Dissertations / Theses on the topic 'Canaux à calcium. Ions calcium. Calcium dans l'organisme'

Nouvelles voies de modulation des canaux calciques de type T.Grâce à leur rôle dans l'excitabilité cellulaire et l'homéostasie calcique, les canaux calciques de type T participent à différentes fonctions physiologiques telles que le sommeil ou le contrôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle. Ils sont également impliqués dans certaines pathologies comme la douleur ou l'épilepsie. La régulation de l'activité des canaux de type T est encore mal connue et c'est l'enjeu de cette thèse. Dans une première partie, nous avons caractérisé l'effet de certains lipides endogènes sur ces canaux, en particulier les métabolites de l'acide arachidonique, et identifié le 5,6-EET comme un nouveau bloqueur des canaux de type T. Nous avons ensuite évalué l'existence d'un site de liaison des lipoamino acides sur les canaux de type T à l'aide d' d'expériences de compétitions réalisées avec un inhibiteur spécifique de ces canaux, la molécule TTA-A1.Dans une deuxième partie, nous avons étudié la régulation par le calcium des canaux de type T. Nous avons montré que l'entrée de calcium par les canaux T eux-mêmes ou par activation des récepteurs P2X4 et NMDA induisait une inhibition du courant de type T. Le calcium activerait une phosphatase qui provoquerait un déplacement de la courbe d'inactivation à l'état stable vers les potentiels négatifs, réduisant ainsi la disponibilité des canaux. Ce phénomène d'inhibition du courant lié à l'entrée du calcium pourrait être un mécanisme de rétrocontrôle négatif limitant l'entrée de calcium dans la cellule afin d'éviter une toxicité provoquée par une concentration de calcium intracellulaire trop élevée. Suite à cette inhibition, lorsque l'entrée de calcium est arrêtée, le courant augmente. Cette augmentation semble être due à l'intervention de la protéine kinase Pak qui rendrait les canaux de type T disponibles.En conclusion, nous avons identifié et caractérisé deux nouveaux mécanismes endogènes de régulation des canaux de type T : une modulation par les lipides, et une modulation par les calcium et la protéine kinase Pak<br>New pathways of regulation of T-type calcium channels.Thanks to their role in cellular excitability and calcium homeostasis, T-type calcium channels are involved in several physiological functions such as sleep or control of cardiac rythmicity and vascular tone. They are also involved in some diseases such as pain or epilepsy. The regulation of T-type calcium channels is still poorly understood and that is the challenge of this thesis.In a first part of the study, we caracterised the effect of some endogenous lipids on these channels, particularly the metabolites of arachidonic acid, and identified the 5,6-EET as a new blocker of T-type channels. We then evaluated the existence of a binding site of lipoamino acids on T-type channels using binding experiments made with a specific inhibitor of these channels, the TTA-A1 molecule.In a second part, we studied the regulation of T-type channels by calcium. We showed that a calcium entry through T-type channels or through P2X4 and NMDA receptors activation induced an inhibition of T-type current. Calcium would activate a phosphatase which would trigger a shift of the steady-state inactivation curve toward negative potentials, reducing the availability of channels. This phenomenon of current inhibition due to calcium entry may be a feedback mechanism limiting calcium entry in the cell to avoid toxicity due to a too high intracellular calcium concentration. After this inhibition, when calcium entry is stopped, the current increases. This increase seems to be due to the intervention of the Pak protein kinase which would make T-type channels available again.In conclusion, we studied and caracterised tow new mechanisms of T-type channels regulation: a modulation by lipids, and a modulation by calcium and the Pak protein kinase

