Dissertations / Theses on the topic 'Bothrops'

Las PLA2s homólogas (también conocidas como miotoxinas Lys49 o PLA2s K49) son las principales miotoxinas en los venenos de las serpientes del género Bothrops a pesar de presentar nula o ínfima actividad catalítica. En este trabajo, se identificaron tres nuevos transcritos codificantes de las PLA2s homólogas K49 en venenos de las especies Bothrops pictus (“jergón de la costa”), Bothrops brazili (“jergónshushupe”) y Bothrops atrox (“jergón de la selva”) que habitan en el Perú y se clonaron en células de Escherichia coli. Como primer paso, el RNA total fue aislado de venenos frescos y liofilizados, así como de tejido glandular. El rendimiento del RNA obtenido fue aproximadamente 5.0 ng/mg de veneno y 40.0 ng/mg de glándula. La cantidad y calidad de los transcritos fueron suficientes para la eficiente síntesis y amplificación del cDNA. La secuencia aminoacídica deducida de los transcritos se compone de 121/122 residuos de ~ 14.0 kDa y posee un punto isoeléctrico teórico (pI) de ~ 9.0. Los homólogos de PLA2 identificados en B. pictus, B. brazili y B. atrox se nombraron como pictoxina, brazilixina y batroxina, respectivamente, los cuales fueron clonados en células deE. coli TOP10 dentro del vector pCR2.1-TOPO con una eficiencia de transformación de 2.9 x 109 UFC/µg de DNA plasmídico. En relación con estudios transcriptómicos, la batroxina es una variante poblacional en venenos peruanos de una miotoxina encontrada en venenos brasileños con una única mutación nucleotídica que origina la sustitución D13E. La pictoxina corresponde a la PLA2 básica detectada previamente en el veneno de B. pictus. La brazilixina se diferencia considerablemente de otras miotoxinas encontradas en el veneno de B. brazili; por lo que es propuesta como una nueva proteoforma. Asimismo, las tres miotoxinas presentan mutaciones peculiares a nivel de la región C- terminal, loop de unión a calcio e interfaces proteína-membrana y proteína-proteína. Este es el primer estudio de clonación de las PLA2 básicas del género Bothrops de Perú y constituye el cimiento para dar inicio a las actividades de la tecnología recombinante para una caracterización funcional con miras a su aplicabilidad.
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). N° 168-FONDECYT-2017
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. B17100041, 19100184

A saúde bucal, na maioria dos municípios brasileiros, constitui ainda um grande desafio aos princípios do Sistema Único de Saúde, principalmente no que se refere à universalização, à eqüidade do atendimento e alto custo envolvido na terapia restauradora. A procura pela descoberta de novos compostos metabólicos com atividade antibacteriana para a prevenção de doenças bucais e talvez com menores impactos a saúde e financeiros, seria muito importante para obtenção de um meio efetivo de controle da formação de um biofilme patogênico e da cárie dental. O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade biotecnológica do uso de venenos nativos de diferentes serpentes quanto à capacidade de inibir o crescimento de Streptococcus mutans, principal agente envolvido na cárie dental. Nossos resultados mostraram que os venenos das serpentes Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e o componente responsável pela inibição parece ser a peróxido de hidrogênio. Apesar de ainda não totalmente conclusivos, os ensaios já realizados, permitem afirmar que venenos de serpentes são ferramentas importantes na inibição do crescimento de patógenos, especificamente daqueles envolvidos nas doenças cariogênicas.
The oral health at the most of Brazilian municipalities is still a big challenge to the principles of the Brazilian Health Unique System (SUS), particularly with regard to the globalization, the equity of care and high cost involved in restorative therapy. The demand for discovery of new natural products with antibacterial activity in order to prevent dental diseases and perhaps with fewer health and financial impacts, would be very important to achieve an effective means to control the formation of a pathogenic biofilm and dental caries. The objective of this work is to study the feasibility of the use of different snakes crude venom in inhibiting the growth of Streptococcus mutans, the principal agent involved in dental caries. Our results showed that Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu venoms were able to inhibit the growth of Streptococcus mutans and the component responsible for that inhibition appears to be the hydrogen peroxide. Though still not fully conclusive, the tests already carried out, show that snake venoms are important tools to inhibit the growth of pathogens, specifically those involved in caries diseases. MOSCA, R.C., 2008 7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................................

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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
The emergence of pathogenic agents resistant to conventional drugs has stimulated the search for new classes of antimicrobial and antiparasitic agents from natural sources. Among these, it highlights antimicrobial peptides (AMPs), which have mechanisms not dependent on the interaction with a specific receptor, providing new possibilities for the development of drugs against resistant organisms. The present study aimed to purify and characterize biochemically the peptides of B. atrox and B. jararacussu snakes venoms, as well as to evaluate the antimicrobial and antiparasitic activities of the peptides against the strains: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Leishmania amazonensis (IFLA/BR/97/PH8), and Plasmodium falciparum (clone W2, resistant to chloroquine). In this work, we carried out a comprehensive analysis of peptides presents in the venom of B. atrox and B. jararacussu using the combination of Amicon ultrafiltration of 3kDa, high performance liquid chromatography in reverse phase and mass spectrometry with electrospray ionization (Electrospray-Ion Trap-Time of Flight). Sixteen peptides were identified in both venoms, with mass range 444.17 to 1356.73 Da and primary structure between 3 to 13 residues. Among them 13 are unique sequences, including 7 peptides and 6 bradykinin-potentiating peptides (BBPs). The other peptides refer to 2 metallopeptidases inhibitor found in both peptidome venoms, but not described for these species, besides 1 BPP identified in the venom of B. atrox, the BPP-Bax12 with peptide sequence described. Some of the new peptides identified showed antibacterial activity against K. pneumoniae, P. aeruginosa and S. aureus, and low hemolytic activity, but did not demonstrate antiparasitic activity. Therefore, in this study 13 new peptides were identified from the B. atrox and B. jararacussu snake venoms, and some with relevant bacterial activities, which can assist in the development of new drugs against multiresistant microorganisms.
O surgimento de agentes patogênicos resistentes aos fármacos convencionais, têm estimulado a procura de novas classes de agentes antimicrobianos e antiparasitários a partir de fontes naturais. Dentre estes, destacam-se os antimicrobianos (AMPs), que possuem mecanismos não dependentes da interação com um receptor específico, oferecendo novas possibilidades para o desenvolvimento de medicamentos contra microrganismos resistentes. O presente estudo teve como objetivo purificar e caracterizar bioquimicamente o conteúdo peptídico dos venenos das serpentes B. atrox e B. jararacussu, além de avaliar as atividades antimicrobiana e antiparasitárias dos peptídeos frente as cepas: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Leishmania amazonensis (IFLA/BR/97/PH8), e Plasmodium falciparum (clone W2, resistente à cloroquina). Neste trabalho realizou-se uma análise abrangente dos peptídeos presentes nos venenos de B. atrox e B. jararacussu utilizando a combinação de ultrafiltração em Amicon de 3kDa, cromatografia líquida de alta perfomance em fase reversa e espectrometria de massas com ionização por electrospray (Electrospray-Ion Trap-Time of Flight). Foram identificados 16 peptídeos em ambos os venenos, com massas moleculares de 444,17 a 1.356,73 Da e estrutura primária variando de 3 a 13 aminoácidos. Dentre os quais, 13 são sequências únicas, incluindo 7 peptídeos e 6 peptídeos potenciadores de bradicinina (BBPs). Os demais peptídeos referem-se a 2 inibidores de metalopeptidases encontrados em ambos os venenos, porém não descritos para estas espécies, além de 1 BPP identificado no veneno de B. atrox, o BPP-Bax12 com sequência peptídica descrita. Alguns dos novos peptídeos identificados apresentaram atividade antibacteriana contra K. pneumoniae, P. aeruginosa e S. aureus, e baixa atividade hemolítica, porém não demonstraram atividade antiparasitária. Portanto, neste estudo foram identificados 13 novos peptídeos a partir dos venenos de B. atrox e B. jararacussu, e alguns com atividades bacterianas relevantes, que podem auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos contra microrganismos multirresistentes.

Orientador: Selma Maria de Almeida Santos
Banca: Henrique Bartolomeu Pereira Vaz
Banca: Ligia Pizzatto do Prado
Banca: Leonardo de Oliveira
Banca: Phelipe Oliveira Favaron
Resumo: A reprodução é essencial para a perpetuação das espécies e por esta razão este é um tema central no estudo da biologia de qualquer animal. Nesta tese apresento dados inéditos sobre diversos aspectos reprodutivos de algumas espécies de jararacas, incluindo B. cotiara, B. alternatus, B. pubescens, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi e B. pauloensis. Além da caracterização de eventos reprodutivos como produção de gametas, estocagem de esperma e formação de plugs copulatórios, também descrevo pela primeira vez em serpentes a presença de esperma no segmento sexual renal de B. pubescens e a intersexualidade em B. moojeni e B. erythromelas. A influência dos fatores ambientais e da inércia filogenética sobre a determinação dos padrões reprodutivos nestas serpentes foi avaliada por meio de (1) comparações entre a época de ocorrência dos eventos reprodutivos entre as diferentes espécies que indicaram a influência de ambos os fatores; (2) reconstruções de caráter ancestral que apontaram para um forte conservatismo filogenético em relação ao dimorfismo sexual e alta variabilidade em relação ao padrão de maturidade sexual; (3) análises estatísticas cujos resultados indicam que não há relação entre o aumento de parâmetros como temperatura e pluviosidade e o ciclo dos machos de B. pubescens, espécie utilizada como modelo. Embora a predominância de eventos de acasalamento durante o outono e nascimentos no verão indique um forte componente filogenético na determinação dos eventos...
Abstract: Reproduction is essential for the perpetuation of any species. That is why it is a central theme for studies on the biology of any organism. Here, I present new data on several aspects of reproduction for Bothrops species, including B. cotiara, B. alternatus, B. pubescens, B. diporus, B. mattogrossensis, B. neuwiedi and B. pauloensis. The characterization of reproductive events such as gametogenesis, sperm storage, formation of mating plugs and activity of the sexual segment of the kidneys (SSK) is provided. I also describe the presence of sperm inside the SSK for the first time in a snake species and intersexuality in B. moojeni and B. erythromelas. I evaluated the influence of environmental factors and phylogenetic inertia in the determination of reproductive events in these snakes by (1) a comparison of the timing of reproductive events between species which indicates that both factors may be important, (2) ancestral character state reconstructions showing a strong phylogenetic conservatism in sexual dimorphism with females being the larger sex and high variability in sexual maturity between species, (3) statistical analysis indicating that male reproductive variables do not vary according to temperature and rain in B. pubescens. Although there are many observations of reproductive events outside the expected periods for Bothrops species (mainly for timing of ovulation, pregnancy and sperm storage strategies), reports of mating and births are concentrated in autumn and summer, respectively, showing that although phylogenetic inertia has a high influence on the conserved timing of these reproductive events in Bothrops, environmental factors may also play a role in the plasticity observed in some species and individuals
Doutor

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Os venenos de serpente são complexa mistura de toxinas, que são principalmente enzimas e peptídeos com diversas atividades biológicas. Os venenos botrópicos podem induzir hemorragia, edema, necrose e diversas doenças da pele, tais como a formação de bolhas e dermonecrose. Embora existam progressos consideráveis no estudo da patogênese da hemorragia e mionecrose em Viperidae peçonhentas, existem poucas referências das anormalidades de pele derivadas destes venenos, independentemente da sua relevância clínica. O nosso objetivo é avaliar os efeitos dos venenos de Bothrops leucurus e Bothrops jararaca na indução de lesões da pele, bem como no processo de regeneração. Foram utilizados camundongos swiss albinos adultos com 25 ± 3 g (n = 4/grupo, do sexo masculino), que durante todo o experimento receberam comida e água "ad libitum" e foram mantidos em ciclo de luz natural. A manipulação e os procedimentos com os animais seguiram os princípios do Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa (CEUA-UFF n º 219). As lesões cutâneas foram induzidas no abdome por injeção intradérmica de 3 mg / kg de veneno de B. leucurus ou B. jararaca. O grupo controle recebeu injeção de solução salina fisiológica. Os animais foram sacrificados 1, 3, 7, 14, 21, 45 e 60 dias após a injeção de veneno, sob anestesia geral, a fim de remover a pele para processamento histológico. O passo seguinte foi corar com hematoxilina e eosina as amostras de pele e análise por microscopia óptica. Depois de 24 h a epiderme das amostras injetadas com os venenos estava desorganizada e apresentava maior espessura, em comparação com o controle. Após 21 e 45 dias foi possível identificar diferenças na análise imuno-histoquímica de citoqueratina 14 com padrão de marcação suprabasal das camadas epidérmicas, observado apenas em áreas de hiperproliferação nas amostras de pele injetadas com veneno. As amostras de pele de 60 dias do grupo de B. leucurus apresentaram células com núcleos picnóticos e as amostras de pele injetadas com as peçonhas de ambas espécies tinham fibra muscular em fase de recuperação, com núcleos centralizados, indicando processo de regeneração. Ainda nesta fase crônica foi possível identificar angiogênese com base na marcação de endotélio na derme através da imuno-histoquímica com o anticorpo CD34. Os resultados indicam que as lesões cutâneas induzidas por B. leucurus diferem de B. jararaca, sendo que as primeiras produziram intenso infiltrado inflamatório com padrão proliferativo diferenciado de reparação de feridas. Além disso, as peçonhas estudadas apresentaram-se como ferramentas úteis para o estudo de modelos de regeneração cutânea, porém a confirmação da tumorigênese depende de uma análise mais complexa, com destaque para fatores determinantes como o tempo e a intensidade de exposição ao veneno
Snake venoms are complex mixture of toxins, which are mostly enzymes and peptides with diverse biological activities. The bothropic venoms can induce hemorrhage, edema, necrosis and various skin conditions such as blister formation and dermonecrosis. Although there are significant advances in the study of the pathogenesis of hemorrhage and myonecrosis in venomous Viperidae, there are few references to the skin abnormalities derived from these venoms, regardless of its clinical relevance. Our goal is to evaluate the effects of B. leucurus and B. jararaca venoms in the induction of skin lesions as well as in the process of regeneration. The animals used were adult albino Swiss mice with 25 ± 3 g (n = 4/group, male), which throughout the experiment received food and water "ad libitum" and were maintained in natural light cycle. Manipulation and procedures with animals followed the principles of Evaluation Committee on the Use of Animals in Research (CEUA-UFF nº 219). The skin lesions were induced in the abdomen by intradermal injection of 3 mg/kg B. leucurus or B. jararaca venom. The control group received injection of physiological saline solution. The animals were sacrificed 1, 3, 7, 14, 21, 45 and 60 days after venom injection under general anesthesia in order to remove the skin for histological processing. The next step was the hematoxylin and eosin staining of the skin samples and analysis by optical microscopy. After 24 h the epidermis of the samples injected with venoms was disorganized and had greater thickness, compared with the control. After 21 and 45 days it was possible to identify differences in immunohistochemical analysis of cytokeratin 14 with suprabasal epidermal layers staining, observed only in areas of hyperproliferation in samples of skin injected with venom. Skin samples of B. leucurus 60 days group cells had pyknotic nuclei and skin samples injected with venoms of both species had muscle fiber in recovery phase, with centered nuclei , indicating regeneration process. Still in chronic phase, we found angiogenesis based on marking endothelium in the dermis by immunohistochemistry with CD34 antibody. The results indicate that the cutaneous lesions induced by B. leucurus differs from B. jararaca, with the first resulting in intense inflammatory infiltrate with different proliferative pattern of wound repair. In addition, the venoms studied were presented as useful tools to study models of skin regeneration , although confirmation of tumorigenesis depends on a more complex analysis with emphasis on determining factors such as the time and intensity of exposure to the venoms

O envenenamento ofídico é considerado uma condição tropical negligenciada pela OMS, e no Brasil, o gênero Bothrops está envolvido na maioria dos casos. Primeiramente, estudamos a atividade hidrolítica do veneno de B. jararaca sobre peptídeos biologicamente ativos que podem estar relacionadas com o envenenamento. A hidrólise dos peptídeos que foram substratos para as serinopeptidases não foi eficientemente bloqueada pelo soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan e, portanto, as causas dessas falhas foram investigadas. Para isso, purificamos quatro serinopeptidases não bloqueadas pelo soro e, por estudos imunoquímicos, observamos que apesar deste não bloquear as atividades destas enzimas, o mesmo é capaz de reconhecê-las. Portanto, decidimos obter soros experimentais contra estas moléculas utilizando camundongos, a fim de compará-los com o soro comercial. Os soros experimentais contra as serinopeptidases mostraram capacidade de reconhecimento e alta afinidade contra elas, e mais importante, capacidade de neutralizar suas atividades in vitro.
Snakebite is considered a neglected tropical condition by WHO, and in Brazil, the Bothrops genus is involved in most of the cases. Initially, we have studied the B. jararaca venom activity over bioactive peptides which could be related with the envenomation. The hydrolysis of the peptides substrate for serinepeptidases were not efficiently blocked by the Butantan Institute bothropic antivenom, therefore, the causes of this flaw were investigated. Thereafter, we purified four serinepeptidases not blocked by the antivenom and, by immunochemistry analysis, we observed that although it could not neutralize the activity, it could well recognize these proteins. Thus, we decided to obtain experimental sera against these serinepeptidases in mice, in order to compare it with the commercial antivenom. The experimental sera against these enzymes demonstrated recognition capability and high affinity, and most important, the ability to neutralize their activity in vitro.

Os venenos do gênero Bothrops induzem efeitos locais caracterizados por hemorragia, necrose, edema e dor intensa. Apesar da importância clínica do fenômeno de dor, os estudos sobre os mecanismos envolvidos na gênese deste fenômeno são ainda escassos. Além disso, não existem dados sobre a capacidade do antiveneno em neutralizar este fenômeno. Neste trabalho foi investigada, a capacidade dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops asper e da miotoxina III (Fosfolipase A2, variante Asp 49), uma toxina isolada do veneno de Bothrops asper, em induzir hiperalgesia em ratos, a mediação química deste fenômeno e a capacidade dos antivenenos em neutralizar esta ação dos venenos. A possível correlação entre a hiperalgesia e a resposta edematogênica causada pelos venenos ou miotoxina foi também avaliada. O limiar de dor foi determinado antes e em diferentes tempos após a administração dos venenos ou toxina, empregando o teste de pressão de pata de rato. Para o estudo da resposta edematogênica, o aumento do volume das patas posteriores foi determinado por pletismografia. Os venenos e a toxina, administrados por via intraplantar, nas doses de 5µg (VBj), 15µg (VBa) ou 10µg (MIII), induziram hiperalgesia e edema, com respostas máxima na 1a (VBj, MIII) ou 2a (VBa) hora, não sendo mais detectadas na 24a hora. Para o estudo da neutralização, foram utilizados o antiveneno botrópico produzido no Instituto Butantan e o antiveneno polivalente produzido no Instituto Clodomiro Picado da Costa Rica, administrados por via endovenosa, 15 min. ou imediatamente antes ou 15 min. após a injeção dos venenos. O AVIB, quando injetado 15 min. antes do VBj, foi capaz de reverter a hiperalgesia induzida pelo veneno. Em relação ao edema, esta inibição foi observada quando o antiveneno foi administrado 15 min. ou imediatamente antes do VBj. Por outro lado, o AVCP não interferiu com a dor e o edema acarretados pelo VBa. Quando o VBj e o VBa foram incubados, in vitro, por 30 min., a 370C com os AV correspondentes, a hiperalgesia e o edema foram abolidos. Estes resultados indicam que a incapacidade do AVCP, quando administrado in vivo, de bloquear a hiperalgesia e o edema induzidos pelo VBa, não é consequência da ausência de anticorpos específicos no antiveneno, uma vez que estes efeitos foram inibidos quando o veneno foi pré-incubado com o antiveneno. Para avaliação da mediação química da hiperalgesia e do edema, os animais foram submetidos a tratamentos com inibidores de síntese, antagonistas de receptores, anticorpos ou drogas depletoras destes mediadores. Os resultados mostraram que o Hoe-140, dexametasona e NDGA inibem a hiperalgesia induzida pelo VBa, enquanto que apenas a prometazina interferiu com o edema causado pelo veneno. A hiperalgesia induzida pela MIII foi revertida pelo tratamento com prometazina, metisergida, Hoe-140, dexametasona e por NDGA, enquanto que o edema foi inibido apenas por prometazina e dexametasona. Estes dados sugerem que: a) a MIII é um importante componente do veneno para a geração de hiperalgesia, b) a bradicinina e os derivados da lipoxigenase são mediadores da dor acarretada pelo VBa e pela MIII, c) histamina e serotonina participam também da hiperalgesia induzida pela miotoxina e d) a histamina é mediador do edema induzido pelo VBa e pela MIII. Com relação à hiperalgesia induzida pelo VBj, somente o tratamento com Hoe-140 diminuiu este fenômeno, indicando a participação da bradicinina. Por outro lado, este tratamento não foi capaz de interferir com o edema induzido por este veneno. Cabe ressaltar que TEIXEIRA et al. (1994) demonstraram a participação de eicosanóides e PAF na hiperalgesia induzida pelo VBj. Os dados em conjunto sugerem ainda, dissociação entre os fenômenos de dor e edema acarretados por ambos os venenos e pela miotoxina.
Bothrops venoms cause pronounced local tissue-damage characterized by hemorrhage, myonecrosis, edema and pain. Venom-induced pain has been poorly investigated, despite its clinical relevance. Furthermore, the ability of antivenom to neutralize hyperalgesia induced by these venoms is not known. In the present study the hyperalgesia and edema induced by Bothrops jararaca (BjV) and Bothrops asper (BaV) venom and by myotoxin III-MIII (Asp49- phospholipase A2), a toxin isolated from BaV, were investigated. The chemical mediators involved in these phenomena and the ability of the antivenom to neutralize the hyperalgesia and edema induced by these venoms were also investigated. Pain threshold was assessed before and at several intervals after venom injection, using the rat paw pressure test. Edema of paw was measured phethysmographically at the same periods of time. The intraplantar injection of BjV (5µg/paw), BaV (15µg/paw) or MIII (10µg/paw) caused hyperalgesia and edema, whose peak were observed at the 1st (BjV, MIII) or 2nd (BaV) hours after venom/toxin administration, decreasing thereafter. For neutralization studies, the antivenoms produced either at Instituto Butantan from Brazil (AVIB) or Instituto Clodomiro Picado from Costa Rica (AVCP) were administered intravenously 15 min prior to, or immediately before, or 15 min after venoms injection. When the antivenom from Instituto Butantan was injected 15 min. before BjV, the hyperalgesia and edema were abolished. Furthermore, partial inhibition of edema was also observed when the antivenom was injected together with BjV. On the other hand, hyperalgesia and edema induced by BaV were not modified by AVCP. Incubation of BjV and BaV, for 30 min. at 37oC, with the antivenoms in vitro, abolished the hyperalgesia and edema. The inability of the in vivo treatment with antivenom in abolishing hyperalgesia and edema induced by BaV seems not to be related to the lack of neutralizing antibodies in antivenom, because neutralization was achieved in pre-incubation experiments. In order to investigate the chemical mediation of hyperalgesia and edema induced by the venoms or toxin, animals were treated with several drugs. Pretreatment with Hoe-140, dexamethasone and NDGA blocked the hyperalgesia induced by BaV, whereas only promethazine reduced the edema induced by this venom. The MIII-induced hyperalgesia was blocked by promethazine, methysergide, Hoe-140, dexamethasone and NDGA, whereas the edema was reduced only by promethazine and dexamethasone. These results suggest that: a) MIII may contribute to the BaV-induced hyperalgesia, b) bradykinin and leukotrienes mediate the BaV- and MIII-induced pain and MIII; c) histamine and serotonin also participate in the myotoxin-induced hyperalgesia and d) the edema induced by BaV and MIII is mediated by histamine. Pre-treatment of the animals with Hoe-140 abolished BjV-induced hyperalgesia, suggesting that bradykinin may mediate the venom-induced hyperalgesia. However, this treatment did not modify the BjV-induced edema. It is important to stress that previous studies have shown that BjV-induced hyperalgesia is mediated, at least partially, by eicosanoids and PAF (TEIXEIRA et al.,1994). The data presented herein also suggest that distinct mechanisms may be involved in the development of hyperalgesia and edema induced by both venoms and myotoxin III.

