Dissertations / Theses on the topic 'Calorimétrie de toitration isotherme'

L’anhydrase carbonique IX (AC IX h) est une enzyme souvent associée à un mauvais pronostic, à la progression tumorale et à la régulation du pH extracellulaire des cellules tumorales sur un plan moléculaire. L’AC IX est très peu exprimée dans les tissus sains mais par contre, elle est surexprimée au sein de la masse tumorale, ce qui permet de la qualifier comme une cible thérapeutique potentielle. Une nouvelle classe d’inhibiteurs d’anhydrase carbonique IX a été conçue et synthétisée par notre équipe. Cette série de composés présente une solubilité aqueuse faible, limitant ainsi son développement pharmaceutique. La complexation de ces composés avec des cyclodextrines offre la possibilité d’améliorer leur solubilité et leur biodisponibilité sans affecter leur structure originale. Des études de complexation entre nos composés et diverses cyclodextrines ont été réalisées, afin de déterminer le complexe supramoléculaire le plus adéquat. Les études des complexes Analyte / Cyclodextrine ont été réalisées par deux techniques complémentaires, la résonance magnétique nucléaire et l’électrophorèse capillaire. La complexation de six sulfonamidodiarylpyrazoles originaux avec six cyclodextrines (&#61537;-, &#61538;- et &#61543;- CDs, hydroxypropyle HP-&#61538;-CD, méthyle Me-&#61538;-CD ou amino NH2-&#61538;-CD) a été étudiée au pH physiologique. Les constantes de complexation, la stœchiométrie et l’étude structurale des complexes ont alors été déterminées. Par ailleurs, la présence d’un centre d’asymétrie dans la série des alcools secondaires, synthétisés sous leurs formes racémiques, a orienté nos travaux vers le développement de méthodes séparatives à l’échelle préparative afin de disposer de quantités suffisantes d’énantiomères permettant la détermination de leurs affinités pour la cible. Les séparations chirales ont été mises au point par chromatographie liquide haute performance, par chromatographie en phase supercritique ou par électrophorèse capillaire. La caractérisation de quatre analytes vis-à-vis de l’anhydrase carbonique II (AC II) a été réalisée, dans un premier temps, par des études d’interaction moléculaire utilisant des méthodes biophysiques qui ne nécessitent pas de marquage des partenaires, la résonance plasmonique de surface, la calorimétrie de titration isotherme et la thermal shift assay. L’objectif de cette comparaison était de valider les résultats obtenus mais aussi de sélectionner la méthode d’analyse permettant l’étude d’une grande série de composés avec l’isoforme d’intérêt (AC IX). Les résultats obtenus nous ont conduits à choisir la résonance plasmonique de surface (RPS) comme technique de choix pour l’étude de l’affinité des sulfonamidodiarylpyrazoles. Les affinités de seize composés pour trois isoformes (AC II, IX et XII) ont ensuite été déterminées par RPS. Des affinités de l’ordre du nanomolaire ont été obtenues pour les trois isoformes. De cette étude, deux composés possédant une affinité intéressante pour l’AC IX et une sélectivité AC IX versus AC II ont été selectionnés. De plus, l’étude de l’affinité des composés optiquement purs a permis de mettre en évidence une énantioselectivité isoforme dépendante<br>Carbonic anhydrase (CA) IX expression is increased upon hypoxia and has been proposed as a therapeutic target since it has been associated with poor prognosis, tumor progression and pH regulation. A new class of human carbonic anhydrase IX (hCA IX) inhibitors, diarylpyrazole sulfonamide derivatives, has been synthesized in our team. These compounds have a very limited water solubility which limits their pharmaceutical development. The complexation with cyclodextrins (CDs) offers the possibility to improve their solubility without affecting their original structure and has proved to be one of the most effective. The studies of the complexes formed between our compounds and various CDs have been performed, in order to choose the most appropriate CD. We investigate by NMR and capillary electrophoresis the complexes formed between six original diarylpyrazole sulfonamide derivatives and six CDs (native &#61537;-, &#61538;- and &#61543;- CDs, hydroxypropylated HP-&#61538;-CD, methylated Me-&#61538;-CD or amino NH2-&#61538;-CD) at physiological pH. Futhermore, as these compounds have a chiral center, it was essential to separate their enantiomers and verify their optical purities before envisaging the study of their pharmacological activity. The enantiomeric purification was performed by three separative methods, the high performance liquid chromatography, the supercritical fluid chromatography and the capillary electrophoresis. This study permit to obtain optically pure compound in order to determine affinity of carbonic anhydrase. To determine the affinities of derivatives with isoforms, we performed first a comparison of three label-free methods for quantitative assessment of binding strength between carbonic anhydrase II and sulfonamides derivatives. The formation constants have been determined by surface plasmon resonance, isothermal titration calorimetry and thermal shift assay, which characterize the interaction between two partners. This study was useful to select and to validate the surface plasmon resonance (SPR) for the molecular interaction between carbonic anhydrases and all our derivatives. Affinities of sixteen compounds for three carbonic anhydrase isoforms (CA II, IX and XII) were then determined by SPR. These compounds have nanomolar affinities for three isoforms. Two compounds have affinities with great interest for the isoform CA IX, and a good selectivity CA IX versus CA II and should be considered as lead compounds. Additionally, some of optically pure compounds have shown an enantioselectivity for the AC isoforms

Le silicate tricalcique est le constituant principal du ciment Portland utilisé dans le béton. L’hydratation du silicate tricalcique conduit à former deux hydrates peu solubles, l'hydrosilicate de calcium et la portlandite. La cinétique de l'hydratation du silicate tricalcique a été étudiée sur des suspensions diluées et agitées par microcalorimétrie et conductimétrie. L’utilisation simultanée de ces techniques a conduit à des résultats originaux qui ont permis de mettre en évidence: 1) le début de la précipitation de l'hydrosilicate de calcium et de la portlandite; 2) l'existence de deux étapes cinétiques lors de la précipitation de l'hydrosilicate de calcium. La première est observée lorsque la solution est sous-saturée par rapport à la portlandite et la seconde lorsque la solution est sursaturée par rapport à la portlandite. Au début de chacune des étapes, la cinétique est gouvernée par la nucléation-croissance de l'hydrosilicate de calcium puis par la diffusion à travers la couche formée par ce dernier autour des grains de silicate tricalcique. Le changement de régime cinétique correspond à un taux d'avancement de la réaction différent lors des deux étapes. Ceci indique que l'hydrosilicate de calcium formé lors de la première étape est différent de celui formé lors de la seconde, bien qu'aucune différence structurale n'ait pu être établie par RMN du silicium 29 ou par diffraction des rayons X. La compréhension du processus de l'hydratation du silicate tricalcique en suspension a permis d'expliquer l'hydratation du silicate tricalcique en pâte grâce à la continuité qui a été établie entre ces deux milieux. Ainsi les hypothèses antérieures pour expliquer l'hydratation du silicate tricalcique en pâte ont pu être discutées de façon critique à la lumière de nos résultats.

