IBs). In order to obtain active, soluble protein, expression conditions were optimized in E. coli, coexpression of chaperones was tested and a non-classic IBs resolubilizing system was developed. Additionally, the gene was also inserted in P. pastoris to study its expression, being able to compare both systems. Taguchi and response surface methodologies were used to develop a culture media that, together with the implementation of a computer application to model and simulate the process, allowed to develop a high-density culture of E. coli. Results showed that the optimal conditions to express TGZ in E. coli were an IPTG concentration of 100µmol IPTG/ g dry biomass and an induction time of 5h. These conditions allowed to obtain a TGZ yield of 160 mg/L with a specific activity of 450 pmol putrescine/mg resolubilized TGZ·h. A full biochemical characterization of the TGZ obtained using E. coli was performed. A P. pastoris high cell density cultivation system was implemented and TGZ was successfully expressed. The cross-linking reaction of TGZ to the casein was also studied, and the result was same as the reaction of casein by TGZ expressed in E. coli. A production of 480mg/L of total protein with an activity of 4000 pmol putrescine/mg total protein·h was obtained. These results indicated that an effective procedure for expressing TGZ in P. pastoris was also established.

Um método baseado na extração de rRNA, seguido de RT-PCR rRNA 16S, clonagem e ARDRA foi otimizado e validado para a identificação das bactérias ativas em biofilmes. O método foi analisado primeiro com consórcios artificiais de três organismos. As etapas de clonagem e RT não causaram variações importantes na composição destes consórcios, do contrário da etapa de PCR, onde foi necessária a redução de 30 para 10 ciclos para limitar a distorção da proporção de templates. A análise de biofilmes reais indicou que clones dominantes podem ser identificados com o critério de ocorrência de >2% na biblioteca, mas que a reprodutibilidade de análises ainda é insatisfatória, possivelmente devido a fatores como a micro heterogeneidade espacial do biofilme, viés na reação de PCR e formação de mais de um clone de ARDRA por organismo. O armazenamento do biofilme a -20 °C por 2 meses não levou à alterações expressivas em sua composição. O perfil de clones detectado com o kit (Mo Bio) de extração de RNA foi muito diferente do perfil detectado com o método otimizado neste trabalho.<br>A method based on extraction of rRNA, followed by RT-PCR of 16S rRNA, cloning and ARDRA was optimized and validated for identification of bacteria active in biofilms. The method was first tested with artificial three-membered consortia. Cloning and RT did not lead to significant changes in the composition of the artificial consortia, but a reduction in cycle number in the PCR reaction from 30 to 10 was necessary for limiting the distortion in the proportion of amplicons relative to that of the templates. Analysis of real biofilms revealed that clones from active organisms occurred in frequencies >2% in the clone library, but reproducibility of analysis was unsatisfactory, probably due to factors such as the spatial heterogeneity of colonization of biofilms by microbes, PCR bias and more than one ARDRA clone per organism. Storage of biofilm samples at -20 °C for 2 months did not lead to important changes in composition. Very different clone profiles were obtained in the analysis of the same biofilm sample with the optimized method and with a kit (Mo Bio) for extraction of RNA.

O material lignocelulósico, presente na biomassa vegetal, representa uma importante fonte de energia, entretanto necessita da ação das enzimas lignocelulolíticas para sua degradação. A busca por novas enzimas que atuam na quebra da parede celular da planta em comunidades microbianas evoluídas naturalmente em um ambiente de degradação de biomassa como o rúmen oferece uma estratégia promissora para a prospecção de genes. Com isso, o projeto teve como objetivo a identificação de genes degradarores de biomassa vegetal em microrganismos do rúmen de ovinos usando a abordagem metagenômica. Para tanto, foram coletadas amostras da fase sólida do rúmen de 6 animais fistulados (Ovis aries) divididos em dois grupos e submetidos a duas dietas por 60 dias: tratamento controle e tratamento com dieta contendo bagaço de cana-de-açúcar. O DNA metagenômico total das amostras foi extraído e sequenciado na plataforma MiSeq Personal Sequencer (Illumina&reg;). A análise dos dados para a anotação taxônomica e funcional foi realizada no software MG-RAST. A caracterização dos genes degradadores de biomassa vegetal foi feita na plataforma CLC Genomic Workbench v.5.5.1(CLC Bio, Denmark) e a anotação de 4,68 gigabases de dados foi feita no banco de dados CAZy. A análise taxonômica mostrou uma predominância do domínio Bacteria compondo mais de 96% de todas as amostras, sendo os filos mais abundantes Bacteroidetes, Firmicutes, seguido de Proteobacteria. Entre todos os filos anotados, cinco tiveram a abundância aumentada no tratamento com adição de bagaço de cana-de-açúcar na dieta, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes e Verrucomicrobia, e dois filos foram mais abundantes no tratamento controle, Bacteroidetes e Synergistetes. De modo geral, a análise de ordenação não mostrou correlação entre a composição do microbioma e o tipo de dieta, porém, na análise funcional, essa correlação foi observada uma vez que houve separação entre os tratamentos. A abundância relativa das famílias de enzimas relacionadas à degradação de carboidratos segue um padrão similar em todas as amostras metagenômicas. O módulo catalítico da família de Glycoside Hydrolases (GH), o qual foi anotado em 129 subfamílias diferentes, foi o mais abundante em todas as amostras (45,5%), seguido da família GT (Glicosyl Tranferase), anotada em 97 subfamílias diferentes e CBM (Carbohydrete-Bining Module), em 78 subfamílias. A montagem do metagenoma resultou em aproximadamente 110.000 contigs e possibilitou a identificação de 15 diferentes genes completos codificados nas subfamílias GH1, GH2, GH3, GH16, GH20, GH25, GH32, GH97 e GH127. A análise comparativa dos diferentes tratamentos mostrou uma maior abundância dessas enzimas no rúmen dos animais alimentados com a dieta enriquecida com bagaço de cana-de-açúcar. Em conclusão, a manipulação da dieta de ovinos por meio da substituição de parte da fração fibrosa da dieta por bagaço de cana-de-açúcar promove o enriquecimento de enzimas que degradam a biomassa vegetal no rúmem, favorecendo a prospecção e identificação de genes ativos em carboidratos.<br>The lignocellulose present in the plant biomass is a promising source of energy generation. However, the breakdown of plant biomass into simple sugars for bioethanol production is still inefficient and costly due to the recalcitrant nature of the plant fiber. The sheep rumen microbiome is specialized in degradation of plant material, but most members of this complex community are uncultured in the laboratory. Therefore, the search for new lignocellulolytic enzymes in microbial communities naturally evolved in biomass degradation environments, such as the rumen, using the exploration of the metagenome, is a promising strategy for identifying new genes. In this context, this study aimed to prospect plant biomass-degrading genes, selected from the sheep rumen microorganisms. The rumen samples were collected from 6 fistulated animals (Ovis aries), divided into two groups and subjected to two diets: control treatment and a treatment with a diet amended with sugarcane bagasse. The animals were fed for 60 days before sampling. To characterize the composition and functions of the rumen microbiome followed by the search of biomass-degrading genes, the metagenomic DNA was extracted from the solid contents of rumen and sequenced in MiSeq Personal Sequencer platform (Illumina&reg;). The taxonomic and functional data were performed using MG-RAST software. For the characterization of the plant biomass degrading genes, they were analyzed on the CLC platform Genomic Workbench v.5.5.1 (CLC Bio, Denmark) and 4.68 gigabases of data was annotated against the CAZy database. The taxonomic analysis showed a predominance of the Bacteria domain composing more than 96% of all the samples, being the most abundant phyla Bacterioidetes, Firmiutes, followed by Proteobacteria. Five bacterial phyla were significantly more abundant in the treatment were sugarcane bagasse was added, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes and Verrucomicrobia, and two phyla were more abundant in the control treatment, Bacteroidetes and Synergistetes. In general, the ordination analysis did not show correlation between diet type and rumen microbiota, but in the functional analysis, this correlation was observed since there was separation between the treatments. The relative abundance of enzyme families related to carbohydrate degradation follows a similar pattern of abundance across all metagenomic samples. The catalytic module of the GH (Glycoside Hydrolases) family, which was annotated in 129 different subfamilies, was the most abundant in all samples (45.5%), followed by the GT family (Glycosyltransferase), annotated in 97 different subfamilies and CBM (Carbohydre-Bining Module) in 78 sub-families. Metagenome assembly resulted in ~110,000 contigs enabled the retrieval of 15 complete different genes encoded in the subfamilies GH1, GH2, GH3, GH16, GH20, GH25, GH32, GH97 and GH127. A comparative analysis between the groups of animals in the different treatments showed a greater abundance of enzymes, with no metagenome of the fiber proven from the group of animals fed a diet enriched with sugarcane bagasse. These results show the sheep rumen microbiome as an untapped source of potential new fibrolytic enzymes. Using a diet amended with sugarcane bagasse increases the abundance of CAE and provide a substantially expanded catalog of genes participating in the deconstruction of plant biomass.

Orientador: Lara Durães Sette<br>Banca: Eleonora Cano Carmona<br>Banca: Alysson Wagner Fernandes Duarte<br>Resumo: Ambientes extremos são fontes potenciais para a descoberta de novos produtos naturais com propriedades específicas para aplicação biotecnológica, devido ao pouco conhecimento sobre a diversidade e os recursos genéticos dos micro-organismos que habitam esses locais. Micro-organismos do ambiente Antártico têm demonstrado potencial para produção de enzimas ativas em temperaturas brandas com aplicação em diversos setores de importância econômica. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a produção de L-asparaginase e proteases produzidas por fungos filamentosos (n=161) e leveduras (n=137), isolados de oito diferentes amostras de solos da Antártica (coletados na expedição Antártica de nov/dez de 2013 no âmbito do INCT Criosfera). Os fungos filamentosos e as leveduras encontram-se preservados na coleção de pesquisa vinculada à Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Um total de 101 (62,7%) fungos filamentosos apresentou potencial para produção da enzima L-asparaginase em meio sólido (triagem qualitativa), porém nos testes quantitativos em meio líquido a enzima não foi produzida nas condições utilizadas. Com relação às proteases, 121 (75,1%) fungos apresentaram halo de degradação em meio sólido e 30 (18.6%) isolados apresentaram resultados de atividade de proteases acima de 45,0 U/mL. Dentre eles, 13 (8,7%) foram capazes de produzir proteases acima 100,0 U/mL: sete isolados apresentaram atividade de proteases alcalina e seis de proteases ácidas. Os isolados 5BI ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: Extreme environments are potential sources for the discovery of new natural products with specific properties for biotechnological applications due to little knowledge about the diversity and genetic resources of microorganisms that inhabit these places. Microorganisms from the Antarctic environment have shown potential for producing active enzymes in mild temperatures with application in various sectors of economic importance. In this context, the present study evaluated the production of proteases and L-asparaginase by filamentous fungi (n= 161) and yeasts (n= 137) isolated from seven different samples of the Antarctic soils (collected in the Antarctic expedition Nov/Dec 2013 - INCT Cryosphere Project). The isolates are being maintained in the research collection linked to the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). A total of 101 (62.7%) filamentous fungi showed potential for production of L-asparaginase on solid medium (qualitative screening), but in the quantitative screening in liquid medium the enzyme was not produced. Concerning proteases production, 121 (75.1%) filamentous fungi presented halo of degradation on solid medium and 30 (18.6%) isolates showed protease activity above 45.0 U/mL Among them, thirteen (8.7%) isolates were able to produce protease above 100.0 U/mL: seven isolates produced alkaline proteases and six acid proteases. The isolates 5BI (Aspergillus sp.) and 6 MP (Thelebolus sp.) showed the best results in the production of acid and alkaline ... (Complete abstract click electronic access below)<br>Mestre

In recent years, advances in biotechnology has allowed the development of synthetic membranes associated with nanocomposites, which has shown promising results as dermal burns dressings. In this sense, silver nanoparticles (NPAg) has been the focus of interest because of their biological properties such as antimicrobial and antiinflammatory effect. The incorporation of NPAg in biological membranes of different natures, such as chitosan, polyester, polymethacrylate methyl and cellulose, has been successfully tested in several biological models. The association between NPAg and polymers produced by the micro-organism presents important advantages, such as water solubility and lack of toxicity. Recently we developed a technique for producing NPAg associated with xanthan (GX), a biopolymer with potential application in various sectors of the petrochemical industry, food and pharmaceutical, through fermentation by Xanthomonas sp performed in the presence of silver nitrate. Therefore, this study aimed to develop, characterize and evaluate the potential antimicrobial and healing membranes nanocomposite xanthan: silver on second-degree burns in the porcine model. Therefore, xanthan biocomposites: silver were used for fabrication of membranes (for casting process, which were subsequently characterized for thickness, mechanical properties (stress, strain, Young´s modulus) and the thermal profile (DSC, TG and DTG). Activity antimicrobial was tested against strains of Escherichia coli (ATCC 25922) and Staphylococcus aureus (ATCC 25923). analysis for tissue repair were made two dermal burns on the back nine male pigs breed Yorkshire (25 ± 5 kg), treated with Xanthan biosensor membrane: silver (XNPAg) with topical application of silver sulfadiazine 1% (SDZ). After eight, 18 and 30 days the wounds were examined macroscopically determined for each lesion area, and the animals euthanized for Microscopic study of the scar area observed that XNPAg membranes showed a significant increase in the values of thickness (P <0.05), density (p <0.01) and Young´s modulus (p <0.001) and reduced strength strain (p <0.05) when compared to membranes of xanthan. Were revealed changes in the thermal profile of the two membranes suggesting the incorporation of silver nanoparticles in the polymer xanthan. XNPAg The membrane induced the formation of inhibition zones 9, 7 mm and 9.6 mm and death rate of 89% and 100% for Staphylococcus aureus and Escherichia coli respectively. Histological analysis showed quantitative and qualitative increase in the reaction granulation and best architectural arrangement of collagen fibers along the the healing process of wounds covered with membranes XNPAg. Could be concluded that the membranes nanocomposite xanthan:silver showed satisfactory mechanical properties for its handling, transportation and storage, as well as important antimicrobial activity and pro-healing in dermal burns using porcine model.<br>Nos últimos anos, os avanços na área da biotecnologia tem propiciado o desenvolvimento de membranas sintéticas associados à nanocompostos, que vem apresentando resultados promissores como curativos de queimaduras dérmicas. Nesse sentido, as nanopartículas de prata (NPAg) tem sido foco de interesse devido as suas propriedades biológicas como atividade antimicrobiana e efeito antiinflamatório. A incorporação de NPAg em membranas biológicas de diferentes naturezas, como quitosana, poliéster, polimetacrilato de metila e celulose, vem sendo testada com sucesso em diversos modelos biológicos. A associação entre NPAg e polímeros produzidos por microrganismo apresenta importantes vantagens, como solubilidade em água e ausência de toxicidade. Recentemente foi desenvolvida uma técnica de produção de NPAg associadas a goma xantana (GX), um biopolímero com aplicação potencial em vários setores da indústria petroquímica, alimentícia e farmacêutica, através de processo fermentativo realizado pela Xanthomonas sp na presença de nitrato de prata. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo desenvolver, caracterizar e avaliar o potencial antimicrobiano e cicatrizante de membranas de bionanocompósito xantana:prata sobre queimaduras de segundo grau em modelo suíno. Para tanto, biocompósitos xantana:prata foram utilizadas para confecção de membranas (por casting process, que foram posteriormente caracterizadas quanto a espessura, propriedades mecânicas (tensão, deformação, módulo de Young) e perfil termoanalítico (DSC, TG e DTG). A atividade antimicrobiana foi avaliada frente a cepas de Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Para análise do reparo tecidual foram confeccionadas duas queimaduras dérmicas no dorso de nove suínos machos, da raça Yorkshire (25 ± 5 kg), tratadas com membrana de biocompósito xantana:prata (XNPAg) e com aplicação tópica da sulfadiazina de prata a 1% (SDZ). Após oito, 18 e 30 dias, as feridas foram analisadas macroscopicamente, determinada a área de cada lesão, e os animais eutanasiados para estudo microscópico da área cicatricial. Observou-se que as membranas XNPAg apresentaram aumento significativo nos valores de espessura (p<0,05), deformação (p<0,01) e módulo de Young (p<0,001), e redução da força de tensão (p<0,05) quando comparados a membranas de xantana. Foram evidenciadas alterações no perfil termoanalítico das duas membranas sugestivas da incorporação das nanopartículas de prata no polímero de xantana. As membrana XNPAg induziram a formação de halos de inibição de 9,7 mm e 9,6 mm e Taxa de letalidade de 89% e 100% para Staphylococcus aureus e Escherichia coli respectivamente. A análise histológica mostrou incremento quantitativo e qualitativo na reação de granulação, bem como melhor disposição arquitetural das fibras de colágeno ao longo do processo cicatricial das feridas cobertas com membranas XNPAg. Pôde-se concluir que as membranas de bionanocompóstico xantana:prata apresentaram propriedades mecânicas satisfatórias para sua manipulação, transporte e armazenamento, bem como importante atividade antimicrobiana e pró-cicatrizante em queimaduras dérmicas utilizando modelo suíno.