As doenças neurodegenerativas (DN), incluindo doença de Alzheimer e doença de Parkinson, estão entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos países ocidentais. Não há ainda um tratamento definitivo para estas neuropatias, mas os estudos têm apontado para mecanismos comuns de toxicidade, que incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e apoptose. Assim, as mitocôndrias constituem alvos importantes para futuras estratégias de neuroproteção visando tratar, prevenir ou retardar a neurodegeneração. A biodiversidade da fauna brasileira representa uma fonte promissora e ainda pouco explorada de novas moléculas com (i) atividade neuroprotetora e, portanto, potencial para originar novos fármacos para o tratamento destas doenças; ou ainda com (ii) atividade neurotóxica, podendo ser utilizadas como ferramentas de estudo de mecanismos de neurotoxicidade. O presente estudo teve por objetivo investigar o possível potencial neuroprotetor e/ou neurotóxico de peptídeos de baixo peso molecular, obtidos a partir do veneno de diferentes espécies de serpentes do gênero Bothrops por meio da investigação dos efeitos destes compostos na função mitocondrial de cérebro de rato. Duas das frações estudadas (obtidas a partir do veneno da B. atrox e da B. jararaca) apresentaram um interessante potencial protetor contra o intumescimento osmótico mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), eventos associados à transição de permeabilidade mitocondrial e à morte celular. Por outro lado, outra fração, obtida a partir do veneno da B. pirajai, apresentou potencial neurotóxico. Estes achados podem ser úteis para estudos mecanísticos e também no estabelecimento de futuras estratégias de tratamento das doenças neurodegenerativas, tendo as mitocôndrias como alvos terapêuticos (terapia alvo).
The neurodegenerative diseases, including Alzheimer\'s and Parkinson\'s diseases, are among the main causes of morbidity and mortality in Western countries. A definitive treatment for these neuropathies has not yet been found, but studies have indicated common mechanisms of toxicity, including mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis. Therefore, mitochondria represent important targets for the future neuroprotective strategies aimed to treat, prevent or delay the neurodegeneration. The Brazilian fauna biodiversity represents a promising and under explored source of new molecules with (i) neuroprotective activity and potential to originate new drugs for the treatment of these diseases; or yet, with (ii) neurotoxic activity, representing tools to study neurotoxicity mechanisms. The present study aimed to investigate the possible neuroprotective and/or neurotoxic potential of low-molecular-mass peptides extracted from the venom of different species of Bothrops genus snakes by investigating their effects on rat brain mitochondrial function. Two of the studied fractions (from B. atrox and B. jararaca venoms) presented an interesting protective potential against both the mitochondrial swelling and reactive oxygen species (ROS) production, events associated with mitochondrial permeability transition and cell death. On the other hand, other fraction (from B. pirajai venom) presented a neurotoxic potential. These findings might be useful for mechanistic studies and also for the establishment of future strategies of neurodegenerative diseases treatment, using mitochondria as therapeutic targets (targeted therapy).

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos.
Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Orientador : Julia Prado Franceschi
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-07-18T13:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_AntonioLelisFranco_M.pdf: 930305 bytes, checksum: 9a1adb016c549a5a0842d2de171594e8 (MD5) Previous issue date: 1993
Resumo: Serpentes da especie B. moojeni, conhecidas popularmente como "caiçaca", apesar de medirem cerca de 1,50m são capazes de fornecer até 300mg de veneno por extração, podendo por este motivo causar acidentes graves. Na Região Noroeste do estado de São Paulo (região de São Josédo Rio Preto), chegam a 90% dos casos registrados. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital
Abstract: Bothrops moojeni (Hoge, 1966), populary known by the Tupi-Guarani Indian name of "caiçaca" meaning "something that burns", is a widely distributed venomous snake species found in the state of São Paulo and in neighboring regions. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations
Mestrado
Mestre em Farmacologia

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-06T13:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_LucimaraJulio_M.pdf: 11295607 bytes, checksum: 8492693ea03dda6f72a75c0c23ee0d9c (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: O veneno de Bothrops lanceolalus exerce várias atividades biológicas, dentre elas a atividade hemolítica indireta. Neste trabalho verificamos algumas das características desta atividade in vitro. O veneno induziu hemólise indireta em eritrócitos de cavalo, boi, rato e carneiro, sendo que, dentre essas espécies, a primeira foi mais sensível; não houve atividade hemolítica direta. A hemólise foi concentração-dependente e atenuada em temperaturas >40°C. O tratamento do veneno com brometo de p-bromofenacil aboliu a atividade da fosfolipase A2 (PLA2) do veneno e impediu a hemólise. Corroborando estes achados, uma PLA2 ácida purificada deste veneno também induziu hemólise. Esta PLA2 reagiu contra o anti-soro do veneno de B. lanceolatus. Estes resultados indicam que atividade hemolítica do veneno de B. lanceolatus é mediada pela PLA2. A reação cruzada da PLA2 com o anti-soro sugere que a atividade desta enzima pode eficazmente ser neutralizada durante a terapia sorológica
Abstract: Bothrops lanceolatus venom exerts a variety of biological activities, including indirect hemolysis. In this work, we examined some of the characteristics of this activity in vitro. The venom caused indirect hemolysis in horse, ox, rat and sheep erythrocytes, with the first of these species being the most sensitive; there was no direct hemolysis. The hemolysis was concentration-dependent and was markedly attenuated at >40°C. Treatment of the venom with />-bromophenacyl bromide abolished the phospholipase A2 (PLA2) activity of the venom and prevented the hemolysis. In agreement with this finding, an acidic PLA2 purified from this venom also caused hemolysis. This PLA2 reacted with antivenom against B. lanceolatus venom. These results indicate that the hemolytic activity of B. lanceolatus venom is mediated by PLA2. The cross-reactivity of the PLA2 with antivenom suggests that the activity of this enzyme may be effectively neutralized during antivenom therapy
Mestrado
Mestre em Farmacologia

Orientador: Lea Rodrigues Simioni
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-12T11:19:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_PriscilaRandazzode_D.pdf: 2478214 bytes, checksum: bbb891d96754c5530c891d237eeb45c9 (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: Os efeitos miotóxicos dos venenos botrópicos são inquestionáveis pela exuberante manifestação clínica e são extensivamente relatados na literatura. Já os efeitos neurotóxicos têm sido descritos sob condições in vitro, em preparações neuromusculares, com pouca ou nenhuma evidência clínica. O objetivo do presente estudo foi o de contribuir para o conhecimento sobre a caracterização bioquímica e farmacológica da Bp-12, uma nova miotoxina do veneno de B. pauloensis. O perfil cromatográfico do veneno evidenciou 18 picos, o pico 12 (Bp-12) refere-se a nova fração estudada, uma vez que em ensaios preliminares apresentou efeito sobre a JNM. O perfil eletroforético da Bp-12 mostrou a presença de uma única banda protéica com aproximadamente 14 kDa, confirmado pela espectrometria de massa (13.789,56 Da). A composição de aminoácidos apresentou alto conteúdo dos resíduos, Lys, Tyr, Gly, Pro e Cys, típicos de PLA2 básicas. A Bp-12 possui 122 resíduos de a.a.: SLFELGKMIL QETGKNPAKS LGAFYCYCGW GSQGQPKDAV DRCCYVHKCC YKKITGCNPK KDRYSYSWKD KTLVCGEDNS CLKELCECDK AVAICLRENL NTYNKKYRYF LKPLCKKADA AC, com pI de 8,55 e uma alta homologia com outras PLA2 Lys49 botrópicas (92,6 %). A preparação nervo frênico-diafragma (NFD) de camundongo foi mais sensível à ação da toxina do que a preparação biventer cervicis de pintainho. Em preparações NFD, a Bp-12 (3,6 ?M) induziu 50% de bloqueio em 17 ± 7 min, inibindo completamente a resposta contrátil a estímulos indiretos (120 min, 37 °C); o bloqueio neuromuscular irreversível também foi observado, quando o Ca2+ foi substituído pelo Sr2+ na solução de Tyrode, quando a preparação foi curarizada (estímulo direto) ou quando submetida à baixa temperatura (22 °C). O registro do PM mostrou que a partir de 15 min de incubação com a Bp-12 (3,6 ?M) ocorreu uma progressiva despolarização da membrana, com valores de -20,2 ± 1 mV (90 min, p<0,05). Após 60 min de incubação, o efeito da Bp-12 (3,6 ?M) sobre os valores do conteúdo e tamanho quântico e amplitude média foram respectivamente: 50 ± 8; 0,09 ± 0,01 e 3,0 ± 0,3 mV, estes não foram significativamente diferentes quando comparados com os valores controle (68 ± 9; 0,07 ± 0,01 e 3,3 ± 0,2 mV). Nos estudos de miotoxicidade, após 120 min de incubação com 50 ?g/mL de veneno de B. pauloensis ou de Bp-12, o músculo diafragma apresentou áreas de mionecrose da ordem de 26 ± 2 % e 27 ± 1 % (p<0,05), respectivamente. Os níveis de CK plasmático aumentaram significativamente após a administração intramuscular de Bp-12, sendo: 827 ± 92 U/L (50 ?g) e 225 ± 36 U/L (20 ?g) versus 48,3 ± 8 U/L (controle), entretanto, com a via intravenosa não houve aumento significativo, mostrando que a Bp-12 não produz miotoxicidade sistêmica. A Bp-12 (2,5; 5,0 e 10,0 ?g/pata) induziu edema de pata dependente da dose, caracterizada por apresentar início de ação rápido, em torno de 30 min, sendo: 0,4 ± 0,02 mL; 0,6 ± 0,05 mL e 0,7 ± 0,07 mL, respectivamente; também foi calculada a área sob a curva para cada dose injetada, cujos valores foram (mL.h): 0,5 ± 0,02 (salina); 0,9 ± 0,11; 1,3 ± 0,15 e 1,7 ± 0,19, respectivamente. Conclui-se que a Bp-12 é uma nova PLA2 Lys49 miotóxica, de caráter básico, com baixa atividade catalítica, que induz bloqueio neuromuscular irreversível dependente do tempo e da concentração e que apresenta atividades farmacológica e bioquímica características de miotoxinas botrópicas.
Abstract: The myotoxic effects caused by bothropics venoms are unquestionable by their exuberant clinic manifestation and are extensively related in literature, since the neurotoxic effects have been described in vitro conditions, in nerve-muscle preparations, with little or neither clinic evidence. The aim of this study was to contribute for the knowledge about the pharmacological and biochemical characterization of Bp-12, a new myotoxin from B. pauloensis snake venom. The elution profile of B. pauloensis crude venom after purification in one chromatographic step presented eighteen peaks ranging from Bp-1 to Bp-18. Peak 12 was named Bp-12 and resulted in one small peak with a retention time of 37 min, eluting at 56% of buffer B. The SDS-PAGE gel showed one electrophoretic band, indicating that this toxin was obtained with high homogeneity and a molecular mass of around 14 kDa, confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry, which showed that the protein had a molecular mass of 13789.56 Da. The amino acids composition showed that Bp-12 presented high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical of a basic PLA2. The sequence of Bp-12 contains 122 amino acid residues: SLFELGKMIL QETGKNPAKS LGAFYCYCGW GSQGQPKDAV DRCCYVHKCC YKKITGCNPK KDRYSYSWKD KTLVCGEDNS CLKELCECDK AVAICLRENL NTYNKKYRYF LKPLCKKADA AC, with a pI value of 8.55 and with a high homology with Lys49 PLA2 from other bothropics venoms. In mouse phrenic nerve-diaphragm (PND), the time needed for 50% paralysis was 17 ± 7 min (3.6 ?M). Bp-12 can induce indirect and directly blocked evoked twitches, even in the preparations in which Ca2+ is replaced by Sr2+ or low temperature (22 °C), being the addition of d-tubocurarine required for direct blocking. The resting membrane potential showed that after 15 min of incubation with Bp-12 (3.6 ?M), progressive despolarization decreased from -83.9 ± 1 mV to -20.2 ± 1 mV (90 min, p<0.05). Intracellular recordings of endplate potentials (EPPs) from mouse diaphragm preparations revealed that Bp-12 did no alter the quantal content (50 ± 8, t60, p>0.05 of the control). Incubation with Bp-12 (50 ?g/mL) or B. pauloensis (50 ?g/mL) for 120 min damaged 26 ± 2 % and 27 ± 1 % (p<0,05), respectively. Bp-12 (20 and 50 ?g/50 ?L) has significantly increased the release of CK levels in the serum after 60 min of i.m. administration, being the values: 827 ± 92 U/L and 225 ± 36 U/L (20 ?g/mL). However, i.v. administration has not presented significant increased. Bp-12 (2.5 - 10.0 ?g/paw) induced local oedema formation in rat paw in vivo at around 30 min, being found the values of: 0.4 ± 0.02 mL (2.5 ?g/paw), 0.6 ± 0.05 mL (5.0 ?g/paw) and 0.7 ± 0.07 mL (10.0 ?g/paw). In conclusion, Bp-12 is a new myotoxic PLA2 (Lys49), with low catalitic activity, that is able to induce irreversible neuromuscular blockade and presents biochemical and pharmacological activities characteristic of bothropics miotoxins.
Doutorado
Doutor em Farmacologia

Orientador: Stephen Hyslop
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-15T04:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Smaal_Adriana_M.pdf: 6478282 bytes, checksum: 2107d35eeaa596500136ca0dd4e07119 (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops resulta em alterações sistêmicas que incluem coagulopatia, hemorragia sistêmica, choque hipovolêmico e insuficiência renal aguda. Neste estudo investigamos a ação de da peçonha de B. jararacussu e suas frações cromatográficas sobre alguns parâmetros cardiovasculares (pressão arterial, freqüências cardíaca e respiratória, e eletrocardiograma) em ratos anestesiados com uretana. Ratos Wistar (300-400 g) foram canulados na arteria carótida esquerda para monitoramento contínuo da pressão arterial sistêmica e na veia femoral para administração das peçonhas e frações cromatográficas. A freqüência cardíaca e o ECG foram monitorados por um eletrocardiógrafo. No final do experimento, coração, rins, fígado e pulmão foram processados para avaliação histológica. Os ratos foram monitorados durante 120 min. Para análise histológica, foram coletados amostras de coração, pulmão, rim e fígado. A peçonha (0.25, 0.5 and 0.75 mg/kg, i.v.) casou queda acentuada da pressão arterial nos até os 5 minutos após administração das peçonhas, tendo recuperação para valores de níveis basais nas doses menores, e a dose maior não houve recuperação. As doses menores não causaram alterações nas freqüências cardíacas e respiratórias, porem a dose maior causou queda irreversivel destes parâmetros. Alterações transitórias vistas no ECG foram extra sístole, taquicardia ventricular e alteração na amplitude do complexo QRS. Ratos injetados com a menor dose sobreviveram durante os 120 minutos monitorados no experimento, já os injetados com a maior dose morreram com aproximadamente 15 minutos após a administração da peçonha. A gel filtração resultou em 5 picos (PI-PV), sendo que a administração dos 2 primeiros picos mostraram alterações semelhantes a peçonha bruta. O fracionamento do pico I por troca iônica, não resultou em alterações cardiovasculares,pois provavelmente eles agem em sinergismo. Similarmente, a Bothropstoxina isolada do pico III não causou alterações. Analise histológica mostraram alterações em órgãos, principalmente em pulmões. Adicionalmente,foi visualizado mionecrose, edema e infiltrado inflamatório no coração, perda da arquitetura tecidual no fígado, e microaneurismas capilares, presença de proteína na luz tubular, e infiltrado inflamatório nos rins. Os picos I, II e III mostraram alterações similares a peçonha bruta. Estes resultados mostram que as peçonhas botrópicas produzem alterações cardiovasculares importantes, alem de alterações morfológicas em diversos órgãos. A predominância de hemorragia e presença de atividade hemorrágica nos picos I, II e III indicam a presença de diversas proteínas hemorrágicas nesta peçonha.
Abstract: Envenoming by Bothrops snakes results in systemic alterations that include coagulopathy, internal hemorrhage, hypovolemic shock and acute renal failure. In this work, we investigated the action of Bothrops jararacussu snake venom and its chromatographic fractions on arterial blood pressure, heart and respiratory rates, and electrocardiogram in urethane-anesthetized male Wistar rats. The rats were cannulated for blood pressure measurements (carotid artery) and the injection of venom or fraction (femoral vein). The heart rate and electrocardiogram (ECG) were measured with an ECG recorder. At the end of the experiments, samples of heart, liver, lung and kidney were processed for histological analysis. Venom (0.25, 0.5 and 0.75 mg/kg, i.v.) caused immediate hypotension that lasted for 5 min followed by a gradual recovery to pre-venom levels with the two lowest doses, whereas there was no recovery with the highest dose. The two lowest doses did not significantly affect the heart rate or respiratory rate, but these parameters were depressed with the highest dose. Transient changes in the ECG seen during the first 5 min included ventricular extrasystoles, ventricular tachycardia and alterations in the QRS complex amplitude. Rats injected with the two lowest doses survived for 120 min post-venom, whereas with the highest dose the survival time was 15 min at the most. Gel filtration (Sephacryl 75) of venom resulted in five peaks (PI - PIV), the first two of which produced cardiovascular alterations similar to those of the venom. Fractionation of PI resulted in two major peaks, neither of which produced significant cardiovascular alterations, perhaps because they normally act in synergy. Similarly, a PLA2 (bothropstoxin) isolated from peak PIII did not alter the parameters investigated. Histological analysis revealed hemorrhage in the organs examined, particularly the lungs. In addition, there were focal lesions in hepatic and renal tissue, as well as renal epithelial desquamation, glomerular microaneurysms, an increase in the capsular space and the presence of protein-like material in the lumen of proximal and distal tubules. Peaks PI, PII and PIII produced histological alterations similar to those of the venom. These results show that B. jararacussu venom causes important cardiovascular changes in anesthetized rats, in addition to morphological alterations in a variety of organs. The predominance of hemorrhage and the presence of hemorrhagic activity in peaks PI - PIII indicate the presence of a variety of hemorrhagic proteins in this venom.
Mestrado
Farmacologia
Mestre em Farmacologia