Ce travail a pour objectif essentiel de mettre en évidence les apports des récents développements des techniques de mesures fluxmétriques pour l'étude de l'hydratation des bétons. Il comprend deux parties distinctes. La première concerne la mise au point d'un calorimètre isotherme adapté au matériau béton. On conçoit l'intérêt de ce dispositif dans le cadre de l'étude d'une réaction thermoactivée. Dans le travail présenté ici la calorimétrie isotherme est utilisée avec quatre applications principales. Il s'agit tout d'abord d'étudier l'effet de la température de cure sur la chaleur d'hydratation. Le développement d'une méthode de détermination de l'énergie d'activation et du degré d'avancement constitue un second objectif. Des études comparatives de cinétique de réaction en conditions isothermes et adiabatiques sont présentées. Une étude des réactions pouzzolaniques est ensuite décrite. Ces deux dernières études ont été réalisées en collaboration avec le LCPC. La seconde partie du rapport vise à discuter de l'apport potentiel des mesures fluxmétriques dans une démarche de maturométrie sur ouvrages. Un travail de traitement du signal est nécessaire au préalable pour extraire du flux global mesuré, la part qui est liée à la réaction d'hydratation. Les résultats obtenus sont encourageants. Les flux de réaction estimés permettent une description assez précise de la cinétique d'hydratation alors que l'information température est totalement inutilisable. L'instant de début de prise peut par exemple être détecté beaucoup plus précisément. Le taux de production de chaleur, le degré d'avancement et la chaleur dégagée peuvent être estimés en fonction du temps. Les mesures présentées concernent des éléments fins pour lesquels la variation de température durant la prise est sensiblement homogène.

Ce travail de thèse a été consacré au développement de nouvelles méthodologies de caractérisation des affinités intermoléculaires par le biais de la calorimétrie de titration isotherme (ITC), après validation de systèmes modèles par l'intermédiaire des spectroscopies UV-visible, RMN et de l'électrophorèse capillaire. Nous avons en particulier montré que la mise en place et le couplage d'expériences non conventionnelles avec les protocoles classiques permettait d'améliorer la caractérisation calorimétrique, avec notamment une diminution parfois spectaculaire des incertitudes liées aux paramètres thermodynamiques. Ce potentiel de l'analyse globale d'expériences différenciées a été évalué sur un plan théorique, permettant ainsi la définition et l'optimisation des expériences à mettre en oeuvre en fonction du type de complexe étudié. L'exploitation expérimentale de ces stratégies a également permis l'étude de complexations problématiques sur le plan analytique, dans le cadre de complexes impliquant des molécules telles que les cyclodextrines ou l'albumine, et s'inscrivant dans des applications liés aux domaines de l'environnement et de la santé. Ainsi, nos stratégies ont levé les difficultés liées aux complexes athermiques, aux complexes de faibles affinités, aux équilibres multiples et aux faibles solubilités de l'un ou l'autre des partenaires de la complexation. Enfin, l'évaluation d'un nouveau modèle de traitement thermo-cinétique du thermogramme ITC a été réalisée, accroissant encore le potentiel de cette technique vis-à-vis de la caractérisation des interactions moléculaires<br>This work was dedicated to the development of new isothermal titration calorimetry (ITC) methodologies for the characterization of intramolecula affinities, after validation of model system via capillary electrophoresis, UV-visible and NMR spectroscopy. We have demonstrated that the coupling of unconventional experiments with the conventional protocols generally improves the calorimetric characterization, with a dramatic decrease of the uncertainties on thermodynamic parameters. The potential of global analysis applied to differentiated experiments was evaluated on a theoretical level, allowing the definition of optimal experiments, depending on the type of studied complex. These strategies also enabled, on a experimental point of view, the study of complexations which cannot be analyzed by conventional approaches, in the case of complexes involving cyclodextrins or albumin. Indeed, our strategies overcomes the difficulties associated with athermic complexes, with complexes of low affinity, with multiple equilibria and with the low solubility of interacting partners. Finally, the evaluation of a new thermo-kinetic treatment of ITC thermograms has been achieved, further increasing the potential of this technique in the characterization of molecular interactions

L'etude structurale et texturale (diffraction des rayons x, microscopie electronique a balayage et adsorption de gaz), de zeolites a echangees, a montre que la presence des cations nickel ou cuivre dans le reseau zeolitique, entraine une instabilite structurale au-dela de trois cations sodium echanges par maille. Par contre, les cations lithium, cobalt et zinc ont peu d'influence sur la cristallinite quand ils remplacent les cations sodium. La calorimetrie d'adsorption montre que le dioxyde de carbone est chimisorbe sous forme de carboxylates bidentates sur un nombre de sites tres limites (moins de 0,3 par maille), aussi bien avec naa originale qu'avec linaa. Ce nombre de sites diminue progressivement par echange avec des cations divalents et tend vers zero quand plus de deux cations sodium sont remplaces. Lors de l'adsorption de l'ethylene, par contre, c'est l'introduction des cations divalents dans le reseau zeolitique qui fait apparaitre des relativement fortes chaleurs. Celles-ci augmentent avec le taux d'echange mais n'interessent qu'un nombre de sites tres inferieur au nombre de cations divalents presents par maille. Ces fortes chaleurs sont dues a une polarisation plus importante des electrons delocalises de la double liaison carbone-carbone

