Dissertations / Theses on the topic 'Canal sodium voltage-dépendant'

La contraction des cellules musculaires est due à la propagation d'un stimulus électrique appelé potentiel d'action (PA). Il est produit par l'ouverture séquentielle de plusieurs canaux ioniques générant des courants à travers les membranes cellulaires. Les canaux sodiques dépendant du voltage (Nav) déclenchent la première phase du PA. Les variants Nav1. 4 et Nav1. 5 sont exprimés respectivement dans le muscle et le coeur. Des mutations de leurs gènes (SCN4A et SCN5A) provoquent respectivement des pathologies neuromusculaires et des arythmies cardiaques. Mon travail de thèse a consisté à étudier les canalopathies. J'ai ainsi examiné les conséquences de deux mutations sur les propriétés biophysiques des canaux en les exprimant dans des cellules HEK293. La mutation du gène SCN4A engendrait des modifications importantes de la fonction de Nav1. 4 expliquant certains aspects de la myotonie observée chez les patients. Le patient de la deuxième étude, atteint d'un syndrome de Brugada, présentait une mutation du gène SCN5A provoquant une perte de fonction des canaux Nav1. 5 à 37°C. Enfin, nous avons identifié une nouvelle protéine impliquée dans la régulation de Nav1. 5. Les trois derniers acides aminés du C-terminus de Nav1. 5 (SIV) interagissent avec la protéine SAP97. Une réduction de l'expression de SAP97 ainsi que l'expression de canaux tronqués (sans SIV) induisent une baisse importante du courant sodique. Ces résultats suggèrent que SAP97 est impliquée dans la régulation du canal Nav1. 5. Ainsi, certaines maladies musculaires et cardiaques peuvent être la conséquence directe de mutations de canaux ioniques, mais l'action de protéines auxiliaires peut aussi affecter leur fonction
The contraction of muscles cells is due to the propagation of an electrical influx called action potential (AP). It results from the sequential opening of ion channels generating currents through the cell membranes. The voltage-gated sodium channels (Nav) are responsible for the rising phase of the AP. Nav1. 4 and Nav1. 5 are respectively the main skeletal muscle and cardiac sodium channels. Mutations in their encoding genes (SCN4A and SCN5A) lead respectively to neuromuscular disorders or cardiac arrhythmias. The general aim of my PhD has been to study channelopathies. I first characterized the effects of two mutations. I used HEK293 cells to express wild-type or mutant channels and study their biophysical properties. We found that the SCN4A mutation produced complex alterations of Nav1. 4 function, explaining the myotonic phenotype described in patients carrying the mutation. In the second study, the index case carried a SCN5A mutation that leads to a "loss of function" of the channel. The decreased sodium current (lNa) measured at 37°C with mutated Nav1. 5 channels could explain the observed Brugada syndrome. The last project aimed at identifying a new potential protein interacting with the cardiac sodium channel. We found that SAP97 binds the three last amino-acids (SIV) of the C-terminus of Nav1. 5. Silencing the expression of SAP97 as well as the truncating the SIV motif, decreased 1Na. These preliminary results suggest that SAP97 is implicated in the regulation of sodium channel directly or indirectly. These studies reveal that cardiac and muscle diseases may result from ion channel mutations but also from regulatory proteins affecting their regulation

Lors des efflorescences de micro-algues productrices de toxines paralysantes (PST), les bivalves filtreurs peuvent bioaccumuler une grande quantité de toxines et devenir à leur tour toxiques, notamment pour l’homme. La quantité de toxines PST accumulée d’un individu à l’autre s’avère être très variable au sein même d’une population de bivalves. Ainsi, dans nos conditions expérimentales, la quantité de PST accumulées par des huîtres creuses, Crassostrea gigas, d’un même lot, exposées au dinoflagellé toxique Alexandrium minutum, variait d’un facteur 450. L’origine de cette variabilité est inconnue jusqu’alors mais l’une des hypothèses pour l’expliquer serait l’existence de plusieurs formes de canaux sodium voltage-dépendant (NaV), cible des PST, qui confèreraient aux bivalves des sensibilités différentes aux PST. L’objectif principal de cette thèse était de comprendre s’il existe une sensibilité individuelle aux PST différente entre les huîtres et si cette variabilité pouvait être due à des formes différentes de NaV.Une première partie a permis de caractériser le NaV chez C. gigas par une approche de biologie moléculaire. Deux gènes NaV ont été mis en évidence chez C. gigas : CgNaV1, codant un canal sodium et CgNaV2 codant un canal potentiellement sélectif du sodium et du calcium. L’épissage alternatif de CgNaV1 produits trois variants (A, B et C) avec des profils d’expression différents : au niveau des jonctions neuromusculaires pour CgNaV1A, dans les cellules nerveuses pour CgNaV1B et dans les deux pour CgNaV1C. L'acide aminé Q, observé dans le site de liaison aux PST (domaine II) de la séquence CgNaV1 pour les 3 variants et chez tous les individus des 4 populations étudiées, pourrait conférer aux huîtres une certaine résistance aux PST. Ainsi, les variants issus du génotypage/épissage de CgNaV1 ne seraient donc pas le point déterminant du niveau de bioaccumulation des huîtres.Une deuxième partie a permis d’étudier la sensibilité aux PST des nerfs de l’huître creuse C.gigas en relation avec l’accumulation de PST par une approche