Orientador: Léa Rodrigues Simioni
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-25T16:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Collaco_RitadeCassiadeOliveira_M.pdf: 3001453 bytes, checksum: ea83fa3506989e7f90775d8ab6cf742a (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: Venenos de serpentes botrópicas são caracterizados pela indução de extenso dano local associado a feitos sistêmicos. Bothrops fonsecai é uma serpente de distribuição geográfica restrita das regiões montanhosas de Mata Atlântica cujo veneno é pobremente estudado. Recente estudo proteômico identificou que esse veneno possui principalmente metaloproteases, fosfolipases A2, Lectinas tipo C e serinoproteases. Ensaios experimentais utilizando antiveneno botrópico comercial para neutralizar as atividades biológicas de venenos botrópicos possibilitam não somente respostas de cunho clínico (tratamento de acidentes), mas também se constitui em uma valiosa ferramenta farmacológica para avaliar a existência de diferenças na composição dos diversos venenos através da reatividade cruzada entre veneno e antiveneno. Levando em consideração esses fatos, este trabalho teve como objetivo estudar a toxicidade do veneno de B. fonsecai através da atividade bloqueadora sobre a junção neuromuscular, atividade miotóxica, hemorrágica, edematogênica e coagulante assim como a sua caracterização bioquímica. A neutralização dessas atividades por antiveneno botrópico comercial e a comparação das ligações antígeno:anticorpo (veneno:antiveneno) entre B. fonsecai e os antivenenos botrópico comercial e específico usando SE-HPLC e immunoblotting também foram avaliadas. O veneno de B. fonsecai apresentou atividade fosfolipásica, sendo essa provavelmente a maior responsável pelo bloqueio neuromuscular e miotoxicidade, além de ser uma das mediadoras da atividade edematogênica; a inibição parcial dessa atividade pelo antiveneno comercial corrobora com a neutralização parcial dos efeitos na junção neuromuscular e redução da atividade edematogênica, já a neutralização total da atividade miotóxica demonstra que as PLA2 catalíticas podem não ser as principais responsáveis pela miotoxicidade. Embora o veneno apresente metaloproteinases P-I e P-III, a atividade proteolítica não demonstrou-se marcante in vitro, diferente do ensaio de atividade hemorrágica (induzida principalmente por essas enzimas e que foi completamente inibida pelo antiveneno comercial) o que leva a crer que o ensaio enzimático esteja subestimando essa atividade. O veneno exibiu atividades esterásica e coagulante que são normalmente causadas por serinoproteases e ambas foram inibidas pelo antiveneno botrópico comercial, em menor grau na proporção 5:1 (recomendada pelo fabricante) que a obtida em 5:2. O antiveneno botrópico comercial apresentou reatividade-cruzada em todas as atividades testadas, porém sua afinidade com o veneno de B. fonsecai demonstrou-se baixa ressaltando que o veneno de B. fonsecai possui composição diferente do veneno das serpentes utilizadas na produção do antiveneno comercial, em especial as fosfolipases catalíticas, metaloproteinases P-I e serinoproteases
Abstract: Bothropic snake venoms are characterized for a marked local damage associated to systemic effects. Bothrops fonsecai is a Brazilian pit viper of restrict distribution (Atlantic Forest at high altitude regions) and its venom has been poorly studied but is known it has phospholipases A2, metalloproteases (P-I and P-III) and serine proteases. Experimental assays using commercial bothropic antivenom to neutralize the bothropic venom activities allows clinical responses (snakebites treatment) and also is a pharmacological tool to evaluate different venoms composition through venom:antivenom cross-reactivity. Thinking in all this, the aim of this work were the B. fonsecai venom toxicity analysis through the in vitro neuromuscular junction action, the myotoxic, hemorrhagic, edema-forming and coagulant activities, as well its biochemical characterization. The neutralization of those activities by the commercial bothropic antivenom and the comparison of venom:antivenom bindings (Bothrops fonsecai venom : Commercial and specific antivenoms) by SE-HPLC and immunoblotting were also evaluated. B. fonsecai venom had a high phospholipasic activity and this probably is the major responsible for neuromuscular blockade and miotoxicity caused by this venom. This activity is also one of edema-forming activity mediator (with metalloproteases P-I). The partial inhibition of this activity with both proportions (5:1 and 5:2) corroborates the partial neuromuscular blockade and edema neutralization; in contrast total the inhibition of miotoxicity allows us to suppose that the catalytic PLA2 are not the major responsible for the miotoxicity. The venom also showed a low metalloprotease activity (caused principally by P-I once is more abundant on this venom) and was not significantly inhibited by commercial bothropic antivenom at both proportions; these enzymes (especially P-III) also induced hemorrhage totally inhibited by commercial bothropic antivenom. The esterase and coagulant activities of this venom are caused mainly by serine-proteases; the commercial antivenom neutralization was more potent at 5:2 than 5:1 proportion. The commercial antivenom presented cross-reactivity in all tested activities but its low affinity with B. fonsecai venom indicates that the venom composition is a quite different than the composition of snake venoms used to produce the commercial antivenom, specially catalytic phospholipases, metalloproteases P-I and serine proteases
Mestrado
Farmacologia
Mestra em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:16Z : No. of bitstreams: 1 salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf: 205572 bytes, checksum: ea2da7983b8e624b8fb6f242a2874147 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-16T11:30:15Z: salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-03-16T11:31:00Z : No. of bitstreams: 1 000709624.pdf: 1507151 bytes, checksum: e7624c11b3bf8ce0e311b5d40988f595 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade...
Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes
Banca: Roberto Morato Fernandez
Banca: Antonio Sérgio Kimus Braz
Resumo: Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Bothrops insularis é uma espécie de serpente endêmica da Ilha da Queimada Grande. Atualmente é considerada criticamente ameaçada de extinção. A espécie mais próxima filogeneticamente é a jararaca encontrada no continente (B. jararaca). Considerando a importância da alimentação e do crescimento em vários aspectos de vida das serpentes, o estudo dos diferentes tipos de presas em relação ao crescimento e maturidade sexual, é de grande importância para promover melhorias nos programas de reprodução e manejo de espécies ameaçadas mantidas em cativeiros conservacionistas. Portanto, este estudo tem como objetivo acompanhar o desenvolvimento (massa e crescimento) de B. jararaca e B. insularis até a maturidade sexual avaliando a influência de dois tipos de presas (anfíbio e mamífero). Os indivíduos foram divididos em grupos pelo tipo de presa oferecida, sexo e frequência alimentar (grupos alimentados a cada 15 e 30 dias) e alimentados com uma proporção de 30% da massa corporal de cada indivíduo. Observamos que nos primeiros seis meses de vida as serpentes exibem preferência por anfíbios. A alimentação com camundongo e a maior frequência (a cada 15 dias) proporcionou um maior crescimento comparado aos animais alimentados com rã inicialmente. Além disso, para B. insularis os animais alimentados com camundongo a cada 15 dias ficaram sexualmente maduros mais jovens e com um maior tamanho, enquanto que em B. jararaca o tipo de presa não influenciou na maturidade dos machos, porém teve influência evidente nas fêmeas. Concluímos que a dieta oferecida em cativeiro exerce influência no crescimento e no tamanho da maturidade sexual de serpentes.
Bothrops insularis is a species of serpent endemic to the Island of Queimada Grande. It is currently critically endangered. The phylogenetically closest species is the jararaca found on the continent (B. jararaca). Considering the importance of feeding and growth in various aspects of snake life, the study of different types of prey in relation to growth and sexual maturity is of great importance to promote improvements in breeding programs and management of endangered species kept in captivity conservationists. Therefore, this study aims to follow the development (mass and growth) of B. jararaca and B. insularis until sexual maturity evaluating the influence of two types of prey (amphibian and mammal). Individuals were divided into groups by type of prey offered, sex and feeding frequency (groups fed every 15 and 30 days) and fed with a proportion of 30% of the body mass of each individual. We observe that in the first six months of life the snakes exhibit preference for amphibians. Feeding with mouse and higher frequency (every 15 days) provided a higher growth compared to the animals fed with frog initially. In addition, for B. insularis, the animals fed with mouse every 15 days were sexually mature younger and with a larger size, whereas in B. jararaca the prey type did not influence the maturity of the males, however it had an evident influence on the females. We conclude that the diet offered in captivity influences the growth and size of the sexual maturity of snakes.

A espécie Bothrops atrox é responsável por grande parte dos acidentes no estado do Amazonas. No entanto, ainda são poucos os estudos sobre as toxinas que compõem o veneno dessa serpente, os mecanismos envolvidos na sintomatologia dos acidentes, bem como de formas de inibição. Os soros antiveneno utilizados atualmente com o objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos mostraram reatividade cruzada entre componentes dos venenos de serpentes do gênero Bofhrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). No entanto alguns componentes do veneno não apresentaram essa reatividade (SILES-VILARROEL et al.., 1974), mostrando a existência de toxinas espécie específicas.Os venenos de serpentes estão sujeitos a grandes variações induzidas por diversos aspectos ontogenéticos e influencia do habitat. Assim, essas variações podem gerar toxinas espécie específicas cujos mecanismos de ação ainda são desconhecidos e que os anticorpos presentes nos antivenenos disponíveis não sejam capazes de reconhecer e neutralizar eficientemente. O gênero Bothrops possui espécies extremamente variáveis, algumas de difícil classificação taxonõmica, e novas espécies têm sido descobertas recentemente. Como contribuição para o acúmulo de informações a respeito das diferentes composições do veneno do gênero Bothrops, e para o conhecimento de toxinas já isoladas e as ainda não isoladas na espécie tipo Bothrops atrox, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno.Os dados obtidos são importantes para a elaboração de um painel da expressão gênica dessa espécie e permitirá a identificação de toxinas que podem ser comuns ou não ao veneno de outras espécies do gênero. Aliado a isso, esses dados permitirão a correlação com o estudo proteõmico, e possivelmente fornecerão subsídios para a melhoria da terapêutica empregada no tratamento dos casos envenamento na região.
The species Bothrops atrox is responsible for most accidents in state of Amazonas. However, there are few studies on toxins that make up the venom of this snake, mechanisms involved in symptomatology of accidents, as well as inhibition forms. Sera antivenom currently used in order to neutralize the systemic and local activities of the venoms showed cross-reactivity between components of the venom of Bothrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). However some components of the venom showed no reactivity (SILES-VILARROEL et al., 1974), indicating the existence of species-specific toxins. Snake venoms are subject to large variations induced by several aspects and influences of ontogenetic habitat. Thus, these variations can produce toxins whose mechanisms of species-specific action are still unknown and antibodies present in available antivenoms maybe not are capable to recognize and neutralize some toxins efficiently. Bothrops species have highly variable, some of difficult taxonomic classification and new species have been discovered recently. As a contribution to gain of information about of different compositions of Bothrops venom and to knowledge of toxins not yet isolated and the isolated in Bothrops atrox type species we constructed a venom gland cDNA library . The data obtained are important for the development of gene expression panel of this species and enable the identification of toxins common or not in the venom of other species. These data will allow correlation with the proteomic study, and possibly provide input for improving the therapeutic used in the treatment of accidents cases in the region.

No Brasil, 90% dos acidentes por serpentes peçonhentas são causadas por Bothropsafin (Bothrops, Bothropoides, Bothriopsis, Bothrocophias e Rhinocerophis), com predominância nos meses quentes e chuvosos, atingindo principalmente trabalhadores rurais do sexo masculino. Na região Sudeste, a serpente peçonhenta mais encontrada são as da espécie Bothropoides jararaca, devido ao fato de possuírem grande capacidade adaptativa. Os acidentes são classificados em leve, moderado e grave, porém números desconhecidos de acidentes não causam envenenamento. Este trabalho foi realizado entre 1990 a 2004, no Hospital Vital Brasil, em pacientes picados por Bothropoides jararaca (n = 792) através de prontuários médicos. A maioria dos acidentes foi causada por serpentes fêmeas e filhotes. A ausência de conteúdo estomacal foi encontrada em 93,4% dos espécimes de serpentes. Não houve diferença estatística entre a ocorrência de picadas de seca e da maturidade da serpente. Observou-se que a necrose foi mais comum nos dedos dos pés e mãos (4,8%) em comparação com as outras regiões do corpo (1,8%). Houve diferença significativa entre a gravidade e o intervalo de tempo entre a picada e a admissão hospitalar superior a seis horas. Foi encontrada associação significativa entre gengivorragia e incoagulabilidade sanguínea. Nos acidentes causados por serpentes adultas, a necrose foi mais freqüente (7,2%) quando comparado aos acidentes causados por filhotes (1%). Neste trabalho destaca-se a associação entre alguns dados epidemiológicos e biológicos em relação ao quadro clínico nos acidente botrópicos, contribuindo para a melhoria do atendimento desses acidentes
In Brazil, 90% of the venomous snake bites are caused by Bothrops, Bothropoides, Bothriopsis, Bothrocophias and Rhinocerophis, predominantly from hot and rainy months. Bothropoides jararaca is widespread in the south, southeastern and part of the northeastern Brazil. Due to the fact they have great adaptative capacity, it is the predominate species in São Paulo City and neighborhood. A retrospective study was made in patients bitten by Bothropoides jararaca (n= 792) between 1990 to 2004 in Hospital Vital Brazil, São Paulo, Brazil. The data was obtained from medical records. The majority of the cases in this study were caused by female and juvenile snakes. No stomach contents were found in 93.4% of the snake specimens. There was no statistical difference found between the occurrence of dry bites and the maturity or sex of the snake. We observed that necrosis was more common in the digits of the feet and hands (4.8%) compared to the other body regions (1.8%). Significant difference was found between severity and time interval greater than 6 hours between the bite and hospital admission. We found a significant association between gingival bleeding and abnormal blood coagulability. It was observed that in accidents caused by adult snakes, necrosis was more frequent (7.2%) when compared to accidents caused by juvenile snakes (1%). On this work we highlight the association between some epidemiological data and biological parameters evolved in the clinical picture of Bothrops-like accidents, contributing to improvement of the snake bite assistance

Orientador: Lea Rodrigues Simioni
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-12T23:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monzon_GeorginaSucasaca_M.pdf: 3056250 bytes, checksum: d246d55d0b29698ce7253fb6a9fc3f6a (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: O veneno botrópico possui uma mistura de substâncias protéicas necessárias para a sobrevivência da serpente, dentre elas, as mais amplamente estudadas são as fosfolipases A2, que hidrolisam glicerofosfolipídios de membrana na posição sn-2, liberando isofosfolipídios e ácidos graxos, que além de desempenhar uma ação biológica no processo de digestão de lipídios, exibem também uma ampla variedade de efeitos farmacológicos. O presente trabalho teve como objetivo, caracterizar farmacologicamente uma nova fosfolipase A2 denominada Bp-13 do veneno de Bothrops pauloensis, serpente endêmica do cerrado brasileiro, avaliando sua ação sobre a junção neuromuscular, efeito miotóxico e atividade edematogênica. A Bp-13 foi purificada utilizando-se o sistema cromatográfico HPLC de fase reversa em coluna µ-Bondapack C18; possuindo uma massa molecular de 14 035 Da e atividade catalítica de 2,43 nmol/min/mg (30-35 ºC), dependente de Ca2+ porém inibida por Mg2+, Mn2+, Cd2+ e Sr2+. A atividade neuromuscular foi avaliada em preparações biventer cervicis (BC) de pintainho, extensor digitorum longus (EDL) e nervo frênico-diafragma (NFD) de camundongo, sob estimulação elétrica indireta durante 120 min a 37 ºC. A Bp-13 (3,56 µM) induziu bloqueio neuromuscular completo e irreversível, nas preparações de mamífero, que se mostraram mais sensíveis à ação da toxina do que as preparações de ave. Em preparação BC de pintainho o bloqueio neuromuscular foi de 28 ± 2 % após 120 min de incubação com a Bp-13 (7,12 µM) e a contratura evocada após a adição exógena de ACh foi parcialmente inibida. Concentrações menores (0,71 e 1,42 µM) foram testadas na preparação NFD de camundongo, induzindo o bloqueio da resposta contrátil em 29 ± 5 % e 55 ± 6 %, respectivamente. Em alguns experimentos, onde o Ca2+ foi substituído pelo Sr2+ na solução de Tyrode houve ausência do bloqueio neuromuscular característico da Bp-13 (3,56 µM); evento semelhante foi observado quando a temperatura do banho foi alterada de 37 ºC para 24 ºC, com bloqueio de 37,4 ± 6 % da resposta contrátil. A Bp-13 (3,56 µM) foi capaz de inibir a resposta contrátil a estímulo elétrico direto em preparações NFD de camundongo previamente curarizadas. Com o estudo eletrofisiológico realizado em preparação músculo hemidiafragma de camundongo, avaliaram-se os potenciais de membrana em repouso (PM). A Bp-13 (3,56 µM) causou uma despolarização progressiva do sarcolema, alcançando valores de -80 ± 1 mV (controle) até -37 ± 3 mV após 120 min de incubação com a toxina. Em preparações músculo diafragma pré-tratadas com d-Tubocurarina (10 µM), observou-se uma redução da despolarização induzida pela da Bp-13 (-37 ± 3 mV para -58 ± 2 mV). A miotoxicidade foi avaliada in vitro através de análise morfológica do músculo diafragma de camundongo e in vivo através da determinação da atividade de creatinoquinase (CK). Na análise morfológica considerou-se fibras normais as que mantiveram íntegro o sarcolema com o formato poligonal e fibras alteradas as que apresentavam hipercontração das miofibrilas, células com lesão tipo delta, edemaciadas e vacuolizadas. A porcentagem de fibras lesadas de preparações incubadas com o veneno de Bothrops pauloensis (100 e 50 µg/mL) foi de 14,4 ± 3 % e 8,7 ± 3 % respectivamente; e com a fração Bp-13 (20 e 50 µg/mL) foi de 8,3 ± 4 % e 30,6 ± 5 %, respectivamente. Quando as preparações foram mantidas em solução de Tyrode, onde o Ca2+ foi substituído pelo Sr2+, as alterações morfológicas foram de 36,7 ± 11 %, ou seja, semelhante aos valores observados com a Bp-13 na solução de Tyrode normal. O aumento nos valores de liberação de creatinoquinase, após 30 min da injeção da Bp-13, revelou o efeito miotóxico in vivo, valores que retornaram ao normal após 6 horas. A dose de 10 µg/pata de Bp-13 injetada em ratos via intraplantar induziram a formação de edema de pata após 15 min de injeção da toxina. Conclui-se, então, que a Bp-13 é uma miotoxina, que inibe a resposta neuromuscular dependente de temperatura e de Ca2+, em preparações isoladas EDL e NFD de camundongo, sugerindo que a atividade catalítica possivelmente contribua com o evento farmacológico, embora o efeito mionecrótico in vitro não seja afetado, indicando uma dissociação entre estes efeitos.
Abstract: Bothropic venom has several substances necessary to serpent survival, among them, one of the most widely studied are phospholipase A2 enzymes, that hydrolise sn-2 from membrane phospholipids, releasing lysophospholipids and fatty acids, which beyond playing a biological action in the lipid digestion process, also exhibit a wide variety of pharmacological effects. The present work had as objective to characterize pharmacologically a new phospholipase A2 denominated Bp-13 from the Bothrops pauloensis (endemic serpent to the Brazilian cerrado) venom, evaluating its action at neuromuscular junction, myotoxic effect and edematogenic activity. Bp-13 was purified through chromatographic system, a reverse phase HPLC on a µ-Bondapack C18 column; it has a molecular mass of 14 035 Da, 2,43 nmol/min/mg (30- 35 ºC) catalytic activity Ca2+ dependent, however it was inhibited by Mg2+, Mn2+, Cd2+ and Sr2+. Neuromuscular activity was evaluated in chick biventer cervicis (BC) preparations, extensor digitorum longus (EDL) and mouse phrenic nerve-diaphragm (PND), under indirect electrical stimulation during 120 minutes, at 37oC. Bp-13 (3,56 µM) induced complete and irreversible neuromuscular block in mammalian preparations, which showed to be more sensitive to toxin action than bird preparations. In chick BC preparation, neuromuscular block was 28 ± 2 % after 120 minutes incubation with Bp-13 (7,12 µM) and evoked contracture after exogenous ACh addiction was partially inhibited. Smaller concentrations (0,71 e 1,42 µM) were tested in mouse PND preparation, inducing block of the contractile response in 29 ± 5 % and 55 ± 6 %, respectively. In some experiments, where Ca2+ was substituted for Sr2+ in Tyrode's solution, there was absence of the Bp-13 characteristic neuromuscular block (3,56 µM); similar event was observed when the bath temperature was altered from 37 ºC to 24 ºC, with a block of 37,4 ± 6 % of the contractile response. Bp-13 (3,56 µM) was able to inhibit contractile response to direct electrical stimulus in previously curarized mouse PND preparations. Through electrophysiological study performed in mouse hemidiaphragm muscle preparation, membrane potentials at rest were evaluated (MP). Bp-13 (3,56 µM) caused a progressive sarcolemma depolarization, reaching values from -80 ± 1 mV (control) until - 37 ± 3 mV after 120 minutes in toxin incubation. In d-tubocurarine (10 µM) pre-treated hemidiaphragm muscle preparations, a depolarization reduction was observed, induced by Bp-13 (-37 ± 3 mV to -58 ± 2 mV). Myotoxicity was evaluated in vitro through morphological analysis of the mouse hemidiaphragm muscle and in vivo through determination of creatinkinase (CK) activity. Regarding morphological analysis, fibers which maintained intact sarcolemma with polygonal shape were considered normal, and fibers which presented hypercontraction of myofibrils, delta type lesion cells, edemaciated and vacuolized, were considered altered fibers. Lesioned fibers from Bothrops pauloensis (100 and 50 µg/mL) venom incubated preparations were 14,4 ± 3 % and 8,7 ± 3 % , respectively; and for Bp-13 fraction (20 e 50 µg/mL) they were 8,3 ± 4 % and 30,6 ± 5 %, respectively. When preparations were Ca2+ was substituted for Sr2+, morphological maintained in Tyrode's solution, where alterations were 36,7 ± 11 %, that is similar to the observed values with Bp-13 in normal Tyrode's solution. The increase in creatinkinase release values after 30 minutes of Bp-13 injection revealed in vivo myotoxic effect, values that returned to normal after 6 hours. Bp-13 concentration of 10 µg injected in rats via intraplantar induced paw edema formation after 15 minutes of toxin injection. In conclusion, Bp-13 is a myotoxin that inhibits temperature and Ca2+ dependent neuromuscular response in mouse EDL and PND isolated preparations, suggesting that its catalytic activity possibly contributes to the pharmacological event, although in vitro myotoxic activity was unaffected by these treatments, indicating a dissociation between these effects.
Mestrado
Mestre em Farmacologia