Ce travail est dédié essentiellement aux mesures d'enthalpies de formation de composes intermétalliques par calorimétrie de réaction directe à températures élevées. Six systèmes binaires et un ternaire de métaux de transition ont été étudiés. L’étude par rayons X et microsonde des produits de la calorimétrie a permis de mettre en évidence deux nouveaux composes: OsZr2 (structure cubique type NiTi2) et Os17Zr54 (structure orthorhombique type Os17Hf54) aussi que de confirmer l'existence de Fe23Zr6. Dans le système Os-Hf, aucune trace des phases Os29Hf71 et OsHf2, qualifiées par Waterstrat de phases mystérieuses, n'a été observée. La modélisation numérique du système binaire Os-Zr, à l'aide du logiciel thermo-Calc a permis de vérifier la cohérence des enthalpies de formation mesurées et de compléter le diagramme expérimental fragmentaire disponible. L'application de notre méthode calorimétrique, pour la première fois dans le laboratoire à un système ternaire, nous a permis la détermination des enthalpies de formation de plusieurs alliages: Fex(Hf, Zr)1-x pour x 0. 66 at. % Fe et de corriger dans le coin riche en fer la coupe isotherme a 900°C du système Fe-Hf-Zr telle qu'elle figure dans la littérature

C'est dans un contexte marqué par une demande croissante en énergie primaire, une diminution des ressources et dans un souci de protection de l'environnement que le biocarburant de 2ème génération est développé. Cependant, ce biocarburant est non viable économiquement. L’optimisation, le contrôle et la connaissance des cinétiques régissant les procédés de fabrication de ce bioéthanol sont donc des éléments capitaux. Dans cette étude, le potentiel de la calorimétrie isotherme pour surveiller les réactions d'hydrolyse et de fermentation est testé.Les résultats montrent que cette méthode est efficace. En effet, celle-ci a permis de mettre en évidence l'importance du ratio enzyme/substrat pour maximiser le rendement et de déterminer un meilleur cocktail composé de cellulases + cellobiose déshydrogénase (CDH) qui permet la production d'une certaine quantité d'acide gluconique, qui pourrait améliorer l'attractivité de ce biocarburant. Ces mêmes essais ont également permis de déterminer la chaleur de l'hydrolyse de la paille de blé, qui est 32,18 ± 3,18 J.g-1 (gramme de sucres produits).Les mesures obtenues ont été utilisées pour déterminer les constantes cinétiques des cellulases + CDH sur la paille de blé et les résultats montrent que ce cocktail enzymatique est plus rapide à 45 °C dans la gamme de températures testée (40-55°C) avec une vitesse de 7,36 ± 0,62 mmol/L.min.Par ailleurs, les essais avec un calorimètre à échelle laboratoire ont montré que même si celui-ci ne mesure pas avec précision les chaleurs engendrées par les réactions d'hydrolyse et de fermentation, celui-ci donne de bonnes indications sur le déroulement et l'avancement de ces réactions<br>Second generation biofuel is developed in a context marked by an increasing demand for primary energy, a decrease in resources and in environmental protection concernsHowever, this biofuel is not economically viable. Optimization, control and knowledge of the kinetics governing this bioethanol production processes are crucial elements.In this study the potential of isothermal calorimetry to monitor hydrolysis and fermentation reactions is tested.The results show that the isothermal calorimetry is an effective method. Indeed this method allowed determining that the substrate/enzyme ratio is an important parameter of the hydrolysis yield.Furthermore it has determined a better enzyme cocktail consisting of Cellulases + Cellobiose Dehydrogenase (CDH) which allows the production of a certain amount of gluconic acid, which could improve the attractiveness of these second-generation biofuels. These same tests also determined the hydrolysis heat of wheat straw which is 32.18 ± 3.18 J.g-1 (gram reducing sugars product).The measurements obtained were used to determine kinetic constants cellulases + CDH on wheat straw and the results show that this enzyme cocktail is faster at 45 ° C in the range of temperatures tested (40 - 55°C) with a speed of 7.36 ± 0.62 mmol/L.min.In addition, testing with a laboratory-scale calorimeter showed that even if this tool does not accurately measure the heat generated by the hydrolysis reaction and fermentation, it gives a good indication of the development and advancement of these reactions

L’utilisation des combustibles fossiles (énergies non renouvelables) est responsable de l’augmentation de la concentration en gaz à effet de serre dans l’atmosphère. Lors de l'examen des solutions de rechange, l’hydrogène comme vecteur énergétique est le plus séduisant. Le stockage de l’hydrogène en phase solide sous forme d’hydrures, est l’une des solutions non polluantes futures pour le stockage et le transport de l’énergie. Parmi les matériaux candidats, le borohydrure de sodium (NaBH4) et l’hydrure de magnésium (MgH2) ont été sélectionnés au vu de leur capacité gravimétrique élevée en hydrogène. La réaction d'hydrolyse de NaBH4 a été étudiée dans un calorimètre en phase liquide couplée à un compteur à gaz, afin de suivre en même temps, la cinétique de production d’hydrogène et l’évolution de la chaleur de réaction. Nous avons préparé des catalyseurs à base de cobalt supporté sur différents supports (hydrotalcites, KF/Al2O3, hétéropolyanions) ayant des propriétés acido-basiques différentes. Les supports et les catalyseurs à base de cobalt ont été caractérisés par DRX, MEB+EDX, ICP et BET. Co/hétéropolyanions a montré une cinétique très élevée pour la production d'hydrogène accompagnée d'une conversion totale dans la réaction d'hydrolyse. L’absorption et la désorption de l’hydrogène ont été étudiées sur l’hydrure de magnésium. Afin d’améliorer la cinétique de sorption de MgH2, nous avons préparé des mélanges MgH2-MT (MT = métal de transition Co, Ni, Fe, Cr, Mn), MgH2-MTmélangé (MT = métal de transition Co, Ni, Fe,), MgH2-MTnano (MT = métal de transition Conano, Ninano, Fenano, Cunano, Znnano) et MgH2-nLiBH4-MTnano (MT = métal de transition Conano, Ninano, Fenano) par broyage à billes de haute énergie. Leurs propriétés physico-chimiques ont été étudiées par DRX et MEB+EDX. La température de désorption de l’hydrogène et la quantité d’hydrogène dégagée ont été étudiées par TPD. La cinétique d’absorption de l’hydrogène et la réversibilité du stockage de l’hydrogène ont été étudiées par isotherme PCT pour le système MgH2-MTnano. MgH2-10-Ninano présente la meilleure propriété de stockage réversible de l’hydrogène, MgH2-10-Conano et MgH2- 10-Fenano sont aussi de bons candidats potentiels<br>The use of fossil fuels (non-renewable) is the main raison of increasing the green house in the atmosphere. Among the considered alternatives, hydrogen is seen as the most attractive energy carrier. The storage of the hydrogen in the solid phase in the form of hydrides is one of the clean future solutions for storage and transport of energy. Among potential materials, sodium borohydride (NaBH4) and magnesium hydride (MgH2) were selected regarding their high hydrogen gravimetric capacity. The hydrolysis reaction of NaBH4 was studied in a liquid phase calorimetry coupled to a gas-meter, in order to monitor simultaneously the kinetics of the hydrogen production and the evolution of the reaction heat. We prepared cobalt supported catalysts using various supports (hydrotalcites, KF/Al2O3, heteropolyanions) with different acid-base properties. The supports and the catalysts were characterized by XRD, SEM+EDX, ICP and BET. Co/heteropolyanions showed a very high kinetics for the production of hydrogen accompanied by a total conversion in the hydrolysis reaction. The absorption and desorption of hydrogen were studied using magnesium hydride. In order to improve the sorption kinetics of MgH2, we have prepared the MgH2-MT (MT= transition metal Co, Ni, Fe, Cr, Mn), MgH2-MTmixture (MT= transition metal Co, Ni, Fe), MgH2-MTnano (MT = transition metal Conano, Ninano, Fenano, Cunano, Znnano) and MgH2-nLiBH4-MTnano (MT = transition metal Conano, Ninano, Fenano) mixtures by high energy ball milling. Their physicochemical properties were studied by XRD and SEM+EDX. The temperature of hydrogen desorption and the amount of hydrogen generated were investigated by TPD. The kinetics of hydrogen absorption and the reversibility of hydrogen storage were investigated with PCT isotherm for the system of MgH2-MTnano. The sample MgH2-10-Ninano presents the best property for reversible hydrogen storage; MgH2- 10-Conano and MgH2-10-Fenano are also good potential candidates