d’électrophysiologie. La sensibilité à la STX des nerfs cérébroviscéraux d'huîtres a été évaluée en étudiant leur potentiel d'action (CNAP).Il a été montré que les nerfs de C. gigas possédaient une sensibilité à la STX de l’ordre du micromolaire, ce qui leur confère une sensibilité intermédiaire parmi les bivalves. Cette sensibilité des nerfs peut varier selon la période à laquelle les huîtres ont été prélevées et potentiellement selon leur condition physiologique. Une pré-exposition des huîtres à A. minutum semble augmenter la résistance des nerfs à la STX. Cependant, aucune corrélation significative n'a été observée entre la sensibilité nerveuse à la STX et la charge en PST dans la glande digestive des huîtres.Il apparait donc que la variabilité de l’accumulation des PST par les huîtres résulterait plutôt d’une plasticité physiologique, en terme de filtration, d’ingestion et d’assimilation, que d’une sensibilité différentielle des NaV
During bloom of microalgae producing paralytic shellfish toxins (PST), filtering bivalves can bio-accumulate a large quantity of toxins and become toxic for human consumption. The amount of accumulated PST can greatly vary from one individual to another within a bivalve population. Indeed, under our experimental conditions, the amount of accumulated PST by Pacific oysters, Crassostrea gigas, exposed to the toxic dinoflagellate Alexandrium minutum, varied by a factor of 450. To explain such variability we hypothesized the existence of several forms of voltage-gated sodium channel (NaV), target of the PST, resulting in different sensitivities to PST. The main objective of this thesis was to understand whether there are relationships between nerve sensitivity to PST, the different forms of NaV and the amount of accumulated PST.The NaV was first characterized in C. gigas by a molecular biology approach. Two NaV genes were reported in C. gigas: CgNaV1, encoding a sodium channel and CgNaV2 encoding a channel potentially selective for sodium and calcium. Alternative splicing of CgNaV1 produced three variants (A, B and C) with different expression profiles: at the neuromuscular junctions for CgNaV1A, in the nerve cells for CgNaV1B and in both for CgNaV1C. The amino acid Q observed in the binding site of PST (domain II), of the sequence CgNaV1 for the 3 variants and in all individuals from the 4 studied populations possibly provide some PST resistance to oysters. Thus, the variants resulting from the genotyping/splicing of CgNaV1 would not therefore be the determining factor of the level of bioaccumulation in oysters.A second part allowed studying the nerve sensitivity to PST of C. gigas oyster in relation to the accumulation of PST by an electrophysiology approach. The sensitivity to saxitoxin (STX, a PST) of the cerebro-visceral nerves from oysters was assessed by studying their action potential (CNAP). C.gigas nerves have been shown to have sensitivity to STX of the micromolar range, which gives them intermediate sensitivity among bivalves. This nerve sensitivity may vary depending on the period at which the oysters were collected and potentially according to their physiological condition. A preexposure of oysters to A. minutum appears to increase nerve resistance to STX. However, there was no significant correlation between STX nerve sensitivity and PST content in the oyster digestive gland.Overall, it appears that the variability of the PST accumulation by oysters would result rather from a physiological plasticity, in terms of filtration, ingestion and assimilation, than from a differential sensitivity of the NaV

Les cellules cancéreuses mammaires invasives expriment des canaux sodiques NaV1.5 dont l’activité semble être associée au développement métastatique. L’activité de ce canal dans les cellules MDA-MB-231 conduit à une acidification péricellulaire favorable à l’activité des cathepsines à cystéine B et S extracellulaires et à la dégradation de la matrice extracellulaire. Au cours de cette thèse, nous avons montré que l’échangeur NHE1 est le principal régulateur du pH des cellules MDA-MB-231 et que l’activité du canal NaV1.5 augmente l’activité d’efflux de protons par NHE1 vraisemblablement par modulation allostérique. NaV1.5 et NHE1 sont co-localisés dans des radeaux lipidiques et plus particulièrement dans les invadopodes des cellules MDA-MB-231. Les activités de NHE1 et NaV1.5 stimulent l’activité protéolytique des invadopodes. Enfin, l’activité du canal NaV1.5 semble moduler le cytosquelette et la morphologie des cellules cancéreuses MDA-MB-231 pour leur donner un phénotype invasif. En conclusion, NaV1.5 augmente l’activité de NHE1 dans les invadopodes stimulant ainsi l’invasivité des cellules cancéreuses mammaires
Invasive breast cancer cells express NaV1.5 sodium channels which activity seems to be associated with metastatic progression. The activity of the channel in MDA-MB-231 cells leads to a pericellular acidification favourable for the activity of extracellular cysteine cathepsins B and S and for extracellular matrix degradation. During this thesis, we have shown that NHE1 exchanger is the main pH regulator in MDA-MB-231 cells and that the activity of NaV1.5 channels increases protons efflux activity of NHE1 possibly through allosteric modulation. NaV1.5 and NHE1 are co-localised in lipid rafts and in invadopodia of MDA-MB-231 cells. The activity of NHE1 and NaV1.5 promotes the proteolytic activity of invadopodia. Finally, the activity of NaV1.5 channels seems to modulate cytoskeleton and morphology of MDA-MB-231 cancer cells to promote the acquisition of a proinvasive phenotype. In conclusion NaV1.5 increases NHE1 activity in invadopodia to stimulate breast cancer cells invasiveness