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-22T22:19:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilcaQuispe_Augusto_D.pdf: 3256672 bytes, checksum: 5fbbaf997230230025e7a3945d3d9410 (MD5) Previous issue date: 2013
Resumo: No presente trabalho duas novas serinoproteases com atividade trombina-simile, nomeadas TLBbz e TLBro isoladas a partir de Bothrops brazili e Bothrops roedingeri respectivamente, foram purificadas em um único passo cromatográfico por HPLC de fase reversa com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. Ambas serinoproteases foram caracterizadas fisico-quimicamente, revelando uma massa molecular relativa de TLBbz = 35,13 KDa e TLBro = 20,24 KDa por SDS-PAGE. Ambas apresentaram atividade proteolítica perante o substrato cromogenico DL-Ba?NA. Os estudos da atividade cinética mostraram que as serinoproteases tiveram um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-Ba?NA, apresentando uma Vmax = 1,89 nmoles ?-NA/Lt/min e KM = 0,853 mM para TLBbz; e Vmax = 0,0432 nmoles ?-NA/Lt/min e KM = 0,039 mM para TLBro. Ambas serinoproteases apresentam uma atividade ótima em torno de 38 oC e pH 8,0; sendo inibidas pela ação do fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e outros inibidores, através dos quais a atividade trombina-simile foi reduzida em mais dos 50 % (TLBbz = 86.2 % and TLBro = 42.6 %). Ambas TLBbz e TLBro possuem caráter acido ao apresentar um elevado numero de aminoácidos ácidos, assim como uma boa quantidade em numero de aminoácidos hidrofóbicos, o que garante a estabilidade conformacional da proteína. A presença de 12 cisteinas sugere a possível formação de 6 pontes dissulfeto. TLBbz e TLBro evidenciaram uma atividade fibrinogenolitica frente ao fibrinogenio bovino hidrolisando a cadeia alfa (?) e beta (?), comportando-se como uma trombina-simile tipo AB no caso da TLBro e tipo B, por hidrolizar a cadeia beta (?), no caso da TLBbz. Finalmente, estudos da atividade biológica indicam a propriedade de induzir agregação plaquetaria e esse efeito e inibido pela presença de PMSF
Abstract: In this work, two new serine proteases with thrombin-like activity called TLBbz and TLBro from Bothrops brazili and Bothrops roedingeri respectively were purified in a single chromatographic step by reverse phase HPLC with a high degree of purity and molecular homogeneity without loss of biological activity. Both serine proteases have been characterized physico-chemically, showing a relative molecular mass of TLBbz = 35.13 and TLBro = 20.24 kDa by SDS-PAGE. On the other hand, showed a proteolytic activity towards the chromogenic substrate DL-Ba?NA. The studies of the kinetic activity showed that serine proteases have a michaelian behavior when tested with the substrate DL-Ba?NA, with a Vmax = 1.89 nmoles ?- NA/Lt/min and KM = 0.853 mM for TLBbz, and Vmax = 0.0432 nmoles ?-NA/Lt/min and KM = 0.039 mM for TLBro. Both serine proteases have an optimal activity around 38 °C and pH 8,0; and were inhibited by the action of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and other inhibitors, whereby the thrombin-like activity was reduced in more than 50 % (TLBbz = 86.2 % and TLBro = 42.6 %). Both TLBbz and TLBro have acidic character by presenting a large number of aminoacids acids and a good amount of hydrophobic amino acids, which ensures the conformational stability of the protein. The presence of 12 cysteines suggests the possible formation of six disulfide bridges. TLBbz and TLBro showed a fibrinogenolytic activity against the bovine fibrinogen and hidrolise alpha (?) and beta (?) chain, behaving as a thrombin-like AB types in the case of TLBro and hydrolyzing the beta chain (?) behaving as a thrombin-like B types in the case of TLBbz. Finally, studies of biological activity indicate the ability to induce platelet aggregation and this effect is inhibited by the presence of PMSF
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório.
Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
A insuficiÃncia renal aguda à uma das complicaÃÃes mais freqÃentes nos envenenamentos ofÃdicos. Contudo, a sua patogÃnese permanece obscura. Em nossos estudos foram avaliados os efeitos renais causados pelas miotoxinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu (Bthtx I, Lys 49 e Bthtx II, Asp 49) e Bothrops moojeni (BmTx I, Lys 49), assim como pelas lectinas dos venenos de Bothrops moojeni (BmLec) e Bothrops jararacussu (BJcuL). Tentando avaliar o mecanismo envolvido nos efeitos renais das substÃncias acima mencionadas, foram testados os efeitos da indometacina, um bloqueador inespecÃfico de ciclooxigenase. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos inibitÃrios do Tezosentan, um bloqueador de receptor de endotelina, nos efeitos renais causados pela miotoxina I da serpente Bothrops moojeni. Para tanto, as miotoxinas, na dosagem de 5Âg/mL, ou as lectinas, na dosagem de 10Âg/mL foram adicionadas 30 minutos depois do inÃcio dos experimentos. Contudo, a indometacina e o tezosentan foram adicionados no sistema de perfusÃo sempre no inÃcio de cada experimento na dosagem de 10Âg/mL. Os efeitos renais foram comparados com um grupo controle, onde os rins foram perfundidos somente com a soluÃÃo de Krebs-Henseleit modificada. Bthtx I, BthtxII e BmLec aumentaram a pressÃo de perfusÃo (C120= 110,28  3,09, Bthtx I120 = 171,20  6,3 *, Bthtx II120 = 175,50  7,20 * e BmLec120 = 152,50  2,10 *), a resistÃncia vascular renal (C120= 5,46  0,54, Bthtx I120= 8,62  0,37 *, Bthtx II120= 8,90  0,36 * e BmLec120= 7,77  0,30*), o fluxo urinÃrio (C120= 0,143  0,008, Bthtx I120= 0,326  0,048*, e Bthtx II120= 0,373  0,085*, BmLec120= 0,085  0,007* ), o ritmo de filtraÃÃo glomerular (C120= 0,678  0,065, Bthtx I120= 0,855  0,133 *, Bthtx II120= 1,224  0,282*, BmLec120=1,037  0,055*) e a excreÃÃo de sÃdio potÃssio e cloreto (ENa+, EK+, ECl-). PorÃm, diminuÃram os percentuais dos transportes tubulares de sÃdio (C120= 79,76  0,56, Bthtx I120= 62,23  4,12*, Bthtx II120= 70,96  2,93* e BmLec60= 77,25  1,36*) e potÃssio (C60= 66,38  3,31, Bthtx I60= 55,79  5,57 *, Bthtx II60= 50,86  6,16* e BmLec60= 59,78  3,49). A indometacina foi capaz de bloquear os efeitos causados pela miotoxina I da B. jararacussu e lectina da B. moojeni, mas reverteu parcialmente os efeitos causados pelas miotoxinas II e lectina da B. jararacussu e miotoxina I da B. moojeni. O tezosentan, por sua vez, bloqueou os efeitos causados pela miotoxina I da B. moojeni. Foi concluÃdo que prostaglandinas estÃo envolvidas nas alteraÃÃes renais promovidas pelas substÃncias isoladas das serpentes B. jararacussu e B. moojeni, enquanto que endotelina seria o principal mediador nas alteraÃÃes renais causadas pela miotoxina I da B. moojeni.
Acute renal failure is one of the most common systemic complications after snakebite. However, its pathogenesis remains obscure. In this study, we evaluated the renal effects of Bothrops jararacussu myotoxins I and II (Bthtx-I Lys 49 and BthtxII, Asp 49), Bothrops moojeni myotoxin I and the lectins from Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu. Attempting to investigate the mechanisms involved in the renal effects of the mentioned toxins, we tested indomethacin, an unespecific cyclooxigenase inhibitor. Additionally, tezosentan, an endothelin receptor blocker, was used to evaluate the role of endothelin in the renal effects of Bothrops moojeni myotoxin I. All myotoxins (5 Âg/mL) and lectins (10Âg /mL) were added to the perfusion system 30 min after the beginning of each perfusion. Indomethacin (10Âg/mL) and tezosentan (10 Âg /mL) were always added 30 minutes before the tested substances. The renal effects were compared against a control group, where kidneys were perfused only with the modified Krebs-Henseleit solution. Myotoxins from Bothrops jararacussu and the lectin from Bothrops moojeni increased the perfusion pressure (C120= 110.28 Â 3.09, Bthtx I120= 171.20 Â 6.3 * ,Bthtx II120= 175.50 Â 7.20 * and BmLec120= 152.50 Â 2.10 *), the renal vascular resistance (C120= 5.46 Â 0.54, Bthtx I120= 8.62 Â 0.37 *, Bthtx II120= 8.90 Â 0.36 * and BmLec120= 7.77 Â 0.30*), the urinary flow (C120= 0.143 Â 0.008, Bthtx I120= 0.326 Â 0.048*, and Bthtx II120= 0.373 Â 0.085* ), the glomerular filtration rate (C120= 0.678 Â 0.065, Bthtx I120= 0.855 Â 0.133 *, Bthtx II120= 1.224 Â 0.282* and BmLec120= 1.037 Â 0.055*) and the sodium, potassium and chloride excretion. On the other hand, the same substances decreased the percent of renal tubular transport of sodium (C120= 79.76 Â 0.56, Bthtx I120= 62.23 Â 4.12*, Bthtx II120= 70.96 Â 2.93* and BmLec60= 77.25 Â 1.36*), potassium (C60= 66.38 Â 3.31, Bthtx I60= 55.79 Â 5.57 *, Bthtx II60= 50.86 Â 6.16* and BmLec60= 59.78 Â 3.49*). Indomethacin inhibited the renal effects induced by Bothrops jararacussu myotoxin I and Bothrops moojeni lectin, but partially blocked the effects promoted by myotoxin II and the lectin of Bothrops jararacussu, and the effects of myotoxin I of Bothrops moojeni. Tezosentan inhibited the renal effects induced by B. moojeni myotoxin I. In conclusion, prostaglandins are involved in the renal alterations induced by myotoxins and lectins purified from the snake venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni. In addition, endothelin is the main mediator of the renal alterations promoted by Bothrops moojeni myotoxin I

BARBOSA, Paulo Sérgio Ferreira. Efeitos renais de miotoxinas e lectinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu e Bthrops moojeni : papel da ciclooxigenase e endotelina. 2006. 175 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006.
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Acute renal failure is one of the most common systemic complications after snakebite. However, its pathogenesis remains obscure. In this study, we evaluated the renal effects of Bothrops jararacussu myotoxins I and II (Bthtx-I Lys 49 and BthtxII, Asp 49), Bothrops moojeni myotoxin I and the lectins from Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu. Attempting to investigate the mechanisms involved in the renal effects of the mentioned toxins, we tested indomethacin, an unespecific cyclooxigenase inhibitor. Additionally, tezosentan, an endothelin receptor blocker, was used to evaluate the role of endothelin in the renal effects of Bothrops moojeni myotoxin I. All myotoxins (5 µg/mL) and lectins (10µg /mL) were added to the perfusion system 30 min after the beginning of each perfusion. Indomethacin (10µg/mL) and tezosentan (10 µg /mL) were always added 30 minutes before the tested substances. The renal effects were compared against a control group, where kidneys were perfused only with the modified Krebs-Henseleit solution. Myotoxins from Bothrops jararacussu and the lectin from Bothrops moojeni increased the perfusion pressure (C120= 110.28 ± 3.09, Bthtx I120= 171.20 ± 6.3 * ,Bthtx II120= 175.50 ± 7.20 * and BmLec120= 152.50 ± 2.10 *), the renal vascular resistance (C120= 5.46 ± 0.54, Bthtx I120= 8.62 ± 0.37 *, Bthtx II120= 8.90 ± 0.36 * and BmLec120= 7.77 ± 0.30*), the urinary flow (C120= 0.143 ± 0.008, Bthtx I120= 0.326 ± 0.048*, and Bthtx II120= 0.373 ± 0.085* ), the glomerular filtration rate (C120= 0.678 ± 0.065, Bthtx I120= 0.855 ± 0.133 *, Bthtx II120= 1.224 ± 0.282* and BmLec120= 1.037 ± 0.055*) and the sodium, potassium and chloride excretion. On the other hand, the same substances decreased the percent of renal tubular transport of sodium (C120= 79.76 ± 0.56, Bthtx I120= 62.23 ± 4.12*, Bthtx II120= 70.96 ± 2.93* and BmLec60= 77.25 ± 1.36*), potassium (C60= 66.38 ± 3.31, Bthtx I60= 55.79 ± 5.57 *, Bthtx II60= 50.86 ± 6.16* and BmLec60= 59.78 ± 3.49*). Indomethacin inhibited the renal effects induced by Bothrops jararacussu myotoxin I and Bothrops moojeni lectin, but partially blocked the effects promoted by myotoxin II and the lectin of Bothrops jararacussu, and the effects of myotoxin I of Bothrops moojeni. Tezosentan inhibited the renal effects induced by B. moojeni myotoxin I. In conclusion, prostaglandins are involved in the renal alterations induced by myotoxins and lectins purified from the snake venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni. In addition, endothelin is the main mediator of the renal alterations promoted by Bothrops moojeni myotoxin I
A insuficiência renal aguda é uma das complicações mais freqüentes nos envenenamentos ofídicos. Contudo, a sua patogênese permanece obscura. Em nossos estudos foram avaliados os efeitos renais causados pelas miotoxinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu (Bthtx I, Lys 49 e Bthtx II, Asp 49) e Bothrops moojeni (BmTx I, Lys 49), assim como pelas lectinas dos venenos de Bothrops moojeni (BmLec) e Bothrops jararacussu (BJcuL). Tentando avaliar o mecanismo envolvido nos efeitos renais das substâncias acima mencionadas, foram testados os efeitos da indometacina, um bloqueador inespecífico de ciclooxigenase. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos inibitórios do Tezosentan, um bloqueador de receptor de endotelina, nos efeitos renais causados pela miotoxina I da serpente Bothrops moojeni. Para tanto, as miotoxinas, na dosagem de 5µg/mL, ou as lectinas, na dosagem de 10µg/mL foram adicionadas 30 minutos depois do início dos experimentos. Contudo, a indometacina e o tezosentan foram adicionados no sistema de perfusão sempre no início de cada experimento na dosagem de 10µg/mL. Os efeitos renais foram comparados com um grupo controle, onde os rins foram perfundidos somente com a solução de Krebs-Henseleit modificada. Bthtx I, BthtxII e BmLec aumentaram a pressão de perfusão (C120= 110,28 ± 3,09, Bthtx I120 = 171,20 ± 6,3 *, Bthtx II120 = 175,50 ± 7,20 * e BmLec120 = 152,50 ± 2,10 *), a resistência vascular renal (C120= 5,46 ± 0,54, Bthtx I120= 8,62 ± 0,37 *, Bthtx II120= 8,90 ± 0,36 * e BmLec120= 7,77 ± 0,30*), o fluxo urinário (C120= 0,143 ± 0,008, Bthtx I120= 0,326 ± 0,048*, e Bthtx II120= 0,373 ± 0,085*, BmLec120= 0,085 ± 0,007* ), o ritmo de filtração glomerular (C120= 0,678 ± 0,065, Bthtx I120= 0,855 ± 0,133 *, Bthtx II120= 1,224 ± 0,282*, BmLec120=1,037 ± 0,055*) e a excreção de sódio potássio e cloreto (ENa+, EK+, ECl-). Porém, diminuíram os percentuais dos transportes tubulares de sódio (C120= 79,76 ± 0,56, Bthtx I120= 62,23 ± 4,12*, Bthtx II120= 70,96 ± 2,93* e BmLec60= 77,25 ± 1,36*) e potássio (C60= 66,38 ± 3,31, Bthtx I60= 55,79 ± 5,57 *, Bthtx II60= 50,86 ± 6,16* e BmLec60= 59,78 ± 3,49). A indometacina foi capaz de bloquear os efeitos causados pela miotoxina I da B. jararacussu e lectina da B. moojeni, mas reverteu parcialmente os efeitos causados pelas miotoxinas II e lectina da B. jararacussu e miotoxina I da B. moojeni. O tezosentan, por sua vez, bloqueou os efeitos causados pela miotoxina I da B. moojeni. Foi concluído que prostaglandinas estão envolvidas nas alterações renais promovidas pelas substâncias isoladas das serpentes B. jararacussu e B. moojeni, enquanto que endotelina seria o principal mediador nas alterações renais causadas pela miotoxina I da B. moojeni.

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O ensaio imunoenzimático de ELISA foi utilizado para avaliar, acompanhar e comparar a resposta imune humoral de camundongos SWISS durante o processo de hiperimunização com veneno nativo e irradiado com Cobalto-60 (60Co) obtido das serpentes Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni. A potência e a capacidade de neutralização foram avaliadas por meio de desafios “in vitro”. A imunidade obtida ao final do processo de hiperimunização foi verificada mediante desafio “in vivo” e os efeitos colaterais foram avaliados. A imunização dos animais, com uma DL50 de cada veneno, ocorreu nos dias um, 15, 21, 30 e 45, quando foram colhidas amostras de sangue. No 60º dia ocorreram os desafios. Os resultados demonstraram que o teste de ELISA mostrou-se eficiente na avaliação, acompanhamento e comparação da resposta imune dos camundongos durante o processo de hiperimunização. Os títulos do soro produzido com veneno nativo foram semelhantes aos títulos do soro obtido com veneno irradiado. A capacidade imunogênica foi mantida após a irradiação com 60Co. O soro produzido a partir do veneno irradiado de Crotalus durissus terrificus apresentou potência e capacidade de neutralização maiores, quando comparado ao soro obtido a partir do veneno nativo.Os anticorpos antiveneno nativo e irradiado, mediante os desafios “in vitro”, mostraram-se igualmente eficazes na neutralização dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops. Todos anticorpos foram capazes de neutralizar cinco DL50 dos respectivos venenos. As alterações clínicas foram mínimas durante o processo de hiperimunização com veneno irradiado e evidentes com veneno bruto.
ELISA was used to evaluate, follow, and compare the humoral immune response of Swiss mice during hyperimmunization with natural and Cobalt-60- irradiated (60Co) Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. Potency and neutralization were evaluated by in vitro challenges. After hyperimmunization, immunity was observed by in vivo challenge and the side effects were assessed. The animals’ immunization with one LD50 of each venom was on days one, 15, 21, 30, and 45, when blood samples were collected; the challenges occurred on the 60th day. Results showed that ELISA was efficient in evaluating, following, and comparing mouse immune response during hyperimmunization. Serum titers produced with natural venom were similar to those with irradiated venom. Immunogenic capacity was maintained after 60Co irradiation. Serum produced from Crotalus durissus terrificus irradiated venom showed higher potency and neutralization capacity than that from natural venom. Antibodies from natural and irradiated venom by in vitro challenges were also efficient in neutralizing Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. All antibodies were capable of neutralizing five LD50 from these venoms. Clinical alterations were minimum during hyperimmunization with irradiated venom and evident with natural venom.

Resumo: O ensaio imunoenzimático de ELISA foi utilizado para avaliar, acompanhar e comparar a resposta imune humoral de camundongos SWISS durante o processo de hiperimunização com veneno nativo e irradiado com Cobalto-60 (60Co) obtido das serpentes Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni. A potência e a capacidade de neutralização foram avaliadas por meio de desafios "in vitro". A imunidade obtida ao final do processo de hiperimunização foi verificada mediante desafio "in vivo" e os efeitos colaterais foram avaliados. A imunização dos animais, com uma DL50 de cada veneno, ocorreu nos dias um, 15, 21, 30 e 45, quando foram colhidas amostras de sangue. No 60º dia ocorreram os desafios. Os resultados demonstraram que o teste de ELISA mostrou-se eficiente na avaliação, acompanhamento e comparação da resposta imune dos camundongos durante o processo de hiperimunização. Os títulos do soro produzido com veneno nativo foram semelhantes aos títulos do soro obtido com veneno irradiado. A capacidade imunogênica foi mantida após a irradiação com 60Co. O soro produzido a partir do veneno irradiado de Crotalus durissus terrificus apresentou potência e capacidade de neutralização maiores, quando comparado ao soro obtido a partir do veneno nativo.Os anticorpos antiveneno nativo e irradiado, mediante os desafios "in vitro", mostraram-se igualmente eficazes na neutralização dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops. Todos anticorpos foram capazes de neutralizar cinco DL50 dos respectivos venenos. As alterações clínicas foram mínimas durante o processo de hiperimunização com veneno irradiado e evidentes com veneno bruto.
Abstract: ELISA was used to evaluate, follow, and compare the humoral immune response of Swiss mice during hyperimmunization with natural and Cobalt-60- irradiated (60Co) Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. Potency and neutralization were evaluated by in vitro challenges. After hyperimmunization, immunity was observed by in vivo challenge and the side effects were assessed. The animals' immunization with one LD50 of each venom was on days one, 15, 21, 30, and 45, when blood samples were collected; the challenges occurred on the 60th day. Results showed that ELISA was efficient in evaluating, following, and comparing mouse immune response during hyperimmunization. Serum titers produced with natural venom were similar to those with irradiated venom. Immunogenic capacity was maintained after 60Co irradiation. Serum produced from Crotalus durissus terrificus irradiated venom showed higher potency and neutralization capacity than that from natural venom. Antibodies from natural and irradiated venom by in vitro challenges were also efficient in neutralizing Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. All antibodies were capable of neutralizing five LD50 from these venoms. Clinical alterations were minimum during hyperimmunization with irradiated venom and evident with natural venom.
Orientador: Domingos Alves Meira
Coorientador: Benedito Barraviera
Mestre

Na região nordeste é registrado o maior índice de letalidade por acidentes ofídicos do Brasil. As serpentes Bothrops erythromelas (Be) são as responsáveis pela maioria dos acidentes na região, e o veneno dessa serpente não integra o pool de antígenos utilizado pata a obtenção do soro antibotrópico (SAB). Nesse estudo avaliou-se a potência do SAB na neutralização de algumas atividades do veneno (V) de Be. Os resultados mostraram que o SAB neutraliza as atividades do VBe, mas, exceto para a atividade coagulante e letalidade, a potência do SAB foi significativamente menor, quando comparado à neutralização das mesmas atividades do veneno de B. jararaca. A utilização de um soro obtido após a inclusão do VBe ao pool de antígenos não melhorou significativamente a potência do SAB. O SAB neutralizou também o edema inflamatório induzido pelo VBe, mas a associação do SAB à dexametasona inibiu o edema quando aplicado até 45 min após o envenenamento. Nesse tempo, SAB ou dexametasona aplicados isoladamente não foram efetivos em diminuir esse edema.
In the northeast region is registered the higher lethality index by snakebites in Brazil. Bothrops erythromelas (Be) snakes are responsible for the larger number of snakebites in that region, and the venom of these snakes do not integrate the pool of antigens used to obtaining the Bothrops antivenom (BAV). In the present study, the potency of this serum in neutralizing some activities of Be venom (V) was evaluated. Results showed that BAV neutralizes BeV activities, but, except for coagulant activity and for lethality, the potency of the BAV was significantly lower, when compared to the neutralization of the same parameters of the Bothrops jararaca venom. The use of antivenom obtained after inclusion of BeV to the pool of antigens did not ameliorate the BAV potency. The BAV also neutralizes the inflammatory edema induced by BeV, but the association of BAV and dexamethasone decreased the edema when applied up to 45 min after the venom. At this time, antivenom or dexamethasone administered alone were ineffective in inhibiting this edema.