L’ATPase du réticulum sarcoplasmique transporte à chaque cycle deux ions Ca(2+) grâce à l’hydrolyse d’une molécule d’ATP. Nous avons étudié les interactions des ions (Ca(2+) avec les sites de transport de la protéine, en montrant d’abord que leur dissociation luminale est séquentielle. Une telle caractéristique est connue du coté cytoplasmique mais la séquentialité du coté luminal n’est observable que dans certaines conditions (3°C, 300 mM de KCI et pH8). Puis nous avons effectué une étude de la stabilité du métal catalytique sur l’espèce du cycle dont se dissocient les Ca(2+) du coté luminal, et nous avons caractérisé le mécanisme de dissociation luminale : le blocage d’un ion 45Ca(2+) au site luminal profond par un ion 40Ca(2+) au site luminal superficiel se produit de manière coopérative pour une concentration de 0. 5 mM de 40Ca(2+) Ce blocage est bien simulé par un mécanisme simple à 5 espèces. Le blocage que l’on peut observer en supprimant le KCl de la perfusion se produit dans la même gamme de concentration, mais il est intrinsèquement différent et n’est pas convenablement simulé par ce même gamme mécanisme. Nous avons étudié l’influence du pH et montré l’effet accélérateur des nucléotides sur cette dissociation luminale. Nous avons par ailleurs étudié l’effet accélérateur des nucléotides sur l’étape de fixation cytoplasmique des ions Ca(2+). La séquentialité des dissociations cytoplasmiques et luminales nous a permis d’effectuer une étude sur le devenir de l’ordre des deux ions au cours du transport. Nous avons ainsi montré que lors des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation, un ordre préétabli est perdu, contrairement à ce que l’on attend d’un passage en file indienne. Ceci a des implications importantes sur la structure des sites de transport et nous avons envisagé quelques hypothèses structurales qui permettent une perte de l’ordre des deux ions au cours de leur transport par la protéine.

Les canaux calciques de type T sont associés aux activités rythmiques et aux décharges en bouffées dans les cellules excitables. Le clonage de 3 isotypes a soulevé l'hypothèse que chacun y serait différemment associé. Dans cette étude, nous avons observé des oscillations spontanées du potentiel (MPOs) corrélées à l'ouverture spontanée des canaux T selon l'isotype concerné, induisant une augmentation concomittante de la concentration de calcium intracellulaire. De nombreux arguments ont souligné l'importance du courant de fenêtre dans le déclenchement de ces activités rythmiques. De plus, nous avons déterminé les propriétés électrophysiologiques responsables de la forme et de la fréquence des MPOs. Enfin, nous avons montré que ces oscillations inhibaient d'autres voies de signalisation comme la réponse calcique à la bradykinine. En conclusion, ces données démontrent que chaque isotype de canaux T joue un rôle déterminant dans les activités rythmiques grâce à leur courant de fenêtre<br>T-type calcium channels are associated with pacemaker activity and burst firing in excitable cells. The cloning of three isotypes have raised the possibility that each one could differently participate to these phenomena. In our study, we have identified isotype-specific spontaneous opening of T-type calcium channels correlated with spontaneous oscillations of the membrane potential (MPOs), and concomitant increase of the intracellular calcium concentration ([Ca2+]. Several arguments have confirmed that these spontaneous rythmic activities were triggered by the T-type window current. Moreover, we have determined isotype-specific electrophysiological properties associated with the waveform and frequency of MPOs. Finally, we measured an inhibition of the amplitude of [Ca2]i response to bradykinin in cells exhibiting MPOs. Overall, these data demonstrate T-type calcium channels can play a primary role in pacemaker activity thanks to their isotype-specific window current

