Academic literature on the topic 'Capacitation des spermatozoïdes – Dissertations universitaires comme sujet'

La protéine TAT1/SLC26A8 a été isolée dans le laboratoire comme une cible des GTPases Rho, exclusivement exprimée dans le testicule humain adulte. Elle appartient à la famille des protéines de transport SLC26 et l'équipe a précédemment montré sa localisation à la membrane plasmique des cellules germinales mâles aux stades spermatocyte et spermatide, ainsi que son activité vis-à-vis des anions sulfate et chlorure. Durant ma thèse, j'ai caractérisé un modèle d'inactivation du gène Tatl chez la souris (Knock ouf) et mis en évidence l'importance de la protéine Tatl pour la différenciation et la mobilité des spermatozoïdes. Ainsi, les souris mâles Tat1-/- sont stériles suite à une asthénozoospermie sévère et des défauts structuraux des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes Tat1-/- présentent une atrophie de l'annulus, structure en forme d'anneau située à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, une disjonction PI/PP, une plicature du flagelle et une cassure de l'axonème; par ailleurs les spermatozoïdes TaT1-/- présentent une absence d'hyperphosphorylation en conditions capacitantes. En accord avec ce phénotype, nous avons montré que chez l'homme comme chez la souris, la protéine TAT1 est également exprimée dans le spermatozoïde mature où elle se localise à l'annulus. De manière à tester l'implication de la protéine TAT1 dans les infertilités masculines humaines, nous avons réalisé des immunodétections de la protéine TAT1 sur des frottis de spermatozoïdes de sujets asthénozoospermiques. Le criblage d'une cohorte de 75 sujets a permis d'isoler un patient présentant une asthénozoospermie modérée associée à une absence de marquage TAXI à l'annulus. Par microscopie électronique à transmission, nous avons observé l'absence complète de l'annulus et une disjonction PI/PP. Ces résultats inédits suggèrent que chez l'homme comme chez la souris, l'intégrité de l'annulus conditionne la mobilité et la différenciation flagellaire des spermatozoïdes. Finalement, afin de déterminer si le rôle de la protéine Tatl dans le contrôle de la mobilité du spermatozoïde fait intervenir son activité de transport anionique, j'ai crée deux mutants ponctuels de la protéine TAT1 (D95N et G218V); ces mutations précédemment décrites dans la littérature abolissent l'activité de transport des protéines SLC26 mais préservent leur adressage à la membrane plasmique. In vitro, y ai vérifié que les mutants TAT1 D95N et TAT1 G218V présentent une expression quantitativement normale et un adressage correct à la membrane plasmique des cellules COS. Si comme attendu, ces mutations induisent, in vitro, une perte de l'activité de transport d'anions, elles seront introduites (de manière indépendante) dans le gène Tatl murin pour la création de modèles d'étude de type « Knock in »
We have previously identified TAT1/SLC26A8 as a potential target of Rho GTPases, exclusively expressed in human adult testis. TAT1 is a member of the SLC26 family and we have shown that TAT1 is located at the plasma membrane of germ cells at spermatocyte/spermatid stages and exhibits a transport activity towards sulfate and chloride anions. During my thesis, I characterized the phenotype of mice with a targeted disruption of Tat gene (knock out) and showed that Tatl protein is essential for sperm flagella differentiation and motility. Hence, Tat1-/- males are sterile due to severe asthenozoospermia and structural defects of the spermatozoa. Tatr spermatozoa display an atrophia of the annulus (the ring shape structure connecting the midpiece to the principal piece), a midpiece-principal piece disjunction and hairpin-like bending of the flagella leading to the disruption of the axonemal structure. In addition, we observed that Tat1-/- spermatozoa do not display the phosphorylation profile required for sperm capacitation. According to this phenotype, we showed that TAT1 is also expressed in mature sperm where it is specifically localized at the annulus. In order to investigate the implication of TAT1 in human asthenozoospermia, we performed imunodetection of TAT1 on sperm smear preparations from a cohort of 75 asthenozoospermic subjects. We identified one patient with a moderate asthenozoospermia associated with the absence of TAT1 staining at the annulus. By transmission electron miscroscopy, we observed complete lack of the annulus and midpiece-principal piece disjunction in spermatozoa from the patient. This case, so far unique, suggests that in human the integrity of the annulus is also required for proper sperm motility and flagella differentiation. Finally, in order to address the role of TAT1 anion transport activity in the control of sperm motility and capacitation, I generated two mutants (D95N and G218V) in TAT1 sequence, based on published data concerning mutations in SLC26 proteins that abolish transport activity without affecting plasma membrane localization. I analyzed these mutants, in vitro, and showed normal expression level and proper localization of the proteins at plasma membrane of COS cells. If, as we expect, these mutations inhibit TAT1 transport activity in vitro, we will proceed to their introduction into the murine Tatl gene in order to generate « knock in » mouse models