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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
Acidentes envolvendo serpentes do gênero Bothrops são uma das principais causas de envenenamento no Brasil, e constituem importante problema de saúde pública devido as elevadas taxas de mortalidade e morbidade. A peçonha de Bothrops provoca danos teciduais locais e o processo inflamatório é uma das suas principais complicações. O tratamento preconizado pela Organização Mundial de Saúde para os acidentes ofídicos constitui na administração de soro hiperimune que neutraliza efeitos sistêmicos, mas não inibe o desenvolvimento de efeitos locais. Desta forma, a busca de tratamentos alternativos/complementares torna-se necessário. Este estudo tem como objetivo caracterizar os constituintes químicos dos extratos de Myrsine parvifolia e avaliar sua ação inibitória sobre os efeitos locais induzidos pela peçonha de B. jararaca e B. jararacussu. No presente estudo, foi determinada a composição química do óleo essencial de frutos e folhas de M. parvifolia e o perfil químico dos extratos bruto hidroetanólico, fração em hexano, fração em diclorometano, fração em acetato de etila, fração em butanol e extrato bruto aquoso de suas folhas. O teor de polifenóis, taninos e de flavonoides totais foi determinado por técnicas espectrofotométricas. As substâncias foram identificadas por técnicas cromatográficas e espectrométricas. A atividade antioxidante foi determinada usando os ensaios de sequestro do radical 1-difenil-2- picrilhidrazila (DPPH). Avaliou-se a capacidade dos extratos em inibir atividade proteolítica e coagulante induzida pela peçonha de B. jararacussu em modelo in vitro e a capacidade de proteção contra letalidade e redução do processo inflamatório (aumento da permeabilidade vascular, edema de pata e migração de leucócitos) induzido pela peçonha de B. jararaca em modelo in vivo. Inibição da proteólise e coagulação induzida pela peçonha de B. jararacussu foi verificada após pré-incubação da peçonha com os extratos (10:1). Camundongos suíços foram pré-tratados com extrato (100 mg/kg) uma hora antes da administração da peçonha de B. jararaca e submetidos ao ensaio de indução de letalidade, edema de pata, aumento da permeabilidade vascular intraperitoneal e pleurisia. Os principais constituintes químicos identificados no óleo essencial de folhas de M. parvifolia foram óxido de cariofileno (14,4%), β-cariofileno (12,6%) e γ-muuroleno (7,9%) e nos frutos β-cariofileno (11,7%) e δ-cadineno (7,1%). Os flavonoides miricetina, miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo, quercetina e kaempferol foram isolados da fração acetato de etila. Terpenos, vitaminas liposolúveis e ácidos graxos foram identificados na fração em hexano e diclorometano. Todos os extratos inibiram atividade proteolítica (81-100%) enquanto que a coagulação induzida por B. jararacussu foi prolongada pelo extrato bruto hidroetanólico e fração em butanol. Verificou-se aumento da taxa de sobrevida entre os animais tratados com fração em acetato de etila (40%). Nos animais tratados com extrato bruto hidroetanólico e fração em diclorometano observaram-se redução do edema total (40 e 52%, respectivamente), redução do aumento da permeabilidade vascular (32,2 e 32,4%, respectivamente) e redução do influxo de leucócitos na cavidade pleural (42 e 39%, respectivamente). No grupo tratado com a fração em hexano observou-se apenas redução do edema (37%). A inibição de enzimas proteoliticas e prócoagulantes da peçonha de B. jararacussu e redução da inflamação induzida pelo envenenamento por B. jararaca, demonstram o potencial antiofidico de folhas de M. parvifolia, principalmente no controle da morbidade observada dos acidentes por serpentes do gênero Bothrops
Accidents involving snakes of the genus Bothrops are one of the main causes of poisoning in Brazil, and represent a significant problem of public health due to its high rates of mortality and morbidity. The Bothrops venom causes local tissue damage and the inflammatory process is one of its major complications. The recommended treatment for snakebites by the World Health Organization is the administration of hyperimmune serum which neutralizes systemic effects, but does not inhibit the development of local effects. Therefore, the search for alternative/complementary treatments becomes necessary. This study aims to characterize the chemical constituents and evaluate the inhibitory effects of Myrsine parvifolia extracts against local effects induced by the Bothrops jararaca and B. jararcussu venom. In the present study, it has been estabilished the chemical composition of the essential oil from the M. parvifolia leaves and fruits and the chemical profile of the hydroethanolic crude, hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol and aqueous crude extracts. The concentration of total phenols, tannins and flavonoids was established using spectrophotometric techniques. Compounds were identified by chromatographic and spectrometric techniques. The antioxidant activity was determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals (DPPH) radical scavenging assay. The extracts ability to inhibit proteolytic and coagulant activity induced by the B. jararacussu venom was determined in vitro and their ability of protection against lethality and reduction of the inflammatory process (increase in vascular permeability, paw edema and leukocyte migration) induced by the B. jararaca venom was determined in vivo. Inhibition of proteolysis and coagulation induced by the B. jararacussu venom was verified after preincubation of the venom with extracts (10: 1). Swiss mice were pretreated with extract (100 mg/kg) one hour before the administration of the B. jararaca venom and then submitted to the assays of lethality, paw edema, increased intraperitoneal vascular permeability and pleurisy. The main substances identified in the essential oil of leaf of M. parvifolia were caryophyllene (14.4%), β-caryophyllene (12.6%) and γ-muurolene (7.9%) and in the fruits β-caryophyllene (11.7%) and δ-cadinene (7.1 %) were identified. The flavonoids myricetin, myricetin-3-O-β-arabinopyranoside, quercetin and kaempferol were isolated from the ethyl acetate extract. Terpenes, fat-soluble vitamins and fatty acids were identified in the hexane and dichloromethane extracts. All extracts inhibited proteolytic activity (81-100%), while coagulant activity induced by the B. jararacussu was inhibited only by hydroethanolic crude and buthanol extracts. There was an increase in survival rates in the animals treated with ethyl acetate extract (40%). In the animals treated with the hydroethanolic crude and dichloromethane extract it was noted total edema reduction (40 and 52 %, respectively), reduction in vascular permeability increase (32.2 and 32.4 %, respectively) and reduction of leukocytes in the pleural cavity (42 and 39 %, respectively). Inhibition of proteolytic and procoagulant enzymes from B. jararacussu venom and the reduction of inflammation induced by B. jararaca poisoning demonstrate the antiofidic potential of M. parvifolia leaves, mainly in the control of morbidity observed in accidents coused by Bothrops snakes

Orientador: Stephen Hyslop
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-25T14:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_IgorRappFerreirada_M.pdf: 2311174 bytes, checksum: c1f5a65bf448cb7a06bd5d1b0764ad1e (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: O envenenamento causado por Bothrops jararaca pode resultar em dor local, edema, hemorragia e mionecrose, parcialmente causados por SVMPs. Neste trabalho, descrevemos a caracterização da BJ-PI2, uma metaloprotease da classe P-I da peçonha de B. jararaca e suas ações em tecidos locais. BJ-PI2 foi purificada por uma combinação cromatográfica de gel-filtração, troca aniônica e fase reversa em HPLC, e identificada por espectrometria de massas. As atividades coagulante e fibrin(ogen)olítica foram medidas por métodos convencionais. A atividade hemorrágica e as alterações na permeabilidade vascular foram examinadas em pele dorsal de ratos. A mionecrose e a atividade inflamatória foram avaliadas em músculo gastrocnêmio de camundongos. BJ-PI2, uma proteína de cadeia única com massa molecular de 23,08 kDa. Fragmentos trípticos da BJ-PI2 mostraram alta homologia com a SVMP insularinase A oriunda de Bothrops insularis, mas também com a bothrojaractivase, uma SVMP oriunda de B. jararaca; foi observada similaridade menor com a BJ-PI e jararafibrases II e IV isoladas de B. jararaca. A BJ-PI2 não coagula fibrinogênio nem plasma citratado de rato porém teve atividade ?- e ?-fibrinogenase (inibidas por EDTA e 1,10- fenantrolina mas não por PMSF) e atenuou a coagulação de plasma induzida pela recalcificação. BJ-PI2 tem atividade fibrinolítica. BJ-PI2 aumentou a permeabilidade vascular em pele dorsal de rato (atividade inibida por 1,10-fenantrolina). BJ-PI2 não provocou hemorragia ou mionecrose, contudo causou migração de células inflamatórias. Em contrapartida, a peçonha foi fortemente hemorrágica e mionecrótica porém causou pouca infiltração de células inflamatórias. Estes resultados indicam que a BJ-PI2 é uma SVMP não hemorrágica, não mionecrótica e não coagulante da classe PI que pode aumentar a permeabilidade vascular e a migração de células inflamatórias in vivo, mas não contribui com a hemorragia e a necrose induzidas pela peçonha
Abstract: Envenoming by Bothrops jararaca can result in local pain, edema, hemorrhage and necrosis, partially mediated by snake venom metalloproteinases (SVMPs). In this work, we describe the characterization of BJ-PI2, a P-I class SVMP from B. jararaca venom, and its local tissue actions. BJ-PI2 was purified by a combination of gel filtration, anion-exchange chromatography and reverse phase HPLC, and identified by mass spectrometry. Clotting and fibrin(ogen)olytic activities were assayed using conventional methods. Hemorrhagic activity and changes in vascular permeability were examined in rat dorsal skin. Myonecrosis and inflammatory activity were examined in mouse gastrocnemius muscle. BJ-PI2 was a 23.08 kDa single-chain polypeptide. Tryptic fragments showed highest homology with SVMP insularinase A from Bothrops insularis, but also with B. jararaca SVMP bothrojaractivase; less similarity was observed with B. jararaca SVMPs BJ-PI and jararafibrases II and IV. BJ-PI2 did not clot fibrinogen or rat citrated plasma but had ?- and ?-fibrinogenolytic activity (inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline but not by PMSF) and attenuated coagulation after plasma recalcification. BJ-PI2 had fibrinolytic activity. BJ-PI2 increased the vascular permeability of rat dorsal skin (inhibited by 1,10-phenanthroline). BJ-PI2 was not hemorrhagic or myonecrotic but caused migration of inflammatory cells. In contrast, venom was strongly hemorrhagic and myonecrotic but caused less infiltration of inflammatory cells. These results indicate that BJ-PI2 is a non-hemorrhagic, non-myonecrotic, non-coagulant P-I class SVMP that may enhance vascular permeability and inflammatory cell migration in vivo, but is not a major contributor to venom-induced hemorrhage and necrosis
Mestrado
Farmacologia
Mestre em Farmacologia

A Bothrops jararaca é a serpente de maior importância médica no Brasil. Vários estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar os componentes do veneno de serpentes, entretanto, a base molecular dos genomas das serpentes é pouco conhecida. Assim, foi realizado o sequenciamento e montagem do genoma da serpente Bothrops jararaca. Foram construídas bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realização de corridas de sequenciamento usando a tecnologia Illumina e sequências complementares foram obtidas em equipamento PACBIO RS II. Uma biblioteca de BACs também foi construída e 768 pools de 12 BACs foram sequenciados. Um grande conjunto de segmentos genômicos foi obtido e foi possível identificar genes de várias toxinas, entre elas SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs e VEGF. Ainda foi possível depreender o contexto genômico de muitos destes genes e identificamos os principais elementos repetitivos genômicos. Estes achados são relevantes para o entendimento da função e evolução do sistema venenífero e podem servir de base para outros estudos futuramente.
The pit viper Bothrops jararaca is the most medically important snake in Brazil. Several studies were conducted in order to characterize the components of snake venom. However, the molecular basis of snake genomes is poorly known. Hence, it was carried out the sequencing and assembly of the Bothrops jararaca snake genome. Shotgun and mate-pair libraries were constructed to perform sequencing runs using Illumina technology and complementary sequences were obtained in PACBIO RS II equipment. A BAC library was also constructed and 768 pools of 12 BACs were sequenced. A large number of genomic segments was obtained. It was possible to identify genes of several toxins, including SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs and VEGF. In addition, it was possible to infer the genomic context related to most of these genes and identify the main genomic repetitive elements. These findings are relevant for understanding the function and evolution of the venom system and it provides the basis for further studies.

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento da semente de Araucaria angustifolia através da proteômica comparativa, buscando compreender as alterações fisiológicas e metabólicas que ocorrem durante esse processo. Inicialmente, foram avaliados três diferentes metodologias de extração de proteínas. A metodologia composta por solução de extração contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 1% de ditiotreitol, 2% de Triton-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 5 µM de pepstatina, seguido de precipitação em 20% de ácido tricloroacético apresentou géis de maior resolução e reprodutibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para o estudo das alterações no proteoma da semente de A. angustifolia. Uma dificuldade associada ao estudo do proteoma de espécies não sequenciadas é a baixa representatividade nos bancos de dados protéicos, resultando em identificações baseadas em homologia. Estratégias proteômicas baseadas em fracionamento em gel resultam em grandes contaminações por fragmentos de queratina. Sendo assim, foi desenvolvido um programa de remoção de espectros de baixa qualidade para utilização em proteômica baseada em homologia. As análises mostraram que o programa reduz o tempo de busca, melhora a qualidade dos alinhamentos e não resulta em perda de identificações positivas. Finalmente, utilizando as metodologias descritas, foram estudadas as alterações no proteoma durante o desenvolvimento da semente de A. angustifolia. Noventa e seis proteínas foram identificadas e agrupadas de acordo com sua função biológica e padrão de detecção. Os resultados obtidos permitiram o estabelecimento de marcadores protéicos no início e final do desenvolvimento embrionário. A análise das proteínas abundantes no início da embriogênese indica um maior controle no metabolismo oxidativo em relação aos estádios finais. Contrariamente, o final da embriogênese é caracterizado por um alto metabolismo de assimilação de carbono e acúmulo de proteínas de reserva. As implicações dos resultados obtidos no controle e melhoramento de sistemas de embriogênese somática na espécie também foram discutidas
The aim of the present work was to characterize the seed development of Araucaria angustifolia through proteomics in order to understand the physiological and biochemical changes during this process. For that, initially, three different protein extraction methods were evaluated. The extraction based on protein solubilization in 7 M urea, 2 M thiourea, 1% dithiothreitol, 2% Triton-100, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 5 µM pepstatin, followed by 20% trichloroacetic acid precipitation showed the highest gel resolution and reprodutivity and, thus, was chosen to be used in the analysis of the proteome of A. angustifolia seeds. One aspect that hampers the proteome study of unsequenced species is the low protein representativity in databases. So, protein identification is usually carried out through homology. Strategies based on 2-DE result in high keratin contamination. In the present work a spectra filtering software was developed and evaluated for use in homology driven proteomics. The software reduced the time of search, improved alignment quality and did not result in lost of positive identifications. Finally, using the described strategies, the changes in the proteome of A. angustifolia seeds were studied. Ninety six proteins were identified and classified according to their biological functions and expression profiles during seed development. The identified proteins may be used as protein markers of early and late embryogenesis. Proteins involved in the control of oxidative metabolism were highly expressed during the early stages of seed development; while, carbon metabolism and storage proteins were highly expressed in late stages. Considerations on the improvement and control of somatic embryogenesis through medium manipulation and protein markers screening using data generated are also discussed.

Orientador : Julia Prado Francheschi
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-07-14T02:00:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zappellini_Aldete_M.pdf: 1943638 bytes, checksum: d681f5b052540f56a0eb44ceaadfdf0d (MD5) Previous issue date: 1991
Resumo: A B. erythromelas é uma serpente que habita exclusivamente as regiões quentes do Nordeste brasileiro (Bahia ao Ceará). Nesta Tese avaliaram-se características bioquímicas e farmacológicas de sua peçonha. Verificou-se que o veneno apresenta atividades coagulante, proteolítica (caseinolítica), fosfolipásica e hemorrágica, bem como discreta atividade TAME-esterásica. Os fracionamentos realizados revelaram a presença de três (Sephadex G-75) e quatro (Sephadex G-100) picos distintos. No primeiro pico detectaram-se as atividades proteolítica e coagulante, no segundo, TAME-esterásica (ausente em Sephadex G-75), no terceiro, fosfolipásicae coagulante. Nenhuma atividade foi detectada no último pico. Através do estudo farmacológico, verificou-se que a peçonha de B. elyrhromelas é menos tóxica do que a de B. jararaca para camundongos (via intraperitoneal); no entanto, esta relação se inverteu para pintainhos (via, intramuscular). Estudamos também os efeitos deste veneno sobre,a pressão arterial sistêmica e a respiração, bem como sobre o tempo de coagulação, de cães anestesiados. Observou-se que após administração de 25 fJ.g/kg da peçonha (via endovenosa, "bolus"), os animais apresentaram uma queda da pressão arterial que revelou a presença de dois componentes distintos: o primeiro manifestou-se por uma queda de rápida instalação e de moderada intensidadee o segundo, por uma queda mais acentuada e persistente. Verificou-se também que o veneno determinou a morte de 58,8% dos animais, por parada respiratória precedida por hiperpnéia. Incoagulabilidade sanguínea, após uma breve fase de hipercoagulabilidade (coagulopatiade consumo) foi também observada. O pré-tratamento dos animais, de forma independente, com heparina, sulfato de celulose, NW-nitro-L arginina metil éster (L-NAME) , indometacina, soro antibotrópico (SAB), e sulfato de celulose e indometacina associados, determinou a sobrevida de 100% dos animais experimentados. O primeiro componente hipotensor foi inibido significativamente pelo sulfato de celulose, bem como pela heparina, enquanto que o segundo componente hipotensor foi abolido em 50% dos animais tratados com indometacina. A associação de sulfato de celulose e indometacina inibiu completamente as alterações pressóricas induzidas pelo veneno, bem como as anomalias respiratórias. Estes resultados sugerem que bradicinina seja responsável pela queda inicial da pressão arterial e que eicosanóides com ação vasodilatadora, tais como prostacic1ina e/ou prostaglandina E2 sejam os mediadores da segunda queda pressórica. O estado de choque, por sua vez, seria mantido pela liberação de óxido nítrico pelas células endoteliais, uma vez que o pré-tratamento com L-NAME determinou uma recuperaçãoacelerada dos níveis pressóricos, ainda que não tenha interferido com nenhuma das respostas hipotensoras. As alterações na coagulação somente foram revertidas com o uso do SAB, no entanto em proporção 30 vezes superior àquela recomendada pelo Instituto Butantan
Abstract: B. elythromelas is a snake found exc1usivelyin the Northeast of Brazil (from Bahia to Ceará). In this Thesis, some of the biochemical and pharmacological characteristics of this venom were examined. B. erythromelas venom possesses coagulant activity as well as proteolytic (caseinolytic), phospholipase and TAME-esterase activities. Practionation of the venom yielded either three (Sephadex G-75) or four (Sephadex G-IOO) distinct peaks. The first peak contained primarily proteolytic and clotting activities; in the second one, TAME-esterase activity was detected (this peak was absent in the G-75 fractionation). The third peak contained phospholipase activity and in the last, no activity could be detected. B. erythromelas venom, compared with B. jararaca venom, is less toxic in mice, when given i.p.. However, this potency is inverted when the venoms are given i.m. in chicks. The effects of B. erythromelas venom on arterial blood pressure and respiration, as well as clotting time "in vivo" (anaesthetized dogs), were also examined. A bolus injection of B. Erythromelas venom (25 f-tg/kg,i.v.) induced a biphasic hypotensive response consisting of a rapid initial decrease followed by a partial recovery (early phase) which was then succeeded by a more sustained hypotension (late phase). The dose of venom used caused a 58.8% mortality. The animals died following a period of profound respiratory alterations. Independent pre-treatment of the animaIs with heparin, cellulose sulphate, NW-Nitro-L arginine methyl ester (L-NAME), indomethacin, antibothropic serum, or a combination of cellulose sulphate and indomethacin, abolished the lethality. The ear1yphase of hypotension was inhibited by cellulose sulphate as well as by heparin, while the late phase was partially inhibited (50%) by indomethacin. Pre-treatment with cellulose sulphate and indomethacin abolished the venom-induced alterations in blood pressure and respiration. These results suggest that bradykinin may be responsible for the initial hypotensive response and that vasodilatory eicosanoids, such as prostacyclin and/or prostaglandin E2 may mediate the late phase. Pre-treatment with L-NAME led to a more rapid recovery from the sustained late phase of hypotension although there was no effect on the immediate hypotensive response. This observation suggests that nitric oxide release, from endothelial cells, may contribute to the maintenance of the venom-induced shock. On the other hand, the hemostatic alterations were prevented only by pre-treatment with antibothropic serum, however in a dose 30 fold above that recommended by the Butantan Institute
Mestrado
Mestre em Farmacologia