La prise en charge de la douleur est un enjeu médical majeur car il existe toujours des douleurs réfractaires aux traitements antalgiques actuels. La détection de la douleur est assurée par les neurones nociceptifs dont l'excitabilité est majoritairement contrôlée par les canaux sodiques dépendants du potentiel (Nav). Parmi eux, le canal Nav1.9 se distingue par son expression restreinte dans les nocicepteurs et par ses caractéristiques électrophysiologiques qui lui confèrent un rôle particulier dans l'électrogenèse de ces neurones. Au cours de ce travail de thèse nous avons caractérisé le rôle du canal Nav1.9 dans trois modèles de douleurs inflammatoires : aigue, persistant et chronique. Nous avons mis en oeuvre un ensemble de techniques d'analyses comportementales, moléculaires et électrophysiologiques, qui nous ont permis de montrer le rôle du canal Nav1.9 dans ces trois modèles de douleur et de révéler plusieurs mécanismes de régulation potentiels.Par la suite, nous nous sommes attachés à décortiquer l'un de ces mécanismes. Nous avons montré que le canal Nav1.9 est présent dans des microdomaines membranaires riches en cholestérol. Nous avons mis en évidence que l'inflammation diminuait la quantité de cholestérol dans les tissus. Ce mécanisme est à l'origine de douleurs dues à l'activation des canaux Nav1.9 et à leur relocalisation en dehors des radeaux lipidiques. Enfin nos expériences montrent que l'application topique de cholestérol peut réduire les douleurs inflammatoires, ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques
In mammals, perception of pain is initiated by signaling the occurrence of noxious stimuli through nociceptive neurons located in peripheral sensory ganglia. Nociceptive neurons play a pivotal role in pain perception as they transmit painful information to the central nervous system (CNS). They are largely responsible for the modifications of pain sensation caused by a lesion/inflammation or during the course of chronic diseases like rheumatoid arthritis. Unravelling the precise mechanism of ion channel activation during such pathophysiological conditions is one of the most challenging issues to design new therapeutic pain killer strategies.In this PhD thesis work, we will focus on one particular and promising sodium channel, named Nav1.9. We characterized Nav1.9 channel function in three inflammatory pain models: acute, persistent and chronic, using behavioural, molecular and electrophysiological analysis technics. This work allowed us to point out different putative mechanisms of regulation of this channel.We further decipher the regulation of Nav1.9 by cholesterol lipid in membrane microdomains. We showed that Nav1.9 channel is present in rafts specialized membrane microdomains enriched in cholesterol. We demonstrated that inflammation triggers a decrease in cholesterol level in inflamed territories and that cholesterol deletion induces mechanical allodynia in animals. In addition, we demonstrated that this pain was due to Nav1.9 channel activation and relocalization of this channel out of lipid rafts. Finally our experiments reported that exogenous cholesterol application reduces inflammatory pain. All these results provide a new insight in therapeutic perspectives

Le canal sodique Nav1. 5 est responsable de la genèse et de la propagation du potentiel d‘action cardiaque. Il est aujourd'hui considéré comme faisant partie d'un complexe macromoléculaire impliqué dans des pathologies électriques mais aussi structurales. Dans une première partie, nous avons caractérisé le remodelage myocardique dans un modèle murin invalidé à l'état hétérozygote pour Scn5a (la souris Scn5a+/-). Nous avons pu montrer que le développement de fibrose ventriculaire était dépendent de la voie du TGF-β et était associée avec le remodelage de l'expression et de l'organisation de la Connexine43. Nous avons aussi pu montrer que la réduction seule du courant sodique n'induisait pas la pathologie, la présence de la protéine à la membrane est donc déterminante. Cette étude montre une interaction fonctionnelle entre Nav1. 5 et la Connexine43 dans la physiopathologie de la maladie de Lenègre. Dans une deuxième partie, nous avons développé un nouveau modèle murin de syndrome du QT long de type 3, la souris Scn5a+/ΔQKP. Ce modèle regroupe l'ensemble des caractéristiques cliniques retrouvées chez les patients que ce soit l'allongement de l'intervalle QTc, les arythmies ventriculaires et la dilatation myocardique. L'étude de cette mutation in vivo a permis de confirmer la présence courant sodique persistant de mettre en évidence le remodelage pathologique des protéines associées au cycle du calcium. Le traitement aigu de ces souris avec la Ranolazine supprime les arythmies ventriculaires et normalise l'intervalle QTc. Ceci ouvre la voie à l'utilisation de cette molécule en traitement chronique pour améliorer la survie des patients atteints de syndrome QT long de type 3