Le mouvement ciliaire s'oppose à la pénétration des agresseurs de l'air ambiant dans les voies respiratoires. Un rappel des connaissances sur les cils vibratiles souligne la grande diversité des modèles expérimentaux. Nous avons étudié la fréquence de battement ciliaire (FBC) des voies respiratoires humaines en appliquant à ce modèle des techniques développées sur le modèle flagellaire de spermatozoi͏̈des d'oursin à la Station Océanologique de Villefranche-sur-Mer (CNRS-URA 671 et Univ. Paris VI). Pour mesurer la FBC, nous avons utilisé la méthode stroboscopique puis la méthode d'analyse dynamique d'image. Ainsi la FBC normale est de 8,14 Hz en moyenne (température de 25ʿ C ; écart-type : 1,5 Hz). Il y a de grandes variations inter-individuelles, sans rapport avec l'âge, le sexe, le tabagisme ou les fonctions respiratoires. La FBC est sensible à la température ambiante et à la viscosité du milieu. Les FBC nasale et trachéale sont similaires alors que la FBC bronchiolaire n'est qu'à 65% de FBC bronchique. Les cils bronchiques et bronchiolaires tolèrent de larges variations de pH extracellulaire. Nous avons appliqué au modèle cilié bronchique la technique de démembranation-réactivation. Le battement ciliaire démarre pour une concentration d'ATP-Mg de 5. 10-5 M et devient normal à 5. 10-3 M. La FBC réactivée augmente avec la concentration de calcium ionisé. Cependant le calcium n'est pas indispensable puisqu'un battement persiste à Ca2+ 10-11 M. La FBC réactivée est très sensible au pH dont la valeur optimale est de 8. La dynéine axonémale ciliaire humaine a donc des caractéristiques superposables à la dynéine flagellaire de spermatozoi͏̈des d'oursin. Une revue générale des substances régulant du mouvement ciliaire est présentée. L'utilisation des anticorps anti-tubulines ou anti-dynéine dont certains ont la propriété de modifier le mouvement axonémal et la mise au point d'une méthode de cultures permettant l'obtention d'une ciliogenèse satisfaisante en culture sont des perspectives en développement
Ciliary movement is responsible for the transport of mucus and inhaled pollutants both from the nasal cavity and the lung. A summary of motile cilia biology shows many different experimental models. We studied the ciliary beat frequency (CBF) from human airways using techniques applied to a flagellar model of sea urchin spermatozoa and developed in the Marine Station of Villefranche-sur-Mer (CNRS-URA 671 and Paris VI University). For CBF measurement, we first used a stroboscopic method, then a dynamic image analysis system. We found a normal CBF of 8,14 Hz (mean; standard deviation : 1,5 Hz ; temperature 25ʿc). There are large interindividual variations without link with age, sex, smoking status or lung function. CBF is influenced by temperature and the viscosity of medium. Nasal and tracheal CBF are similar. Bronchiolar CBF mean value is 65 % of bronchial. Bronchiolar and bronchial cilia tolerate variations in external pH on a wide range. Acidic pH values are better tolerated by bronchiolar than bronchial cilia. Demembranation and reactivation are successfully applied to human cilia. Reactivated CBF appears at a ATP-Mg concentration of 5. 10-5 M; normal reactivated CBF is obtained with a ATP-Mg concentration of 5. 10-3 M. Reactivated CBF levels off with CA2+ concentration. However Ca2+ is not necessary to ciliary beating as a beat is obtained at Ca2+ as low as 10-11 M. CA2+ 10-1 M impairs reactivation. Reactivated CBF is greatly influenced by pH : optimal pH is 8. Human ciliary dynein has the same properties as sea urchin flagellar dynein. A general review of the mediators regulating the ciliary beat is presented. Antibodies against tubulin or dynein, some of which are able to modify reactivated CBF, are to be tested on this human model. We are now developing a culture of human ciliated respiratory cells, allowing complete ciliogenesis

Chez la souris, l'epithelium epididymaire secrete une grande variete de proteines et de glycoproteines. Quatre d'entre elles, seuls marqueurs de la differenciation, de la regionalisation et de l'androgenodependance du canal, presentent une specificite tissulaire et zoologique. Ces proteines specifiques sont des complexes macromoleculaires essentiellement constitues de sous-unites riches en residus glucidiques. L'adsorption de certaines sous-unites a la surface des spermatozoides en transit dans l'epididyme, suggere l'intervention de ces proteines dans la maturation du gamete male.