Orientador: Julia Prado Franceschi
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-07-27T10:30:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RejaneMariaLirada_D.pdf: 35252135 bytes, checksum: d8fa4a7fb76a10643309ff440ecc76fc (MD5) Previous issue date: 2001
Resumo: Este trabalho trata do estudo farmacológico do veneno de Bothrops leucurus, conhecida como jararaca-do-rabo-branco. Objetivou-se caracterizar suas atividades bioquúnicas e imunobiológicas, como forma de avaliar o grau de soroproteção conferido pelos anti-venenos produzidos no Brasil e anti-B. leucurus, produzido na Argentina. Utilizou-se venenos de duas regiões geográficas da Bahia (Região Metropolitana do Salvador - RMS e Sul/Sudeste baiano - SB) e de machos e remeas, a fim de se estabelecer possíveis variações geográficas e sexuais. Procedeu-se a determinação da dosagem protéica, perfil cromatográfico e eletroforético, das atividades tóxica, proteolítica, edemaciante, hemorrágica, necrosante, defibrinante, pró-coagulante, miotóxica e sobre a junção neuromuscular, caracterização imunoquúnica e neutralização das atividades biológicas da peçonha, frente aos soros antibotrópico-crotálico (SABC) do Instituto Butantan (IB), Instituto Vital Brazil (IVB), Fundação Ezequiel Dias (FUNED) e Soro anti- B. leucurus do Instituto Carlos Malbrán. O perfil eletroforético do veneno caracterizou-se pela presença de 4 bandas e o perfil cromatográfico por 7 picos, sendo semelhantes nos diferentes pools. Houve variação regional e sexual, nas atividades biológicas, já que o veneno das serpentes do SB apresentou atividades tóxica, hemorrágica, necrosante e miotóxica maior que da RMS, no entanto, a atividade coagulante desta última foi maior que o da primeira. O veneno das remeas foi mais coagulante que o dos machos. Todas as amostras induziram mionecrose, caracterizada por "balonização", vacuolização, lesões "delta", hipercontração, condensação das miofibrilas e áreas de degeneração muscular. As amostras, em concentrações a partir de 50 J.!glrnl,inibirama transmissão neuromuscular, de maneira dose-dependente e irreversível(com exceção do veneno dos machos), devido às suas ações pós-juncionais. Na dose de 10 µg/ml,veneno de machos e remeas induziu aumento na amplitude das respostas musculares, demonstrando ação pré-sináptica. A peçonha de espécimens da RMS foi mais potente em provocar 50% do bloqueio da resposta contrátil que os da SB, assim como o veneno das remeas foi mais potente que dos machos. Observou-se inibição da resposta acetilcolínica nas preparações tratadas com 50 e 100 µg/mldas diferentes amostras e da amplitude da resposta muscular, de maneira dose-dependente e irreversível, com variação geográfica e sexual. O ELISA demonstrou que todos os pools apresentaram títulos de anticorpos frente a todos os anti-soros testados, sendo maiores frente ao soro específico, com exceção do pool da RMS, cuja titulação do soro específico foi equivalente a do SABC do IB. Dentre os soros inespecíficos,o do IB foi o que apresentou maior titulação, seguido do SABC da FUNED e do IVB. Houve variação na capacidade neutralizante dos soros frente às amostras, e o SABC/IB apresentou maior reatividade cruzada frente ao veneno de machos e da RMS. Os SABCIFUNED e IVB foram melhor reconhecidos pelo veneno de machos, da RMS e SB. O Westemblot demonstrou que o veneno desta espécie apresentou reação cruzada tanto frente ao soro anti-B. leucurus quanto ao SABC do IB e que a reação foi mais intensa quando utilizou-se o soro específico. Todos os anti-venenos foram capazes de neutralizar as atividades hemorrágica, necrosante e hemolítica das duas amostras de veneno, apesar da variação regional observada nesta soroneutralização
Abstract: The present work was a phannacological study of the action Bothrops leucurus venoro, popular known as "white-tailed lancehead". Venom effects (males and females from 1v1RSand South/Southeast region - SSR, Bahia, Brazil) were examined to establish geographical and sexual variability. The venom was characterized based on biochemical (total protein content, chromatographic and electrophoretic pattern), biological (lethal - LDso, proteolytic, venom-induced oedema - ED3o, haemorrhagic - MHD, necrotizing - MND, procoagulant - MCD, defibrinogenating- MDD, myotoxic and neurotoxic activities), imunochemical (ELISA, Westemblot) properties and neutralization of the toxic activities (haemorrhage, necrosis and coagulation). The antibothropic antivenom was provided Instituto Butantan, Instituto Vital Brazil and Fundação Ezequiel Dias (Brazil) and anti-Bothrops leucurus antivenom provided Instituto Malbrán (Argentina). The electrophoretic pattem showed 4 bands and chromatographic pattem 7 peaks without sexual and geographical variability. Lethal, haemorrhagic, necrotizing and myotoxic activities are more intense in snakes proceeding of the SSR than MRS. The coagulant activity of the female's venom is more coagulant than male. All samples induced myonecrosis characterized by swollen, vacuolization, "delta" lesions, myofilament hypercontraction and areas of the muscular damage. Results indicated that by indirect stimulation, B. leucurus venom induced neuromuscular blockade dose-dependent and is irreversible under concentration upper of 50 µg/ml, with exception of the male's venom (upper 100 µg/ml). This occurred probably due to postsynaptic action (depolarizing the cellular membrane, characterized for the severe contracture in 100 µg/ml e 200µg/ml concentrations) of the venom proceeding of the 1v1RSand SSR regions and moderated contracture in 200 µg/ml concentration of the males and females venoro. A males and females venom-induced effect on presynaptic activity was suggested by the marked increase in the twitch tension in 10 µg/ml concentration. The female's B. leucurus venom and proceeding of the 1v1RS region were more potent than male's venom of the SSR region in provocked 50% of the neuromuscular blockade (P<0.05)
Doutorado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Ciências Médicas

Esse trabalho teve como objetivo estudar aspectos importantes das estratégias reprodutivas de machos e fêmeas de Bothrops jararaca do clado norte (CN) e sul (CS) e das ilhas de Búzios (SP), Ilhabela (SP) e ilha dos Franceses (ES). Para isso, foram analisados exemplares de B. jararaca preservadas de diversas coleções zoológicas. Machos e fêmea de B. jararaca do CN foram significativamente maiores que os machos e fêmeas CS, no entanto tiveram cabeças relativamente menores e foram menos robustos. Fêmeas do CN têm em média maior fecundidade e filhotes maiores do que fêmeas do CS. O ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de ambas as populações é sazonal e não variou entre as estações do ano. Fêmeas do CN e do CS tem cópula outonal. A vitelogênese tem início no final do verão e fêmeas grávidas são observadas a partir do final do inverno. Nascimentos de B. jararaca de ambos os clados podem ser observados principalmente no verão e podem se estender até o início do outono. A estocagem de espermatozoides no útero e no infundíbulo foi observada principalmente no outono e inverno. Ciclos reprodutivos de machos de ambos os clados são considerados do tipo pós-nupcial ou do tipo I. O início da produção de espermatozoides é na primavera e a fase ativa pode ser observada no verão. No outono e no inverno, os testículos estão inativos. Estocagem de espermatozoides nos ductos deferentes foi observada durante todos os meses do ano e o segmento sexual renal (SSR) apresentou a fase mais ativa (fase secretora) na primavera e verão (sincronizado com a espermatogênese nos testículos) e fase não secretora no outono e no inverno. Esse padrão dos ciclos dos machos foi observado em ambos os clados. Dessa forma, foram observadas variações geográficas nas características de histórias de vida entre as populações do CN e CS, porém, não foram observadas diferenças entre os padrões de ciclos reprodutivos. Assim, o ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de B. jararaca do CN e do CS são conservativo na espécie.
This research aimed to study important aspects of reproductive strategies in male and female of Bothrops jararaca from north clade (CN), south clade (CS) including the islands of Búzios (SP), Ilhabela (SP), and Franceses (ES). We analyzed specimens of B. jararaca preserved on several zoological collections. Male and female of B. jararaca from CN were significantly longer than male and female from CS, however they had relatively smaller heads and were less robust. Male and female of B. jararaca from CN were significantly larger than individuals from CS, had relatively smaller heads and were less robust. Females from CN had on average higher fecundity and larger offspring than females of CS. The reproductive cycle of males and females from both populations was seasonal and the timing of events was also similar between clades. Females of CN and CS have autumn mating season. The vitellogenesis starts in the end of the summer and pregnant females are observed from late winter. Births of B. jararaca occurred from early summer to the beginning of autumn. Sperm storage in the uterus and infundibulum was mainly observed during autumn and winter. Reproductive cycles of male of both clades are type postnuptial or a type I. The beginning of the sperm production occurs in spring and the active phase was observed in the summer. During autumn and winter, the testicles are inactive. Sperm storage in the different ducts was observed throughout the year and the sexual segment of the kidney (SSK) shows a more active phase during spring and summer and non-secretory phase on autumn and winter. This pattern of cycles of male was observed in both clades. In conclusion, there is geographical variation in life-history characteristics between CN and CS populations. However, differences among the reproductive cycle pattern were not evident. Then, the reproductive cycles of male and female of CN and CS are conservative in the species.

O grupo Bothrops neuwiedi é composto por serpentes neotropicais que desempenham grande impacto na saúde pública, em decorrência de acidentes ofídicos. O grupo apresenta ampla distribuição ao longo da diagonal seca de formações abertas, desde o nordeste do Brasil até o noroeste da Argentina. A taxonomia atual, baseada principalmente em dados morfológicos qualitativos, não recupera as linhagens evolutivas apontadas pelas abordagens moleculares. O objetivo deste trabalho foi investigar o grupo B. neuwiedi utilizando análises filogenéticas, filogeográficas, biogeográficas, estimativa de datação e delimitação de espécies em um total de 276 indivíduos amostrados ao longo de toda a sua distribuição, incluindo representantes do Brasil, Bolívia, Argentina, Paraguai e Uruguai. As análises contemplaram três genes mitocondriais, dois nucleares, dois introns e 33 locos de microssatélites obtidos por sequenciamento de nova geração. Estimou−se, por meio do método de delimitação de espécies e análises filogeográficas, que o grupo B. neuwiedi possui ao menos 14 espécies, das quais oito já são reconhecidas (B. erythromelas, B. lutzi, B. mattogrossensis, B. marmoratus, B. neuwiedi, B. pauloensis, B. pubescens e B. diporus) e seis possíveis espécies (Bothrops sp. 1 a Bothrops sp. 6). O grupo teria se originado durante o Mioceno e diversificado durante o Plio-Pleistoceno. As flutuações climáticas do Pleistoceno, decorrentes dos ciclos glaciais e interglaciais, desempenharam um importante papel na diversificação das espécies e suas populações. Adicionalmente, eventos tectônicos que ocorreram durante este período também teriam influenciado na estruturação espacial da diversidade genética. Foi revelada uma intrincada relação do domínio biogeográfico Chaquenho (áreas abertas) com os domínios do Sudoeste da Amazônia e do Paraná (áreas de floresta). Nuances na temperatura e aridez, ora permitiram a expansão do Cerrado sobre as florestas, ora possibilitaram a expansão do Chaco sobre o Cerrado, levando à interrupção da conexão entre as populações de manchas de Cerrado nestes domínios florestais. Os resultados evidenciaram a complexidade da diversificação das serpentes na diagonal seca de formações abertas e, dependendo da linhagem, diferentes padrões puderam ser observados. A Linhagem Leste−Oeste (B. marmoratus, B. neuwiedi, Bothrops sp. 1) apresentou elevado grau de diversidade genética e elevada estruturação espacial, concordante com unidades geomorfológicas do relevo. Nas linhagens do sul do Brasil (B. pubescens e B. diporus) verificou−se um padrão de diversificação consistente com espécies incipientes em estágios iniciais do processo de especiação. Na região central do Cerrado, propõe−se que as espécies B. marmoratus, B. pauloensis e B. mattogrossensis apresentam forte estruturação no DNAmt e baixa estruturação nos marcadores nucleares em decorrência de fluxo gênico desigual mediado por machos. Baseado nas informações obtidas neste trabalho, sugerimos fortemente que o grupo Bothrops neuwiedi seja revisado sob uma perspectiva multidisciplinar.
The Bothrops neuwiedi group is composed of Neotropical snakes that have a serious impact on Brazilian public health, as they are responsible for a large number of snakebite accidents. The group is widespread along the dry diagonal of open formations in South America (Chacoan dominion), since northeast Brazil to northwest Argentina. Current taxonomic arrangement is based on blotches and color pattern, which does not represent the evolutionary lineages uncovered in molecular analyses. This study aims to investigate the B. neuwiedi group using phylogenetic analyses, biogeography, phylogeography, estimates of divergence, and species delimitation. A total of 276 representatives of the B. neuwiedi group were obtained throughout the geographic distribution of the group, including samples from Brazil, Bolivia, Argentina, Paraguay, and Uruguay; in addition, three mitochondrial and two nuclear genes, two introns, and 33 microsatellite loci were used. According species delimitation and phylogeographic approach, 14 species in the B. neuwiedi group could be delimited as follows: eigth species already recognized (B. erythromelas, B. lutzi, B. mattogrossensis, B. marmoratus, B. neuwiedi, B. pubescens, B. diporus, and B. pauloensis) and six other putative species (Bothrops sp. 1 to Bothrops sp. 6). Estimates of divergence placed the origin of the B. neuwiedi group in the Miocene and diversification in the Plio−Pleistocene. Climatic fluctuations and tectonic events during the Pleistocene probably played an important role in the species and populations diversification. An intricate network was revealed with Chacoan dominion (open area) and South-west and Paraná dominion (forested areas). Nuances in temperature and aridity, sometimes allowed the expansion of the Cerrado on forests, sometimes allowed the expansion of the Chaco on the Cerrado, leading to the interruption of the connection between the populations of Cerrado patches of forest in these areas. The results showed the complexity of the diversification of snakes in the dry diagonal of open formations and depending on the lineage studied, different patterns were observed. East−West Lineage (B. marmoratus, B. neuwiedi, Bothrops sp. 1) presented high genetic diversity and high genetic and spatial structure associated with Brazilian geomorphology. B. pubescens and B. diporus revealed a pattern consistent with incipient species in the early stages of speciation. B. marmoratus, B. pauloensis and B. mattogrossensis presented strong structure in mtDNA and and weak structure in nuclear markers due to male−biased gene flow.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12000_Tese Gustavo Baptista Naumann20180619-110017.pdf: 3482795 bytes, checksum: b9454d6f83b0f0344e5f41fd21fa9e14 (MD5) Previous issue date: 2018-04-05
Bothrops leucurus (jararaca-do-rabo-branco) é a principal espécie causadora de acidentes ofídicos na região Nordeste do Brasil e norte do Espírito Santo. Diversos estudos têm investigado as características bioquímicas da peçonha dessa serpente, bem como seus efeitos locais. Entretanto, efeitos sistêmicos como os cardiovasculares têm sido pouco explorados. O objetivo do presente trabalho foi investigar as atividades cardiovasculares agudas induzidas pela peçonha de B. leucuros (BlV) "in vivo" e em "in vitro". Em ratos anestesiados foi demonstrado que BlV (10-100μg/kg), induz hipotensão imediata e transiente, a resposta máxima foi observada em 5 min e houve um retorno a valores basais em ≈ 20 minutos. Os animais não apresentaram alteração na frequência cardíaca. Os efeitos in vitro foram avaliados em anéis de artéria mesentérica précontraídos com fenilefrina utilizando um miógrafo de resistência. Foi demonstrado que BlV (1-20 μg/mL) causa vasodilatação dose dependente nestes vasos, atingindo a resposta máxima em ≈ 10 minutos, com recuperação progressiva após 15 minutos. Um menor relaxamento do vaso foi observado em vasos sem endotélio, demonstrando que além do músculo liso vascular o endotélio também participa desta resposta. O prétratamento dos animais e/ou dos vasos com inibidores de vias envolvidas nestas repostas - indometacina (inibidor da ciclooxigenase), L-NAME (inibidor da óxido nítrico sintase), heparina (inibidor indireto da trombina), atropina (antagonista muscarínico), PMSF (inibidor de serinoprotease) e EDTA (inibidor de metaloprotease) - mostrou que somente a indometacina foi capaz de reduzir a resposta cardiovascular induzida pela BlV (50 μg/kg). Este inibidor foi capaz de bloquear ≈ 45% e ≈ 77% das alterações nas pressões sistólica e diastólica e ≈ 30% do relaxamento vascular induzido pela BlV, sugerindo a participação dos metabólitos do ácido araquidônico nessas respostas. Um componente proteico que reproduz os efeitos cardiovasculares observados foi purificado por duas etapas cromatográficas (Troca iônica e Fase reversa). Análises por espectrometria de massas - MALDI-ToF e MALDI-ISD - revelaram que a proteína com atividade cardiovascular apresenta massa molecular (MW) de 13.889,975 Da e identificaram uma sequência interna de 27 resíduos de aminoácidos. Essa MW corresponde à da fosfolipases blD-PLA2 já purificada da peçonha de B. leucurus, e a sequência identificada apresenta 100% de identidade com os resíduos 10 ao 36 - cobertura de 22% dessa molécula. Estes dados permitem inferir que a proteína purificada é a blD-PLA2. Neste trabalho foi demonstrado que a peçonha da B. leucurus induz vaso relaxamento e consequentemente hipotensão imediata após o envenenamento, e parte destes efeitos são acarretados pelo aumento da liberação de prostanóides vasodilatadores pela atividade esterásica da blD-PLA2. Estes dados sugerem a participação dos metabólitos do ácido araquidônico nessas respostas. Um componente proteico que reproduz os efeitos cardiovasculares observados foi purificado por duas etapas cromatográficas (Troca iônica e Fase reversa). Análises por espectrometria de massas - MALDI-ToF e MALDI-ISD - revelaram que a proteína com atividade cardiovascular apresenta MW de 13.889,975 Da e identificaram uma sequência interna de 26 resíduos de aminoácidos. Essa MW corresponde à da blD-PLA2 já purificada da peçonha de B. leucurus, e a sequência identificada apresenta 100% de identidade com os resíduos 11 ao 36 - cobertura de 21% dessa molécula. Estes dados permitem inferir que a proteína purificada é a blDPLA2. Neste trabalho foi demonstrado que a peçonha da B. leucurus induz vaso relaxamento e consequentemente hipotensão imediata após o envenenamento, e parte destes efeitos são acarretados pelo aumento da liberação de prostanóides vasodilatadores pela atividade esterásica da blD-PLA2.

EVANGELISTA, Inez Liberato. Caracterização das atividades cardiorenal e neural de Bothrops marajoensis e suas frações. 2009. 116 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009.
Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-11T16:07:57Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_ilevangelista.pdf: 1002705 bytes, checksum: 1ca0fdd63eeb9c816ec03fcadbfe7553 (MD5)
Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-12T14:04:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_ilevangelista.pdf: 1002705 bytes, checksum: 1ca0fdd63eeb9c816ec03fcadbfe7553 (MD5)
Made available in DSpace on 2012-06-12T14:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_ilevangelista.pdf: 1002705 bytes, checksum: 1ca0fdd63eeb9c816ec03fcadbfe7553 (MD5) Previous issue date: 2009
In this article we evaluated the activity of Bothrops marajoensis (Bmj) and its fractions in the cardio-renal system. The results of the total venom in blood pressure experiments showed a decrease in the mean arterial pressure and heart rate without significant changes in respiratory rate. The same experiments performed in rats atropinized showed the permanence of falling blood pressure and heart rate. After administration of Bmj used in infusion of isolated rats heart of there was a decrease in myocardial force of contraction accompanied by an increase in perfusion pressure, without changes in coronary flow. The electrocardiographic analysis after injection of Bmj in rats causes a progressive atrioventricular block until a complete blockage and difficulty in atrial conduction. The assessment in the mesenteric vascular bed Bmj did not produce significant changes. The system renal perfusion in rats caused significant decrease in perfusion pressure, renal vascular resistance, urinary flow, filtration rate, transport of sodium and chloride. The phospholipase (PLA2) type 1 showed only an alteration in the transport of electrolytes. The Bmj fractions neurotoxicity in rat phrenic nerve diaphragm increasing showed a blockage dose-dependent in the strength of contraction. In mice vas deferens we observed an induced of a dose-dependent inhibition of contraction stimulated by electric field. This fact was not reversed by yohimbine or by naloxone. In another study the addition of the total venom of Bmj inhibited the neurogenic contraction, compared with no significant decrease in contraction by Cch, NA or ATP (in normal Krebs solution or with enriched with guanethidine and phentolamine). The fractions, PLA2 (type 1 and type 2) showed a dose-dependent inhibition of contraction.
Avaliou-se a atividade de Bothrops marajoensis (Bmj) e suas frações no sistema cardiorrenal. A resposta pressora do veneno bruto demonstrou uma diminuição da pressão arterial média e da freqüência cardíaca, sem alterações significativas na freqüência respiratória. Em ratos atropinizados demonstrou a permanência dos efeitos. Na perfusão de coração isolado de ratos observou-se uma diminuição na força de contração miocárdica acompanhada de um aumento da pressão de perfusão, sem alterações no fluxo coronariano. A análise eletrocardiográfica em ratos após injeção de Bmj provocou um bloqueio átrio ventricular gradual até um bloqueio completo indicando arritmia e dificuldade de condução atrial. Em leito vascular mesentério pré-contraído com fenilefrina não houve alterações significativas. No sistema de perfusão renal em ratos apresentou decréscimo significativo na pressão de perfusão, resistência vascular, fluxo urinário, ritmo de filtração e transportes de sódio e de cloreto. Fosfolipase miotóxica (tipo 1) demonstrou alterações somente no transporte de íons. A atividade de Bmj em doses crescentes em nervo Frênico Diafragma de rato mostrou um bloqueio na força de contração dose dependente, com efeito significante nas maiores doses. Em canal deferente de camundongos induziu a uma inibição dose dependente da contração estimulada por campo elétrico. Este feito não foi revertido pela Ioimbina nem por naloxone. Em outro estudo a adição do veneno bruto de Bmj inibiu a contração neurogênica,quando comparado com nenhuma queda significante pela contração com Cch, NA ou ATP (em Krebs normal ou enriquecido com guanetidina e fentolamina. A ausência de efeito do veneno bruto de Bothrops marajoensis sobre a contração induzida pelos principais agonistas purinérgicos demonstra provável atividade a nível pré-sináptico. Frações de fosfolipases miotóxicas (tipo 1 e tipo 2) demonstraram uma inibição da contração dose dependente.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1952_1.pdf: 436008 bytes, checksum: 2bc5d55cfecbd7102987de5ec1c6f17c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003
A variabilidade intraespecífica presente nas peçonhas de serpentes pode causar implicações na sintomatologia dos envenenamentos e nas pesquisas com toxinas desses animais. O presente estudo identificou a variabilidade em 52 amostras de peçonha de B. erythromelas, relacionando-a ao sexo, origem geográfica, desenvolvimento ontogenético e variação individual das serpentes. Para tanto, foram determinadas a dosagem proteica, a distribuição de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições redutoras, as atividades coagulante sobre o plasma, proteolítica sobre azocaseína e fosfolipásica utilizando clara de ovo como substrato. Os resultados obtidos não mostraram diferenças significativas nas amostras de peçonha de B. erythromelas provenientes de machos e fêmeas (Achova). A variabilidade das atividades proteolítica (p=0,004) e coagulante (p=0,02) foi dependente do desenvolvimento ontogenético, observando em ambos os casos relação inversa ao tamanho dos animais. O conteúdo proteico (p=0,01) e a atividade fosfolipásica (p=0,04) foram significativamente maiores nas amostras de peçonha de serpentes originárias do estado da Bahia quando comparadas às de Pernambuco. A variação individual foi observada no padrão eletroforético das proteínas, conteúdo proteico e atividades fosfolipásica e coagulante. Diante do exposto, concluímos que, dentre os parâmetros testados, o principal fator de variabilidade da peçonha de B. erythromelas é de origem genética, porém o desenvolvimento ontogenético e a origem geográfica também são fatores de variabilidade que devem ser levados em consideração no momento do tratamento ofídico e pesquisas com toxinas dessa espécie