La contraction du muscle squelettique est sous le contôle d'un ensemble de mécanismes assurant une régulation étroite de la concentration en calcium libre cytoplasmique ([Ca2́+]). Le présent travail apporte des éléments nouveaux à la connaissance de ces mécanismes, sur fibre musculaire intacte, dans les conditions normales et pathologiques. Trois aspects ont été traités:(i) les effets de la ryanodine sur la régulation de la [Ca2+]. Les résultats montrent que cet agent pharmacologique produit une fuite de calcium à partir du réticulum sarcoplasmique (RS), dont l'amplitude est sous le contrôle de la durée et du niveau de dépolarisation de la membrane plasmique. Ceci suggère qu'une fraction prédéterminée de canaux calciques du RS serait activée par une dépolarisation d'amplitude et de durée données. (ii) l'étude de la régulation de [Ca2+] dans le muscle de souris mdx, un modèle de la myopathie de Duchenne dans laquelle un dysfonctionnement de cette régulation est suspecté: la [Ca2+] au repos ainsi que les variations de [Ca2+] induites par des dépolarisations imposées ne sont pas altérées de manière importante sur le modèle mdx. Par ailleurs, les fonctions de détecteur de potentiel du récepteur aux dihydropyridines présent dans le sarcolemme, sont similaires sur fibres musculaires contrôle et mdx, alors que ses fonctions de canal calcique sont sensiblement modifiées dans la muscle mdx. Ces modifications représentent sans doute une conséquence de l'état pathologique des fibres mdx. (iii) l'étude des propriétés de diffusion des ions Mg2́+ dans le milieu intracellulaire. Le Mg2+ intracellulaire a un rôle prépondérant dans le couplage excitation-contraction, mais certaines propriétés fondamentales concernant sa régulation sont inconnues. Le travail réalisé ici a permis de déterminer la constante de diffusion du Mg2+ dans le cytoplasme (190um2. S-1). Cette valeur suggère l'existence de sites de fixation statiques et de faible affinité vis à vis du Mg2+.

Certaines circonstances pathologiques telles que l'hypertension, l'athérosclérose ou la resténose après une intervention vasculaire comme l'angioplastie ou la greffe peuvent induire une réponse proliférative des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi artérielle. La régulation de la concentration intracellulaire des ions calcium ([Ca2+]i) semble jouer un rôle important dans le contrôle de la croissance des CML et des composés tels que les antagonistes des canaux calciques sensibles aux variations du potentiel de membrane (dihydropyridines, benzothiazépines et phénylalkilamines) sont capables de ralentir la prolifération des CML. Ces molécules qui sont d'efficaces agents antihypertenseurs semblent jouer un rôle critique dans la physiologie cardio-vasculaire puisqu'ils possèdent, en plus de leur propriété d'antagoniste des canaux calciques, des activités anti-athérogéniques. Les objectifs de ce travail ont été de définir les mécanismes par lesquels, une dihydropyridine comme l'amlodipine, en ralentissant la croissance des cellules musculaires lisses, exerce son effet anti-athérogénique. Pour cela nous avons examiné l'effet de ce composé sur certains des événements essentiels de la croissance cellulaire dont l'expression des proto­ oncogènes c-fos, c-jun, c-myc, les variations de la concentration intracellulaire de calcium et l'activité des protéines MAPK p42 et p44 déclenchés par différents facteurs impliqués dans la réponse proliférative des CML. Nos études réalisées sur un modèle in vitro de culture de CML d'aorte de rat ont montré que 1) l'amlodipine inhibe la prolifération des CML en agissant sur des événements précoces du cycle cellulaire 2) elle réduit l'expression des proto-oncogènes c-fos, c-jun et c-myc 3) elle inhibe la libération du calcium des stocks intracellulaires induite par la thrombine et la thapsigargine 4) elle n'influence pas l'activité des MAPK p42 et p44 stimulée par la thrombine 5) la phase de mobilisation des ions calcium est nécessaire à l'effet mitogène de la thrombine mais n'influence pas l'activation des MAPK p42 et p44 par cet agoniste. Nos résultats apportent donc, sur le plan fondamental, de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la transmission du signal mitogénique par la thrombine et sur les effets intracellulaires de l'amlodipine. Les effets de l'amlodipine décrits dans cette étude et qui s'ajoutent aux propriétés princeps de ce composé doivent participer à son activité anti­ athérogénique.