Nav1. 5 is the main sodium channel implicated in genesis and propagation of cardiac action potential. Currently, it's a part of a macromolecular complex involved in electrical and structural disorders. In a first part, we have characterized myocardial remodelling in a mouse model heterozygously invalidated for Scn5a (Scn5a+/- mice). We demonstrated that ventricular fibrotic process is TGF-β dependant and is associated with Connexin43 expression and organization remodelling. We also demonstrated that reduction of sodium current is not sufficient to induce pathology, the loss of Nav1. 5 protein is the fundamental in this process. This study shows a functional interaction between Nav1. 5 and Connexin43 in the Lenègre disease processing. In a second part, we have developed a new mice model for type 3 long QT syndrome, the Scn5a+/ΔQKP mice. This model reproduces the phenotype of the human mutation carriers, long QT syndrome, ventricular arrhythmias and heart failure. In vivo study permits to confirm persistent sodium current and to focus on pathological remodelling of calcium cycle's proteins. Acute treatment using Ranolazine suppresses arrhythmias and normalise QTc. That opens the possibility to use Ranolazine as a chronic treatment for mice and for patients witch develop type 3 long QT syndrome

Le canal sodique Nav1.5, codé par le gène Scn5a, est nécessaire au potentiel d’action des cardiomyocytes. Mais son expression a aussi été décrite dans divers contextes et a été associée à de nouvelles fonctions. Une expression a été montrée dans le muscle lisse des voies respiratoires, suggérant une implication de Nav1.5 dans la fonction respiratoire. Ce travail a consisté à décrire les expressions et à montrer les rôles potentiels de Nav1.5 dans la respiration chez la souris. Des analyses histologiques ont confirmé l’expression de Nav1.5 dans le muscle lisse des voies respiratoires in situ, mais un site d’expression majeur a également été montré à la membrane plasmique de « cardiomyocytes » présents dans les veines pulmonaires. Des tests de contractilité des voies respiratoires ont été réalisés sur des souris knock-out Scn5a+/-. Ils ont montré ex vivo par des tests de contractilité de trachées isolées une baisse de la contraction pour les souris femelles Scn5a+/- , et WT pré-incubées à l’ajmaline ou à la kétamine, des inhibiteurs sodiques. Cet effet a été confirmé in vivo par pléthysmographie corporelle totale montrant une hyporéactivité respiratoire chez les souris Scn5a+/- femelles. Aucun remodelage structural ou inflammatoire n’y étant associé, cela suggère un rôle électrique de Nav1.5 dans la respiration. Les souris Scn5a+/- mâles n’ont pas montré de diminution d’expression et de fonction pour Nav1.5, suggérant une possible influence hormonale dans sa régulation. Pour conclure, Nav1.5 contribue à la contractilité des voies respiratoires chez la souris. Il reste à déterminer ses mécanismes d’action et ses éventuelles implications en pathologie, notamment dans l’asthme
Nav1.5 sodium channel, encoded by the Scn5a gene, is necessary for action potential in cardiomyocytes. However, its expression has been described in various contexts and has been associated with new functions. An expression has been recorded in airway smooth muscle, suggesting an involvement of Nav1.5 in respiratory function. The aim of the work has been to describe the expressions and to highlight the potential roles of Nav1.5 in mice breathing. Histological assay has confirmed Nav1.5 expression in airway smooth muscle in situ, but a major expression site has been showed at the plasma membrane of “cardiomyocytes” located in pulmonary veins. Airway contractility assessments were made on knock-out Scn5a+/- mice. Ex vivo isolated trachea contractility test showed a decrease of contraction for Scn5a+/- mice and for WT mice pre-incubated with sodium blockers ajmaline or ketamine.This effect was confirmed by in vivo whole body plethysmography, showing respiratory hyporesponsiveness on female Scn5a+/- mice. No structural of inflammatory remodelings were associated, suggesting an electrical role for Nav1.5 in respiration. Male Scn5a+/- mice do not showed a significant decrease of Nav1.5 expression, suggesting a possible hormonal influence in its regulation. To conclude, Nav1.5 contribute to mice airway contractility. It remains to determine its mechanism of action and its potential involvement in pathological context such as asthma

Les canaux Nav1. 5 sont des régulateurs clés de l'excitabilité cardiaque, et tout défaut de leur régulation augmente le risque d'arythmies. Plusieurs études ont suggéré que les défauts d'inactivation des canaux Nav1. 5 dans l'insuffisance cardiaque sont associés à leur état de phosphorylation. Une approche de phosphoprotéomique développée au laboratoire a permis d'identifier in situ 19 sites de phosphorylation natifs des canaux Nav1. 5 purifiés à partir de ventricules de souris sauvages ou développant une insuffisance cardiaque. Deux de ces sites, les phosphosérines 1938 et 1989, sont plus abondants chez les souris en insuffisance cardiaque comparé aux souris sauvages. De façon intéressante ces sites sont localisés à proximité des domaines de liaison du FGF13 et de la Calmoduline, deux protéines clés dans l'inactivation du canal. Mon premier objectif de thèse a été de déterminer le rôle de la phosphorylation dans la régulation de l’expression des canaux Nav1. 5 à la surface cellulaire en criblant, dans des cellules HEK293, le rôle de chaque site identifié et celui des kinases connues pour réguler Nav1. 5. Mon deuxième objectif a été de déterminer le rôle de la phosphorylation des sérines 1938 et 1989 dans la régulation de l'inactivation des canaux Nav1. 5. Nous avons montré que la phosphorylation de ces deux sérines diminue l'interaction de FGF13 et de la Calmoduline avec Nav1. 5 et altère les propriétés d'inactivation du canal. En conclusion, ces travaux ont révélé que le canal Nav1. 5 est fortement phosphorylé et que deux des sites de phosphorylation identifiés constituent des cibles potentielles dans les défauts d'inactivation des canaux Nav1. 5 dans l'insuffisance cardiaque