Le nombre de cibles potentielles pour la conception de nouvelles molécules à activité thérapeutique ne cesse de croître. Pour chaque cible, il est nécessaire d’identifier des molécules actives et de les optimiser afin d’atteindre l’affinité et la sélectivité recherchées. Ces nouveaux défis accentuent la nécessité d’améliorer notre compréhension des facteurs qui mènent à la reconnaissance moléculaire entre une drogue potentielle et une macromolécule biologique, et particulièrement des facteurs énergétiques à la base de la stabilisation d’un complexe d’interaction. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés à l’effet que pouvaient avoir les équilibres de protonation/déprotonation des résidus ionisables d’une protéine sur les paramètres thermodynamiques caractérisant la complexation d’un ligand. Dasns ce but, nous avons étudié l’interaction entre l’α-chymotrypsine et un de ses inhibiteurs compétitifs, la proflavine. Cette protéine est représentative d’un nombre important d’enzymes présentant le même mécanisme catalytique. La compréhension des facteurs qui régissent les équilibres de protonation/déprotonation des résidus ionisables présents dans son site actif ainsi que de l’effet sur ceux-ci de l’interaction avec des ligands est d’une importance primordiale pour le développement d’inhibiteurs plus sélectifs de ces protéases.<p>Cette étude s’est essentiellement composée de trois volets. (i) La réalisation d’un modèle du complexe d’interaction afin de confronter des données structurales aux données expérimentales recueillies. (ii) L’étude de l’interaction entre l’α-chymotrypsine et la proflavine par spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) afin de mettre en évidence les résidus ionisables dont les équilibres de protonation/déprotonation sont influencés par la complexation du ligand. (iii) L’étude de la thermodynamique de l’interaction par Calorimétrie à Titrage Isotherme (ITC) et spectroscopie d’absorption en fonction de l’état d’ionisation des résidus identifiés par l’étude RMN.<p>Le modèle du complexe d’interaction entre l’α-chymotrypsine et la proflavine a été réalisé sur base de la structure cristallographique du complexe entre cet inhibiteur et une protéase apparentée à la chymotrypsine, la thrombine. Il ressort de l’analyse du modèle obtenu que la proflavine est profondément enfouie dans le subsite S1 de l’enzyme et présente une très grande complémentarité de surface avec cette poche hydrophobe. Nous avons également pu constater la présence de plusieurs molécules d’eau immobilisées au sein du complexe, et d’une molécule en particulier faisant office de relais de liens-H.<p>L’étude de l’interaction entre l’α-chymotrypsine et la proflavine par RMN du 1H a été précédée par une étude de l’effet du degré de maturité de l’enzyme sur les interactions liant les différents résidus composant la triade catalytique (Asp102, His57 et Ser195). Lors de l’activation du précurseur inactif de l’enzyme, le chymotrypsinogène, vers la forme mature, l’α-chymotrypsine, il semble en effet que le lien-H entre le NH&949;2 de l’His57 et le Oγ de la Ser195 soit affaibli, contrairement à celui qui relie le NHδ1 de cette même histidine au Oδ1 de l’Asp102. Nous rapportons pour la première fois l’observation de l’influence de la protonation de l’Asp102 sur les déplacements chimiques des protons NHδ1 et NH&949;2 de l’His57. L’étude de l’interaction entre l’α-chymotrypsine et la proflavine par RMN, nous a permis de mettre en évidence l’effet de la complexation du ligand sur l’état d’ionisation des résidus His57 et Asp102 de la triade catalytique, les pKa de ces résidus dans l’enzyme libre valant respectivement 7 et approximativement 4.<p>Les paramètres thermodynamiques de l’interaction α-chymotrypsine - proflavine et des différents équilibres de protonation/déprotonation qui y sont liés ont été obtenus par spectroscopie d’absorption et ITC. Cette dernière technique constitue un outil précieux pour l’étude d’interactions moléculaires car il s’agit de la seule technique expérimentale permettant la mesure directe de l’enthalpie d’interaction. Lorsque des équilibres de protonation/déprotonation sont thermodynamiquement liés à l’interaction, il s’agit également de la seule technique permettant la quantification de ces effets. En mesurant la constante d’affinité et l’enthalpie d’interaction observées à différents pH et dans différents tampons, nous avons pu, sur base du modèle obtenu par RMN, déterminer les paramètres thermodynamiques intrinsèques des différents équilibres.<p>La corrélation entre les données thermodynamiques obtenues par ITC et spectroscopie d’absorption et les données structurales obtenues par RMN et sur base de l’analyse du modèle du complexe d’interaction, nous a permis de rationaliser les facteurs à la base de l’interaction préférentielle de l’inhibiteur avec une des formes de l’enzyme. L’interaction entre l’α-chymotrypsine et la proflavine est la plus favorable lorsqu’à la fois l’His57 et l’Asp102 sont déprotonnés. Cette interaction est caractérisée par un terme enthalpique favorable et un terme entropique légèrement défavorable. Ce dernier terme s’expliquerait en partie par l’immobilisation dans le site d’interaction de plusieurs molécules d’eau. L’affinité entre l’α-chymotrypsine et la proflavine diminue lorsque l’His57 se protonne. La répulsion électrostatique entre les charges positives de la proflavine et de l’His57 est vraisemblablement un des facteurs permettant d’expliquer cette diminution de la constante d’affinité. Nous n’avons pu mettre en évidence d’interaction entre ces deux molécules dès lors que l’Asp102 est protonné, malgré que ce résidu soit situé relativement loin de la proflavine dans le complexe. Il s’agit donc d’un effet indirect, probablement relayé par l’His57. Tant que l’Asp102 est déprotonné, sa charge négative compenserait la charge positive de l’His57 et réduirait la répulsion électrostatique avec la proflavine, ce qui n’est plus le cas lorsque l’aspartate se protonne.<br>Doctorat en sciences appliquées<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les « glycoligands » sont des complexants obtenus par fonctionnalisation avec des bases de Lewis de structures centrales de type sucre. Nous avons fait varier de manière sys tématique la nature d'une plateforme centrale monosaccharidique (pyrannoses et furannoses de configurations et conformations variées) dans le cadre de l'étude des complexes dérivés de ligands contenant trois fonctions éther de 2-picolyle (ligands « triéther »). Nous avons considéré également des ligands « aminoéther » et « diamino » obtenus respectivement par fonctionnalisation de dérivés de type aminodésoxy-furannose et diaminodidésoxy-furannose. Les propriétés de complexation de cette famille de ligands pour les cations divalents 3d (Mn . . . Cu) ont été appréciées à travers des études structurales (diffraction des rayons X) et spectroscopiques. Divers complexes ont été étudiés par dichroïsme circulaire prouvant le caractère diastéréosélectif de la réaction de complexation et mettant en évidence une corré- lation empirique entre la conformation des cycles pyrannosique ou furannosique et la forme du signal. Dans un exemple choisi, la complexation a été caractérisée thermodynamiquement (par titration calorimétrique isotherme) afin de mettre en évidence l'effet de l'inclusion du site de chélation dans une structure cyclique. L'activité de type superoxyde dismutase d'un glycocomplexe diamino de manganèse s'oxydant à l'état Mn(III) en solution aqueuse aérobie a été mesurée à l'aide du test de McCord-Fridovich.