Solos apresentam hidrocarbonetos gasosos em quantidades variáveis e acredita-se que as formações de reservatórios de óleo podem ser detectáveis indiretamente utilizando-se bactérias no solo capazes de degradá-los. O presente estudo teve como objetivo caracterizar comunidades microbianas envolvidas com o metabolismo desses hidrocarbonetos. As amostras de solo Np (área não petrolífera) e Solo P (área petrolífera) foram analisadas através da construção de bibliotecas do gene RNAr 16S de bactérias e arquéias e de genes catabólicos que codificam enzimas monooxigenases solúveis (SDIMO). As comunidades apresentaram estrutura diferente em relação aos grupos de bactérias e arqueias e análise dos genes catabólicos indicou maior riqueza e diversidade no solo P. A maior parte do clones se mostrou filogeneticamente mais próxima de sequências de enzimas de bactérias não cultivadas proveniente de amostras ambientais. Análises de cromatografia gasosa realizadas logo após a coleta detectaram maiores níveis de metano no solo P e maiores níveis de etano e propano no solo Np. A técnica de PCR quantitativo (Real Time PCR) mostrou um número maior de cópias do rRNA 16S no solo Np, mas não foi eficiente em quantificar os genes degradadores de gases leves presentes no solo.<br>Gaseous hydrocarbons occur in sub-surface soil in highly variable amounts and oil reservoirs formations are supposed to be indirectly detectable through soil microbial populations capable of consuming it. The goal of the present work was to characterize microbial communities involved in short-chain alkane metabolism in soils in and off sedimentary basin areas (named P and Np soil, respectively). Three clone libraries were constructed for each sample, one 16S rRNA gene library for each of the Domains Bacteria and Archaea, and one for the catabolic gene coding for the soluble di-iron monooxygenase (SDIMO) enzyme. Bacterial and archaeal communities structures were different between the samples. Analysis of the catabolic genes presented higher values of richness and diversity in soil P. The sequences from soil samples were more closely related to each other than to reference sequences. Short-chain hydrocarbon measures performed just after samples were collected showed higher levels of methane and lower levels of ethane and propane in soil P in comparison to soil Np. A real-time PCR method was not successful in yielding the catabolic gene quantification suggesting that such genes occur in very low abundance in the soil samples under study.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Alimentar<br>O ovo é um dos alimentos largamente consumidos em todo o mundo devido ao seu conteúdo nutritivo e fácil preparação. A casca, resultante do processamento do ovo, representa cerca de 10% da massa total. Normalmente este resíduo é descartado, sem qualquer tratamento, em aterros e constitui um elevado encargo económico para as empresas. O presente trabalho teve como principal objetivo fazer um levantamento de novas formas de utilização e valorização da casca de ovo em Portugal, na Comunidade Europeia e noutros países onde a indústria de ovoprodutos está fortemente desenvolvida, com o objetivo de identificar uma solução rentável, a nível económico e ambiental. Assim, foi realizada a caracterização microbiológica da casca de ovo, para determinar as cargas microbianas de Escherichia coli, coliformes totais, enterobactérias totais, Staphylococcus aureus, mesófilos totais, bolores e leveduras, e enterococcus. Foi ainda realizado um estudo de deteção de presença ou ausência de patogénios alimentares em 25 g de amostra, no caso de Salmonella e Listeria. Foi analisada ainda a humidade da casca. Os mesófilos totais foram, dos microrganismos estudados, os que apresentaram cargas microbianas mais elevadas. No caso da casca esterilizada os valores obtidos apresentaram-se abaixo do limite de deteção para todos os microrganismos, pelo que a esterilização foi eficiente. No que se refere à deteção de patogénios, verificou-se a presença de Listeria e/ou Salmonella em alguns dos ensaios realizados para a casca triturada. No entanto, não foi detetada a presença de Listeria e de Salmonella/25g de amostra de casca esterilizada. Relativamente à humidade da casca esterilizada, esta apresentou, de forma geral, valores mais baixos comparativamente com a amostra de casca triturada. Por volumetria foi estimada, na amostra de casca triturada, a percentagem de cálcio como sendo 31,0%. Deste trabalho resultou como utilização mais promissora da casca de ovo a sua incorporação em rações, como substituto do CaCO3 usado<br>Eggs are one of the most consumed foods worldwide due to its nutritive content and easy confection. The eggshell, resultant from egg processing, represents about 10% of the total mass. Usually, this solid waste is discarded without any treatment in landfills being an important economic burden for enterprises. The main objective of the present work was to conduct a survey on new ways of using and valuing eggshell in Portugal, European Community and other countries where the egg industry is strongly developed, aiming to identify a cost-effective solution, both in an economical and environmental level. Thus, microbiological characterization of eggshell samples was performed, in order to determine the microbial loads of Escherichia coli, total coliforms, total enterobacteria, Staphylococcus aureus, total aerobic mesophiles, yeasts and moulds, and enterococcus. It was also conducted a study for detection of presence or absence of food pathogens, such as Salmonella and Listeria, in 25 g of food samples. The humidity of eggshell samples was also analyzed. Total aerobic mesophiles were the studied microorganisms with the highest microbial loads. In the case of sterilized eggshell, the obtained values were below the detection limit for all microorganisms, which means that sterilization was effective to achieve microbial inactivation. Regarding pathogen detection, the presence of Listeria and/or Salmonella was detected in some of the analyzed crushed eggshells. However, these microorganisms were not detected on sterilized samples (25 g). Concerning the humidity of sterilized eggshell, this parameter resulted, in general, in lower values when compared to crushed eggshell samples. The percentage of calcium in eggshell samples was estimated through volumetry to be 31.0%. The incorporation of the crushed eggshell into feeds, as a replacement for the currently used CaCO3, was identified in this work as the most promising use of eggshells.