Nav1. 5 channels are key determinants of myocardial excitability and defects in their functioning or regulation increase the risk of life-threatening arrhythmias. Several studies have suggested the role of phosphorylation in the inactivation defects of Nav1. 5 channels in heart failure. A phosphoproteomic approach in the laboratory led to the identification of 19 native phosphorylation sites on the Nav1. 5 channel proteins purified from wild-type mouse ventricles or from ventricles isolated from failing mice. Two of these sites, the phosphoserines 1938 and 1989, are more abundant in the failing, compared with the non-failing wild-type, conditions. Interestingly, these two sites are located near the binding sites for FGF13 and Calmodulin, two key regulatory proteins of Nav1. 5 channel inactivation. The first objective of my thesis was to determine the role of phosphorylation in the regulation of Nav1. 5 channel cell surface expression, by screening in HEK293 cells the role of each identified site as well as of kinases previously described to regulate Nav1. 5 channels. My second objective was to determine the role of phosphorylation at serines 1938 and 1989 in regulating the inactivation properties of Nav1. 5 channels. The results showed that phosphorylation at these two serines decreases the interaction of FGF13 and Calmodulin with Nav1. 5 and alters the inactivation properties of the channel. In conclusion, these studies demonstrated that the Nav1. 5 channels are highly phosphorylated in ventricles and suggested that two of the newly identified phosphorylation sites constitute novel potential targets in the inactivation defects of Nav1. 5 channels in heart failure

Le canal sodique voltage dépendant Nav1. 5, codé par le gène SCN5A, joue un rôle primordial dans l'activité électrique du cœur. Des pathologies cardiaques sont associées à des mutations pour ce gène. De plus, des modifications de l'expression et/ou de l'activité de Nav1. 5 ont été rapportées au cours de l'insuffisance cardiaque. De rares cas cliniques suggèrent l'existence d'un lien entre des mutations du gène SCN5A, une pathologie coronarienne, et l'augmentation de l'incidence des arythmies ventriculaires potentiellement associés à la survenue de mort subite cardiaque. L'objectif de mon travail de thèse a été de confirmer ce lien dans le but d'identifier une nouvelle population à risque. Par une étude réalisée chez la souris, nous avons pu montrer une augmentation de l'incidence des arythmies ventriculaires au cours des 24 premières heures suite un infarctus du myocarde, induit par ligature permanente de l'artère coronaire gauche ascendante, chez des animaux invalidés à l'état hétérozygote pour le gène SCN5A. De plus, j'ai pu identifier un profil inflammatoire supérieur et une réserve de conduction plus diminuée chez ces mêmes animaux. Ces observations laissent présager un remodelage cardiaque post ischémique plus sévère comme le suggèrent nos données préliminaires. Au cours de ce travail, nous avons aussi pu mettre en évidence une expression et une fonctionnalité pour le canal Nav1. 5 au niveau pulmonaire. Ce nouveau siège d'expression pourrait avoir des répercussions potentielles lors de la mise en place d'un remodelage post ischémique. Parallèlement à ce travail, j'ai été amené à caractériser un nouveau modèle transgénique murin surexprimant la mutation humaine T220I pour Nav1. 5
The voltage dependant sodium channel Nav1. 5, encoded by the gene SCN5A, plays an essential role for the electrical activity of the heart. Cardiac congenital disorders are associated with mutations for this gene. Moreover, several modifications of the expression and the activity of Nav1. 5 have been reported during heart failure. Several clinical cases suggest a link between mutations of SCN5A, coronary heart disease, and an increase of the occurrence of ventricular arrhythmic storms associated with sudden cardiac death. The aim of this study was to validate this link for the identification of a new population at risk. By a preclinical study, we have observed an elevation of ventricular arrhythmias during the first 24 hours after a myocardial infarction on mouse model invalidated at the heterozygous state for the gene SCN5A. In the same time, we are characterized a pro inflammatory pattern and a more reduced reserve of conduction in these KO mice. The observations suggest a more severe ischemic cardiac remodelling, which seem to be confirmed by preliminary data. In this framework, we have also identified an expression and functionality for Nav1. 5 in lungs. This new seat of expression for Nav1. 5 could have some repercussions in the setting of post ischemic remodelling. In the same time, I contribute to characterize a new knock-in mouse model for the human T220I mutation for Nav1. 5. Key-words: SCN5A, Nav1. 5, myocardial infarction, ventricular arrhythmias, cardiac remodelling, heart failure, sudden cardiac death and risk stratification