Em 1987 o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde iniciou o uso do Veneno Botrópico de Referência Nacional (VBRN), que é a primeira extração das serpentes B. jararaca recém-chegadas da natureza. Em 10 anos notou-se uma queda de 67,65% na recepção de serpentes ao Instituto Butantan (IB), e na distribuição geográfica, resultando em uma maior heterogeneidade na composição do VBRN. Assim, comparamos os venenos das serpentes nascidas em cativeiro (VP) do Laboratório de Herpetologia do IB com o VBRN, para verificar a possibilidade de incorporar o VP na preparação dos lotes do VBRN. O VP mostrou-se estatisticamente semelhante ao VBRN nos testes de dosagem de proteínas, SDS-PAGE, 2DE, cromatografia, atividade fosfolipásica, ELISA, Western blotting, dose mínima coagulante (plasma) e hemorrágica, enquanto para as atividades de L-aminoácido oxidase, caseinolítica, zimografia e dose mínima coagulante (fibrinogênio) o VP mostrou-se diferente do VBRN. Para as doses letais e efetiva dos venenos o pool do VP com VBRN foi mais eficaz do que os VP e o VBRN sozinhos.
In 1987, The National Institute of Quality Control in Health in Brazil (INCQS) established the Brazilian Reference Bothrops Venoms (BRBV), which should be composed of the first extractions of newcomers wild snakes. In 10 years there has been a decrease of 67.65% in the reception snakes to Butantan Institute (IB), and geographic distribution, resulting in a higher heterogeneity in BRBV composition. So, we compared the venom samples of snakes born in captivity (SVP) of IB Herpetology Laboratory with BRBV to check the possibility of incorporating the SVP in the preparation of batches of BRBV. SVP was statistically similar to BRBV the proteins dosage, SDS-PAGE, 2DE, chromatography, phospholipase, ELISA, Western blotting, minimum coagulant dose (plasma) and hemorrhage dose, while for L-amino acid oxidase activity, caseinolytic, zymography and minimum coagulant dose (fibrinogen) SVP was shown to be different from BRBV. For effective and lethal doses of pool with SVP and BRBV it was more effective than SVP and BRBV alone.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-05T14:55:06Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 6265632 bytes, checksum: b400bacf85cbecabd2bc0a3fd0a7f19c (MD5)
Made available in DSpace on 2017-09-05T14:55:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 6265632 bytes, checksum: b400bacf85cbecabd2bc0a3fd0a7f19c (MD5) Previous issue date: 2017-04-25
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Snakebite or snakebite is the chart of poisoning from the inoculation of toxins through the snake inoculation apparatus. The objective of this study was to evaluate and in vitro the cytotoxic, oxidative and homeostasis effects (on erythrocytes, hemoglobins and human plasma, respectively) caused by the presence of the crude venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni snakes. The protein profile of each venom was characterized by reverse phase chromatography and SDS-PAGE. The venom compositions of both species showed similar protein profiles. The amounts of the crude venoms from B. jararacussu and B. moojeni induced significant indirect hemolysis in the presence of fatty acid and fatty acid plus calcium chloride. The crude venom of B. jararacussu presented a higher cytotoxic potential. The venoms of B. jararacussu and B. moojeni, showed no anti-hemolytic effect. The venom of B. jararacussu presented a haemagglutinating effect in the analyzed amounts of 100 and 1000μg and did not present an oxidizing effect. The B. moojeni venom presented an oxidizing effect only in the amount of 1000μg. Venoms of both species showed no anti-oxidant effect. The crude venom of B. moojeni had a higher coagulant potential compared to B. jararacussu venom and all plasma clots formed were turbid, rigid and stable. The clot formation time was inversely proportional to the amount of venom evaluated. Therefore, the information obtained from the comparisons of the biological effects caused by the venoms, showed that B. jararacussu showed indirect hemolytic activity, hemagglutinating and coagulant, and B. moojeni presented indirect hemolytic activity, oxidant and coagulant.
Acidente ofídico ou ofidismo é o quadro de envenenamento decorrente da inoculação de toxinas através do aparelho inoculador de serpentes. O objetivo desse estudo foi avaliar e comparar, in vitro, os efeitos citotóxico, oxidativo e na homeostase (sobre eritrócitos, hemoglobinas e plasma humano, respectivamente), causados pela presença das peçonhas brutas das serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni. O perfil proteico de cada peçonha foi caraterizado por cromatografia de fase reversa e SDS-PAGE. As composições das peçonhas de ambas as espécies mostraram perfis proteicos similares. As quantidades das peçonhas brutas de B. jararacussu e B. moojeni induziram hemólise indireta significativa na presença de ácido graxo e de ácido graxo mais cloreto de cálcio. A peçonha bruta de B. jararacussu apresentou maior potencial citotóxico. As peçonhas de B. jararacussu e B. moojeni, não exibiram efeito anti-hemolítico. A peçonha de B. jararacussu apresentou efeito hemaglutinante nas quantidades analisadas de 100 e 1000μg e não apresentou efeito oxidante. A peçonha de B. moojeni apresentou efeito oxidante somente na quantidade de 1000μg. As peçonhas de ambas as espécies não mostraram efeito anti-oxidante. A peçonha de B. moojeni apresentou maior potencial coagulante em relação a peçonha de B. jararacussu e todos coágulos plasmáticos formados eram turvos, rígidos e estáveis. O tempo para formação dos coágulos foi inversamente proporcional à quantidade de peçonha avaliada. Portanto, as informações obtidas das comparações dos efeitos biológicos provocados pelas peçonhas, mostraram que B. jararacussu apresentou atividade hemolítica indireta, hemaglutinante e coagulante, e B. moojeni apresentou atividade hemolítica indireta, oxidante e coagulante.

Foi observado no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan que indivíduos da espécie Bothrops moojeni, quando acidentados entre si, apresentavam casos de mortalidade ocasionados por efeitos do envenenamento. Um modelo composto de análises bioquímicas e biológicas de 13 amostras de veneno e plasma de serpentes B. moojeni foi utilizado. SDS-PAGE mostrou perfis proteicos bem distintos para as amostras de veneno, e não para as de plasma. Western Blottings (WB) com amostras desses plasmas mostraram uma zona de detecção na faixa de 25 kDa em alguns indivíduos. Outro teste de WB, cruzando amostras de plasmas e venenos, mostrou que alguns indivíduos possuem proteínas que se ligam à estas regiões do plasma, o que não ocorre com o veneno dos outros indivíduos testados. Espectrometria de massas mostrou que esses indivíduos apresentam maiores concentrações proteicas e outras tantas exclusivas, incluindo inibidores de fosfolipases. A Dose Letal 50% mostrou uma maior eficiência nesses venenos, enquanto que a Dose Mínima Hemorrágica se mostrou inferior. Conclui-se que alguns indivíduos dessa espécie apresentam diferenças na composição dos seus venenos que se tornam significativas para o envenenamento.
It was observed in the Herpetology Laboratory of the Butantan Institute that individuals of the species Bothrops moojeni, when injured among themselves, presented cases of mortality caused by the effects of envenoming. A model composed of biochemical and biological analyzes of 13 venom and plasma samples of B. moojeni snakes was used. SDS-PAGE showed very different protein profiles for the venom samples, and not for the plasma ones. Western Blottings (WB) with samples of these plasmas showed a detection zone in the range of 25 kDa in some individuals. Another WB test, cross-linking plasma and venom samples, showed that some individuals have proteins that bind to these regions of the plasma, which does not occur with the venom of the other individuals tested. Mass spectrometry results showed that these individuals have higher protein and other unique concentrations, including phospholipase inhibitors. The Lethal Dose 50% showed a higher efficiency in these venoms, whereas the Minimum Hemorrhagic Dose was inferior. It is concluded that some individuals of this species present differences in the composition of their poisons that become significant for the envenoming process.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
As serpentes do gÃnero Bothrops sÃo responsÃveis pela maior parte dos acidentes ofÃdicos ocorridos no Brasil, representando um sÃrio problema de saÃde pÃblica pela freqÃÃncia com que ocorrem e pela morbidade e mortalidade que ocasionam. Envenenamento por serpente Bothrops atrox conduz à alteraÃÃo sistÃmica que à responsÃvel pela causa preliminar de morte apÃs acidente ofÃdico. Esse trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos farmacolÃgicos do veneno bruto da serpente Bothrops atrox (VBA) na perspectiva de elucidaÃÃo dos mecanismos fisiopatolÃgicos causados aos tecidos. Primeiramente, avaliou-se as aÃÃes do VBA no sistema de perfusÃo renal, no qual o ÃrgÃo era exposto à peÃonha de B. atrox para se avaliar as possÃveis alteraÃÃes dos parÃmetros renais. ApÃs a perfusÃo renal, os rins foram submetidos à anÃlise histolÃgica. Os parÃmetros foram analisados pelo ANOVA e Student t-test, com p<0,005. Os resultados encontrados demonstraram que VBA promoveu diminuiÃÃo significativa na pressÃo de perfusÃo (PP) e na resistÃncia vascular renal (RVR). O fluxo urinÃrio (FU) e o ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG) aumentaram significativamente. Foi observado aumento e diminuiÃÃo do percentual de transporte de cloreto e sÃdio, respectivamente. As alteraÃÃes histolÃgicas dos rins perfundidos foram discretas, indicando presenÃa de material proteinÃceo nos glomÃrulos e tÃbulos. Realizou-se uma investigaÃÃo da participaÃÃo do Ãxido nÃtrico (NO) nos efeitos sistÃmicos causados por VBA, em um experimento in vivo. Houve um aumento na produÃÃo de nitrito no sangue dos animais tratados com VBA. Efetuou-se o bloqueio farmacolÃgico com L-NAME e o aumento na produÃÃo de nitrito foi abolida. AtravÃs desses resultados conclui-se que o VBA causa alteraÃÃo nos parÃmetros renais e induz aumento na produÃÃo de Ãxido.
Snakes of the genera Bothrops are the most responsible for ophidian accidents occurred in Brazil, representing a serious public health problem due to their frequency, morbity and mortality rates. Envenomation caused by the species Bothrops atrox leads to systemic complication, which is responsible for the preliminary cause of death after ophidian accident. The aim of this work was to evaluate the pharmacological effects of the crude venom of Bothrops atrox (VBA), in perspective of elucidating the physiopathological mechanisms occurred in the tissues. First of all, the actions of VBA were evaluated in the renal perfusion system, in which the organ was exposed to the venom of B. atrox to evaluate possible renal parameters alterations. After the renal perfusion, the kidneys were submitted to histological analysis. The parameters were analyzed by ANOVA and Student t-test, with p<0,005. The results showed that VBA decreased the perfusion pressure (PP) and renal vascular resistance (RVR) significantly as in contrast with the urinary flow (UF) and glomerular filtration rate (GFR) which had a significant increase. It was observed both increase and reduction of the percentage of chloride and sodium transport, respectively. The histological alterations of the perfused kidneys were discrete, indicating the presence of proteinaceous substance in the glomeruli and tubules. An investigation was made - in an in vivo experiment - into the participation of nitric oxide (NO) in the systemic effects induced by VBA. There was an increase of the nitrite production in the blood of animals that received the VBA treatment. Pharmacological blockade with L-NAME was carried out and the increase of the nitrite production was nullified. Due to these results, we conclude that VBA causes alterations on renal parameters and it induces increase of the oxide production.

No Brasil, ocorrem anualmente mais de 20.000 acidentes ofídicos, sendo mais de 80 por cento por espécies do gênero Bothrops. Envenenamentos por serpentes desse gênero raramente causam óbito mas, muitas vezes, levam a necrose e infecção secundária, que podem determinar a perda de um membro acometido ou de segmento desse. A dose de soro antibotrópico utilizada para o seu tratamento é baseada na gravidade do envenenamento ao exame inicial. Vários fatores têm sido associados a essa gravidade, mas poucos são os dados científicos e nenhuma avaliação foi feita para acidentes comprovadamente causados por B. jararaca. O presente estudo teve como objetivo identificar: as variáveis associadas à ocorrência de necrose; as variáveis asociadas à ocorrência de abscesso; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de necrose; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de abscesso. Foram analisados no presente estudo 779 casos de acidentes por B. jararaca atendidos no Hospital Vital Brazil do Instituto Butantan, no período de 1982 a 1990. Os dados foram levantados a partir de prontuários médicos arquivados nesse hospital. Os casos que apresentaram necrose e os que evoluiram para abscesso, foram comparados no que se refere a uma série de variáveis, respectivamente, com aqueles que não apresentaram necrose e não evoluiram para abscesso. Correlacionaram-se estatisticamente à análise bivariada com necrose e abscesso (p < 0,05) o acidente por serpentes de grande porte (> 60cm), a picada em perna, o uso de torniquete, a presença de dor, edema, equimose, bolha, choque, sangramento fora da região da picada. Acidentes em determinados meses do ano, picadas nos dedos da mão e alteração da coagulação sanguínea só se correlacionaram com necrose (p < 0,05). Mostraram-se fatores prognósticos independentes para necrose à análise multivariada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento, 60 - 80cm, 80 - lOOcm, 100 - 140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picadas no dedo da mão, e na perna; uso de torniquete; ocorrência de sangramento. Mostraram-se fatores prognósticos independentes para abscesso, à análise multi variada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento 60-80cm, 80- lOOcm, 100-140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picada na perna; alteração da coagulação sanguínea; ocorrência de sangramento. Conclui-se que, as variáveis relacionadas com necrose e aquelas relacionadas com abscesso, os fatores prognósticos independentes para necrose e aqueles para abscesso, são os apresentados acima e que o porte de B. jararaca é o fator prognóstico independente mais importante para necrose e, principalmente, para abscesso, que são tanto mais freqüentes quanto maior o comprimento da serpente.
There is an annual incidence of over 20 000 snakebite cases in Brazil; of these over 80 per cent are caused by Bothrops species. Bothropic envenoming commonly causes necrosis and secondary infection which may lead to loss of part or of all the bitten limb. Fortunately fatalities are rare. During treatment, the dose of antivenom administered is based on the clinical severity of the envenoming. Several factors have been shown to be associated with the severity of the envenoming, however data are scarce and no such studies on Bothrops jararaca exist. The objective of this study was to identify the following: the variables associated with necrosis; the variables associated with abscess formation; the independent prognostic factors of necrosis; the independent prognostic factors of abscess formation. The study analysed 779 B. jararaca envenoming cases admitted from the Hospital Vital Brazil of the Instituto Butanatan in the period from 1982 to 1990. Data were taken from medical records in this hospital. Occurrence of necrosis or of abscesses was independently compared, in the light of a series of specific variables, with cases in which, necrosis or abscesses did not occur. Occurrence of necrosis and of abscess (p<0,05) was correlated by bivariable statistical analysis with the following: bites caused by large-sized snakes (>60cm in length); bites on the leg; use of tourniquet; presence of pain, oedema, equimosis, blisters, shock; and systemic bleeding. Occurrence of necrosis (p<0.05) was only correlated with bites on the fingers, impaired blood coagulability, and with accidents grouped according to the month of the year. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic factors for necrosis: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80- l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on fingers and legs; use of tourniquet; and the presence of haemmorrhage. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic indicators for abscess formation: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80-l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on the leg; impaired blood coagulability; and the presence of haemmorrhage. It is concluded that the forementioned are: associated factors of necrosis and abscess formation; and the independent prognostic factors of necrosis; and independent prognostic factors of abscess. The size of B. jararaca responsible for the bite was shown to be the most important independent prognostic factor of necrosis and, even more so, of abscess.

