Dissertations / Theses on the topic 'Capacitation des spermatozoïdes'

Suite à l’éjaculation, les spermatozoïdes ne sont pas aptes à féconder un ovocyte. Ces derniers doivent subir une maturation dans le tractus génital femelle afin d’acquérir le pouvoir fécondant soit la capacitation. Bien qu’elle fût découverte depuis plus de soixante ans, les modifications protéiques de la surface de la membrane des spermatozoïdes ne sont toujours pas complètement élucidées. Particulièrement chez le cheval et le porc, l’étude des protéines de surface des spermatozoïdes lors de la capacitation aurait un impact direct sur l’amélioration des techniques de reproduction avancées. La présente étude a pour premier objectif d’abord d’établir les meilleures conditions afin de promouvoir et caractériser la capacitation des spermatozoïdes équins et porcins en condition in vitro. Le deuxième objectif est d’optimiser un protocole d’isolement de protéines de surface des spermatozoïdes en utilisant la biotinylation. La démarche est de rendre ce processus complètement imperméable afin d’étudier seulement les protéines de surface.
After ejaculation spermatozoa must undergo a maturation to be able to fertilize an oocyte. The collective events that lead to this capability are named capacitation. Although capacitation was first discovered more than sixty years ago, the events and regulation of this maturation are still not fully understood. Also, the equine and porcine species has several reproductive issues believed to be caused by defects in sperm capacitation. Thus, the study of stallion sperm surface protein modification during capacitation could help to ameliorate advanced reproductive technologies in the horse and the pig. The aim of the first study was to establish the best in vitro conditions to promote horse sperm capacitation and to characterize the sperm using different tests. Our second objective was to optimize a surface biotinylation protocol to prevent biotin labeling of internal sperm proteins in order to study the surface membrane protein changes during capacitation.

La protéine TAT1/SLC26A8 appartient à la famille des transporteurs d'anions SLC26 ; elle est exprimée à la membrane plasmique des spermatozoïdes humains et murins au niveau de Pannulus, à la jonction des pièces intermédiaire et principale du flagelle. Nous avons précédemment montré que les souris mâles Tatl⁻/⁻ sont stériles suite à une asthénozoospermie associée à des défauts de structure du flagelle et du mécanisme de capacitation. Le canal CFTR, un partenaire de certains SLC26, est également exprimé dans les spermatozoïdes et participe à la régulation des flux d'ions chlorure et bicarbonate contrôlant certaines des modifications du spermatozoïde associées à la capacitation (variations de pH intracellulaire, de potentiel de membrane, production d'AMPc et hyperphosphorylation). Au cours de ma thèse, j'ai démontré, in vitro, que les protéines TAT1 et CFTR interagissent et que la protéine TAT1 stimule l'activité du canal CFTR. J'ai également observé que les spermatozoïdes Tatl⁻/⁻ présentent une dérégulation du taux d'AMPc et que l'hyperphosphorylation protéique et le battement flagellaire sont partiellement restaurés en présence d'analogues perméants de l'AMPc. Ces résultats indiquent que la protéine TAT1 pourrait réguler le processus de capacitation en stimulant l'activité du canal CFTR. Je me suis également intéressé au rôle structural de la protéine TAT1 et j'ai mis en évidence son interaction avec la protéine SEPT4. Nos travaux sur l'expression des protéines TAT1 et SEPT4 dans les spermatozoïdes de souris Sept4⁻/⁻ et Tatl⁻/⁻ et d'un patient asthénozoospermique permettent d'approcher les mécanismes de la mise en place et le rôle de l'annulus au niveau du flagelle
TAT1/SLC26A8 is a member of the SLC26 family of anion transporters, expressed at the plasma membrane of human and mouse male germ cells; in mature sperm, TAT1 protein is adressed at the annulus, a structure located at the jonction of the midpiece and principal piece of the flagellum. We previously reported that Tatl⁻/⁻ mâles are stérile due to severe asthenozoospermia associated with flagellar structure and capacitation defects. The CFTR channel, a partner of several SLC26 members, is also expressed in sperm where it regulates chloride and bicarbonate fluxes responsible for sperm modifications during capacitation (i. E. Increase of intracellular pH and cAMP, plasma membrane hyperpolarization, protein hyperphosphorylation). During my thesis, I have shown, in vitro, the physical interaction between TAT1 and CFTR together with the stimulation of CFTR activity by TATl. I have also observed that Tatl⁻/⁻ sperm display cAMP regulation defects and that protein hyperphosphorylation and flagellar beating are rescued by permeant cAMP analogs. These results indicate that TATl might regulate sperm capacitation by cooperating with thé CFTR channel. I have also studied the structural role of TATl and demonstrated a physical interaction between TATl and SEPT4. Analysis of both proteins and of annulus structure in sperm from Sept4" and Tatl" mice and from an asthenozoospermie patient provide new informations about the mechanisms involved in the formation of this structure and its role in sperm flagellum