Dans la première partie de ce mémoire nous rappelons la contribution des axones géants aux recherches électrophysiologiques et biophysiques menées sur les membranes excitables, les propriétés de base des différents canaux ioniques et nous présentons les derniers modèles élaborés surtout pour le canal sodique. Des méthodes d'extraction et de chromatographie diverses ont permis d'atteindre un facteur de purification de 50% qui, associé aux profils électrophorétiques, est en faveur d'une seule glycoprotéine de 260 kDa. La densité des glycanes dans la structure de ce canal serait faible ou bien leur nature serait différente de celle des vertébrés. Dans les fragments membranaires non solubilisés, cette protéine présente une grande affinité pour la saxitoxine tritiée (Kd=1,5 nM). La constante de dissociation s'élève à 8 nM après utilisation de détergent non ionique (Lubrol-PX). Après réincorporation dans des bicouches lipidiques planes, le niveau de conductance unitaire principale (active par la batrachotoxine) s'établit à 15 pS avec une sélectivite P(Na)/P(K) de 8. D'autres états de conductance ont également été observés (surtout 120/150 pS) mais leur signification physiologique reste à déterminer, en particulier lors de l'application d'échelons de potentiel. Les premières expériences d'hybridation des ARN extraits de ganglions stellaires avec une sonde d'ADNc de l'anguille sont en faveur d'une certaine conservation de la structure du canal sodique du Loligo forbesi. Cette étude devra être étendue à d'autres tissus de cette préparation

Le but de ce projet de recherche est d'identifier de nouveaux gènes responsables du syndrome de Brugada (SBr), une maladie rare définie par un aspect électrocardiographique spécifique, associé à un risque élevé de mort subite par fibrillation ventriculaire sur coeur structurellement normal. Le SBr a été associé à des mutations ponctuelles du gène SCN5A codant pour la protéine Nav1. 5, responsable de la phase 0 du potentiel d’action cardiaque. Cependant, seulement 20 à 30% des patients atteints du syndrome de Brugada sont porteurs de mutations de SCN5A : d'autres gènes responsables de ce syndrome restent encore à découvrir. Afin d'identifier ces autres gènes, nous avons appliqué trois stratégies complémentaires, basées sur des technologies de criblage génomique à haut débit. La première approche a été l'utilisation d’un système de capture et d'enrichissement. Des régions codantes de gènes candidats, suivi d'un séquençage haut débit, de manière à identifier un enrichissement en variants rares chez les patients par rapport à une population contrôle. La seconde approche a consisté à coupler CGH-array, analyse d'identité par descendance et séquençage d'exome sur des formes familiales de BrS. Enfin, nous avons réalisé une étude d'association sur génome entier qui a permis d'identifier des polymorphismes génétiques associés à un risque accru de SBr
The aim of this project is to identify new genes involved in the Brugada syndrome (BrS), a rare disease characterized by a specific ECG pattern and associated with a high risk of sudden cardiac death due to ventricular fibrillation on structurally normal heart. The BrS has been previously associated to mutations in the SCN5A gene, encoding the Nav1. 5 protein that is responsible for the phase 0 of the action potential in human cardiomyocytes. However, only 20 to 30% of the patients with BrS carry a mutation in this gene: other genes responsible for this disorder remain unknown. In this project, in order to identify these others genes, we have applied three complementary approaches based on high throughput genetic technologies. The first strategy consists in using a targeted and enrichment system of the coding region of candidate genes followed by massively parallel sequencing, in order to identify enrichments in rare variants for candidate genes in patients compared to control individuals. The second strategy is a systematic approach combining CGH-array, Identity-by- Descent analysis and Exome sequencing in familial forms of BrS. At last, we have performed a genome wide association study, in which we have identified genetic polymorphisms associated with a higher risk of BrS

Le tissu cardiaque est actif électriquement et propage l'influx électrique par une série de processus physiologiques complexes. Le travail présenté ici étudie la capacité des myocytes à générer et à propager un tel influx sur deux modèles de rongeurs : un modèle murin de dystrophie myotonique de type 1 (DM1) et un modèle de rat présentant une insuffisance cardiaque et un remodelage atrial. La DM1 est une pathologie associée à des troubles de la conduction cardiaque et des arythmies. La DM1 est due à l'expansion toxique d'une séquence de triplets CTG. Le mécanisme des troubles conductifs est actuellement inconnu. Nous avons établi un parallèle entre la DM1 et les différentes pathologies issues d'une mutation du canal sodique cardiaque Nav1. 5 (syndrome de Brugada) chez les patients DM1. Ces similitudes plaidaient pour une anomalie du courant sodique IN,. Dans le modèle murin DMSXL, il existait effectivement une sensibilité anormale aux bloqueurs de 'Na et une cinétique accélérée de l'inactivation d'INa. Ces résultats plaident pour une altération d'IN, dans la genèse des troubles conductifs dans la DM1. La fibrillation atriale (FA) est l'arythmie la plus fréquente chez l'homme et est fortement associé à l'insuffisance cardiaque (IC). Dans un modèle d'IC, nous avons caractérisé le remodelage atrial et avons mis en évidence une perte d'excitabilité atriale associé. Celle ci était associée à des altérations atriales à l'étage cellulaire et tissulaire. L'intégration de ces altérations dans un outil de modélisation a confirmé l'existence d'une balance entre remodelage cellulaire et tissulaire au cours du remodelage atrial