Au cours ce travail, un dispositif de mesure couplé manométrique-calorimétrique a été développé pour déterminer simultanément les isothermes et les enthalpies d’adsorption dans des intervalles élevés de pression et température. Ce dispositif couplé comprend un calorimètre Calvet C80 (de Setaram) associé à un dispositif manométrique développé in-situ. Il permet d’étudier les phénomènes d’adsorption de gaz sur des solides pour des températures comprises entre 303. 15K et 423. 15K et des pressions comprises entre 0 et 2. 5MPa. Dans un premier temps, une description complète de l’appareillage et des protocoles expérimentaux sont exposés. Dans un second temps, la fiabilité et la reproductibilité de ce dispositif a été testée en réalisant des mesures un échantillon poreux benchmark (Filtrasorb F400) à 318. 15K. Les mesures ont été complétées, à différentes températures avec celles obtenues par méthode gravimétrique afin d’établir des informations à haute température et haute pression. Ces dispositifs ont permis d’étudier l’adsorption de fluide supercritique (azote N2, méthane CH4, dioxyde de carbone CO2) dans des charbons actifs et des silices microporeuse ou mésoporeuse. L’adsorption du méthane dans une roche de type (TGR) a été également étudiée. Ces résultats expérimentaux sont utilisés pour l’étude des interactions fluide/substrat à prendre en compte dans la simulation moléculaire ou la théorie DFT<br>A specific thermostated experimental device comprising a differential heat flow calorimeter with a home built manometric system has been built for the simultaneous determinationof adsorption isotherms and adsorption enthalpies. The differential heat flow calorimeter is a tian Calvet Setaram C80 model which measures the heat flux of a gas and can be operated isothermally, the manometric system is a stainless stell homemade apparatus. This coupled apparatus allows measurement for pressure up to 2. 5MPa and temperature up to 423. 15K. On the one hand, the apparatus and the experimental procedures are described. On the second hand the reliability and reproducibility were established by measurind adsorption isotherms on a benchmark (Filtrasorb F400) at 318. 15K. The gravimetric method has been used at higher pressure at various temperatures. These devices allowed us to study the adsorption of supercritical fluid (nitrogen N2, methane CH4, carbon dioxide CO2) in activated carbons and microporous or mesoporous silica. The adsorption of methane on a rock of type (TGR) was also studied. These experimental results are used for the study of the interactions fluid/solid that must be taken into account in molecular simulations or DFT theory