Xylanases have an important role as biocatalysts in different agroindustrial processes, such as saccharification of plant residues for the production of ethanol and bleaching of wood pulp for the production of pulp. On an industrial scale, these processes may require extreme pH or temperature, which require enzymes compatible with these conditions. Most enzymes available or showing commercial potential is synthesized by fungi or bacteria belonging to a few genera. Evaluation of rare isolation bacteria is an important strategy to expand the diversity of xylanases and their potential in terms of activity, stability and technological application. The aim of this study was to evaluate a collection of common and rare isolation soil bacteria regarding to xylanase activity and characterize the stability conditions of temperature and pH. The analyzed collection consists of 120 isolates with representatives from six phyla that were subjected to screening for xylanase activity in pure cultures and in the extracellular proteic extract (EPE). The ratio between the halos diameters of xylan hydrolysis and in the colonies on solid medium (ratio H:C), incubated at 30 ° C for up to 14 days, was used for the evaluation of cultures as a selection criteria. The effects of different sources of variation in the bacteria isolation stage (original soil, culture medium, solidifying agent, inoculum dilution and plating method and incubation time to colony appearance) and the group of bacterial isolation (rare or common) on the frequency of isolates with high xylanase activity were evaluated based on the ratio H:C. EPEs were obtained in liquid media containing xylan inoculated with the eleven isolates with highest ratios H:C. The extracts were evaluated for the specific xylanase activity at 50 °C for 1 h. Extracts of the three isolates with the highest potential for activity under this condition were evaluated for optimum activity, stability, activity at 60 oC and at pH 4.0, 5.5 and 8.0. Twenty-two isolates (25%), including eight from rare isolation, showed xylanase activity under the conditions evaluated, and found a high variability (> 230%) between these isolates. No isolation factor or rare or common isolation condition were associated with efficiency of xylanase activity in solid medium. High variability in specific xylanase activity in EPEs was also found among isolates (1500%), highlighting two rare isolates (TC119 and TC21), from Alfaproteobacteria class, and one common isolate (TC99), from Ralstoniaceae family. Extracellular xylanases from TC21 and TC119 showed high relative activity at temperatures up to 70 oC and were insensitive to pH in the range 4.0 to 8.0; however, TC99 isolate showed optimum temperature at 40 °C and low stability to temperature and pH. Extracellular xylanases from TC119 showed no cellulolytic activity. Rare isolation soil bacteria show high potential as a source of extracellular xylanases adapted to extreme pH and temperature conditions, which are required in agroindustrial processes.<br>As xilanases apresentam papel relevante como biocatalisadores de diferentes processos agroindustriais, como a sacarificação de resíduos vegetais para a produção de etanol e o clareamento de polpas de madeira para a produção de celulose. Em escala industrial, estes processos podem requerer pH e, ou, temperatura extremos, os quais demandam enzimas compatíveis com estas condições. A maioria das enzimas disponíveis ou com potencial comercial é sintetizada de fungos ou de bactérias pertencentes a poucos gêneros. A avaliação de bactérias de isolamento raro constitui-se em estratégia importante para ampliar a diversidade de xilanases e suas potencialidades em termos de atividade, estabilidade e aplicação tecnológica. O objetivo deste trabalho foi avaliar uma coleção de bactérias do solo de isolamento comum e raro quanto à atividade de xilanases e caracterizar estas enzimas quanto à estabilidade a condições contrastantes de temperatura e pH. A coleção analisada é composta de 120 isolados com representantes de seis filos e foi submetida à seleção quanto à atividade de xilanases em culturas puras e no extrato proteico extracelular (EPE). Para a avaliação das culturas, utilizou-se como critério de seleção a relação entre os diâmetros de halos de hidrólise de xilana e das colônias em meio sólido (relação H:C), incubado a 30 oC por até 14 dias. Os efeitos de diferentes fontes de variação da fase de isolamento destas bactérias (solo de origem, meio de cultura, agente solidificante, diluição do inóculo e método de plaqueamento e tempo de incubação até surgimento de colônias) e do grupo de isolamento bacteriano (raro ou comum) sobre a frequência de isolados com alta atividade de xilanase foram avaliados com base na relação H:C. EPEs foram obtidos em meios líquidos contendo xilana inoculados com os onze isolados com maiores relações H:C. Os extratos foram avaliados quanto à atividade específica de xilanases a 50 oC, por 1 h. Os extratos dos três isolados com maior potencial de atividade sob esta condição foram avaliados quanto à temperatura ótima de atividade, estabilidade de atividade a 60 oC e a valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0. Vinte e dois isolados (25%), incluindo oito de isolamento raro, apresentaram atividade de xilanase nas condições avaliadas, sendo encontrada uma alta variabilidade (>230%) entre estes isolados. Nenhum fator de isolamento ou a condição de isolado raro ou comum foram associadas à eficiência de atividade de xilanases em meio sólido. Alta variabilidade de atividade específica de xilanases nos EPEs também foi encontrada entre os isolados (1500%), com destaque para dois de cultivo raro (TC119 e TC21), da classe Alfaproteobacteria, e um de cultivo comum (TC99), da família Ralstoniaceae. As xilanases extracelulares de TC119 e TC21 apresentaram elevada atividade relativa em temperaturas de até 70 oC e foram pouco sensíveis ao pH na faixa de 4,0 a 8,0; entretanto, as de TC99 apresentaram temperatura ótima de 40 oC, baixa estabilidade a temperatura e pH. Xilanases extracelulares de TC119 não apresentaram atividade celulolítica. Bactérias do solo de isolamento raro apresentam alto potencial como fonte de xilanases extracelulares adaptadas a condições extremas de pH e temperatura requeridas em processos agroindustriais.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-06T13:04:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Jamille Almeida.pdf: 1302682 bytes, checksum: 996b2da859b03a0f196518660811cde6 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T15:06:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Jamille Almeida.pdf: 1302682 bytes, checksum: 996b2da859b03a0f196518660811cde6 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2017-06-29T15:06:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Jamille Almeida.pdf: 1302682 bytes, checksum: 996b2da859b03a0f196518660811cde6 (MD5)<br>CAPES<br>Os polissacarídeos microbianos estão sendo muito utilizados atualmente por causa das vantagens em relação aos provenientes de outras fontes. Muitos são sintetizados por bactérias pertencentes à família Sphingomonadaceae como gelana, ramsana, welana, diutana, entre outras. Apesar da quantidade de polissacarídeos existentes, a descoberta de novos polissacarídeos microbianos é importante, tendo em vista a sua vasta aplicabilidade industrial, como espessantes, emulsificantes, estabilizantes e quelantes. Além disso, há a possibilidade de propriedades mais vantajosas e maior produção bacteriana. Este trabalho teve como objetivo selecionar linhagens bacterianas nativas de ambiente marinho produtoras de exopolissacarídeos e caracterizá-los. Neste contexto, a otimização da composição dos meios de cultivo e condições de processo podem modificar a produção, com possibilidade de aplicação industrial. Quatro bactérias foram selecionadas a partir da Coleção de Cultura Microbiana do Instituto de Ciências da Saúde pela resistência ao meio ágar nutriente contendo o antibiótico estreptomicina nas concentrações 100 e 200 μg.mL-1, sendo posteriormente identificadas por análise molecular como pertencentes aos gêneros Sphingomonas sp., Sphingobium sp. e Bacillus sp. A produção dos polímeros sintetizados por essas bactérias foi realizada em meio de cultivo, com alteração da fonte de carbono (sacarose ou glicerina bruta). A quantidade dos exopolissacarídeos sintetizados pelas bactérias pertencentes aos gêneros Sphingomonas sp. e Bacillus sp foi de 0,2 g.L-1 independente da fonte de carbono utilizada. O polímero produzido por Sphingobium sp. foi de 0,1 g.L-1 no meio contendo sacarose e 0,2 g.L-1 no meio com glicerina bruta. A CCMICS SB 22 não produziu exopolissacarídeo no meio contendo sacarose, enquanto que com a glicerina bruta foi de 0,2 g.L-1. As viscosidades dos exopolissacarídeos produzidos pelas quatro linhagens estudadas não apresentaram diferença entre si. A massa molecular do exopolissacarídeo produzido por Sphingobium sp. foi de 1,13 x 103 Daltons. Os outros polímeros não tiveram a massa molecular determinada por não apresentarem solubilidade em água.<br>The microbial polysaccharides are currently used being much because of advantages over from other sources. Most of those which are being studied are synthesized by bacteria of Sphingomonadaceae family, like gelan, rhamsan, welan, diutan, among others. Despite the amount of existing polysaccharides, the discovery of new polysaccharides is important, in view of its wide industrial applicability, such as thickeners, emulsifiers, stabilizers, and binders. Furthermore, there is the possibility of further advantageous properties and increased bacterial production. This work aimed to select native bacterial strains of exopolysaccharides-producing marine environment and characterize them. In this context, optimization of the composition of culture media and process conditions may change the production, with the possibility of industrial application. Four bacteria were selected from the Microbial Culture Collection of Sciences Institute of Health the resistance to the nutrient agar containing the antibiotic streptomycin in concentrations 100 and 200 μg.mL-1, subsequently identified by molecular analysis as belonging to the Sphingomonas sp., Sphingobium sp. and Bacillus sp. genres. The production of polymers synthesized by those bacteria was held in the culture medium, by changing the carbon source (sucrose or crude glycerin). The quantity of synthesized exopolysaccharides by the bacteria belonging to the Sphingomonas sp. and Bacillus sp genres was 0,2 g.L-1 regardless of the carbon source used. The polymer produced by Sphingobium sp. was 0,1 g.L-1 in the medium containing sucrose and 0,2 g.L-1 in the medium with crude glycerin. The CCMICS SB 22 produced no exopolysaccharide in the medium containing sucrose, while with crude glycerin was 0,2 g.L-1. The viscosities of exopolysaccharides produced by the four strains studied did not differ among themselves. The molecular mass of the exopolysaccharide produced by Sphingobium sp. was 1,13 x 10³ Daltons. The others polymers did not have the molecular mass determined for not showing solubility in water.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.<br>Made available in DSpace on 2016-10-25T03:14:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342403.pdf: 2156235 bytes, checksum: cd652312197cb776d37821de591ca5ac (MD5) Previous issue date: 2016<br>A microbiota humana é o conjunto de microrganismos que habitam as superfícies externas e internas do nosso corpo, tais como, pele, mucosa oral e respiratória, ou o trato gastrointestinal (TGI) e geniturinário (TGU). Este conjunto de microrganismos é adquirido pelos recém-nascidos inicialmente no momento do parto. Entre os 18 e 24 meses se torna já semelhante à microbiota de um adulto. Uma das principais funções dessa microbiota é a estimulação do sistema imune, tornando-o apto a desenvolver suas funções de homeostase e defesa, através do amplo leque de células e moléculas que o compõe. Existem evidências de que variações na microbiota intestinal podem causar alterações no sistema imunológico, podendo constituir um ambiente que modula de forma negativa ou positiva a indução de uma resposta imune eficaz. O desequilíbrio dessa microbiota (disbiose) pode provocar não só dano tecidual, mas também anergia imune, tolerização ou inflamação intestinal crônica que, caso persistam, podem comprometer a resposta do hospedeiro aos antígenos, e dentre eles àqueles que formam parte das vacinas. O presente trabalho teve como objetivo geral estudar o impacto das alterações provocadas experimentalmente na microbiota intestinal sobre a resposta imune de camundongos imunizados. Os animais foram vacinados por via subcutânea com 108 ufp/animal (109 ufp/mL) de vacina atenuada de adenovírus humano (HuAd5V) recombinante. Para avaliar a ação de variações significativas da microbiota intestinal e correlacioná-la com a imunogenicidade das vacinas foram traçados dois desenhos experimentais baseados na depleção da microbiota com antibióticos. No primeiro desenho experimental (A), camundongos BALB/c foram tratados com 250 mg de axetilcefuroxima e 25 mg de enramicina diluídos em 250 ml de agua estéril administrado por via oral durante 14 dias. Para o segundo desenho experimental (B) utilizaram-se diferentes combinações de antibióticos não absorvíveis: Gentamicina (G), Metronidazol (M), Neomicina (N) e Vancomicina (V), administrada via oral (1 g/L) durante 14 dias. Durante o tratamento, os animais foram avaliados quanto ao seu desenvolvimento mediante a mensuração do seu peso corporal, e foram também realizadas coletas de fezes para realização de culturas bacterianas e quantificação da microbiota intestinal por PCR quantitativa (qPCR). Os resultados mostraram que o desenho experimental B conseguiu ter uma eficácia maior quanto à depleção da microbiota, apesar de que também foram observadas com ele as maiores taxas de diminuição do peso corporal dos animais. Os grupos de animais tratados com M apresentaram maior redução do peso corporal médio e não tiveram sua microbiota totalmente depletada. Já, uma significativa redução da microbiota foi observada no início do tratamento com NGV ainda sem observar uma redução proporcional do seu peso médio corporal. O resultado mais relevante do nosso trabalho é o que diz a respeito do fato de que a depleção/seleção da microbiota intestinal utilizando NGV e MGV teve impacto significativo na imunogenicidade das vacinas recombinantes adenovirais atenuadas, já que os níveis de anticorpos anti-adenovirais resultantes foram menores, apresentando valores de significância estadística (p) de 0.0154 e 0.0293, respectivamente, em relação ao grupo controle.<br><br>Abstract : Human microbiota is formed by a group of microorganisms that inhabit our body surfaces, such as skin, respiratory or oral mucosa as well as the gastrointestinal (GIT) or genital-urinary (GUT) tracts. Between 18 and 24 months, this microbiota becomes similar to that of an adult human being. One major function of these microorganisms is to stimulate a diversity of immune functions, making our immune system able to perform their homeostasis and defense functions, mainly through the use of a wide arrange of cells and humoral factors that make part of it. Evidences suggest that variations in gut microbiota contents may cause positive or negative alterations in immune responses, thus representing an immune-modulative microenvironment. Disbiosis (lost of equilibrium) may be responsible not only for intestinal tissue damage but also for immune anergy, tolerization or chronic intestinal inflammation, which, if maintained for long periods, may compromise host´s response to antigens, including those that form the vaccines.Our current study had the aim of elucidating the impact that experimental alterations in gut microbiota of mice might have on the immune responses induced in those animals by vaccination. Mice were immunized subcutaneously with 108 pfu/animal (109 pfu/mL) of a human adenovirus type 5 (HuAdV) recombinant attenuated vaccine. To evaluate significant alterations in gut microbial contents and to correlate those with vaccine immunogenicity, two experimental designs were planned, based on different antibiotic usage schedules. In the first experimental design (A), BALB/c mice were treated with 250 mg of axetilcefuroxime and 25 mg of enramicine, diluted in 250 ml of sterile water, administered orally for 14 days. As for the second experimental design (B), different combinations of non-absorbable antibiotics were used: Gentamicin (G), Metronidazole (M), Neomycin (N) and Vancomycin (V), all of them administered orally at 1 g per liter of drinking water for 14 days. During treatment, mouse development was evaluated by measuring body weight, and fecal samples were also collected to perform bacterial cultures and to quantify total gut microbiota by quantitative PCR (qPCR). Results show that experimental design B was more efficient in terms of microbiota depletion; despite the most significant decrease in body weight was also observed in those groups of mice. Mice treated with M displayed a major reduction in body weight and did not have their gut microbiota totally depleted. In contrast, a significant reduction in gut microbiota was observed during the first ten days of antibiotic treatment with NGV, without observing any significant reduction in mean body weight. The most relevant result of our study relates to the fact that depletion/selection of gut microorganisms in animals treated with NGV or MGV had a significant impact in the immunogenicity of our recombinant attenuated viral vaccines, since the levels of anti-adenovirus antibodies detected were significantly lower in those groups of immunized mice when compared to the other groups of mice, with p values of 0.0154 and 0.0293, respectively.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior<br>A biotecnologia microbiana tem evoluído muito nas últimas décadas, principalmente pela utilização de diferentes micro-organismos para produção de inúmeros bioprodutos utilizados nos diferentes setores industriais e ambientas. As enzimas desempenham um importante papel catalítico em inúmeras reações metabólicas existentes, e as de origem microbiana apresentam diversas vantagens em relação as de origem animal e vegetal. A reutilização de resíduos agroindustriais oriundos da indústria alimentícia na elaboração de meios de produção de produtos biotecnológicos, tem surgido como uma alternativa econômica viável, pois diversos nutrientes descartados, apresentam um elevado teor nutricional que pode ser reaproveitado pelos micro-organismos nos processos fermentativos. As proteases são enzimas que constituem um grande grupo de enzimas hidrolíticas que catalisam a hidrólise de proteínas e as degradam em pequenos peptídeos e aminoácidos. A relevância deste grupo de enzimas, ricas em diversidade e mecanismos de ação estrutural se reflete na importância de suas aplicações em processos industriais. Foram realizados ensaios de seleção de amostras de Aspergillus niger (SIS 18, SIS 19 e SIS 20) em diferentes temperaturas (28, 30, 40oC) e diferentes pH ( 6, 7, 8) para a obtenção da melhor amostra para a produção de protease. Após a seleção da melhor amostra, foram realizados ensaios de produção da enzima através de fermentação submersa utilizando 4 diferentes meios. Os ensaios ocorreram em câmara incubadora com agitação orbital, 150 rpm, 37oC, 96 horas, onde foram realizados a determinação do pH, da atividade enzimática e curva de crescimento. Em seguida, após a seleção do melhor meio de produção, foram realizados novos ensaios utilizando planejamento fatorial 22 completo com 4 repetições, utilizando os resíduos de soro de leite e de sorvete, nas mesmas condições cinéticas pré-estabelecidas. Os resultados obtidos indicaram que a amostra de A. niger (SIS 18) apresentou a formação do maior halo característico de 3,0 cm, com 96 h de crescimento. Os ensaios realizados com diferentes meios de produção em fermentação submersa, indicaram que o meio denominado 3, apresentou uma atividade proteolítica de 0,104 U/mL, após 96 horas de fermentação. No planejamento fatorial 22, utilizando meios contendo substratos agroindustriais, o melhor resultado obtido foi no ensaio 2, que apresentou uma atividade proteolítica de 0,118U/mL com o soro de leite e 0,093U/mL para o resíduo de sorvete.Esses resultados validam que a utilização de resíduos agroindustriais tem sido uma alternativa viável para produção de protease em fermentação submersa, e com isso pode reduzir os custos de produção e o descarte desses resíduos no meio ambiente.<br>Microbial biotechnology has evolved a lot in the last decades, mainly by the use of different microorganisms for the production of numerous bioproducts used in the different industrial and environmental sectors. Enzymes play an important catalytic role in numerous metabolic reactions, and those of microbial origin have several advantages over those of animal and plant origin. The reuse of agroindustrial residues from the food industry in the elaboration of means of production of biotechnological products has emerged as a viable economic alternative because several discarded nutrients present a high nutritional content that can be reused by the microorganisms in the fermentative processes. Proteases are enzymes that constitute a large group of hydrolytic enzymes that catalyze the hydrolysis of proteins and degrade them in small peptides and amino acids. The relevance of this group of enzymes, rich in diversity and mechanisms of structural action, is reflected in the importance of their applications in industrial processes. Sampling assays of Aspergillus niger (SIS 18, SIS 19 and SIS 20) were carried out at different temperatures (28, 30, 40C) and different pH (6, 7, 8) to obtain the best sample for the production of Protease. After the selection of the best sample, enzyme production assays were performed by submerged fermentation using 4 different media. The tests were carried out in an orbital shaker, 150 rpm, 37oC, 96 hours, where the pH, the enzymatic activity and growth curve were determined. Then, after the selection of the best production medium, new assays were performed using a 22 complete factorial design with four replicates using milk serum and ice cream residues, under the same pre-established kinetic conditions. The results indicated that the A. niger (SIS 18) sample showed the formation of the largest characteristic halo of 3.0 cm, with 96 h of growth. The assays performed with different production media in submerged fermentation indicated that the medium 3 was a proteolytic activity of 0.104 U/mL after 96 hours of fermentation. In factorial design 22, using media containing agroindustrial substrates, the best result obtained for test 2, which presented a proteolytic activity of 0.118 U/mL with serum of milk and 0.093 U/mL for ice cream residue.These results validate that the use of agroindustrial residues has been a viable alternative for the production of protease in submerged fermentation, and with this can reduce the costs of production and the discard of these residues in the environment.

The investigation of phylogenetic diversity and functionality of complex microbial communities in relation to changes in the environmental conditions represents a major challenge of microbial ecology research. Nowadays, particular attention is paid to microbial communities occurring at environmental sites contaminated by recalcitrant and toxic organic compounds. Extended research has evidenced that such communities evolve some metabolic abilities leading to the partial degradation or complete mineralization of the contaminants. Determination of such biodegradation potential can be the starting point for the development of cost effective biotechnological processes for the bioremediation of contaminated matrices. This work showed how metagenomics-based microbial ecology investigations supported the choice or the development of three different bioremediation strategies. First, PCR-DGGE and PCR-cloning approaches served the molecular characterization of microbial communities enriched through sequential development stages of an aerobic cometabolic process for the treatment of groundwater contaminated by chlorinated aliphatic hydrocarbons inside an immobilized-biomass packed bed bioreactor (PBR). In this case the analyses revealed homogeneous growth and structure of immobilized communities throughout the PBR and the occurrence of dominant microbial phylotypes of the genera Rhodococcus, Comamonas and Acidovorax, which probably drive the biodegradation process. The same molecular approaches were employed to characterize sludge microbial communities selected and enriched during the treatment of municipal wastewater coupled with the production of polyhydroxyalkanoates (PHA). Known PHA-accumulating microorganisms identified were affiliated with the genera Zooglea, Acidovorax and Hydrogenophaga. Finally, the molecular investigation concerned communities of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) contaminated soil subjected to rhizoremediation with willow roots or fertilization-based treatments. The metabolic ability to biodegrade naphthalene, as a representative model for PAH, was assessed by means of stable isotope probing in combination with high-throughput sequencing analysis. The phylogenetic diversity of microbial populations able to derive carbon from naphthalene was evaluated as a function of the type of treatment.