Cardiac tissue is electrically active and propagates electrical impulses through a series of complex physiological processes. Here, we examined the ability of myocytes to generate and propagate cardiac influx in two rodent models: a mouse model of myotonic dystrophy type 1 (DM1 ) and a rat model of heart failure and atrial remodeling. DM1 is a disease associated with conduction disorders and cardiac arrhythmias. DM1 is due to the toxic expansion of a CTG sequence. The mechanism of conduction disorders is currently unknown. We established a parallel between DM1 and various pathologies resulting from a mutation of the cardiac sodium channel Nav1. 5 (Brugada syndrome) in DM1 patients. These similarities suggested for an abnormal cardiac sodium current IN,. In the murine model DMSXL of DM1, there was indeed an increased sensitivity to 'Na blockers and 'Na inactivation was accelerated. These results suggested that 'Na is involved in the genesis of conduction disorders in DM1. Atrial fibrillation (AF) is the most common arrhythmia in humans and is strongly associated with heart failure (HF). In an HF model, we characterized the atrial remodeling and demonstrated that atrial excitability was decreased. Atrial remodeling was also associated with atrial alterations at the cellular and tissue level. The integration of these alterations in a computer model confirmed the imbalance between cellular and tissue remodeling during atrial remodeling

La céphalée migraineuse est une pathologie invalidante qui représente un véritable problème de santé publique. Cette maladie chronique se déroule en crises récurrentes de 4 à 72 heures. Les douleurs observées résultent de la mise en jeu du système trigémino-vasculaire formé par les vaisseaux sanguins cérébraux et méningés et les fibres nerveuses nociceptives trigéminales. Ces fibres nociceptives expriment une large gamme de protéines (canaux ioniques) spécialisées dans la détection et la propagation du message douloureux. Parmi eux, le canal ionique Nav1.9 revêt un intérêt particulier en raison de son expression restreinte aux neurones nociceptifs et de son rôle prépondérant dans l'activité des nocicepteurs. Les résultats obtenus dans notre laboratoire montrent que le canal Nav1.9 est un acteur majeur de la céphalée migraineuse et doit être considéré comme une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de la migraine. Nous cherchons maintenant à comprendre quel est le rôle du système immunitaire, et en particulier des mastocytes, dans la céphalée migraineuse. Les mastocytes sont localisés à proximité des vaisseaux sanguins méningés, en étroite apposition avec les fibres nociceptives. Les mastocytes sont connus pour libérer un grand nombre de médiateurs de l'inflammation par un processus de dégranulation. Nous pensons que ces facteurs sécrétés agissent sur le canal Nav1.9 et contribuent à amplifier l’inflammation neurogène et la céphalée. Nos travaux visent donc à évaluer le poids de la dégranulation mastocytaire dans la phase de céphalée migraineuse, à en comprendre les mécanismes intimes et à développer de nouveaux médicaments sur la base de ces mécanismes
Résumé vulgarisé en anglaisMigraine is a common neurological disorder that affects a large portion of the population. This chronic disease occurs in attacks or episodes that can cause significant pain (4 to 72 hours) accompanied by light (photophobia) and sound (phonophobia) sensitivity and cutaneous hypersensitivity. Current treatments have many side effects and remain ineffective in chronic conditions.Migraine pain results from the activation of nociceptive pathways (fibers of pain) at the level of meningeal vessels. These nociceptive fibers express a wide range of proteins (ion channels) specialized in the detection and spread of the pain message. Among them, the ion channel Nav1.9 is particular interest because of its restricted expression to nociceptive neurons and its preponderant role in the activity of nociceptors. We developed a model of migraine headache in mice that has all migraine symptoms. These symptoms disappear when the gene encoding the Nav1.9 channel has been invalidated. We have shown that activation of the Nav1.9 channel is responsible for pain during a migraine attack and that it is involved in sterile neurogenic inflammation of the meninges.The results obtained show that the Nav1.9 channel is a critical determinant of migraine attack and emerges as a promising target for migraine therapeutics

Le segment initial de l'axone (SIA) joue un rôle dans la maintenance de la polarité neuronale et dans l'initiation du potentiel d'action. Il se construit autour de l'ankyrine G (ankG) qui relie les protéines membranaires au cytosquelette d'actine et de microtubules. Cette structure est dynamiquement régulée par des kinases. S'il a été clairement établi que l'ankG est cruciale à la formation et à la maintenance du SIA, les mécanismes responsables de sa concentration dans la partie proximale de l'axone restent encore inconnus. Il en est de même pour la protéine kinase CK2 qui régule l'interaction entre l'ankG et les canaux sodiques (Nav1). Dans un premier temps, nous avons montré, par des approches de mutagénèse, que le domaine serine-rich (SR), notamment ses 73 premiers acides aminés, porte l'information nécessaire à l'entrée de l'ankG dans l'axone. Mais ce domaine n'est pas suffisant pour le confiner dans la partie proximale de l'axone, cette propriété est portée par le domaine Tail. En plus de la coopération de ces domaines, nous avons aussi observé que l'adressage de l'ankG est régulé par les kinases Cdk5 et PKC. Dans un second temps, nous avons montré que l'accumulation de la CK2 au SIA dépend de l'expression des Nav1. L'existence d'un complexe formé par les Nav1 et la CK2 serait donc importante au recrutement de la protéine kinase CK2 au SIA. En outre, le développement des anticorps phosphospécifiques nous a permis de monter que les Nav1 sont phosphorylés in vivo au niveau de leur motif de liaison à l'ankG. L'ensemble de nos résultats ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension de la formation du SIA et des mécanismes de régulation qui peuvent être associés