Les spermatozoïdes sont des cellules haploïdes hautement spécialisées ayant pour but ultime la fécondation de l'ovocyte. Afin de devenir aptes à la fécondation, les cellules germinales mâles subissent plusieurs étapes de maturation, impliquant bien des modifications tant au niveau protéique, membranaire et intracellulaire. Toutefois, les spermatozoïdes de mammifères fraîchement éjaculés sont incapables de féconder et acquièrent leur plein pouvoir fécondant à l'intérieur du tractus génital femelle, lors de leur transit pour rencontrer l'ovule. Ces différentes étapes de maturation permettent aux spermatozoïdes d'obtenir, entre autres, leur caractéristique unique concernant leur composition protéique et lipidique. Cette complexité membranaire est un mécanisme permettant aux spermatozoïdes d'avoir une spécificité de signal qui rend possible la capacitaton et la réaction acrosomiale au moment et endroit opportuns. Enfin, ce mémoire traitera du fractionnement membranaire et des partenaires d'interaction de la tyrosine kinase YES1 chez les spermatozoïdes humains.

La chronologie des principaux évènements flagellaires survenant dans l'établissement du mouvement des spermatozoïdes de mammifères en relation à la fois avec des phénomènes physiologiques de maturation et de capacitation et les modifications du milieu environnant a été établie grace à des techniques microphotographiques et cinématographiques. L'analyse du mouvement flagellaire a montré l'existence d'un modèle de motilité commun à la maturation et à la capacitation. Un tel modèle apparait aussi au cours de l'induction de la motilité des spermatozoïdes testiculaires et de la réactivation des spermatozoïdes matures demembranes. Dans tous les cas, les spermatozoïdes présentent une courbure non propagée dans la première partie du flagelle avec des déplacemetns erratiques et circulaires. Le rôle joué par cette courbure ainsi que son origine possible sont discutés en relation avec l'ultrastructure et la physiologie du flagelle
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L’obtention de spermatozoïdes fécondants est un processus long et multi étapes, débutant par la production des gamètes mâles dans le testicule. Les spermatozoïdes sont ensuite successivement maturés au cours du transit épididymaire puis lors de leur passage dans les voies génitales femelles au cours du processus de capacitation. Ces étapes de maturation post-testiculaires concernent notamment la composition lipidique du gamète pour lui permettre d’acquérir une fluidité membranaire essentielle à la fécondation. Les résultats présentés dans cette thèse mettent en évidence l’importance de l’homéostasie lipidique épididymaire pour la maturation lipidique des spermatozoïdes et l’acquisition du pouvoir fécondant. Au niveau moléculaire cette homéostasie lipidique est régulée par les isoformes α et β des LXRs, les récepteurs nucléaires des oxystérols (NR1H3 et NR1H2, respectivement). Un régime alimentaire enrichi en cholestérol chez des souris jeunes invalidées pour les LXRs entraîne une infertilité avec une atteinte spécifique de l’épididyme. La maturation épididymaire des spermatozoïdes est alors altérée, entraînant des défauts de compositions lipidiques et protéiques de la membrane plasmique spermatique. Ces défauts ont des répercussions délétères sur la capacitation, issues de perturbations des flux calciques et de la tyrosine phosphorylation. En plus de leurs répercussions endocriniennes, les dyslipidémies semblent également affecter la maturation post-testiculaire. Ces résultats sont à considérer dans le cadre des protocoles de PMA puisque le bilan lipidique plasmatique ne fait pas partie des examens classiques des couples en PMA. Or en France, 55% des hommes entre 30 et 54 ans sont atteints d’une dyslipidémie. Ces désordres métaboliques lipidiques pourraient altérer la maturation post-testiculaire des gamètes, provoquant un certain nombre d’infertilités et/ou d’échecs en PMA
The acquisition of fertile spermatozoa is a long and multi-stage process, beginning with the production of male gametes in the testis. Spermatozoa then undergo two successive maturation steps, first during the epididymal transit and then in the female genital tract during the capacitation process. The post-testicular maturation particularly impacts sperm lipid composition, leading to a higher membrane fluidity considered to be essential for fertilization. The results presented in this work show the importance of epididymal lipid homeostasis for sperm lipid maturation and acquisition of fertilizing ability. At the molecular level, lipid homeostasis is regulated by the LXRs (α and β isoforms), the oxysterol nuclear receptors (NR1H3 and NR1H2, respectively). A cholesterol-enriched diet in young LXR-null mice leads to infertility with a specific epididymal alteration. Sperm epididymal maturation is altered, leading to defects in lipid and protein composition of the spermatic plasma membrane. These defects have detrimental effects on the capacitation process, characterized by disturbances of calcium flows and tyrosine phosphorylation. In addition to their endocrine effects, dyslipidemia also appear to affect post-testicular maturation. These results have to be considered in the context of ART protocols, since the plasma lipid status is not part of the routine examinations for couples in ART protocols. Concomitantly, in France, 55% of men aged 30-54 are dyslipidemic, suggesting that these lipid metabolic disorders could alter sperm post-testicular maturation, causing a number of infertility and / or ART failures