The vaginal microbiota of healthy women consists of a wide variety of anaerobic and aerobic bacteria, dominated by the genus Lactobacillus. The activity of lactobacilli is essential to protect women from genital infections and to maintain the natural healthy balance of the vaginal ecosystem. This role is particularly important during pregnancy because vaginal infection is one of the most important mechanisms for preterm birth. The most common vaginal disorder is bacterial vaginosis (BV). BV is a polymicrobial disorder, characterized by a depletion of lactobacilli and an increase in the concentration of other bacteria, including Gardnerella vaginalis, anaerobic Gram-negative rods, anaerobic Gram-positive cocci, Mycoplasma hominis, and Mobiluncus spp. An integrated molecular approach based on real-time PCR and PCR-DGGE was used to investigate the effects of two different therapeutic approaches on the vaginal microbiota composition. (i) The impact of a dietary supplementation with the probiotic VSL#3, a mixture of Lactobacillus, Bifidobacterium and Streptococcus strains, on the vaginal microbial ecology and immunological profiles of healthy women during late pregnancy was investigated. The intake was associated to a slight modulation of the vaginal microbiota and cytokine secretion, with potential implications in preventing preterm birth. (ii) The efficacy of different doses of the antibiotic rifaximin (100 mg/day for 5 days, 25 mg/day for 5 days, 100 mg/day for 2 days) on the vaginal microbiota of patients with BV enrolled in a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled study was also evaluated. The molecular analyses demonstrated the ability of rifaximin 25 mg/day for 5 days to induce an increase of lactobacilli and a decrease of the BV-associated bacteria after antibiotic treatment, and a reduction of the complexity of the vaginal microbial communities. Thus, confirming clinical results, it represents the most effective treatment to be used in future pivotal studies for the treatment of BV.

A capacidade de degradação de compostos xenobióticos por organismos vivos, principalmente bactérias, tem sido objeto intenso de pesquisa, principalmente por aqueles microrganismos isolados do solo. Dessa forma, a busca por novos nichos que resultem no isolamento de microrganismos altamente eficientes se torna cada vez mais necessária. Assim, dada a diversidade de interações inseto - bactérias, este estudo buscou explorar insetos resistentes a inseticidas como nicho de bactérias com capacidade de degradação de pesticidas para o desenvolvimento de estudos voltados à i) utilização dessas bactérias na biorremediação e ii) determinação de sua contribuição na metabolização de inseticidas pelo hospedeiro. Assim, esse trabalho teve por objetivos i) isolar, identificar e caracterizar microrganismos associados ao trato digestivo de linhagens de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) resistentes a lambda-cyhalothrin e deltamethrin (piretróide), chlorpyrifos ethyl (organofosforado), spinosad (naturalyte) e lufenuron (inibidor de síntese de quitina), ii) verificar o seu potencial de biodegradação desses compostos, iii) estudar sua associação a populações naturais de S. frugiperda e iv) determinar seu papel na metabolização de xenobióticos. Bactérias com potencial de biodegradação foram selecionadas via cultivo seletivo da flora associada ao trato intestinal de lagartas de quinto ínstar de S. frugiperda em meio mínimo M9 acrescido de 10 ?g/mL de um dos inseticidas em estudo como única fonte de carbono. As bactérias isoladas foram sujeitas à análise de PCR-RFLP do gene do 16S rDNA, com três enzimas de restrição (EcoRI, Rsa, DdeI), resultando na identificação de 16 isolados. Após sequenciamento, dez filotipos foram identificados, distribuídos em Firmicutes (Enterococcaceae e Staphylococcaceae), ?-Proteobacteria (Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae), ?-Proteobacteria (Comamonadaceae) e Actinobacteria (Micrococcaceae e Microbacteriaceae). Enterococcus, Pseudomonas e Microbacterium foram os únicos representados por dois filotipos, sendo ainda encontrados um filotipo de Delftia, Leclercia, Staphylococcus e Arthrobacter. Enterococcus casseliflavus e Enterococcus mundtii foram isolados de praticamente todas as linhagens resistentes de S. frugiperda. Análises de antibiograma e do metabolismo de carboidratos indicaram a similaridade entre os clones de E. casseliflavus, enquanto que os clones de E. mundtii diferiram de maneira expressiva. Apesar disso, os alelos analisados para tipagem via multilocus não resultaram em diferenças. Análises de PCR-diagnóstico do intestino de lagartas de S. frugiperda de linhagem suscetível de laboratório resultaram na detecção de quatro dos dez filotipos isolados do intestino de linhagens resistentes de S. frugiperda. Já em populações naturais foram encontrados cinco dos dez filotipos. O isolado com maior capacidade de crescimento em cada inseticida foi selecionado e todos apresentaram resposta dependente da concentração dos inseticidas, sendo encontrado efeito antimicrobiano em alguns inseticidas. A análise de cromatografia acoplada a espectrometria de massas comprovou a degradação dos inseticidas utilizados pelos diferentes isolados. A colonização do trato digestivo de linhagem suscetível de S. frugiperda com um dos filotipos (Microbacterium arborescens) isolado de lagartas resistentes a lufenuron resultou em CL50 cerca de 10 vezes superior àquela da linhagem apossimbionte. Assim, linhagens resistentes de S. frugiperda se mostraram um excelente reservatório de bactérias com capacidade de degradação dos inseticidas testados e que podem auxiliar na metabolização desses produtos pelo hospedeiro, assim como ser exploradas na descontaminação de áreas que apresentam resíduos desses xenobióticos.<br>The capacity of living organisms to degrade xenobiotics has been intensively studied, mainly for soil-associated bacteria. Thus, there is a growing need to search for new niches to lead to the isolation of highly efficient microrganisms. As insect-bacteria interactions are very diverse, we focused on exploiting insecticide resistant insects as a niche of pesticidedegrading bacteria to develop studies devoted to a) bacterial utilization in bioremediation and ii) determination of bacterial contribution to insecticide metabolization by the host insect. Our main objetives were to i) isolate, identify and characterize the microrganisms associated to the gut of resistant strains of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) capable to degrade lambda-cyhalothrin,deltamethrin (pyrethroids), chlorpyrifos ethyl (organophosphate), spinosad (naturalyte) and lufenuron (chitin synthesis inhibitor), ii) verify their potential to degrade these insecticides, iii) to verify their association to natural populations of S. frugiperda, and iv) to determine their role in the metabolization of xenobiotics in the host. Bacteria with biodegrading capacity were selected from the gut flora of fifth instars of S. frugiperda on selective media based on the minimum media M9 added of 10 ?g/mL of one of the insecticides selected as the sole carbon source. The isolated bacteria were subjected to RFLP-PCR analysis of the 16S rDNA gene using three restriction enzymes (EcoRI, Rsa, DdeI), which led to the identification of 16 isolates. These isolates were grouped in ten phylotypes after sequencing, representing Firmicutes (Enterococcaceae and Staphylococcaceae), ?-Proteobacteria (Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae), ?- Proteobacteria (Comamonadaceae) and Actinobacteria (Micrococcaceae e Microbacteriaceae). Enterococcus, Pseudomonas and Microbacterium were the only represented by more than two phylotypes. Delftia, Leclercia, Staphylococcus and Arthrobacter were also represented. Enterococcus casseliflavus and Enterococcus mundtii were isolated from almost all resistant lines of S. frugiperda. Antibiogram and carbohydrate metabolism assays indicated the similarity among the isolates of E. casseliflavus, while those of E. mundtii displayed some differences. However, no molecular differences were observed by comparing different alleles in multilocus sequence analysis. Diagnostic-PCR analysis of a susceptible, lab-strain of S. frugiperda allowed the identification of four out of the ten phylotypes isolated from resistant strains. But no bacteria from the susceptible strain could be cultivated in the selective media. In natural populations of S. frugiperda, five out of the ten isolates were detected. The most active isolate to degrade each pesticide was selected for further tests and all displayed a dose-dependent response to the insecticides. Analyses by gas or liquid chromatography-coupled mass spectrometry demonstrated the capacity of each isolate to degrade the insecticides tested. Gut colonization of larvae from the susceptible strain with Microbacterium arborescens isolated from resistant larvae increased the LC50 to lufenuron in 10 fold when compared to the aposymbiont strain. Thus, resistant strains of S. frugiperda are an excellent reservoir of bacteria capable of degrading the tested insecticides, and have a potential to be exploited for the bioremediation of xenobiotic contaminated areas. Moreover, these bacteria can auxiliate the host insect to metabolize insecticides and may play a role in insect response to insecticides.

Mestrado em Biotecnologia Molecular<br>Great concerns are developing worldwide over the emerging threat of infectious diseases caused by antibiotic-resistant strains of bacteria, especially for the rise of nosocomial infections in healthcare units, placing a major peril over public health systems. There are evidences of resistance genes being transferred from marine life to humans by several mechanisms such as Horizontal Gene Transfer (HGT), with potential reservoirs and vectors still to be determined. The effects caused by antibiotics and other antimicrobial compounds misusage on the gastrointestinal tract (GIT) microbiota of species with some degree of contact with human materials or wastes that could present themselves as vectors for a variety of resistant strains of bacteria still remain unknown. The main goal of this study was to determine the existence of antibiotic-resistant strains of bacteria in the Solea spp. in the public health context. Kirby-Bauer inhibition tests were performed in animals of two aquaculture industries and two fishing harbors located north and south of the Douro river. Results revealed a high resistance for penicillin in all sampling locations. Resistance to amoxicillin with clavulanic acid was obtained in sites A, B and C with few results of intermediate level. In location D the sensibility for this compound was total. The level of inhibition was intermediate for trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT) and ciprofloxacin in site A. Sites B and D revealed sensitivity to both and location C presented resistance to SXT and intermediate resistance to ciprofloxacin. It was considered that antibiotics misusage was the most probable cause for inducing resistance in the GIT microbiota of the Solea spp and the potential for transfer of the genetic determinants of resistance to the human setting is high.<br>A ameaça emergente de doenças infecciosas originadas por estirpes de bactérias multi-resistentes está a causar grandes preocupações a nível mundial, especialmente devido ao aumento de infecções nosocomiais em unidades de saúde, colocando um grande perigo para os sistemas de saúde pública. Existem já evidências directas da transferência de genes de resistência de organismos marinhos para o ser humano através de vários mecanismos, tais como a Transferência Horizontal de Genes, com potenciais reservatórios e vectores ainda por determinar. Os efeitos da má utilização de antibióticos e outros compostos antimicrobianos no microbiota do tracto gastrointestinal (GIT) de espécies com algum grau de contacto com materiais e detritos humanos e que poderão constituir-se como vectores para uma variedade de estirpes de bacterias multi-resistentes, ainda permanecem desconhecidos. O presente estudo teve como objectivo principal determinar a existência de estirpes bacterianas resistentes a antibióticos em Solea spp. No contexto da saúde pública. Foram realizados testes de inibição de Kirby-Bauer em animais de duas aquaculturas e dois portos de pesca localizados a norte e a sul do rio Douro. Os resultados revelaram resistência para a penicilina em todos os locais de amostragem. Resistência à amoxicilina com ácido clavulânico foi verificada nos locais A, B, e no C com alguns resultados de nível intermédio. No local D a sensibilidade a este composto foi total. O nível de inibição foi intermédio para o trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) e para a ciprofloxacina no local A. O local B e D revelaram sensibilidade para ambos e o C apresentou resistência ao SXT e inibição intermédia pela ciprofloxacina. Considera-se, assim, que o mau uso de antibióticos foi a causa mais provável da indução de resistências no microbiota do GIT da Solea spp. e que o potencial para ocorrer transferência de genes de resistência ao contexto humano é elevado.

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Orientador: Denise Bevilaqua<br>Banca: Ana Teresa Lombardi<br>Banca: Monica Cristina Teixeira<br>Resumo: Na natureza, os sulfetos minerais constituem a principal fonte para extração industrial de metais, como o cobre, o chumbo, o zinco e o níquel. A calcopirita (CuFeS2) é um sulfeto de cobre importante, sendo o mineral de cobre mais abundante na natureza. Dentre os processos utilizados para a extração de metais está a biolixiviação, que consiste no processamento de minérios utilizando-se micro-organismos, e é reconhecida hoje como uma metodologia interessante sob os pontos de vista econômico e ambiental. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de se obter consórcios oxidantes de ferro e de enxofre capazes de promover a solubilização da calcopirita. Para obtenção dos consórcios, quinze amostras minerais fornecidas pela Companhia Vale S.A. foram enriquecidas em meios de cultivo específicos. Foram obtidos 4 consórcios oxidantes de ferro e 4 oxidantes de enxofre, denominados Dep SOS-4, S3A, SO3, D1. A análise dessas amostras minerais por difração de raios X evidenciou a presença predominante de quartzo (SiO2) nas amostras Dep SOS-4 e S3A e nas amostras D1 e SO3 também foi observado covelita (CuS), pirrotita (FeS), calcopirita (CuFeS2) e enxofre (S0). Os consórcios oxidantes de ferro foram adaptados ao crescimento em calcopirita e submetidos a ensaios de biolixiviação em calcopirita. Agrupamentos dos consórcios também foram realizados, porém sem adaptação prévia à calcopirita. Nos ensaios de biolixiviação, os valores de Eh se elevaram continuamente nos frascos inoculados, estabilizando ao redor de 550 mV, indicando o aumento da relação Fe3+/Fe2+, o que afeta diretamente a solubilização dos metais pela ação oxidante do Fe3+. Mesmo considerando que a calcopirita é um dos sulfetos mais refratários ao ataque oxidante, bacteriano ou químico, a extração de cobre nos ensaios... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: In nature, sulphide minerals are the main sources for extraction of some metals for industrial uses, such as copper, lead, zinc and nickel. One of the most important and explored copper sulphide is chalcopyrite, being the most abundant copper mineral in nature. Metals can be extracted using microorganisms, leading the bioleaching to an economic and environmentally sustainable process. In this research, it was developed different iron and sulfur oxidizer consortium to promote chalcopyrite (CuFeS2) solubilization. All consortium were obtained from previous enrichment in a specific culture of 15 ore samples provided by Companhia Vale S.A. Four iron oxidizer and four sulfur oxidizer consortium were prepared, and named Dep SOS-4, S3A, SO3 and D1. X ray diffraction of the Dep SOS-4 and S3A samples showed mainly quartz content (SiO2), whereas the SO3 and D1 samples showed covellite (CuS), pyrrothite (FeS), chalcopyrite (CuFeS2) and sulfur (S0) presence too. The iron oxidizer consortium were adapted to grow with chalcopyrite and then used in shake flasks experiments with chalcopyrite. A mix of consortiums was performed, but without a previous adaptation to the chalcopyrite. The Eh values increased during the bioleaching of the inoculated flasks, stabilizing around 550 mV, which affects metal solubilization due to an increase in the Fe+3/Fe+2 ratio. The iron oxidizer consortium resulted in a better dissolution of the chalcopyrite when compare with the control, sulfur oxidizer consortium and pure strain At. thiooxidans - FG01. However, it was not observed any significant difference between the consortium and At. ferrooxidans - LR in the chalcopyrite dissolution. In the respirometric tests with chalcopyrite as substrate were observed lower consumption of oxygen to the iron oxidizer consortium (Dep SOS -4, S3A, SO3 and D1) in relation to... (Complete abstract click electronic access below)<br>Mestre