La zone pellucide (ZP) est une enveloppe acellulaire transparente qui entoure l'ovocyte et l'embryon de mammifère jusqu'à son implantation. Au cours de l'interaction gamètique, elle intervient dans la reconnaissance et la fixation des spermatozoi͏̈des, dans le déclenchement de la réaction acrosomique ainsi que dans le blocage de la polyspermie. Trois glycoprotéines appelées ZP1, ZP2 et ZP3 composent la zone pellucide murine mais la composition de la zone pellucide humaine est encore imparfaitement connue. C'est pourquoi nous avons cherché à caractériser la structure pellucidaire humaine en électrophorèse après biotinylation des protéines et avons étudié ses glycoconjugués, en blot et en cytochimie, à l'aide de lectines et d'anticorps anti-oligosaccharides. La zone pellucide humaine se compose de trois protéines majoritaires appelées ZP1, ZP2 et ZP3 ainsi que d'une glycoprotéine polymérique minoritaire de 180 kDa. Les glycoconjugués Lewis b, sialyl-Lewis a et sialyl-Lewis x se retrouvent également dans la composition des chaînes saccharidiques des zones pellucides humaines. D'autre part, nous avons testé les lectines AAL et LTA ainsi que les anticorps anti-Lewis b, anti-sialyl-Lewis a et anti-sialyl-Lewis x dans le cadre de tests de fixation pellucidaire des spermatozoi͏̈des. Ces deux lectines ainsi que les anticorps anti-Lewis b et anti-sialyl-Lewis a inhibent significativement la fixation des spermatozoi͏̈des. De même, les néoglycoconjugués Lewis b, sialyl-Lewis a et syalyl-Lewis x inhibent significativement la fixation des spermatozoi͏̈des aux ZP. Nous avons pu localiser la fixation du néoglycoconjugué Lewis b sur la portion acrosomique des spermatozoi͏̈des humains. Avec cette même localisation, un anticorps anti L-sélectine marquait les spermatozoi͏̈des capacités. L'ensemble de ces résultats permet de mieux définir la composition protéique et saccharidique de la ZP humaine et nous avons identifié des glycoconjugués intervenant dans la fixation des spermatozoi͏̈des par l'intermédiaire de récepteurs qui restent à caractériser.

La fecondation in vitro (fiv) utilisee en clinique humaine permet dorenavant de traiter des infertilites auparavant sans recours, et aussi de poser des diagnostics genetiques sur l'embryon preimplantatoire. L'objet de cette these est : - d'evaluer l'incidence de la regulation des anomalies chromosomiques de l'embryon pendant la periode preimplantatoire en utilisant le caryotype et la technique d'hybridation in situ. - et de preciser les causes d'echec et l'eventuelle toxicite des nouvelles techniques de fiv telle que la microinjection intracytoplasmique d'un spermatozoide (icsi). En fiv humaine, nous avons ainsi : - precise le taux d'aneuploidies du chromosome 18 dans les ovocytes non fecondes (2 %) et confirme la regulation des oeufs dispermiques vers la diploidie ou vers les mosaiques apres clivage. - nous avons montre que le taux de mosaiques etait egalement eleve (45 %) dans les oeufs normalements fecondes mais ayant evolue vers le blocage de la division cellulaire. Les resultats de ces deux etudes sont des temoins de l'instabilite genetique de l'embryon preimplantatoire. Nous avons par ailleurs montre : a) que la cause majeure d'echec de developpement apres icsi etait l'absence complete d'evolution du noyau spermatique dans le cytoplasme ovocytaire ; b) que la selection d'ovocytes matures avant la microinjection diminuait la frequence des condensations prematurees des chromosomes spermatiques, ce qui est en faveur de la relation entre ces pathologies et l'immaturite ovocytaire. En outre la microinjection semble augmenter la frequence des cassures chromosomiques ovocytaires. Chez la souris nous avons ainsi mis en evidence une elevation du taux d'activation parthenogenetique des oeufs non fecondes, provoquee par le vieillissement et par l'immaturite du sperme.