La circulation pulmonaire a la particularité d'être dotée d'une réponse vasoconstrictrice à l'hypoxie. Cette réponse permet d'ajuster la perfusion à la ventilation alvéolaire, afin d'assurer une hématose correcte du sang. Lorsque l'hypoxie se prolonge dans le temps (hypoxie chronique) et se généralise à l'ensemble des poumons, on observe le développement d'une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). L'étude des mécanismes cellulaires de l'établissement de l'HTAP hypoxique, nous a semblé d'un grand intérêt dans le développement de nouvelles cibles thérapeutiques de l'HTAP. Dans ce travail, nous avons montré que la diminution par l'hypoxie des canaux Kv et BKca joue un rôle majeur dans le développement de l'HTAP hypoxique. Puis nous nous sommes intéressés aux effets de l'hypoxie chronique et du retour en normoxie sur l'homéostasie calcique. Nous avons montré que l'hypoxie provoque de profondes altérations de la réponse calcique des myocytes artériels pulmonaires à différents agonistes (endothéline-1 (ET-1) ; l'angiotensine II (AII) ; ATP) Ces altérations résultent d'une inhibition par l'hypoxie des ATPases calciques du réticulum (SERCA) et probablement de la voie de signalisation impliquant l'inositol 1, 4, 5 triphosphate (IP3)<br>Pulmonary circulation response to hypoxia by a vasoconstriction. This response allows a good control of the ventilation perfusion ratio. Prolonged hypoxic exposure leads to pulmonary hypertension. It is now well recognised that the pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) are a main actor of the hypoxic response. Hypoxia induces membrane depolarization which in turn increase the intracellular calcium concentration [Ca2+]i) in PASMCs and elevate vasomotor tone. PASMCs membrane potential (Em) is controlled by numerous potassium channels including Kv and Kca channels. However, no detailed studies have been performed on the electrophysiological and expression changes of BKca in CH rats PASMCs. Then we studied effects of CH on cytosolic calcium concentration ([Ca2+]i) and effect of CH on PASMCs calcium response to various agonist, such as (endotheline-1 (ET-1) ; angiotensin II (AII) ;ATP). Alterations of those responses are mainly due to the inhibition of the Ca-ATPase by CH

L'ocytocine, médiateur de la parturition, provoque une mobilisation du calcium dans les cellules myométriales via l'activation d'une protéine G de type Gq/G11 insensible à la toxine pertussique. Celle-ci permet la stimulation d'une phospholipase C spécifique des phosphatidylinositides et la production d'IP3 responsable de la libération du calcium stocké. L'augmentation de calcium intracellulaire n'implique pas de récepteurs à la ryanodine et ne se produit qi'à partir d'un seul stock calcique sensible à l'IP3, disposé à la périphérie et au centre de la cellule. Elle permet l'activation de conductances chlorures et cationiques qui conduisent à une dépolarisation de la cellule myométriale ; les canaux sodiques potentiel-dépendants présents sur ces cellules pourraient également y participer. Cette dépolarisation permet l'activation de canaux calciques potentiel-dépendants de type L qui provoquent un influx de calcium dans la cellule. L'ocytocine est aussi capable d'activer un autre influx de calcium qui dépend de l'occupation des récepteurs. Cet influx, vraisemblablement dû à l'action d'un second messager pourrait jouer un rôle important dans le maintien des contractions lorsque les compartiments calciques ont été vidés. Dans les cellules intestinales de souris, la voie de transduction impliquée dans la libération du calcium stocké lors de la stimulation des récepteurs muscariniques est semblable et implique l'IP3. Cependant, l'IP3 permet la libération de calcium à partir de compartiments calciques disposés surtout en périphérie de la cellule. L'augmentation de calcium qui en résulte permet, par un mécanisme autocatalytique mettant en jeu les récepteurs à la ryanodine, le recrutement de compartiments calciques plus profonds distribués au centre de la cellule. La dépolarisation permet l'activation de canaux calciques de type L et d'un nouveau type, différent de ceux couramment décrits sur les myocytes lisses<br>In myometrial cells, the transduction pathway involved in calcium mobilization by oxytocin requires a