Os polihidroxialcanoatos constituem um grupo de poliésteres acumulados por inúmeras bactérias na forma de grânulos intracelulares, que podem representar até 80% da massa seca celular. No presente trabalho, foi avaliado o comportamento de diferentes linhagens quanto a capacidade de metabolizarem ácidos graxos livres e óleo de soja para a produção de biopolímeros e, posteriormente, em biorreator, algumas linhagens selvagens e recombinantes foram testadas na presença ou não de um inibidor da b-oxidação. Experimentos em frascos agitados, mostraram valores de teor de PHA em até cerca de 70% na biomassa total com cerca de 5% de monômeros de cadeia média permitindo selecionar as linhagens Cupriavidus necator e Burkholderia cepacia para os ensaios seguintes. Experimentos em biorreator mostraram que, as variáveis manipuláveis quanto ao fluxo de óleo de soja, de co-substratos e o inibidor de b-oxidação não influenciaram, significativamente, no rendimento de P3HB/3HAmcl formado quando utilizado Burkholderia cepacia IPT-048, entretanto, contribuíram na síntese de 3HV. Durante os ensaios, o aumento do número de cópias do gene phaB em Cupriavidus necator, aparentemente, não contribuíram para o aumento do rendimento de 3HHx, porém, outras variáveis manipuláveis deverão ser propostas para a confirmação.<br>The poly-3-hydroxyalkanoates (PHA) are a group of polyesters accumulated for several bacteria in the intracellular granule form, that can represent up to 80% of the dry mass cellular. The main advantage of the biopolymers on the synthetic materials is its degradation in the environment. Recycable raw materials can be used as carbon sources for the production biodegradable polymer. Some polymers have appeared in literature having mechanical characteristic considered appropriate in such a way for use in packings (flexible and covering films), how base for controlled release of asset to be applied in the pharmacological-medical and foods area. The P3HB-co-3HAmcl are 3-hydroxybutyrate copolymers and 3-hydroxyacyl of 6 or more carbon atoms which has aroused interest for to present intermediate properties between HB and HAmcl, having taken care of the requirements for diverse applications. Some strains are distinguished, however, assays in bottles agitated with the Cupriavidus sp. and Burkholderia sp. strains, using as substratum greasy free acid and soy oil, had led the promising results. In the present work, first, was evaluated the behavior of different strains (Cupriavidus necator DSM545 IPT-026, C. necator H16 IPT-027, Pseudomonas sp. IPT-066, Burkholderia cepacia IPT-048 and B. sacchari IPT-189) how much to metabolizer capacity of free fatty acids and soybean oil for the production of biopolymers and, later, in tank bioreactor some wild strains and recombinant had been tested together or not of an inhibitor of the boxidation (acid acrylic). Experiments in bottles with agitation, had shown values of PHA in about 70% of the total biomass with about 5% monomers chain average allowing to select the Burkholderia cepacia IPT-048 and Cupriavidus necator DSM545 strains for the following assays. Experiments in tank bioreactor had shown that, the interactions between the substratum, co-substratum and the inhibitor of boxidation had influenced in the amount of formed P3HB/3HAmcl when used the Burkholderia cepacia IPT-048 strains, contributing for the synthesis of 3HV and 3HHx. When used only the soybean oil (5g/L) was gotten an amount of HHx with about 6 mol% with Burkholderia cepacia strains. In this same condition was verified that after some determined period also proved monomer HV in an amount of 0.20 mol%. Adding the acid acrylic (0.18 g/L) were gotten 1.50 mol% of HHx, however, differently of the previous condition the amount of HV varied of 0.91 - 2.77 mol%. A conclusion for the condition soybean oil and acrylic acid is that, the strains is using the acrylic fatty acid as carbon source, or either, the formation of acrylil-CoA with consequent formation of chains with 5 carbons. Similar results had been gotten when analyzed extracted polymer, or either, after the stage of extraction with chloroform was verified that the amount varied of 1.60 - 2.14 mol%. When added to a cosubstratum in the phase of accumulation (caproic fatty acid) and absence of the acrylic acid, it did not have the increase of HHx in relation to the previous variable, as much that, the amount of monomer reached about 0.50 mol%. In this condition, the presence of the acrylic fatty acid also did not contribute for the HV synthesis, not having been observed monomers during the assays. In the following phase, in which we work with Cupriavidus necator and a recombinant (Cupriavidus necator::phaB) strains, was verified that the gotten amount of HHx had been similar, about 0.30 mol%. Our hypothesis, we believe that the increase of the number of copies of the gene phaB could contribute for the increase of the carbon flow in the direction to raise the amount of 3HB how much of other monomers. As in the assays in bottles with agitation substrat caproic and caprylic fatty acids they had been distinguished also when availabled 2g/L and the soybean oil of in a concentration of 5g/L, we analyze the strains recombinant with soybean oil and caprylic fatty acid with 5 g/L. The insistence in the use of the caprylic fatty acid was based on the fact of the possibility of strains to oxidate part of fatty acids for the production of cells and energy and, at the moment that had the nitrogen limitation, to begin the accumulation phase dividing two carbons for the production of acetyl-CoA and the remain of the chain was stored in the form of 3HHx. The caprylic fatty acid disponibility it did not have the monomer attainment, therefore, Cupriavidus necator and Cupriavidus necator::phaB had its replyed inhibited capacity by the substratum. In the added soybean oil bottles with and without the acrylic fatty acid the behavior it was the opposite to the observed with caprylic fatty acid. During the incubation period, for both the strains, the amount of PHA, and consequently, the percentage of 3HB in the dry mass cellular was of 22.95% (100 mol%) and 25.90% (100 mol%) in 28ª and 24ª hours, respectively. In this condition, in the recombinant strains, also was observed the presence of HHx between 32ª and 49ª hour with a maxim amount of 1.10 mol%. From the results it can be concluded that the Burkholderia cepacia is considered a promising strains for the attainment of HHx and HV allowing that soybean oil with and without the acrylic fatty acid, respectively. The increase in the number of copies of the gene phaB in Cupriavidus necator apparently did not contribute with the increase of 3HHx efficiency however, other handling variables will be proposed for confirmation.

This study aims to measure the impact of protein and amino acid fermentation on the composition and metabolic output of gut microbiota. Although dissimilatory pathways have been described for most amino acids, microbial degradation routes within the gut microbiota are relatively unexplored. The objectives were (1) to characterize amino acid breakdown by the colonic microbiota, (2) to determine the fermentation products formed from individual amino acids/protein (3) to examine how amino acid metabolism is impacted by the presence of a fermentable fiber (prebiotic inulin) and finally (4) to evaluate with an in vivo model (trout fish) diet:microbe interactions and the development of gut microbiota during fish farming. Interactions between the healthy human intestinal microbiota of the distal colon and different combinations of nutrients were simulated using in vitro pH-controlled anaerobic batch cultures of human faeces. Combining high-throughput sequencing of 16S rRNA amplicons, with high-throughput 1H NMR, changes in faecal microbiota composition and metabolic output were measured. During exogenous substrate microbial fermentation (e.g. beef, Trp or fish feed) in the large bowel bioactive compounds (harmful or beneficial) are produced. Many factors affect the gut-microbial metabolism including pH, type and quantity of growth substrate (e.g. protein/carbohydrate) and make up of the gut microbiota. Considerable interindividual variation was observed in response to different digested substrates but over all, the beneficial impact of prebiotic fiber fermentation on production of bioactive compounds from amino acids/proteins was confirmed in this study. In trout, although our dietary intervention with essential oils had little impact on the gut microbiota, the study showed for the first time a dramatic shift in the composition and diversity of the gut microbiota in juvenile, compared to adult fish. Thse observations may have relevance in designing dietary strategies to reduce chronic diseases like colon cancer and heard disease and for fish farming respectively.

The ideal approach for the long term treatment of intestinal disorders, such as inflammatory bowel disease (IBD), is represented by a safe and well tolerated therapy able to reduce mucosal inflammation and maintain homeostasis of the intestinal microbiota. A combined therapy with antimicrobial agents, to reduce antigenic load, and immunomodulators, to ameliorate the dysregulated responses, followed by probiotic supplementation has been proposed. Because of the complementary mechanisms of action of antibiotics and probiotics, a combined therapeutic approach would give advantages in terms of enlargement of the antimicrobial spectrum, due to the barrier effect of probiotic bacteria, and limitation of some side effects of traditional chemiotherapy (i.e. indiscriminate decrease of aggressive and protective intestinal bacteria, altered absorption of nutrient elements, allergic and inflammatory reactions). Rifaximin (4-deoxy-4’-methylpyrido[1’,2’-1,2]imidazo[5,4-c]rifamycin SV) is a product of synthesis experiments designed to modify the parent compound, rifamycin, in order to achieve low gastrointestinal absorption while retaining good antibacterial activity. Both experimental and clinical pharmacology clearly show that this compound is a non systemic antibiotic with a broad spectrum of antibacterial action, covering Gram-positive and Gram-negative organisms, both aerobes and anaerobes. Being virtually non absorbed, its bioavailability within the gastrointestinal tract is rather high with intraluminal and faecal drug concentrations that largely exceed the MIC values observed in vitro against a wide range of pathogenic microorganisms. The gastrointestinal tract represents therefore the primary therapeutic target and gastrointestinal infections the main indication. The little value of rifaximin outside the enteric area minimizes both antimicrobial resistance and systemic adverse events. Fermented dairy products enriched with probiotic bacteria have developed into one of the most successful categories of functional foods. Probiotics are defined as “live microorganisms which, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host” (FAO/WHO, 2002), and mainly include Lactobacillus and Bifidobacterium species. Probiotic bacteria exert a direct effect on the intestinal microbiota of the host and contribute to organoleptic, rheological and nutritional properties of food. Administration of pharmaceutical probiotic formula has been associated with therapeutic effects in treatment of diarrhoea, constipation, flatulence, enteropathogens colonization, gastroenteritis, hypercholesterolemia, IBD, such as ulcerative colitis (UC), Crohn’s disease, pouchitis and irritable bowel syndrome. Prerequisites for probiotics are to be effective and safe. The characteristics of an effective probiotic for gastrointestinal tract disorders are tolerance to upper gastrointestinal environment (resistance to digestion by enteric or pancreatic enzymes, gastric acid and bile), adhesion on intestinal surface to lengthen the retention time, ability to prevent the adherence, establishment and/or replication of pathogens, production of antimicrobial substances, degradation of toxic catabolites by bacterial detoxifying enzymatic activities, and modulation of the host immune responses. This study was carried out using a validated three-stage fermentative continuous system and it is aimed to investigate the effect of rifaximin on the colonic microbial flora of a healthy individual, in terms of bacterial composition and production of fermentative metabolic end products. Moreover, this is the first study that investigates in vitro the impact of the simultaneous administration of the antibiotic rifaximin and the probiotic B. lactis BI07 on the intestinal microbiota. Bacterial groups of interest were evaluated using culture-based methods and molecular culture-independent techniques (FISH, PCR-DGGE). Metabolic outputs in terms of SCFA profiles were determined by HPLC analysis. Collected data demonstrated that rifaximin as well as antibiotic and probiotic treatment did not change drastically the intestinal microflora, whereas bacteria belonging to Bifidobacterium and Lactobacillus significantly increase over the course of the treatment, suggesting a spontaneous upsurge of rifaximin resistance. These results are in agreement with a previous study, in which it has been demonstrated that rifaximin administration in patients with UC, affects the host with minor variations of the intestinal microflora, and that the microbiota is restored over a wash-out period. In particular, several Bifidobacterium rifaximin resistant mutants could be isolated during the antibiotic treatment, but they disappeared after the antibiotic suspension. Furthermore, bacteria belonging to Atopobium spp. and E. rectale/Clostridium cluster XIVa increased significantly after rifaximin and probiotic treatment. Atopobium genus and E. rectale/Clostridium cluster XIVa are saccharolytic, butyrate-producing bacteria, and for these characteristics they are widely considered health-promoting microorganisms. The absence of major variations in the intestinal microflora of a healthy individual and the significant increase in probiotic and health-promoting bacteria concentrations support the rationale of the administration of rifaximin as efficacious and non-dysbiosis promoting therapy and suggest the efficacy of an antibiotic/probiotic combined treatment in several gut pathologies, such as IBD. To assess the use of an antibiotic/probiotic combination for clinical management of intestinal disorders, genetic, proteomic and physiologic approaches were employed to elucidate molecular mechanisms determining rifaximin resistance in Bifidobacterium, and the expected interactions occurring in the gut between these bacteria and the drug. The ability of an antimicrobial agent to select resistance is a relevant factor that affects its usefulness and may diminish its useful life. Rifaximin resistance phenotype was easily acquired by all bifidobacteria analyzed [type strains of the most representative intestinal bifidobacterial species (B. infantis, B. breve, B. longum, B. adolescentis and B. bifidum) and three bifidobacteria included in a pharmaceutical probiotic preparation (B. lactis BI07, B. breve BBSF and B. longum BL04)] and persisted for more than 400 bacterial generations in the absence of selective pressure. Exclusion of any reversion phenomenon suggested two hypotheses: (i) stable and immobile genetic elements encode resistance; (ii) the drug moiety does not act as an inducer of the resistance phenotype, but enables selection of resistant mutants. Since point mutations in rpoB have been indicated as representing the principal factor determining rifampicin resistance in E. coli and M. tuberculosis, whether a similar mechanism also occurs in Bifidobacterium was verified. The analysis of a 129 bp rpoB core region of several wild-type and resistant bifidobacteria revealed five different types of miss-sense mutations in codons 513, 516, 522 and 529. Position 529 was a novel mutation site, not previously described, and position 522 appeared interesting for both the double point substitutions and the heterogeneous profile of nucleotide changes. The sequence heterogeneity of codon 522 in Bifidobacterium leads to hypothesize an indirect role of its encoded amino acid in the binding with the rifaximin moiety. These results demonstrated the chromosomal nature of rifaximin resistance in Bifidobacterium, minimizing risk factors for horizontal transmission of resistance elements between intestinal microbial species. Further proteomic and physiologic investigations were carried out using B. lactis BI07, component of a pharmaceutical probiotic preparation, as a model strain. The choice of this strain was determined based on the following elements: (i) B. lactis BI07 is able to survive and persist in the gut; (ii) a proteomic overview of this strain has been recently reported. The involvement of metabolic changes associated with rifaximin resistance was investigated by proteomic analysis performed with two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Comparative proteomic mapping of BI07-wt and BI07-res revealed that most differences in protein expression patterns were genetically encoded rather than induced by antibiotic exposure. In particular, rifaximin resistance phenotype was characterized by increased expression levels of stress proteins. Overexpression of stress proteins was expected, as they represent a common non specific response by bacteria when stimulated by different shock conditions, including exposure to toxic agents like heavy metals, oxidants, acids, bile salts and antibiotics. Also, positive transcription regulators were found to be overexpressed in BI07-res, suggesting that bacteria could activate compensatory mechanisms to assist the transcription process in the presence of RNA polymerase inhibitors. Other differences in expression profiles were related to proteins involved in central metabolism; these modifications suggest metabolic disadvantages of resistant mutants in comparison with sensitive bifidobacteria in the gut environment, without selective pressure, explaining their disappearance from faeces of patients with UC after interruption of antibiotic treatment. The differences observed between BI07-wt e BI07-res proteomic patterns, as well as the high frequency of silent mutations reported for resistant mutants of Bifidobacterium could be the consequences of an increased mutation rate, mechanism which may lead to persistence of resistant bacteria in the population. However, the in vivo disappearance of resistant mutants in absence of selective pressure, allows excluding the upsurge of compensatory mutations without loss of resistance. Furthermore, the proteomic characterization of the resistant phenotype suggests that rifaximin resistance is associated with a reduced bacterial fitness in B. lactis BI07-res, supporting the hypothesis of a biological cost of antibiotic resistance in Bifidobacterium. The hypothesis of rifaximin inactivation by bacterial enzymatic activities was verified by using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Neither chemical modifications nor degradation derivatives of the rifaximin moiety were detected. The exclusion of a biodegradation pattern for the drug was further supported by the quantitative recovery in BI07-res culture fractions of the total rifaximin amount (100 μg/ml) added to the culture medium. To confirm the main role of the mutation on the β chain of RNA polymerase in rifaximin resistance acquisition, transcription activity of crude enzymatic extracts of BI07-res cells was evaluated. Although the inhibition effects of rifaximin on in vitro transcription were definitely higher for BI07-wt than for BI07-res, a partial resistance of the mutated RNA polymerase at rifaximin concentrations > 10 μg/ml was supposed, on the basis of the calculated differences in inhibition percentages between BI07-wt and BI07-res. By considering the resistance of entire BI07-res cells to rifaximin concentrations > 100 μg/ml, supplementary resistance mechanisms may take place in vivo. A barrier for the rifaximin uptake in BI07-res cells was suggested in this study, on the basis of the major portion of the antibiotic found to be bound to the cellular pellet respect to the portion recovered in the cellular lysate. Related to this finding, a resistance mechanism involving changes of membrane permeability was supposed. A previous study supports this hypothesis, demonstrating the involvement of surface properties and permeability in natural resistance to rifampicin in mycobacteria, isolated from cases of human infection, which possessed a rifampicin-susceptible RNA polymerase. To understand the mechanism of membrane barrier, variations in percentage of saturated and unsaturated FAs and their methylation products in BI07-wt and BI07-res membranes were investigated. While saturated FAs confer rigidity to membrane and resistance to stress agents, such as antibiotics, a high level of lipid unsaturation is associated with high fluidity and susceptibility to stresses. Thus, the higher percentage of saturated FAs during the stationary phase of BI07-res could represent a defence mechanism of mutant cells to prevent the antibiotic uptake. Furthermore, the increase of CFAs such as dihydrosterculic acid during the stationary phase of BI07-res suggests that this CFA could be more suitable than its isomer lactobacillic acid to interact with and prevent the penetration of exogenous molecules including rifaximin. Finally, the impact of rifaximin on immune regulatory functions of the gut was evaluated. It has been suggested a potential anti-inflammatory effect of rifaximin, with reduced secretion of IFN-γ in a rodent model of colitis. Analogously, it has been reported a significant decrease in IL-8, MCP-1, MCP-3 e IL-10 levels in patients affected by pouchitis, treated with a combined therapy of rifaximin and ciprofloxacin. Since rifaximin enables in vivo and in vitro selection of Bifidobacterium resistant mutants with high frequency, the immunomodulation activities of rifaximin associated with a B. lactis resistant mutant were also taken into account. Data obtained from PBMC stimulation experiments suggest the following conclusions: (i) rifaximin does not exert any effect on production of IL-1β, IL-6 and IL-10, whereas it weakly stimulates production of TNF-α; (ii) B. lactis appears as a good inducer of IL-1β, IL-6 and TNF-α; (iii) combination of BI07-res and rifaximin exhibits a lower stimulation effect than BI07-res alone, especially for IL-6. These results confirm the potential anti-inflammatory effect of rifaximin, and are in agreement with several studies that report a transient pro-inflammatory response associated with probiotic administration. The understanding of the molecular factors determining rifaximin resistance in the genus Bifidobacterium assumes an applicative significance at pharmaceutical and medical level, as it represents the scientific basis to justify the simultaneous use of the antibiotic rifaximin and probiotic bifidobacteria in the clinical treatment of intestinal disorders.