The axon initial segment (AIS) is responsible for both the maintenance of neuronal polarity and the generation of action potentials. The scaffolding protein ankyrin G (ankG) is specifically expressed in the AIS where it links transmembrane proteins to the subjacent actin and microtubule cytosqueletons. Moreover, the AIS is dynamically regulated by kinases. Although, it has been clearly established that ankG directs AIS assembly and maintenance, the mechanisms regulating ankG proper transport and tethering remain unclear. Another AIS component, the protein kinase CK2 is also playing an important role via the phosphorylation of the ankG-binding motif (ABM) on sodium channels (Nav1) to strengthen their interaction with ankG. But, the mechanism regulating its targeting and anchoring to the AIS remain still unknown. Here, we report that the first 73 residues of the serine-rich domain are necessary for the targeting of ankG to the axon and the tail domain for the proper positioning along the proximal axon. We also observed that ankG axonal localization is modulated by post-translational modifications. Using phosphospecific antibodies and inhibition/depletion approaches, we also provide evidence that the ABM of Nav1 are phosphorylated in vivo and that CK2 accumulation at the AIS depends on Nav1 expression, with which they form tight complexes. This suggests that CK2-mediated phosphorylation participates in Nav1 clustering in vivo and that its specific localization at the AIS is dependent on Nav1 expression. Altogether, our results open new perspectives in understanding the formation of AIS and regulatory mechanisms that may be involved

La détection de la température externe par la peau est le point de départ de nombreuses adaptations cellulaires et comportementales permettant de maintenir notre température interne constante. Selon ce concept, les fibres sensorielles cutanées sont les seuls récepteurs sensoriels de la peau pour la détection de la température. Plusieurs canaux ioniques activés directement par des températures chaudes ou froides ont été identifiés, ce sont les canaux TRPs. Le froid peut-il modifier le fonctionnement des organes du toucher?Nous montrons chez l’homme et la souris que les cellules de Merkel (CMs), qui sont les cellules tactiles des complexes de Merkel, peuvent être activées par le froid. Chez les souris dépourvues du canal TRPM8 (KO M8) la réponse au froid des CMs diminue. Le BCTC et le M8B, 2 bloqueurs du canal TRPM8, diminuent également la réponse au froid des CMs. Pour déterminer l’impact de cette sensibilité au froid sur la performance tactile, nous avons enregistré les variations de l’activité nerveuse des récepteurs de Merkel chez les souris WT et KO M8. Un froid modéré (20°C) appliqué sur la peau diminue le train de potentiels d’action issu d’un récepteur de Merkel stimulé mécaniquement. A 20°C ni le seuil de déclenchement des potentiels d’action, ni le train de potentiels d’action en réponse à une stimulation électrique ne sont modifiés. En revanche chez les souris KO M8 cette réponse mécanique tactile n’est plus diminuée. Ce résultat montre pour la première fois qu’une cellule non nerveuse de la peau, la cellule de Merkel, contient un récepteur au froid, le canal TRPM8, qui ajuste l’activité des récepteurs de Merkel lors d’une stimulation tactile
In the skin, Merkel cells (Mcs) are connected to keratinocytes and A sensory nerve fibers and the complexes works as a slow adaptive mechanoreceptor (SA1 receptor). We observe that cooling human and mouse Merkel cells to 15°C increases intracellular Ca2+ ions concentration. The TRPM8 agonist’s provoke intracellular Ca2+ increases. The responses to cooling and TRPM8 agonist’s are reduced in absence of extracellular Ca2+ ions, by the TRPM8 antagonist’s and in KO M8 mouse. These results show that MCs sense cooling through TRPM8 channels. We hypothesize that cooling sensitivity modulate mechano-transduction and we investigate the modulation of SA1 response using the skin nerve and microneurography techniques in mouse and human, respectively. In mouse, cooling the skin at 22°C reduces the frequency of the SA1 discharge, without modifying the nerve conduction. This reduction disappeared in KO M8 mouse. These results suggest that MCs activity reduced the discharge of SA1 receptor at mild fresh temperature, anticipating effect of lower temperature on A nerve fiber excitability.This study is the first report about the sensitivity of MCs to cold temperature and its consequences on the SA1 receptor activity in mouse and human. We conclude that cold sensitivity of Merkel cells mediated by TRPM8 regulates the SA1 mechanical response, particularly at mild fresh temperature, when the nerve conduction is not significantly modified by cold. This is the first description of an active inhibitory process, driven by a TRP channel, during sensory transduction in the skin