Orientador: Sergio Marangoni
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-25T23:09:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_MarcosHikari_D.pdf: 9361968 bytes, checksum: eaf1e7ea3745e2860f46c214010b9739 (MD5) Previous issue date: 2000
Resumo: As serpentes do gênero Bothrops incluem várias espécies, que são amplamente distribuídas na América do Sul e do Norte. Entre as proteínas bioativas do veneno de Bothrops, as Fosfolipases Az (PLAz,E.c. 3.1.14) e as miotoxinas PLAz"like" destacam-se como seus componentes majoritários. Fosfolipases Az são enzimas cálcio dependentes que hidrolisam a ligação 2-éster do 1,2 diacil-3sn fosfoglicerídeo (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). Estas enzimas são encontradas em muitos tecidos, principalmente no suco pancrácio de mamíferos,no veneno de serpentes e insetos. Enzimas PLAz são classificados dentro de quatro grupos (I, lI, III e IV) de acordo com sua origem extracelular ou intracelular, de acordo com sua estrutura primária e pontes de sulfeto (Denis et aI., 1994). Nesta tese, trabalhos com o veneno total de Bothrops pirajai e suas frações fosfolipases Az miotóxicas. Num primeiro instante, nos desenvolvemos uma nova estratégia de purificaçãodestas miotoxinasem HPLC(HPLCde fase reversa, troca iônicae exclusão molecular) e em cromatografia convencional de baixa pressão (CM-Sepharose). Em nossas condições experimentais, observamos que o HPLCde fase reversa (RP HPLC)tem vantagens sobre o método convencional, em relação ao tempo da corrida cromatográfica, a resolução dos picos e a manutenção da integridade molecular da PLAz. O primeiro trabalho feito por Toyama et aI., (1995) apresenta os resultados da purificação da principal miotoxina PLAz"Iike" (MPI e MPII) do veneno total de Bothrops pirajai, usando uma única etapa cromatográfica em HPLCde fase reversa. Este novo protocolo de purificação restringe a quantidade de proteína a ser colocada na coluna algumas mg. O rendimento final é 35% melhor do que na cromatografia de troca iônica de baixa pressão. Em Soares et aI., (1998), propusemos um uma outra alternativa de purificação das miotoxinas PLAz "like" majoritárias usando coluna convencional, uma vez que o RP HPLC não aceita grandes quantidades de amostras. No procedimento convencional,a eluição das miotoxinasPLAz"like" era eluídausando acetato de amônia em altas concentraçõe se altos valor de pH. Atroca do acetato de amônio por bicarbonato de amônia permitiu o uso de tampões com baixo pH e baixas concentrações salinas. Outros venenos de Bothrops jararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus e Bothrops (Bothriopsis) bilineata foram fracionados usando procedimentos simplificados baseados na cromatografia em CMSepharose a pH 8.0 ou em RP HPLC. O uso de NH4HC03ou de acetonitrila como tampões nestes procedimentos cromatográficosdescritos acima, tem outras vantagens como a omissãode desalificaçãoe facilidadena liofilização. Isto permite uma melhorrecuperação das proteínas eluídas e redução do tempo de corrida. O método em CM-Sepharosee RP-HPLCdescritos aqui são recomendados para escalas preparativas e analíticas, respectivamente. Nos métodos previamente descritos usam dois ou mais passos cromatográficos para o isolamento de miotoxinas. Em adição as colunas preparativas wBondapack C18 mostraram também ser conveniente para a purificação de PLA2S. Ambos os métodos descritos aqui separam os componentes principaisdo veneno usando unicamente passo cromatográfico. Os perfis cromatográficos mostraram importantes diferenças no conteúdo de miotoxinas destes venenos. O veneno de B. alternatus, B. atrox e Bothriopsis bilineata não contem a miotoxina principal encontrada em outros venenos. O sequenciamento de aminoácidos dos primeiros 50 resíduos da região N-terminal destas miotoxinas PLA2"like" mostram uma homologia de 90 a 96% com outras miotoxinas botropicas. Todas as miotoxinas isoladas induzem edema de pata, aumentando o nível de creatinina quinase pancreática e indução da mionecrose junto com a infiltraçãode células polimorfonucleares. Nesta tese, nos apresentamos o isolamento, purificação e a determinação da estrutura primária de três miotoxinas fosfolipase A2"like" do veneno de Bothrops pirajai, denominadas como PrTX-I,PrTX-IIe MP-III4R. PrTX-I ou Piratoxina I foi isolado por Mancuso et ai., (1995), e completamente seqüênciada por Toyama et ai., (1998). PrTX-Ié a principal PLA2 miotóxica encontrado no veneno total de Bothrops pirajai, composto por 121 resíduos de aminoácidos, uma DLso de cerca de 8mg/kg em camundongos e uma dose edematogênica mínima de 39.5 :t 1.8 Ilg. A modificação química da His 48 da PrTX-I pelo p-BPB praticamente aboliu sua atividade biológica. PrTX-II ou Piratoxina II foi a segunda miotoxina importante isolada do veneno de Bothrops pirajai que foi sequenciada por Toyama et aI., (1999, submetido). Tem 121 resíduos de aminoácido de baixa atividade PLA2 devido substituição do Asp49 por Lys49e alteração do "Ioop" de ligação do cálcio pela substituição de Gly32 por Leu32 e outras modificações foram importantes para a perda da flexibilidadedo sítio de ligação do cálcio. PrTX-II tem somente um único amino ácido modificado (D132 para A132) em relação a PrTX-I esta mudança confere a PrTX-II um ligeiro caráter básico. A MP-III 4R foi a terceira miotoxina isolada do veneno de Bothrops pirajai. Esta miotoxina PLA2 "Iike" tem uma atividade PLA2moderada se comparada com outras enzimas encontradas em venenos Crotálicos. MP-III4R é um raro exemplode PLA2 com atividade fosfolipase A2, anticoagulante e miotóxica. Sua atividade PLA2 moderada é devido a substituição do resíduo E53 pelo K53 e seu efeito anticoagulante é devido a atividade PLA2.Amiotoxicidade não é devido a sua atividade catalítica. O alinhamento de amino ácidos da PrTX-I,PrTX-II mostra um alto nível (95%) de homologia sequencial entre esta miotoxina e outras PLA2botropicas. Contudo, estes valores diminuem para 80% para as não botropicas e para 70-75% para as PLA2Asp49. Ambas toxinas foram caracterizadas como miotoxinas potentes e tem um atividade PLA2 residual. MP-III 4R mostra uma homologia seqüencial de mais de 50% com outras PLA2 D-49. Maso alinhamento de aminoácidos da MP-III4R com PLA2K-49diminui para cerca de 60% de homologia. PrTX-II e PrTX-III foram cristalizados e difratados usando uma resulução de 2.04 e 2.7 A. Recentemente, a estrutura tridimensional da PrTX-IIfoi resolvida e mostrou uma estrutura dimérica
Abstract: The genus Bothrops comprises severaI species, which are widely distributed in South and North America. Among the bioactive proteins from Bothrops venoms, the phospholipase A2(PLA2,E.C.3.1.14) and PLA2-likemyotoxin are outstanding as their major components. Phospholipase A2Sare calcium-dependent enzymes which hydrolyze the 2 ester bonds of 1,2 diacyl-3sn phosphoglycerides (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). They are found in most tissues, mainly in the pancreatic juice of mammals, venom of snakes and insects. PLA2enzymes are classified onto four groups (I, II, III and IV), according to their extracellular or intracellular origin, their primary structure and disulfide bonding (Denis et aI., 1994). In this thesis, we work with Bothrops pirajai whole venom and its myotoxic phospholipase A2fractions. At first time, we develop a new strategy of purification of this myotoxinon the HPLC(reverse phase, ion exchange, and molecular exclusion) and in the convention low-pressure chromatography (CM-Sepharose). In our experimental condition, we observed that Reverse Phase HPLC(RP HPLC) has advantageous on the conventional method about the time of chromatographic run, the resolution of some proteins and preservation of integrity of PLA2 molecule. The first work made by Toyama et aI., (1995) presents the results of the purification of the main myotoxin PLA2"Iike" (MPI and MPII) from the whole venom of Bothrops piraja.,using only chromatographicstep on the RPHPLC. This novel purification protocol restricts the amount of protein to be loaded on each column in few mg. The final yield is 35% better than to in low-pressure ion exchange chromatography. In the Soares et aI., (1998), we proposed to increase the purification grade of main PLA2 "like" myotoxin using conventional column, because the RP HPLC does not accept great amount of samples. In the conventional procedure, the elution of the PLA2 "like" myotoxin was eluted using ammonium acetate at high salt and pH values. The exchange of the ammonium acetate by ammonium bicarbonate allowed using low pH and ionic salt concentration. PrTX-II or Piratoxin II was a second important myotoxin from Bothrops pirajai that has been sequecianated by Toyama (Submitted). It has 121 amino acid residues and has low PLA2activity arose of the substitution of Asp49 by Lys49and alteration of the calcium binding loop sequence by replacement of Gly32 by Leu32 and other modification were important for 1055of the flexibility the calcium ion binding site. PrTX-II I have only one amino acid change (0132 to A132) to PrTX-I, this change confer to PrTX-II a slight basic character. The MP-III 4R was thirty myotoxin isolated from the Bothrops pirajai venom. This PLA2 like myotoxinhasa moderate PLA2activity if comparedto other enzymesfound in the Crotalic venom. MP-III 4R is a rare example of PLA2 with phospholipase A2, anticoagulant and myotoxic activities. Its moderate PLA2activity is due to the replacement of E53 by K53 and its anticoagulant effects is due to that PLA2activity. The myotoxicity is not due to the catalytic activity. The aminoacid alignment of PrTX-I, PrTX-II shows a high levei(95%) of sequential homology between this myotoxin and other bothropic Lys-49 PLA2. However, these values fali to 80% for nonbothropic and to 70-75% for the Asp 49 PLA2S. 80th toxins were characterized as very potent myotoxin and have a residual PLA2 activity. MP-III 4R 049 exhibit a sequence homology with other 0-49 PLA2up 75%. But the amino acid alignment of MP-III 4R with K-49 PLA2falls to around 60% of homology. PrTX-II and PrTX-III were crystallizedand were diffractedat resolution of 2.04 and 2.7 of resolution, respectively. Recently, the three-dimensional structure of PrTX-II was solved and showed a dimeric structure. Other venoms from Bothropsjararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus and Bothrops (Bothriopsis) bilineata were fractionated using a simplified procedure based on ion-exchange chromatography on CMSepharose at pH 8.0 or reverse phase HPLC. The use of NH4HCO3or acetonitrile as the buffer in these chromatographic procedure described above, has other advantages as omissionof desalting and easy for freeze-drying. This allows a best recoveryof the proteins eluted and reduction of run time. The CM-Sepharose and the RP-HPLC methods described here are recommended for preparative and analytical purpose, respectively. Previous reported methods use two or more chromatographic steps for the isolation of myotoxins. In addition, the preparative WBondapackC18 column was also useful for the purificationof PLA2S. Both methods described here allow separating the major components of the venom using an only one chromatographic step. The resulting elution profiles showed important differences in the myotoxin content of these venoms. The venoms from B. alternatus, B. atrox and Bothriopsis bilineata did not contain the major myotoxin found in the other venoms. The amino acid sequence of the first 50 residues of the N-terminal region of the PLA2-like myotoxins showed a homology of 90-96% with other botropic myotoxins. All of the myotoxins isolated induced rat paw edema, increased the levei of plasma creatine kinase and produced myonecrosis together with polymorphonuclear cell infiltration. In this thesis, we present the isolation; purification and determination of primary structure of three phospholipase A2"like" myotoxin from the Bothrops pirajai snake venom denominated as PrTX-I, PrTX-II and MP-III 4R. PrTX-I or Piratoxin I was firstly isolated by Mancuso et aI., (1995), and full sequenced by Toyama et aI., (1998). PrTX-Iis the main miotoxic PLA2found in the whole Bothrops pirajai venom, composed by 121 amino acid residues, a DLso around 8mg/kg in mice and a minimal edematogenic dose of 39.5 :t 1.8 /.lg. The chemical modification of His-48 of PrTX-I by p-BPB practically destroyed its biological activity
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Nas últimas décadas tem se dado maior atenção à reprodução de animais silvestres, visto que para se conhecer e preservar uma espécie se faz necessário o conhecimento da história natural aliado aos processos da fisiologia e morfologia reprodutivas. Ciclos reprodutivos podem ser sazonais ou assazonais e apresentar variações em ambos os padrões. Por sua natureza e diversidade de fatores associados (e.g., atividade, dieta, temperatura), as estratégias reprodutivas vêm sendo investigadas sob uma abordagem evolutiva. Estudos do comportamento reprodutivo e dimorfismo sexual também têm sido destacados nesse âmbito. No entanto, poucos trabalhos são realizados para se conhecer as estratégias reprodutivas em serpentes neotropicais. Na maioria das vezes tais trabalhos abordam apenas alguns aspectos do ciclo reprodutivo de serpentes, como época de nascimentos, cópula e gestação, podendo ainda ser descritos de forma divergente pelo fato de muitos destes estudos serem norteados por dados de serpentes em cativeiro. Estudos microscópicos e macroscópicos, delineados com animais recém-chegados da natureza e preservados em coleções científicas, pode fornecer uma descrição e uma análise mais efetiva do ciclo reprodutivo permitindo a integração destes fatores. Assim, este trabalho investigou diversos aspectos da biologia reprodutiva de fêmeas e machos de populações de Bothrops alternatus do Brasil. Além disso, foram analisadas e descritas as estratégias reprodutivas empregadas por ambos os sexos durante o ciclo reprodutivo anual. Para isso, os espécimes foram dissecados ventralmente retirando-se fragmentos das gônadas e vias genitais de fêmeas e machos, em diferentes épocas do ano, a fim de se identificar as principais fases do ciclo vitelogênico, espermatogênico e do segmento sexual renal. Igualmente, para determinar se há estocagem de esperma nas fêmeas e nos machos, será investigada o útero aglandular e região do infundíbulo, vias genitais e ductos deferentes respectivamente. Tais dados permitirão compor um padrão reprodutivo, para essa espécie, levando-se em conta processos morfofisiológicos em ambos os sexos. Também foi realizada uma comparação dos ciclos reprodutivos entre populações de Bothrops alternatus e análises de possíveis influências ambientais na duração dos eventos reprodutivos
Over the last decades a greater attention has been given to the reproduction of wild animals, as the knowledge of natural history combined with the processes of reproductive physiology and morphology is essential for the preservation of a species. Reproductive cycles may be seasonal or not, and both patterns may have variations. Due to its nature and to the diversity of the associated factors (e.g., activity, diet, temperature), reproductive strategies have been investigated in an evolutionary approach. Studies of reproductive behavior and sexual dimorphism have also been highlighted in this context. However, few studies have been conducted to determine reproductive strategies in neotropical snakes. Most studies address only some aspects of the reproductive cycle of snakes, such as time of birth, copulation and pregnancy, and may present divergent descriptions as many of them are based on data from snakes in captivity. Microscopic and macroscopic studies carried out with animals newcomers from nature and preserved in scientific collections can provide a more effective analysis of the reproductive cycle allowing the integration of these factors. In this context, this project aims to investigate various aspects of the reproductive biology of female and male populations of Bothrops alternatus from Brazil. The reproductive strategies employed by both sexes during the annual reproductive cycle was analyzed and described. The specimens was dissected ventrally and fragments of gonads and genital tracts of females and males was removed at different times of the year in order to identify the main phases of the vitellogenic cycle, spermatogenesis and sexual segment of the kidney. Also, to determine whether sperm storage is done by females and males, we will investigate the aglandular uterus, the posterior infundibulum, genital tracts and vas deferens respectively. Such data was compose a reproductive pattern for the species that will take into account the morphophysiologic processes of both sexes. It was also performed a comparison of reproductive cycles between populations of Bothrops alternates and analysis of possible environmental influences in the duration of reproductive events

Bothrops atrox é uma serpente de grande importância ecológica devido a sua ampla distribuição geográfica no vasto e diversificado habitat amazônico. Informações sobre a biologia reprodutiva de B. atrox são escassas e pontuais, sendo a maioria dos dados provenientes de serpentes mantidas em cativeiro. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo descrever o ciclo reprodutivo de B. atrox, bem como as estratégias reprodutivas relacionadas a este ciclo tais como: maturidade e dimorfismo sexual, fecundidade, estocagem de espermatozoides e hipertrofia do segmento sexual renal nos machos. Além disso, o trabalho visou ainda relacionar tais estratégias com as condições ambientais (temperatura e precipitação). Para tanto, foram examinados 325 espécimes de B. atrox, sendo machos e fêmeas (maduros e imaturos), provenientes da Amazônia brasileira, preservados em nove coleções herpetológicas. Resultados mostraram haver diferenças relacionadas ao dimorfismo sexual: filhotes machos exibiram a coloração da ponta da cauda amarela, enquanto fêmeas apresentaram a ponta da cauda com coloração escura. Foi também observado que filhotes machos possuíram pigmentação escura na região gular e fêmeas apresentaram coloração clara. As fêmeas adultas foram significativamente maiores que os machos e atingiram a maturidade sexual com maiores tamanhos corpóreos. A vitelogênese foi sazonal (janeiro a agosto), entretanto, não houve sincronia entre a ocorrência de fêmeas prenhes e o período de nascimento dos filhotes. Assim, a extensão observada no ciclo reprodutivo das fêmeas foi possível devido à estocagem de espermatozoides, já que a cópula é sazonal. O ciclo reprodutivo dos machos foi descontínuo, sazonal semi-sincrônico. A produção de espermatozoides ocorreu ao longo do ano, no entanto, a espermiogênese foi observada principalmente no início da estação chuvosa (IEC) e a regressão testicular no início da estação seca (IES). Estocagem de espermatozoides nos ductos deferentes foi observada durante todos os meses do ano e o segmento sexual renal apresentou hipertrofia no IEC e final da estação chuvosa (FEC), sincronizado, portanto com a espermiogênese. Dessa forma, as condições ambientais (temperatura e pluviosidade) foram fundamentais na determinação do tipo de ciclo reprodutivo em B. atrox. Fêmeas prenhes foram encontradas durante vários meses do ano e o pico da atividade testicular ocorreu na estação chuvosa
Bothrops atrox is a snake of large ecological importance due to its wide geographic distribution in the vast and diversified Amazonian habitat. Information about the reproductive biology of B. atrox are scarce and punctual, with most information derived from snakes kept in captivity. Thus, this paper aimed to describe the reproductive cycle of B. atrox, as well as reproductive strategies related to this cycle as: maturity and sexual dimorphism, fecundity, sperm storage, and the hypertrophy of sexual segment of the kidney in males. Moreover, this work also aimed to relate such strategies with environmental conditions (temperature and precipitation). For that, it were examined 325 specimens of B. atrox, being males and females (mature and immature) from the Brazilian Amazon, preserved in nine herpetological collections. Results showed some differences related to sexual dimorphism: neonates males had the coloration of the tail tip yellow, whereas females showed the tail tip with dark coloration. It was also observed that neonate males had dark pigmentation in the throat region, whereas neonate females showed lighter coloration. Adult females were significantly larger than males, and attained sexual maturity at larger body sizes than males. Vitellogenesis was seasonal (January to August), however, there was no synchrony between the occurrence of pregnant females and birth periods. Thus, the extent observed in the female reproductive cycle was possible due to the sperm storage, since mating is seasonal. Male reproductive cycle was discontinuous, seasonal semi-synchronous. Sperm production occurred throughout the year, however, spermiogenesis was observed mainly in the beginning of the rainy season (BRS) and testicular regression in the beginning of the dry season (BRS). Sperm storage in the ductus deferens was observed during all months of the year and the sexual segment of the kidney presented hypertrophy in BRS and in the end of the rainy season (ERS), thus synchronized with spermiogenesis. Therefore, environmental conditions (temperature and rainfall) were essential in determining the type of reproductive cycle of B. atrox. Pregnant females were found during several months of the year and the peak of testicular activity occurred in rainy season

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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Um dos objetivos centrais da biogeografia histórica é a reconstrução da história de um determinado táxon ou um grupo baseado em hipóteses filogenéticas. A ideia de que as relações filogenéticas fornecem informações da distribuição geográfica passada é antiga, e apenas se tornou possível com a Sistemática Filogenética de Willi Hennig. Análises de Dispersão e Vicariância (DIVA) e modelos de Dispersão, Extinção e Cladogênese (DEC) são métodos amplamente difundidos para a reconstrução da distribuição geográfica ancestral de espécies. Essas análises incluem eventos anagenéticos e cladogenéticos. Recentemente, esses métodos foram implementados em um pacote do programa R denominado BioGeoBEARS. Além dos eventos anagenéticos e cladogenéticos já implementados nas versões originais de DEC e DIVA, o BioGeoBEARS apresenta a possibilidade de incluir a dispersão em saltos, ou jump dispersal, que tem se mostrado interessante mesmo quando consideradas espécies ou grupos que habitam o continente. O grupo Bothrops alternatus é um clado monofilético recuperado em diferentes filogenias do gênero Bothrops e inclui seis espécies de jararacas que habitam principalmente áreas de vegetação aberta: B. alternatus, B. itapetiningae, B. fonsecai, B. cotiara, B. ammodytoides e B. jonathani. Os objetivos deste trabalho são: 1) inferir a origem do grupo B. alternatus; 2) compreender a diversificação e evolução da distribuição geográfica das espécies atuais e seus ancestrais hipotéticos; 3) analisar se a diversificação ocorreu a partir de áreas abertas ou florestais; e 4) entender como processos geológicos e 14 climáticos podem ter influenciado a distribuição atual do grupo. Revisamos e georreferenciamos 3.265 registros de distribuição geográfica de espécimes depositados em coleções zoológicas e dados da literatura. Utilizamos uma filogenia datada que inclui cinco das seis espécies do grupo, pois...
One central aim of historical biogeography is the history reconstruction of a taxon or clade based on phylogenetic hypotheses. The idea that the phylogenetic relationships provide information on past geographical distribution is old, and it was only possible with the Willi Hennig's Cladistic method. Dispersal Vicariance Analysis (DIVA) and Models of Dispersal-Extinction-Cladogenesis (DEC) are among the most popular methods to reconstruct ancestral geographical distributions. Both analysis include anagenetic and cladogenetic processes. Both methods were recently implemented in the R software package BioGeoBEARS. Besides the anagenetic and cladogenetic processes of the original DEC and DIVA, BioGeoBEARS includes a parameter related to jump dispersal, that has been shown interesting even for non-insular species. The Bothrops alternatus group corresponds to a monophyletic clade, recovered in different phylogenies of the genus Bothrops and includes six lancehead snakes species that mainly inhabit open vegetation areas: B. alternatus, B. itapetiningae, B. fonsecai, B. cotiara, B. ammodytoides and B. jonathani. Our aims here are: 1) to infer the area origin of the B. alternatus group; 2) to comprehend the diversification and evolution of the geographic distribution of present species and their hypothetical ancestrals; 3) to analyze if diversification occurred in open vegetation or forested areas; and 4) to understand how geological and climatic processes may have influenced the present distribution of the group. We revised and georeferenced 3,265 records of geographic distributions of species via zoological collection records and 17 literature data. We used a phylogeny including five out six species of the group, because B. jonathani is a rare species lacking molecular data. The biogeographic units in which the species occur were delimited by intersection of geographic distribution of the species and shapefiles of provinces and Brazilian...
FAPESP: 2013/03155-5

Orientador: Ricardo J. Sawaya
Banca: Fausto Erritto Barbo
Banca: Maria Fernanda Calio
Resumo: Um dos objetivos centrais da biogeografia histórica é a reconstrução da história de um determinado táxon ou um grupo baseado em hipóteses filogenéticas. A ideia de que as relações filogenéticas fornecem informações da distribuição geográfica passada é antiga, e apenas se tornou possível com a Sistemática Filogenética de Willi Hennig. Análises de Dispersão e Vicariância (DIVA) e modelos de Dispersão, Extinção e Cladogênese (DEC) são métodos amplamente difundidos para a reconstrução da distribuição geográfica ancestral de espécies. Essas análises incluem eventos anagenéticos e cladogenéticos. Recentemente, esses métodos foram implementados em um pacote do programa R denominado BioGeoBEARS. Além dos eventos anagenéticos e cladogenéticos já implementados nas versões originais de DEC e DIVA, o BioGeoBEARS apresenta a possibilidade de incluir a dispersão em saltos, ou jump dispersal, que tem se mostrado interessante mesmo quando consideradas espécies ou grupos que habitam o continente. O grupo Bothrops alternatus é um clado monofilético recuperado em diferentes filogenias do gênero Bothrops e inclui seis espécies de jararacas que habitam principalmente áreas de vegetação aberta: B. alternatus, B. itapetiningae, B. fonsecai, B. cotiara, B. ammodytoides e B. jonathani. Os objetivos deste trabalho são: 1) inferir a origem do grupo B. alternatus; 2) compreender a diversificação e evolução da distribuição geográfica das espécies atuais e seus ancestrais hipotéticos; 3) analisar se a diversificação ocorreu a partir de áreas abertas ou florestais; e 4) entender como processos geológicos e 14 climáticos podem ter influenciado a distribuição atual do grupo. Revisamos e georreferenciamos 3.265 registros de distribuição geográfica de espécimes depositados em coleções zoológicas e dados da literatura. Utilizamos uma filogenia datada que inclui cinco das seis espécies do grupo, pois...
Abstract: One central aim of historical biogeography is the history reconstruction of a taxon or clade based on phylogenetic hypotheses. The idea that the phylogenetic relationships provide information on past geographical distribution is old, and it was only possible with the Willi Hennig's Cladistic method. Dispersal Vicariance Analysis (DIVA) and Models of Dispersal-Extinction-Cladogenesis (DEC) are among the most popular methods to reconstruct ancestral geographical distributions. Both analysis include anagenetic and cladogenetic processes. Both methods were recently implemented in the R software package BioGeoBEARS. Besides the anagenetic and cladogenetic processes of the original DEC and DIVA, BioGeoBEARS includes a parameter related to jump dispersal, that has been shown interesting even for non-insular species. The Bothrops alternatus group corresponds to a monophyletic clade, recovered in different phylogenies of the genus Bothrops and includes six lancehead snakes species that mainly inhabit open vegetation areas: B. alternatus, B. itapetiningae, B. fonsecai, B. cotiara, B. ammodytoides and B. jonathani. Our aims here are: 1) to infer the area origin of the B. alternatus group; 2) to comprehend the diversification and evolution of the geographic distribution of present species and their hypothetical ancestrals; 3) to analyze if diversification occurred in open vegetation or forested areas; and 4) to understand how geological and climatic processes may have influenced the present distribution of the group. We revised and georeferenced 3,265 records of geographic distributions of species via zoological collection records and 17 literature data. We used a phylogeny including five out six species of the group, because B. jonathani is a rare species lacking molecular data. The biogeographic units in which the species occur were delimited by intersection of geographic distribution of the species and shapefiles of provinces and Brazilian...
Mestre