Age-related physiological changes in the gastrointestinal tract, as well as modification in lifestyle, nutritional behaviour, and functionality of the host immune system, inevitably affect the gut microbiota. The study presented here is focused on the application and comparison of two different microarray approaches for the characterization of the human gut microbiota, the HITChip and the HTF-Microb.Array, with particular attention to the effects of the aging process on the composition of this ecosystem. By using the Human Intestinal Tract Chip (HITChip), recently developed at the Wageningen University, The Netherland, we explored the age-related changes of gut microbiota during the whole adult lifespan, from young adults, through elderly to centenarians. We observed that the microbial composition and diversity of the gut ecosystem of young adults and seventy-years old people is highly similar but differs significantly from that of the centenarians. After 100 years of symbiotic association with the human host, the microbiota is characterized by a rearrangement in the Firmicutes population and an enrichment of facultative anaerobes. The presence of such a compromised microbiota in the centenarians is associated with an increased inflammation status, also known as inflamm-aging, as determined by a range of peripheral blood inflammatory markers. In parallel, we overtook the development of our own phylogenetic microarray with a lower number of targets, aiming the description of the human gut microbiota structure at high taxonomic level. The resulting chip was called High Taxonomic level Fingerprinting Microbiota Array (HTF-Microb.Array), and was based on the Ligase Detection Reaction (LDR) technology, which allowed us to develop a fast and sensitive tool for the fingerprint of the human gut microbiota in terms of presence/absence of the principal groups. The validation on artificial DNA mixes, as well as the pilot study involving eight healthy young adults, demonstrated that the HTF-Microb.Array can be used to successfully characterize the human gut microbiota, allowing us to obtain results which are in approximate accordance with the most recent characterizations. Conversely, the evaluation of the relative abundance of the target groups on the bases of the relative fluorescence intensity probes response still has some hindrances, as demonstrated by comparing the HTF.Microb.Array and HITChip high taxonomic level fingerprints of the same centenarians.

Realizou-se um estudo do processo descontínuo alimentado de fermentação, buscando encontrar as melhores condições de produção do ácido graxo gama-linolênico. Empregou-se como fonte de nitrogênio no meio de fermentação a uréia, que foi adicionada de forma exponencialmente crescente e como inóculo usou-se uma cepa de Spirulina platensis. Utilizou-se planejamento experimental e aplicou-se a metodologia de superfície de resposta, o qual permitiu a obtenção de equações que relacionaram as variáveis dependentes, como produtividade em células, conversão de nitrogênio em células, concentração máxima atingida de biomassa, porcentagem relativa de produção de ácido graxo gama-linolênico. com as variáveis independentes tempo de alimentação (Ta) e massa total de uréia adicionada (MUT). Os melhores resultados obtidos foram os seguintes: Px=117,26 mg/L.dia; Yx/n= 4,9; Xmax= 1759 mg/L e porcentagem de ácido graxo &#947;-linolênico na fração lipídica de 23,5 %, com 14 dias (Ta) e 1750 mg (MUT).<br>A Study on the fed-batch fermentation process was made seeking for the best Gamma-linolenic production condition. Mineral media was employed with urea as nitrogen source that was add with exponentially increasing feeding rates and Spirulina platensis as inoculum. Experimental design and a Response Surface Methodology were applied. It was composed by an experimental design which allowed a reduced number of the experiments and by the analysis of the results using equations which combined the interest variables dependent as: Productivity, best Gamma-linolenic production condition, Nitrogen convertion in Biomass, Highest Concentration and the study variables independent (Ta-feeding time and add urea-MUT). The best results were with (Ta-feeding time=14 days; add urea-MUT=1750 mg). In this conditions we had: Productivity=117,26 mg/L.day Best Gamma-linolenic production condition=23,5 per cent Nitrogen convertion in Biomass=4,9 Biggest Concentration.=1759 mg/L.

Orientador: Lara Durães Sette<br>Banca: Maria Aparecida Marin Morales<br>Banca: Carlos Renato Corso<br>Banca: Valeria Maia de Oliveira<br>Banca: Vera Maria Valle Vitali<br>Resumo: Considerando a importância dos processos de biorremediação, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial de consórcios microbianos, constituídos por quatro fungos filamentosos isolados de invertebrados marinhos e duas bactérias recuperadas de reservatório de petróleo, na destoxificação de poluentes ambientais, por meio da sobrevivência do microcrustáceo Artemia sp. e da luminescência da bactéria Vibrio fischeri. Após estudos de antagonismo entre os micro-organismos, foram estruturados oito consórcios microbianos, em diferentes combinações. Os consórcios foram usados, isoladamente, para avaliar a toxicidade dos poluentes ambientais corante têxtil RBBR (Remazol Brilliant Blue R), óleo diesel e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Dentre os consórcios estudados, o consórcio 3, composto por dois fungos filamentosos e pelas duas bactérias, apresentou melhores resultados de destoxificação do corante RBBR e óleo diesel, após sete dias de cultivo a 28 oC e 140 rpm. As enzimas ligninolíticas apresentaram atividade baixa ou ausente no teste feito com o corante e com o óleo diesel. Para o benzo[a]pireno (BaP), apesar de ter havido uma produção mais expressiva de enzimas ligninolíticas, os resultados de destoxificação foram incoerentes, por não apresentar toxicidade mesmo em elevadas concentrações. Sendo assim, no presente estudo o consórcio 3 foi empregado na otimização da destoxificação e descoloração do corante RBBR. Os resultados de dois planejamentos do tipo Plackett-Burman (PB1 e PB2) e um DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional) revelaram que as melhores condições de destoxificação/descoloração foram obtidas no ensaio 11 do PB1 e no ensaio 2 do PB2. As condições de cultivo desses dois ensaios foram submetidas a experimentos de validação, porém ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico)<br>Abstract: Taking into account the relevance of bioremediation processes, the present work aimed to evaluate the potential of microbial consortia composed by four filamentous fungi isolated from marine invertebrates and two bacteria recovered from oil reservoirs in the detoxification of environmental pollutants, through the survival of the microcrustacean Artemia sp. and the luminescence of the bacterium Vibrio fischeri. After studies of antagonism between the microorganisms, eight microbial consortia were structured in different combinations. The consortia were tested separately against the environmental pollutants RBBR (Remazol Brilliant Blue R) textile dye, diesel oil, and polycyclic aromatic hydrocarbons. Among the consortia studied, the consortium 3, composed of two filamentous fungi and two bacteria presented better results of RBBR dye and diesel detoxification after seven days at 28 oC and 140 rpm. Ligninolytic enzymes showed low or absent activity in the experiments containing RBBR and diesel. For benzo[a]pyrene (BaP), although there was a more expressive production of ligninolytic enzymes, the results of detoxification were incoherent, since no toxicity was showed even at high concentrations. Therefore, in the present study the consortium 3 was used to optimize detoxification and discoloration of RBBR dye. Results from two Plackett-Burman designs (PB1 and PB2) and one CCD (Central Composite Design) revealed that the best conditions for detoxification/ discoloration were obtained in the assay 11 from PB1 and assay 2 from PB2. The culture conditions of this two assays were submitted to validation experiments, however only assay 2 from PB2 (4 cylinders (0.5 cm) of each fungus, and 4 mL of each bacteria (OD 0.4), 1 g/50 mL wheat bran, 100 % artificial sea water, pH 8, and 500 ppm RBBR) presented ... (Complete abstract click electronic access below)<br>Doutor

Mestrado em Biotecnologia<br>Nas últimas décadas tem ocorrido um declínio extensivo das espécies de Quercus sp. ao longo da Europa Central e Bacia do Mediterrâneo, induzida por uma série de fatores bióticos e abióticos. De forma a compreender qual o impacto do estado fitossanitário da espécie Quercus suber na população dos microrganismos do solo, foi efetuada a caraterização e comparação do microbioma do solo de sobreiros saudáveis e doentes. Para isso, o DNA total da comunidade microbiana de dezasseis amostras de solo, provenientes de sobreiros saudáveis e sobreiros decrépitos, foi extraído e as sequências dos genes do rRNA 16S (bactérias) e do “Internal Transcribed Spacer II” (fungos) foram amplificadas por PCR. Inicialmente foi utilizada a DGGE como abordagem preliminar para comparação e agrupamento das amostras. De seguida, as amostras selecionadas foram sequenciadas na plataforma 454 da Life Sciences (Roche) de forma a detalhar a estrutura e composição do microbioma associado a cada estádio de saúde do sobreiro, assim como comparar as populações de microrganismos presentes nestas duas condições. Os resultados revelaram que ambas as comunidades microbianas apresentavam uma elevada diversidade de espécies, verificando-se nas comunidades bacterianas e fúngicas uma predominância dos filos Proteobacteria e Basidiomycota, respetivamente. Na análise funcional do grupo dos fungos foram detetadas várias espécies de cogumelos, ectomicorrizas, fungos saprófitas e produtores de antibióticos, e nas bactérias verificou-se a presença de microrganismos que participam no ciclo do azoto, produtoras de antibióticos, produtoras de ácido láctico e promotoras do crescimento das plantas. Na comparação do microbioma do solo de árvores saudáveis e decrépitas não foram observadas diferenças significativas para os dois grupos de microrganismos. Desta forma foi demonstrado que os exsudatos libertados pelas raízes não alteram significativamente a composição das comunidades microbianas presentes no solo livre de raízes. No entanto, este trabalho possibilitou um avanço na compreensão da estrutura e composição das comunidades microbianas do solo de sobreiros, permitindo desta forma a caraterização global dos microrganismos presentes no solo do montado.<br>In recent decades there has been an extensive decay of Quercus sp. in Central Europe and the Mediterranean Basin induced by a complex series of biotic and abiotic factors. In order to understand the impact of Quercus suber health state in soil microbiome, a characterization and comparison of soil from healthy and diseased cork oak trees was performed. For this, total DNA of the microbial community of sixteen soil samples from healthy and decrepit cork oaks was extracted and the 16S rRNA genes (bacteria) and "Internal Transcribed Spacer II" (fungi) were amplified by PCR. Initially DGGE was used as a preliminary approach for comparing and clustering samples. The selected samples were sequenced on the 454 platform of the Life Sciences (Roche) to detail the structure and composition of the microbiome associated with each health stage of the cork oak, so as to compare the populations of microorganisms present in these two conditions. The results demonstrated a high diversity of species for both microbial communities, revealing a predominance of the Proteobacteria and Basidiomycota phyla for bacterial and fungal communities, respectively. After functional analysis, in the fungi group, species of mushrooms, ectomycorrhizae, saprophytic and antibiotic-producing fungi were detected and in the bacteria group, microorganisms that participate in the nitrogen cycle, antibiotic producing, lactic acid producing and plant-growth promoting bacteria were found. There were no significant differences between soil microbiome of healthy and diseased trees in the two microorganism groups. It was thus demonstrated that exudates released by the roots do not modify significantly the microbial composition present in the bulk soil. However this work has enabled a breakthrough in understanding the structure and composition of microbial communities in cork oaks soil, allowing a comprehensive characterization of soil microorganisms in the “montados”.