Le RXP470.1 est l’un des premiers inhibiteurs puissants de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc impliquée dans de nombreuses pathologies comme l’athéroclérose et la bronchopneumopathie obstructive chronique (BPCO). Pour comprendre les bases moléculaires contrôlant l’interaction de cet inhibiteur avec sa cible, des approches pluridisciplinaires associant des relations structure-activité, avec des études de cristallographie de complexes enzymes inhibiteurs et d’études de microcalorimétrie, décrivant les contributions enthalpiques et entropiques impliquées dans la formation des complexes, ont été réalisées dans ce travail de thèse. Les affinités de trois analogues du RXP470.1 ont été tout d’abord déterminées. Puis quatre structures cristallographiques de complexes enzyme/inhibiteur décrivant le mode d’interaction duRXP470.1 et de ces trois analogues ont été obtenues avec des résolutions de 1.15 Å, 1.50 Å, 1.50Å et 1.30 Å, respectivement. Parallèlement les études de microcalorimétrie ont été menées pour étudier les facteurs énergétiques contrôlant l’interaction du RXP470.1 avec la MMP-12. Les résultats indiquent que la présence d’une chaîne latérale très longue et hydrophobe en position P1’de l’inhibiteur s’insérant dans la cavité S1’ de la MMP-12 est essentielle à la très bonne affinité de cet inhibiteur pour la MMP-12. Cette interaction met essentiellement en jeu un effet entropique très important de - 4 kcal/mol. L’interaction du RXP470.1 est aussi essentiellement dirigée par une forte augmentation d’entropie (-TDS= -10 kal/mol) et une composante enthalpique beaucoup plus faible (DH= -2.5 kcal/mol), et ce malgré l’observation dans le cristal de nombreuses interactions entre l’inhibiteur et le site actif de la MMP-12. L’étude de microcalorimétrie met aussi en lumière la prise d’un proton au cours de la formation du complexe enzyme inhibiteur impliquant deux résidus chargés négativement en solution, le résidu catalytique Glu219 et le groupe phosphoryle chélatant du zinc dans l’inhibiteur. Cette étude révèle aussi que si le groupe phosphoryle est considéré comme un chélatant faible de l’atome de zinc, il impose néanmoins des contraintes directionnelles très importantes qui ont un impact sur le positionnement des autres parties de l’inhibiteur dans le site actif de l’enzyme. Ce dernier effet pourrait expliquer pourquoi un certain nombre d’interactions entre l’inhibiteur et l’enzyme ne sont pas optimisées et pourquoi la variation d’enthalpie pour former le complexe reste relativement faible. Cette étude ouvre maintenant la voie à d’autres études en plaçant au centre des futurs travaux le rôle du groupe chélatant dans la conception des inhibiteurs de MMP, ainsi de nouveaux inhibiteurs puissants et sélectifs d’autres MMP devraient voir le jour grâce à ce travail et aux résultats obtenus<br>RXP470.1 is one of the first highly potent and selective inhibitor of MMP-12, a zinc protease involved in several human diseases such as atherosclerosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). To understand the molecular determinants controlling the interaction of RXP470.1 with MMP-12 active site, a multidisciplinary approach combining structure-activity data, crystallography and microcalorimetry have been performed on RXP470.1 and its three analogues. The affinities of the three RXP470.1 analogues have been determined. Then, fourcrystal structures of MMP-12 in interaction with these inhibitors have beendetermined at high resolution, 1.15 Å, 1.50 Å, 1.50 Å et 1.30 Å, respectively. These data have indicated that the presence of a long hydrophobic side chain in the P1’ position of the RXP470.1, which enters deeply inside the S1’ cavity of MMP-12, is playing a key role in the inhibitor affinity. The contribution of this side chain is mostly entropic (-TDS - 4 kcal/mol). The interaction of RXP470.1 with MMP-12 is also mostly driven by a sizeable entropy increase (-TDS= -10 kal/mol) and a more modest enthalpy contribution (DH= -2.5 kcal/mol), despite the observation in the crystal structure of several contacts between inhibitor and MMP-12 active site. Furthermore, this study reveals that the binding of RXP470.1 to MMP-12 is linked to a proton uptake involving two negatively charged residues, the catalytic Glu219 and the phosphoryl group of the inhibitor. Furthermore, despite that the phosphoryl group is considered as a weak zincbinding group, this study highlights that the interactions of this group with the active site zinc atom involved strong directionality between these two groups. This effect has strong impact on the positioning of the other parts of the inhibitor in the MMP-12 active site. This last effect could be responsible for the modest enthalpy increase associated with the binding of RXP470.1 to MMP-12, by preventing the optimization of several interactions between the inhibitor and the enzyme. The results indicate that the role of the zinc-binding group should be better consider in the future. Finally this study opens a new vision in this field and should allow the design of new selective inhibitors of other MMPs

Les bétons de poudres réactives (BPR) forment une nouvelle génération de BUHP. Les bpr sont composes de poudres fines et sont caractérises par un faible rapport eau/ciment et une forte concentration en superplastifiant. Pour étudier l'interaction (ciment, fumée de silice, adjuvant), nous avons développé une méthode basée sur le découplage des effets de l'eau et de l'adjuvant sur la rhéologie. Dans le cas des bpr, il existe un optimum rhéologique en superplastifiant qui dépend fortement de la formulation. Un modèle de prédiction permet de calculer cet optimum avec seulement 4 paramètres définissant la composition du bpr. Des essais d'isothermes d'adsorption confirment le rôle de ces paramètres. Ainsi, la quantité d'adjuvant pour saturer les surfaces est proportionnelle au dosage conduisant au comportement rhéologique optimal. Les effets du superplastifiant sur la cinétique d'hydratation sont étudiés par l'intermédiaire de la conductivité électrique et de la puissance dissipée lors d'essais en mode isotherme. Nous avons mis en évidence une relation linéaire entre la conductivité électrique (#e#l#e#c) et le degré d'hydratation () : #e#l#e#c = av + bvx. Le terme BV est une caractéristique de l'empilement granulaire des bpr étudiés. Le seuil de percolation électrique peut être observé sur cette courbe, #e#l#e#c

Ce travail de thèse démontre l’importance d’intégrer des outils théoriques à des observations expérimentales dans le but d’étudier le rôle des interactions non-covalentes et plus précisément de la dispersion dans la chimie des métaux de transition. Plusieurs thèmes ont ainsi été abordés comme les interactions d’empilement entre chélates de métaux de transition à l’état solide; l’influence de la chiralité sur l’oligomérisation en solution de complexes plans carrés de Rh(I) isonitrile; la stabilité et inactivité inhabituelles de complexes de type cis-platine en solution concentrée. Les résultats obtenus par titration calorimétrique isotherme ont permis d’évaluer la capacité de méthodes théoriques à reproduire avec précision les résultats expérimentaux. Les calculs ont démontré qu’un traitement théorique approprié des effets de la dispersion et de la solvatation, donne des valeurs cohérentes avec les résultats expérimentaux. Cependant, des améliorations supplémentaires sont nécessaires<br>This thesis has shown the importance of integration of theoretical calculations and experimental investigations in studying the role of non-covalent interactions and particularly dispersion interactions in transition metal chemistry. Several subjects were addressed, such as stacking interactions of chelates in transition metal complexes in solid state, influence of chirality on the oligomerization of Rh(I) isonitrile complexes in solution and the stability of the cis-platin type complexes in concentrated solutions. Isothermal titration calorimetry proved to be very useful in the studies by providing accurate experimental data on the thermochemistry of addressed processes. This data was used to gauge the ability of the theoretical methods to accurately reproduce the experimental results. Calculations have shown that the proper treatment of dispersion effects and solvation by theoretical models gives values in relatively good agreement with experiments, but further improvements are needed