pertussis toxin-insensitive G-protein of the Gq/G11 type. This G-protein is involved in the stimulation of a phosphatidylinositide-specific phospholipase C which allows the production of IP3 and the release of intracellular calcium stores. This calcium release is not dependant on activation of ryanodine sensitive-receptors and involves a unique IP3-sensitive calcium store located in peripheral and in central areas of the cell. Calcium release leads to activation of chloride ad cationic conductances and membrane depolarization in which sodium channels may participate. Membrane depolarization opens, in turn, L-type voltage-dependent calcium channels which permit calcium influx into the cell. Ocytocin can also activate a calcium influx dependent on receptor occupation. This influx is probably due to action of a second messenger and can play an important role when calcium stores are empty. In intestinal smooth muscle cells, the transduction pathway involved in calcium store release by muscarinic receptor stimulation also depends on IP3 production. However, in intestinal smooth muscle cells, IP3 allows calcium release from a store essentially located in the peripheral areas of the cell. The further calcium increase permits, by a calcium-induced calcium release mecanism involving ryanodine receptors, the mobilization of deep calcium stores distributed in the central areas of the cell. The depolarization allows the activation of L-type calcium channels and a novel type of calcium channel different of those commonly described in smooth muscle cells

La noradrénaline, neuromédiateur sympathique, induit la contraction du myocyte lisse de veine porte de rat en activant les récepteurs alpha-1A- et alpha-2A - adrénergiques. Les mesures de variations de la concentration calcique intracellulaire, par sondes fluorescentes, et de la production d'inositols phosphates, nous ont permis de caractériser la voie de transduction reliant l'activation des récepteurs alpha-1-A-adrénergiques à la libération du Ca2+ stocké dans les compartiments intracellulaires. Cette voie active, par l'intermédiaire de la sous-unité alpha des protéines Gq ou G11, une phospholipase C qui hydrolyse les phosphatidylinositols membranaires produisant de l'inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP3) et du diacylglycérol (DAG). L'IP3 est responsable de la libération du Ca2+ stocké. La stimulation des canaux calciques potentiel-dépendants (enregistrés par la méthode du patch-clamp) peut être déclenchée par l'activation des récepteurs alpha-1A-adrénergiques et la voie de transduction précédemment citée. Dans ce cas, le DAG agit en activant la protéine kinase C. Cependant, la stimulation des canaux calciques ar la noradrénaline est essentiellement produite par les récepteurs alpha-2A-adrénergiques. La stimulation des canaux calciques par les récepteurs alpha-2A-adrénergiques est indépendante de l'hydrolyse des pphosphatidylinositols et met en jeu une protéine Gi. Les stimulations alpha-1A- et alpha-2A-adrénergiques aboutissent à un effecteur commun : la protéine kinase C. L'activation des récepteurs alpoha-2A-adrénergiques sur des myocytes au potentiel de membrane de repos produit des réponses calciques et électrophysiologiques lentes, durables et de faible amplitude. Ces réponses sont reproduites par l'activation directe des protéines Gi par le mastoparan ; elles correspondent à l'ouverture des canaux calciques potentiel-dépendants et dépendent de l'activation de la protéine kinase C. Les études fonctionnelles montrent que les récepteurs alpha-1 et alpha-2-adrénergiques sont impliqués dans le décours de la contraction du muscle lisse de veine porte : les récepteurs alpha-1 adrénergiques sont associés à la réponse contractile rapide et transitoire alors que les récepteurs alpha-2-adrénergiques interviennent dans la contraction maintenue<br>Noradrenaline induces contraction of rat portal vein myocytes by activating both alpha1A- and alpha-2A-adrenoreceptors. The transduction pathway activated by alpha-1Aadrenoreceptors has been identified by measuring both intracellular calcium concentration with fluorescent dyes and inositol phosphates generation. The alpha-1A-adrenoreceptor couples to the alpha-subunit of a Gq/G11-protein which leads to a stimulation of phospholipase C