El objetivo de este estudio fue obtener lactobacilos nativos productores de exopolisacàridos de interés biotecnológico, que tengan una potencial utilidad en las diferentes industrias como bioespesantes naturales mejorando así las propiedades reológicas de los productos. Para lograr este objetivo se tomaron 30 muestras de alimentos fermentados y de fuentes naturales nativas obteniéndose 15 aislados productores de exopolisacáridos (EPS), luego se seleciono 5 aislados que produjeron la mayor cantidad de EPS. A los aislados seleccionados se les sometió a crecer a diferentes parámetros fisicoquímicos como: temperatura, pH y fuente de carbono, encontrándose que en algunos casos las condiciones óptimas de producción diferían de las de crecimiento. Asimismo los aislados fueron identificados por los métodos fenotípicos y bioquímicos tradicionales y por la prueba molecular denominada reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos para el espaciador intergénico entre los genes ribosómicos 16S y 23S. Del estudio se obtuvo que la cepa Q5-3 identificada como Lactobacillus plantarum, produjo 1.535 g/L de EPS y presento la mejor producción de EPS con glucosa a pH 5.5 y 30°C. La obtención de una cepa de Lactobacillus plantarum productora de EPS es un aporte valioso ya que le da un valor agregado a las distintas propiedades ya conocidas de este microorganismo tan utilizado en la industria alimentaria. -- Palabras clave: Bacterias Ácido Lácticas, lactobacilos, espaciador intergénico16S-23S, exopolisacárido.<br>-- The purpose of the present study was to obtain some original lactobacillus from Perú which had be producers of exopolysaccharide of biotechnology importance with a potential utility to industry as natural biothikeners, improving the rheological properties of the products. To achive this purpose, 30 samples were taken from fermented foods and native nature source, obtaining 15 isolated producers of exopolysaccharide (EPS). Then, 5 isolated were selected because they produced the higher quantity of EPS. All isolated selected were grown to several condition such as temperature, pH and source of carbone. It was found that in some cases the optimus condition of production was different from growth. The isolated were identified by biochemistry and phenotypic traditional methods. In addition, molecular tools as PCR (polimerase chain reaction) were also used to identify the isolated. It was found that the Q5-3 strain, identifying as Lactobacillus plantarum, produced 1.535 g/L of EPS. This strain had the best production of EPS (with glucose) as pH 5.5 and 30°C. The discovery of the Lactobacillus plantarum producer strain of EPS is an important contribution because it provides an addition value to this well-known microorganism. -- Key words: lactic acid bacteria, lactobacilli, intergenic spacer 16S-23S, exopolysaccharides.<br>Tesis

Orientador: Lucia Maria Carareto Alves<br>Banca: Suzan Pantaroto de Vasconcellos<br>Banca: Celso Antonio Jardim<br>Banca: Marita Vedovelli Cardozo<br>Banca: Everlon Cid Rigobelo<br>Resumo: Consórcios de bactérias se constituem em comunidades microbianas que podem possuir um conjunto de diferentes vias metabólicas que podem mediar a degradação das diferentes moléculas. Além disso, esses consórcios de micro- organismos podem fornecer enzimas com grande utilidade em processos biotecnológicos aplicados a indústria. Estas enzimas estão sendo amplamente aplicadas em diversos setores da indústria, devido às vantagens como especificidade das enzimas catalizadoras, o baixo custo e, a facilidade de sua produção em larga escala, não produzir efeitos tóxicos nem gerar resíduos tóxicos ao ambiente. Levando em consideração o potencial dos consórcios microbianos e as vantagens das enzimas microbianas em processos biotecnológicos, esse trabalho teve como objetivo a aplicação de bactérias isoladas dos consórcios, em diversos processos biotecnológicos e agroindústriais. Foram utilizados dois consórcios para o isolamento dos micro-organismos provenientes de solo com alta taxa de degradação de biomassa. Os consórcios foram cultivados em bagaço de cana-de-açúcar e carboximetilcelulose (CMC), assim como em outros resíduos da agroindustria como palha de milho, casca de amendoim, originando desta forma outras comunidades as quais foram utilizadas no isolamento de bactérias. Foram estudados dois isolados bacterianos produtores de exopolissacarídeos (EPS), a caracterização destes EPS e aplicação deles em biorremediação ou como agente antibiofilme. Além de serem isoladas bactérias produt... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: Bacteria consortia have different microbial communities, which may possess a set of different metabolic pathways that can mediate the degradation of different molecules. In addition, these consortia of microorganisms can provide enzymes with great utility in biotechnological processes applied to industry. These enzymes are being widely applied in various industry sectors, due to the advantages such as the specificity of the catalytic enzymes, the low cost, the ease of its large scale production, and because they do not produce toxic effects nor generate toxic waste to the environment. Taking into account the potential of microbial consortia and the advantages of microbial enzymes in biotechnological processes this study aimed to apply bacteria isolated from the consortia in various biotechnological and agribusiness processes. Two consortia were used to isolate microorganisms isolated from soil with high rate of biomass degradation. The consortia were cultivated in sugarcane bagasse and carboxymethyl cellulose (CMC), as well as other agribusiness residues such as maize straw and peanut shells, thus originating other communities that were used for the isolation of bacteria. The characterization of two bacterial isolates producing exopolysaccharides (EPS), the characterization of these EPS and the application in bioremediation or as an anti biofilm agent were carried out. In addition to being isolated producing-proteases bacteria, it is an enzyme widely used in industry. A scree... (Complete abstract click electronic access below)<br>Doutor

Los sistemas modernos de formulación de raciones para el ganado vacuno se basan en los conceptos de proteína digestible y el aporte de aa al intestino delgado del rumiante. De la calidad total de proteína sintetizada en el rumen y que llega al intestino delgado del rumiante, una proporción importante, aunque variable, corresponde a la proteína microbiana, la cual proviene, fundamentalmente, de las bacterias. Aunque la mayor parte de las bacterias están unidas a la parte solida B(AS), en la mayoría de los estudios realizados se utilizan muestras de bacterias obtenidas de la fracción líquida del contenido ruminal (BAL). Existe información en la literatura que indica la diferencia en la composición quimica entre BAL y BAS, las cuales pueden estar relacionadas con importantes errores en la predicción del flujo de proteína y aa de origen microbiano. Otro factor importante que se debe tomar en cuenta se relaciona con la dieta (forraje:concentrado, nivel de fibra, tamaño de partícula, consumo de alimento…etc.) ya que pueden afectar la fermentación y el metabolismo proteico y con ello disminuir el aporte parcial de BAL y BAS y con ello el flujo de proteína o aa de origen microbiano. De igual forma, el flujo de BAL y BAS se ve alterada por los cambios producidos a nivel ruminal debido a variaciones en la dieta o en el tiempo de alimentación (pH, tasa de dilución). El estudio de los problemas antes mencionados in vivo es complicado, ya que la fermentación puede confundir la interpretación de los resultados. Existen diversos sistemas in vitro que nos ofrecen la oportunidad de estudiar cada uno de los factores de forma aislada. El objetivo del presente estudio, fue evaluar los diferentes métodos de digestibilidad y condiciones de fermentación, así como, el flujo de nutrientes y el perfil y flujo de aa de origen microbiano utilizando la excreción de derivados púricos (DP).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-15Bitstream added on 2014-06-13T18:44:34Z : No. of bitstreams: 1 dayoowoyemi_i_dr_rcla.pdf: 2213436 bytes, checksum: 57ef54bb4924dae1b326ff6c146c0802 (MD5)<br>Atualmente, existe um crescente interesse em explorar diversos habitats, a fim de revelar a biodiversidade microbiana, incluindo as leveduras. Tal diversidade ainda não acessada guarda a descoberta de novas espécies para ciência, provavelmente muitas das quais com potencial para aproveitamento em processos biotecnológicos. Com o objetivo de explorar e conservar a diversidade de fungos, o Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM – UNESP) mantém em seu acervo várias estirpes de leveduras isoladas de ecossistemas diversos, sendo alguns deles pouco explorados. No início deste trabalho sabíamos que muitas das leveduras depositadas no acervo do CRM – UNESP não estavam totalmente caracterizadas tanto em nível taxonômico, quanto em relação ao potencial biotecnológico que poderiam apresentar. Portanto, o presente estudo foi desenhado para caracterizar e identificar taxonomicamente leveduras depositadas no CRM – UNESP, bem como selecionar estirpes que produzem enzimas extracelulares degradadoras de polissacarídeos como amilase, celulase, xilanase, pectinase e ligninase. Usando uma abordagem polifásica, um total de 340 isolados de leveduras foi identificado, sendo que 71,2% compreendem 43 taxa de ascomicetos e os restantes 28,8% foram classificados em 27 taxa de basidiomicetos. O estudo também levou à descoberta de 8 prováveis novas espécies. Baseado nesta constatação, a classificação taxonômica e análise filogenética foi realizada para duas espécies anamórficas de ascomicetos e uma espécie teleomórfica de basidiomiceto. A descrição destas três espécies é apresentada neste estudo. Os resultados demonstraram que Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT e W. pindamonhangabaensis H10YT pertencem à clade Wickerhamiella da ordem Saccharomycetales...<br>In recent time, there has been an increasing interest in exploring diverse ecological habitats in order to reveal the yeast biodiversity. The increased awareness in the biotechnological potentials of yeasts has also spurred attempts to search for new species with novel biotechnological capabilities. Aiming to explore and conserve the fungal diversity from various ecosystems, the UNESP – Central for Microbial Resources (UNESP – CMR) harbors various strains of ecologically diverse yeasts isolates, some of which were yet to be identified. Therefore, this study was designed to identify and characterize some yeasts from the UNESP – MRC and to select strains possessing extracellular plant polysaccharide degrading enzymes namely amylase, cellulase, xylanase, pectinase and ligninase. Using a polyphasic approach, a total of 340 strains were identified. Taxonomic classification grouped 71.2% of these isolates into 43 ascomycetous taxa while the remaining 28.8% were classified in 27 basidiomycetous taxa. The study also led to the discovery of 8 putative new species. As a result, we classified two anamorphic species in the Ascomycota and one teleomorphic species in the Basidiomycota. In this study we provide the description of both species. Our results demonstrated that the two ascomycetous species proposed as Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT and W. pindamonhangabaensis H10YT belong to the Wickerhamiella clade of the Saccharomycetales (Saccharomycetes) while the basidiomycetous species proposed as Bulleromyces texanaensis ATT064T belong to the Bulleromyces / Papiliotrema / Auriculibuller clade of the Tremellales (Agaricomycotina). In order to show the significance of intraspecific diversity in yeasts, in one of our studies, we subjected 11 strains, (including the type strain CBS 8960T) of Hannaella kunmingensis... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Fernando Carlos Pagnocca<br>Coorientador: André Rodrigues<br>Banca: Lara Durães Sette<br>Banca: Vanderlei Gerlado Martins<br>Banca: Paula Benevides de Morais<br>Banca: Aline Silva<br>Resumo: Atualmente, existe um crescente interesse em explorar diversos habitats, a fim de revelar a biodiversidade microbiana, incluindo as leveduras. Tal diversidade ainda não acessada guarda a descoberta de novas espécies para ciência, provavelmente muitas das quais com potencial para aproveitamento em processos biotecnológicos. Com o objetivo de explorar e conservar a diversidade de fungos, o Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM - UNESP) mantém em seu acervo várias estirpes de leveduras isoladas de ecossistemas diversos, sendo alguns deles pouco explorados. No início deste trabalho sabíamos que muitas das leveduras depositadas no acervo do CRM - UNESP não estavam totalmente caracterizadas tanto em nível taxonômico, quanto em relação ao potencial biotecnológico que poderiam apresentar. Portanto, o presente estudo foi desenhado para caracterizar e identificar taxonomicamente leveduras depositadas no CRM - UNESP, bem como selecionar estirpes que produzem enzimas extracelulares degradadoras de polissacarídeos como amilase, celulase, xilanase, pectinase e ligninase. Usando uma abordagem polifásica, um total de 340 isolados de leveduras foi identificado, sendo que 71,2% compreendem 43 taxa de ascomicetos e os restantes 28,8% foram classificados em 27 taxa de basidiomicetos. O estudo também levou à descoberta de 8 prováveis novas espécies. Baseado nesta constatação, a classificação taxonômica e análise filogenética foi realizada para duas espécies anamórficas de ascomicetos e uma espécie teleomórfica de basidiomiceto. A descrição destas três espécies é apresentada neste estudo. Os resultados demonstraram que Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT e W. pindamonhangabaensis H10YT pertencem à clade Wickerhamiella da ordem Saccharomycetales... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)<br>Abstract: In recent time, there has been an increasing interest in exploring diverse ecological habitats in order to reveal the yeast biodiversity. The increased awareness in the biotechnological potentials of yeasts has also spurred attempts to search for new species with novel biotechnological capabilities. Aiming to explore and conserve the fungal diversity from various ecosystems, the UNESP - Central for Microbial Resources (UNESP - CMR) harbors various strains of ecologically diverse yeasts isolates, some of which were yet to be identified. Therefore, this study was designed to identify and characterize some yeasts from the UNESP - MRC and to select strains possessing extracellular plant polysaccharide degrading enzymes namely amylase, cellulase, xylanase, pectinase and ligninase. Using a polyphasic approach, a total of 340 strains were identified. Taxonomic classification grouped 71.2% of these isolates into 43 ascomycetous taxa while the remaining 28.8% were classified in 27 basidiomycetous taxa. The study also led to the discovery of 8 putative new species. As a result, we classified two anamorphic species in the Ascomycota and one teleomorphic species in the Basidiomycota. In this study we provide the description of both species. Our results demonstrated that the two ascomycetous species proposed as Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT and W. pindamonhangabaensis H10YT belong to the Wickerhamiella clade of the Saccharomycetales (Saccharomycetes) while the basidiomycetous species proposed as Bulleromyces texanaensis ATT064T belong to the Bulleromyces / Papiliotrema / Auriculibuller clade of the Tremellales (Agaricomycotina). In order to show the significance of intraspecific diversity in yeasts, in one of our studies, we subjected 11 strains, (including the type strain CBS 8960T) of Hannaella kunmingensis... (Complete abstract click electronic access below)<br>Mestre