Etude de la cinétique par calorimétrie isotherme, par balayage et avec une méthode mixte et mesuré des paramètres cinétiques et thermiques. Effet de la variation de ces paramètres sur la progression de température au plan médian de plaques et sur les profils de température et d'avancement de la réticulation. Application à des composés sandwichs caoutchouc-acier

Les nucléolipides sont des molécules amphiphiles dont la structure bio-inspirée dérive de celle des acides nucléiques. Leur auto-assemblage en milieu aqueux aboutit à la formation d’objets supramoléculaires de morphologies et structures très diverses. La morphologie a été caractérisée par des techniques complémentaires de microscopie optique et de diffusion de la lumière, tandis que leur structure a été déterminée par la diffusion des rayons X. Il a ainsi été mis en évidence l’existence et le rôle fondamental des interactions faibles entre têtes polaires, au sein des auto-assemblages. La nature de ces interactions faibles a été déterminée par des techniques de spectroscopies IR et UV. Un premier objectif a été de mettre en évidence l’importance de ces interactions, ainsi que leur corrélation avec d’autres facteurs qui régissent le mécanisme d’auto-assemblage, tels que la nature chimique des amphiphiles, ou la morphologie et la structure des objets supramoléculaires en présence.Par ailleurs, la tête polaire nucléotide permet également d’imaginer la formation d’interactions faibles entre les auto-assemblages et un monobrin d’acide nucléique, à l’image des interactions spécifiques entre bases azotées présentes dans l’ADN. Lors de ce travail, nous nous sommes intéressés à une méthode de vectorisation d’acides nucléiques par des objets eux aussi chargés négativement. Contrairement aux approches classiques, l’interaction électrostatique est ici défavorable et l’association repose alors uniquement sur des interactions faibles spécifiques, estimées en spectroscopie. De façon surprenante, la formation des complexes a pu être mise en évidence par des expériences de diffraction des rayons X et un modèle approprié a permis de proposer des mécanismes de formation des complexes. Les propriétés thermodynamiques des différents complexes formés ont été évaluées par la technique de Calorimétrie à Titration Isotherme (ITC). Un point remarquable a été la mise en évidence systématique de trois types de comportements sur l’ensemble des complexes étudiés en fonction de la nature et de la spécificité des interactions mises en jeu. Ceci nous a ainsi permis de proposer différents mécanismes de formation pour chaque type de complexe observé<br>Nucleolipids are amphiphilic molecules which bio-inspired structure derives from nucleic acid structure. Their self-assembling behaviour in aqueous medium leads to the formation of supramolecular objects of very different morphologies and structures. The morphology has been characterized with optical microscopy and light scattering complementary techniques, whereas their structure has been determined with X-ray scattering. Thus the existence and the fondamental role of weak interactions between polar heads inside the self-assemblies have been highlighted. The nature of these weak interactions has been determined with IR and UV spectroscopies techniques. A first objectif has been to highlight the importance of these interactions, as well as the their correlation with other factors which drive the mechanism of self-assembly, such as the chemical nature of amphiphiles or the morphology and structure of the supramolecular objects.Moreover the nucleotide polar hear also allows to imagine the formation of weak interactions between the self-assemblies and a single-stranded nucleic acid, such as those highlighted in DNA. In this work, we found interest in a nucleic acid vectorisation method with negatively charged objects as well. On the contrary of classic approaches, electrostatic interaction was here defavorable and assembling relies only on specific weak interactions, estimated with spectroscopy methods. Surprisingly, complexes formation could be highlighted with X-ray scattering experiments, and an appropriate model has allowed the proposal of mechanisms for the formation of complexes. Thermodynamic properties of the different complexes formed have been evaluated with Isothermal Titration Calorimetry (ITC) technique. A remarkable point was the systematic highlighting of three types of behaviour on the whole set of complexes studied, depending of the nature and the specificity of the weak interactions implied. This led us to different proposals for the mechanism of formation of each type of complex studied

La protéine NS5A est essentielle pour la réplication et l'assemblage du virus de l'hépatite C (VHC), et elle constitue une cible thérapeutique prometteuse pour le développement d'antiviraux. Cependant, aucune fonction claire n'a encore été décrite pour NS5A, et les connaissances structurales restent limitées. Ainsi, nous avons caractérisé l'état intrinsèquement désordonné des domaines D2 et D3 de NS5A en décrivant leurs espaces conformationnels et leurs potentialités de repliement en combinant différentes méthodes biophysiques. Nous avons aussi mis en évidence la variabilité structurale du domaine D2 au sein des génotypes du VHC, ce qui pourrait être en rapport avec les différences de pathogénie et d'efficacité des thérapies observées selon les génotypes. L'interaction de D2 et D3 avec la cyclophiline humaine A (CypA) a été étudiée par résonance plasmonique de surface (SPR). Bien que des mutations au sein du domaine D2 rendent la réplication du VHC moins dépendante de la présence de CypA, ces mutations n'empêchent pas la liaison entre D2 et CypA. En revanche, elles induisent des perturbations structurales qui pourraient affecter la cinétique d'interconversion des conformères de D2. Nous avons montré par SPR que D2 et D3 interagissent avec le domaine de fixation à l'ADN du récepteur nucléaire FXR. Cette interaction pourrait inhiber la fixation de FXR sur sa cible ADN, suggérant une implication de NS5A dans la modulation de l'activité transcriptionnelle de ce récepteur nucléaire. L'ensemble de ces informations, nous a permis de proposer un modèle de la structure globale de NS5A permettant une meilleure compréhension des propriétés structurales et fonctionnelles de cette protéine énigmatique<br>NS5A is essential for HCV replication and particle assembly, and constitutes a very promising drug target. However, no clear function has yet been described for NS5A, and structural knowledge remains limited. We characterized the intrinsically disordered nature of NS5A domains D2 and D3, and describe their folding propensity and their overall conformational behaviour by combining different biophysical methods. We also highlighted the structural variability of D2 domain in HCV genotypes, which might be correlated with the disparities observed between genotypes in terms of pathogenesis and efficiency of therapies. The interactions between D2 and D3 with human cyclophilin A (CypA) was analysed by surface plasmon resonance (SPR). We showed that mutations in the D2 domain conferring resistance of HCV replication to CypA inhibitors did not prevent the interaction between D2 and CypA. However, they induce structural perturbations that may affect the kinetics of conformers interconversion of D2. We also showed by SPR that D2 and D3 interact with the of DNA-binding domain of the nuclear receptor FXR (farnesoid X receptor alpha). This interaction reduce the binding of FXR to its DNA target, suggesting an involvement of NS5A in the modulation of the transcriptional activity of FXR. All this data led us to propose a model of the overall structure of NS5A, which provides a useful template for a better understanding of structural and functional properties of this enigmatic protein

Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes.<br>Hematopoietic development is regulated through a combinatorial interplay between lineage-specific activators and the general transcription machinery that enables cell-specific patterns of gene expression. This thesis reports structural and functional studies of interactions involving the transcativation domains (TAD) of activators proteins and their role in hematopoietic development. Interactions between the TAD of activators and their partners play an important role in the transcriptional regulation of all genes including those regulating hematopoiesis. The first section reports the identification and characterization of a novel interaction between the erythroid transcription factor GATA-1 and the tumor suppressor protein p53. Using a combination of isothermal titration calorimetry (ITC), NMR spectroscopy and in vivo studies, we identified and characterized the direct interaction between these two important transcription factors in an attempt to determine the role of this interaction in erythroid development. Based on our results, the TAD of p53 directly interacts with the DNA-binding domain of GATA-1 in a cell-type specific manner. Through this interaction, GATA-1 inhibits activation of select p53-regulated genes and we postulate that the inhibition of p53-dependent apoptotic pathways is essential for survival of erythroid precursor cells. In the second section, we report on the interactions between two acidic TADs and the general transcription factor IIH (TFIIH). The structure of the complexes formed by the Tfb1/p62 subunit of TFIIH (Tfb1PH/p62PH) and the acidic TAD of Herpes Simplex viral protein 16 (VP16) and the Erythroid Krüppel-like factor (EKLF) were determined by NMR spectroscopy. The structure of the Tfb1PH/VP16 complex demonstrated that a viral TAD has the ability to mimic the actions of the TAD from the human p53 with Tfb1PH/p62PH. The TADs of both VP16 and p53 adopt a 9-residue α-helix in complex with Tfb1PH/p62PH. Interestingly, the NMR structure of the EKLF/Tfb1PH complex demonstrated that despite sharing a common binding site with p53 and VP16 on Tfb1PH, the EKLF/Tfb1PH binding interface is distinctly different from the binding interfaces we previously observed with p53/Tfb1PH and VP16/Tfb1PH complexes. Surprisingly, EKLF adopted a similar binding mechanism as the general transcription factor TFIIEα in interaction with p62PH as both interact in an extended conformation. Moreover, based on our structural data, we have identified Trp73 as a key residue within the TAD of EKLF that is required for the formation of the EKLF/Tfb1PH complex. Mutations of Trp73 disrupted the binding to Tfb1PH/p62PH and significantly reduced the transcriptional activity of EKLF in red blood cells.

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.<br>Tagatose-1,6-bisphosphate aldolase from Streptococcus pyogenes is a class I aldolase that shows a lack of stereospecificity that is rare in enzymes in general, and in aldolases in particular. This aldolase catalyzes the reversible cleavage of tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), fructose-1,6-bisphosphate (FBP), sorbose-1,6-bisphosphate and psicose-1,6-bisphosphate, four stereoisomers, in dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). A class I aldolase, the aldolase TBP S. pyogenes shares 14 % identity with the model enzyme of this family, mammalian FBP aldolase. Although the catalytic mechanism of the class I FBP aldolase has been examined in detail and it is appropriate to infer information as to the class I TBP aldolase, the singular lack of specificity of the latter enzyme both in the direction of cleavage and condensation is still not elucidated. To better comprehend the characteristics of the enzymatic mechanism, a structural study of the TBP aldolase of S. pyogenes, an extremely versatile human pathogen, has been undertaken. It has allowed the resolution of high resolution structures of the native and mutated enzyme in complex with subtrates and competitive inhibitors. These same structures allowed us to gain information as to the active site of the enzyme in general and the catalytic residues in particular. TBP aldolase native and mutated soaked in a saturated solution of FBP or TBP also trapped an iminium intermediate covalenty bound to Lys205, the Schiff base-forming lysine. The determination of the pH profiles of the native and mutated enzyme, carried out to assess the influence of pH on FBP and TBP cleavage and identify the residue(s) involved, in conjunction with the structural data provided by crystallography, identified unequivocally Glu163, corresponding to Glu187 in FBP aldolase, as the residue responsible for substrate cleavage. The substantially different binding mode of the ligands, according to the stereochemistry of their C3 and C4 carbons, indeed allows Glu163 to abstract the proton in C3-OH and thus initiate C3-C4 bond cleavage. The study of the inverse mechanism, the condensation one, using for instance the crystallographic structure of native TBP aldolase in complex with DHAP and G3P, its three carbons substrates, has led us to believe that a possible isomerism of the G3P substrate was the reason for the synthesis of both C4 isomers by this enzyme. This result, as well as the discovery of a possible cis-trans isomerism around the C2-C3 bond of the Schiff base formed with DHAP, identified previously, almost completely elucidated the features of this enzyme`s mechanism. In addition, these structures have highlighted three highly mobile regions of the protein, which may be related to the role of its isozyme in the regulation of gene expression and virulence in S. pyogenes. Lastly, the resolution of the structure of the FBP aldolase mutant Lys229 → Met in complex with the cyclic form of FBP, as well as crystallographic studies of the corresponding mutant in TBP aldolase, Lys205→Met and ITC experiments, allowed the identification of two particular residues, Ala31 and Asp33 in FBP aldolase, as responsible for this enzyme discrimination against 3(R) 4(S) substrates, by steric hindrance of the cyclic substrates. X-ray crystallography, enzyme kinetics and isothermal calorimetry thus enabled advances in the elucidation of the mechanism and structural properties of this enzyme with singular characteristics.