activity. The subsequent hydrolysis of phosphatidylinositides produces both inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG). IP3 is responsible for calcium release from intracellular stores. Stimulation of voltage-dependent calcium channels (measured with the patch-clamp method) is produced in response to activation of alpha-1A-adrenoreceptors through the same transduction pathway. DAG acts by increasing protein kinase C activity. However, stimulation of calcium channels is mainly dependent on activation of alpha-2A-adrenoreceptors. In this case, the transduction mechanism differs strongly from the precedent one : there is no phosphatidylinositides hydrolysis and the G-protein involved belongs to the Gi-family. Both alpha-1A-and alpha-2A-adrenoreceptor-induced stimulations of calcium channels incvolve activation of protein kinase C. At the resting membrane potential, activation of alpha-2A-adrenoreceptors promotes slow and small variations in both intracellular calcium concentration and membrane current. Similar responses are obtained with mastoparan, an activator of Gi-proteins. These responses are mediated through activation of protein kinase C which phosphorylates calcium channels. Phosphorylation would be responsible for increased opening probability of calcium channels. Contractile responses of intact strips of rat portal vein stimulated by alpha-1-or alpha-2-adrenergic agonists reveal that activation of alpha-1-adrenoreceptors may be associated with fast and transient contraction whereas activation of alpha-2-adrenoreceptors is involved in maintained contraction

En transplantation d’organes, la réponse immunitaire de l’hôte contre son donneur reste une cause très importante de perte de greffons. Ainsi, un meilleur contrôle de la réponse par induction d’une tolérance spécifique reste une priorité en transplantation humaine. Dans ce projet,nous avons donc étudié l’homéostasie calcique au cours des phénomènes précoces de la maturation des cellules dendritiques (DC) humaines. Nous avons mis en évidence la présence d’une ECC (Entrée Capacitive de Calcium), dans la DC humaine, lors d’une stimulation par des agonistes des TLR (LPS ou Zymosan) ou des cytokines inflammatoires (TNF-α). De plus, cette ECC est gouvernée par le complexe ORAI-1 / STIM-1. En effet, l’absence d’expression de ces protéines induit une diminution de la maturation des DC humaines (phénotype, synthèse de cytokines). Par ailleurs, le Calcium, entré par l’ECC, va induire l’activation de canaux potassiques, sensibles à la concentration intracellulaire en Calcium : les canaux KCa3.1. Ces canaux, outre leur rôle dans la facilitation de l’ECC par hyperpolarisation de la membrane,contrôlent la migration des DC humaines. En effet, leur activation permet une sorte d’état de quiescence où les DC restent dans les tissus périphériques. L’ensemble de ces résultats obtenus,in vitro, suggèrent que ces canaux ioniques pourraient être une cible privilégiée pour le développement de nouvelles thérapies pour l’induction de tolérance immune en transplantation<br>In organ transplantation, host immune response against donor still remains a major causeof graft loss. A better control of allogeneic response through the induction of specific tolerance isa major goal in human transplantation. In this work, we studied the calcium homeostasis during the earlier events of the human dendritic cells (DC) maturation. We showed the presence of a CCE(Capacitative Calcium Entry), in the human DC, during the stimulation by TLR agonists (LPS andZymosan) or inflammatory cytokines (TNF-α). Moreover, this CCE was managed by the ORAI-1/ STIM-1 complexe. Indeed, an inhibition of these proteins expression induced a decrease in theDC maturation (phebnotype, cytokines production). Then, the Calcium, issued to CCE, could activate potassium channels, sensitive to intracellular Calcium concentration: KCa3.1 channels.These channels, excepted their role in the facilitation of CCE by membrane hyperpolarisation,control the capacity of human DC migration. Their activation induced a kind of steady state where the DC staied in peripheral tissues. These results taken together suggest that the ion channels seemto be a good target for the development of new therapies to in order to promote allograft tolerance