Marine sediments are the main accumulation reservoir of organic recalcitrant pollutants such as polychlorinated biphenyls (PCBs). In the anoxic conditions typical of these sediments, anaerobic bacteria of the phylum Chloroflexi are able to attack these compounds in a process called microbial reductive dechlorination. Such activity and members of this phylum were detected in PCB-impacted sediments of the Venice Lagoon. The aim of this work was to investigate microbial reductive dechlorination and design bioremediation approaches for marine sediments of the area. Three out of six sediment cultures from different sampling areas exhibited dechlorination activities in the same conditions of the site and two phylotypes (VLD-1 and VLD-2) were detected and correlated to this metabolism. Biostimulation was tested on enriched dechlorinating sediment cultures from the same site using five different electron donors, of which lactate was the best biostimulating agent; complementation of microbial and chemical dechlorination catalyzed by biogenic zerovalent Pd nanoparticles was not effective due to sulfide poisoning of the catalyst. A new biosurfactant-producing strain of Shewanella frigidimarina was concomitantly obtained from hydrocarbon-degrading marine cultures and selected because of the low toxicity of its product. All these findings were then exploited to develop bioremediation lab-scale tests in shaken reactors and static microcosms on real sediments and water of the Venice lagoon, testing i) a bioaugmentation approach, with a selected enriched sediment culture from the same area, ii) a biostimulation approach with lactate as electron donor, iii) a bioavailability enhancement with the supplementation of the newly-discovered biosurfactant, and iv) all possible combinations of the afore-mentioned approaches. The best bioremediation approach resulted to be a combination of bioaugmentation and bioremediation and it could be a starting point to design bioremediation process for actual marine sediments of the Venice Lagoon area.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental<br>Os polihidroxialcanoatos são poliésteres biodegradáveis produzidos por inúmeros organismos. Possuem características muito semelhantes às dos plásticos, apresentando-se como um possível substituto dos mesmos. Os PHAs são produzidos na forma de corpos de inclusão, sendo necessária a sua extração. Os surfactantes são compostos tensioativos capazes de extrair os PHAs, através da sua incorporação, e consequente saturação, nas membranas bacterianas, auxiliando na sua lise. Neste trabalho começou-se por testar a eficácia de uma variedade de surfactantes, e alguns líquidos iónicos, na extração de PHA de culturas mistas. O Tween 20 destacou-se dos restantes visto praticamente não apresentar acumulação de surfactante na amostra de PHA, tendo igualmente sido responsável pelo isolamento e análise do mesmo, de forma eficiente. Com este composto realizaram-se testes onde se variaram a quantidade de biomassa, a concentração de surfactante e o tempo de digestão. Quanto às concentrações de surfactante utilizadas, 50mM, 150mM, 250mM, 400mM e 500mM, os melhores rendimentos de extração (56-61%) foram conseguidos com menores concentrações de surfactante (50mM e 150mM). Com os tempos de digestão (2h, 4h, 6h, 8h e 14h) e com a quantidade de biomassa (0.3g e 0.8g), verificou-se que com quantidades e tempos mais reduzidos (4h e 0.3g) foi possível obter melhores ou semelhantes resultados aos obtidos com valores superiores de tempo e biomassa. O clorofórmio foi substituído pelo dimetil carbonato no passo de purificação, reduzindo bastante a toxicidade do processo. Foi também elaborada uma extração utilizando apenas digestão com surfactante, sem purificação, atingindo-se um rendimento de 16.17%. Para além dos semelhantes resultados obtidos neste trabalho, um novo processo foi testado e redesenhado para a extração de PHAs em culturas mistas, verificando-se até aqui uma redução dos custos e da toxidade do processo, com a possibilidade de remover totalmente o passo de solubilização do polímero num solvente orgânico.<br>Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biodegradable polyesters produced by a variety of organisms. Their characteristics are very similar to those found on plastics, making them a viable replacement for this important product. Inside cells, PHA are produced under the form of inclusion bodies, and its extraction is required. Surfactants are compounds able to carry out PHA extraction by incorporating, and consequently saturating, the bacterial membrane, facilitating the lysis process. In this thesis, we begun by testing the extraction efficiency of a screening of surfactants, and some ionic liquids, on mixed cultures. Tween 20 stood out from the rest, as the PHA biofilm obtained was free from any surfactant and was possible to isolate and analyse the polymer efficiently. Using Tween 20 as extractive agent, more tests were carried out, where the amount of biomass, concentration of surfactant, and time of digestion were studied. As for the surfactant concentrations 50mM, 150mM, 250mM, 400mM e 500Mm, better extraction yields (56-61%) were achieved with lower concentrations (50mM and 150mM). As for digestion times (2h, 4h, 6h, 8h and 14h) and biomass quantity (0.3g and 0.8g), it was verified that with lower values and times (4h and 0.3g), results obtained were very similar, or better, than those obtained with overnight digestion and 0.8g of biomass. Chloroform was replaced by dimethyl carbonate, greatly reducing the process toxicity in the purification step. An extraction using solely surfactant digestion, without a purification step, was also performed, achieving an extraction yield of 16.17%. In addition to the similar yields obtained in this work, a new process was tested, and later redesigned, for PHA extraction in mixed cultures, with a reduction of costs and toxicity of the process, and with the future possibility of completely removing the step based on the solubilization and isolation of the polymer in an organic solvent.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-10T20:24:13Z No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T20:41:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T20:46:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2015-07-10T20:46:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Simone Maria Costa de Oliveira Moreira.pdf: 1289049 bytes, checksum: 9344c925a8f9e3e24da8a85c9fd2b648 (MD5) Previous issue date: 2012-09-03<br>CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico<br>Interest in the use of entomopathogenic microorganisms in agriculture have increased significantly in recent years, faced with problems of inadequate use of pesticides, the accumulation of waste on the environment and ecological imbalances. Currently, the research institutions are concerned to identify a greater number of microorganisms with potential use in biological control of pests that are adapted to the local ecosystem. On economic issues, has increased the demand for technologies that contribute to sustainable agriculture and in response, microbial control, more precisely with entomopathogenic fungi is a promising alternative. Cacao is the main crop of the Trans Territory and Xingu, Pará, and the municipality of Medicilândia the largest Brazilian producer. The coffee is a crop that had great expression in the region, especially Coffea canephora cv. Conilon, and has the potential to become important culture due to availability of culturable areas. In this context, the study aimed to identify naturally occurring entomopathogenic fungi that could be used in biocontrol of insect pests of cultivated plants, seeking the lowest imbalance to the environment. The specific objectives aimed to: i) collect, isolate, identify and characterize the occurrence of entomopathogenic fungi in insect pest of coffee and cocoa, ii) evaluate the effectiveness of microbial agents identified as the pathogenicity and virulence under controlled conditions and iii) testing the production of chitinase enzymes, pectinases, amylases, cellulases and lipases in the isolates obtained and identify them by molecular and classical methods. The work began with several hits on pastures, barns and crops of cocoa and coffee in the municipalities of Altamira, Brazil and New Medicilândia. The parasitized insects were coffee borers (H. hampei) one insect of the order Hemiptera, unidentified, and M. annulipes (monalônio) in cocoa, all colonized by fungi. Where were found parasitized insects, soil was collected for possible identification of entomopathogenic isolates, except where it was found monalônio. We found 14 isolates of fungi colonizing insects, being the main species Verticillium spp., Penicillium citrinum, Hiphopichia burtonii and Fusarium sp. and soil Rhinocladiella sp., Cladosporium sphaerospermum, Verticillium sp. and Pseudallescheria boydii. The analysis of enzymatic activity observed that soil isolates showed the largest degradation of substrates. In bioassay performed against coffee berry borer, with 7 isolates, which have shown highest mortality two H. burtonii, and Icaf 5 were the most pathogenic. Monalônio against the isolated Fusarium sp, colonized 96% of the insects in the ten-day trial. Thus, it is considered that the strains showed significant potential to be introduced in biocontrol programs, with prospects promising results for microbial control of insect pests and enzyme activity.<br>O interesse pelo uso de microrganismos entomopatogênicos na agricultura vêm aumentando significativamente nos últimos anos, diante dos problemas inerentes à inadequada utilização de agrotóxicos, pelo acúmulo de resíduos no ambiente e desequilíbrios ecológicos. Atualmente, as instituições de pesquisa estão preocupadas em identificar um maior número de microrganismos com potencial de utilização no controle biológico de pragas que sejam adaptados ao ecossistema local. Por questões econômicas, tem aumentado a procura por tecnologias que contribuam para uma agricultura sustentável e como resposta, o controle microbiano, mais precisamente com fungos entomopatogênicos é uma alternativa promissora. O cacaueiro é a principal cultura do Território da Transamazônica e Xingu, Pará, sendo o município de Medicilândia o maior produtor brasileiro. O cafeeiro é uma cultura que teve grande expressão na região, especialmente Coffea canephora cv. Conilon, e apresenta potencial para se tornar grande cultura devido a disponibilidade de áreas. Neste contexto, o trabalho teve como objetivo a identificação de fungos entomopatogênicos de ocorrência natural que poderão ser utilizados no biocontrole de insetos-praga de plantas cultivadas, visando o menor desequilíbrio ao meio ambiente. Como objetivos específicos propôs-se a: i) coletar, isolar, identificar e caracterizar fungos entomopatogênicos de ocorrência em insetos-praga das culturas do cafeeiro e cacaueiro; ii) avaliar a eficácia de agentes microbianos identificados quanto à patogenicidade e virulência em condições controladas e; iii) testar a produção de enzimas quitinases, pectinases, amilases, celulases e lipases nos isolados obtidos e identificá-los por métodos clássico e molecular. O trabalho teve inicio com várias visitas em áreas de pastagens, capoeiras e lavouras de cacaueiros e cafeeiros nos municípios de Altamira, Brasil Novo e Medicilândia. Os insetos parasitados encontrados foram brocas-do-café (Hypothenemus hampei), no cafeeiro, um inseto da ordem Hemiptera, não identificado, e monalonium (Monalonium annulipes), no cacaueiro, todos colonizados por fungos. Nos locais onde foram encontrados os insetos parasitados, coletou-se solos para possível identificação de isolados entomopatogênicos, exceto onde foi encontrado o monalônio. Foram encontrados 14 isolados de fungos colonizando insetos, sendo as principais espécies Verticillium spp., Penicillium citrinum, Hiphopichia burtonii e Fusarium sp. e no solo Rhinocladiella sp., Cladosporium sphaerospermum, Verticillium sp. e Pseudallescheria boydii. Na análise da atividade enzimática observou-se que os isolados do solo apresentaram as maiores degradações dos substratos testados. No bioensaio realizado contra broca-do-café, com 7 isolados, os que apresntaram maior índice de mortalidade foram H. burtonii, e Icaf 5, com 96, 94 e 62%, respectivamente, sendo os mais patogênicos. Contra o monalônio, o isolado Icac 3, Fusarium sp, colonizou 96% dos insetos nos dez dias de avaliação. Assim, considera-se que os isolados estudados demonstraram potencial importante para serem introduzidos em programas de biocontrole, com perspectivas de resultados promissores para controle microbiano de insetos-praga e atividade enzimática.

Selecciona, aisla e identifica bacterias halófilas moderadas productoras de Exopolisacáridos (EPS), de interés biotecnológico procedentes de las minas salinas de Atacocha - Ayacucho, se sembraron salmueras al 5% en el medio agua de sales suplementado con extracto de levadura al 0.5%, se seleccionaron 20 aislados productores de exopolisacáridos en función a sus características fenotípicas en el medio sólido maltosa levadura suplementado con 7.5 % de NaCl. Pruebas morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y nutricionales fueron utilizadas en la determinación de las características fenotípicas. El Análisis de Restricción del los genes ribosómicos 16S amplificados por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (ARDRA) se empleo para analizar la diversidad genética de los aislados productores de EPS. La secuenciación de los genes ribosómicos 16S de seis aislados productores de EPS permitió la identificación del género y especie. Todos los aislados fueron bacilos Gran negativos y crecieron en un rango óptimo de sal de 3 al 15%, a temperaturas entre 15 a 37 ºC y pH de 5 a 9, con características fenotípicas diferentes. El análisis UPGMA de los perfiles generados por ARDRA demostró que existen 18 especies diferentes. Las secuencias de los genes ribosómicos 16S analizados para los aislados ATA3, ATA4, ATA-11, ATA9, ATA17 y ATA20 mostraron que ATA4, ATA-11, ATA9 y ATA17 pertenecen al género Halomonas y ATA3 y ATA20 pertenecen al género Chromohalobacter.<br>Tesis

Lipases are carboxylic ester hydrolases which act on acylglycerols to liberate fatty acids and glycerol. These enzymes are currently attracting an enormous attention because they are among the most versatile and widely used enzymes in biotechnological applications and due to their unique properties. Moreover, these enzymes and their inhibitors have a high pharmacological interest because some microbial lipases can act as virulence factors in several infectious diseases. Therefore, the general objective of the present work was the isolation, cloning, characterization and inhibition by natural substances of microbial lipases with interest in biotechnology and infectious diseases.<br/>The first chapter was focused on the isolation and characterization of new<i> Bacillus</i> lipases to evaluate their biotechnological potential. The lipolytic system of several very active strains with an unknown lipolytic system was analyzed, and then, the lipases LipA from <i>Bacillus megaterium</i> CECT 370 and LipA from <i>Bacillus</i> sp. BP-6 were isolated, cloned and characterized. Both enzymes are family I.4 carboxylesterases closely related to <i>Bacillus subtilis</i> LipB, and have a high biotechnological potential due to their high stability and due to their molecular and biochemical properties.<br/>Chapter 2 consisted in the isolation of 724 microorganisms from soil samples collected from a subtropical forest of Puerto Iguazú (Argentina). Among them, 449 showed one or more of the biotechnologically-interesting enzymatic activities "true lipase", carboxylesterase, cellulase, xylanase and pectinase. CR-53 and CR-179, two very active isolates, were subsequently identified as two strains closely related to the species <i>Rhodococcus erythropolis</i> and <i>Bacillus subtilis</i>, respectively. Further analysis revealed that strain CR-53 produces a cell-bound carboxylesterase of 60 kDa, one of the first lipases known in the genus <i>Rhodococcus,</i> whereas strain CR-179 possesses a lipolytic system related to that of other <i>Bacillus</i>.<br/>Chapter 3 was focused in the development of a new, fast, simple and more sensitive colorimetric microassay with a low cost and suitable for high-throughput analysis of purified or non-purified lipolytic enzymes. The assay was subsequently used to evaluate the effect of several saturated fatty acids on five cell-bound or secreted <i>(Paeni)Bacillus lipases</i>. These lipids inhibited all the enzymes analyzed, although secreted lipases were activated by low concentrations of these compounds. Activation of microbial lipases by fatty acids is a phenomenon detected here for the first time, and could be related to the properties and biological function of these secreted enzymes.<br/>Chapter 4 consisted in the analysis of the inhibitory effect of several natural substances (saponins, flavonoids and alkaloids) on the model lipase from <I>Candida rugosa</i> (CRL) to evaluate their potential as antilipase drugs. beta-aescin, digitonin, kaempferol and (±)-catechin were selected as the best candidates for the treatment or prevention of lipase-related diseases due to the strong inhibition they produced on CRL, as well as due to their other beneficial effects and their low toxicity.<br/>The aim of chapter 5 was to isolate, clone, characterize and evaluate the inhibition of lipases from the pathogens <i>Propionibacterium acnes</i> and <i>Helicobacter pylori</i>. The analysis of GehA from <i>Propionibacterium acnes</i> P-37, a lipase considered as a major etiological agent in the pathogenesis of acne, revealed that this enzyme is very adapted to the skin conditions. EstV (HP0739), a family V carboxylesterase which was identified by analyzing <i>Helicobacter pylori</i> 26695 proteome, is the first lipase from this pathogen that has been cloned, purified and characterized. The evaluation of the effect of several natural substances on GehA and EstV revealed that beta-aescin, glycyrrhizic acid, (±)-catechin and kaempferol are promising candidates for the treatment of acne and/or ulcer due to their strong inhibitory activity on these lipases, as well as due to their other anctiacne or antiulcer effects and their low toxicity.