Ce travail a été mené en utilisant la technique de cytofluorométrie et la technique de microscopie électronique. La première partie met en évidence la localisation des résidus N-Acétylglucosamine au niveau de la membrane plasmique, galactose au niveau de la membrane externe de l'acrosome, et mannose et fucose au niveau de la membrane interne de l'acrosome. On a mis au point une technique de triple marquage en utilisant simultanément trois fluorochromes différents (iodure de propidium, GB24 et lectine). Ces résultats ouvrent une orientation vers des applications pratiques pour l'exploration des qualités fonctionnelles du sperme dans le cadre des études des hypofertilités et des indications cliniques des techniques d'assistance médicale à la procréation. La deuxième partie du travail aborde l'étude de l'influence des cytokines sur la fécondance du sperme. Les résultats montrent qu'il existe chez l'homme des corrélations entre la fixation de certaines cytokines sur les spermatozoïdes et des altérations du spermogramme (nombre, mobilité et formes immatures des spermatozoïdes). Les données obtenues permettent une meilleure connaissance des relations cytokine-spermatozoïde et d'envisager des applications à l'exploration de la fécondance du sperme et de ses mécanismes.

Nous avons évalué les variations de l'état de condensation de la chromatine des spermatozoïdes humains au cours de la congélation et de la capacitation in vitro, par l'étude des relations entre ADN et protéines nucléaires. La diminution du pourcentage d'ADN bicaténaire, mesuré à l'aide de l'acridine orange, du contenu en ADN-feulgen et de la surface des noyaux des spermatozoïdes, mesures en microspectrophotométrie quantitative, après congélation/décongélation nous a fait évoquer une surcondensation de la chromatine dommageable pour l'expression du pouvoir fécondant. L'importance biologique de ces changements structuraux a été confirmée par l'analyse de situations de diminution ou de perte du pouvoir fécondant après congélation, ainsi que par le retard observé lors de l'analyse cinétique des évènements précoces de la fécondation in vitro en conditions homo ou hétérospécifiques. En outre, nous avons précisé que les remaniements chromatiniens s'observaient dès l'étape de cryoconservation. Après capacitation in vitro, nous avons observé au contraire une augmentation des contenus en ADN-feulgen et surfaces des noyaux, suggérant une décondensation partielle, avec une relation inverse vis-à-vis du pourcentage de fécondation in vitro. Les résultats confirment la nécessité de prendre en compte l'état des noyaux des spermatozoïdes au cours de l'évaluation de leur cryorésistance et/ou des conditions d'une capacitation in vitro.

L’objectif de la thèse a été d’apporter des éléments sur la réaction acrosomique (RA) aviaire afin de mieux comprendre les processus menant à la fécondation et de mieux maîtriser la capacité des spermatozoïdes à être conservés. Nos résultats ont conforté l’hypothèse de l’absence de capacitation chez les oiseaux. De plus, il n’y a pas d’hyperactivation de la mobilité lors de la RA. Seul le Ca2+ s’avère être l’élément indispensable au déclenchement de la RA. L’évaluation de la RA avec des spermatozoïdes conservés à l’état liquide ou après cryoconservation a révélé une évolution différente en fonction du type de conservation. L’étude des voies de signalisation susceptibles d’être impliquées dans le déclenchement de la RA a suggéré l’activation de 3voies, PKA, PI3K et MAPK ERK. Ce travail ouvre de nombreuses perspectives scientifiques vers l’approfondissement des connaissances de la RA chez les oiseaux et sur l’utilisation qui peut en être faite pour mieux maîtriser la qualité des gamètes
The aim of this work was to provide new information on chicken acrosome reaction (AR) for a better comprehension of the mechanisms leading to this reaction and a better control of the fertilizing potential of spermatozoa after in vitro storage. Our results showed that calcium is the factor absolutely necessary to initiate the AR and supported the hypothesis that chicken spermatozoa do not need to be capacitated. Moreover, motility hyperactivation was not found at the time of AR. Then, we showed that chicken sperm ability to undergo the AR may differ depending on the type of semen storage. Indeed, this ability was dramatically affected by liquid storage, but was submitted to contrasted effect after cryopreservation. Finally, we investigated the potential involvement of several signaling pathways in initiation of the chicken AR and the results showed that the AR could be mediated by activation of the PKA, PI3K and ERK MAPK pathways

La protéine TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) appartient à la famille des SLC26, une famille de transporteurs d’anions qui contribuent dans différents épithelia à l’homéostasie cellulaire. La protéine TAT1 s’exprime exclusivement dans les cellules germinales mâles, chez l’homme et chez la souris. Sur le spermatozoïde mature, la protéine TAT1 est localisée à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, au niveau de l’annulus, une structure en forme d’anneau composée de différents polymères de Septines (1, 4, 6, 7 et 12).Le modèle murin d’invalidation du gène Tat1 présente une infertilité mâle par asthénozoospermie totale (absence de mobilité des spermatozoïdes) et des défauts de capacitation associés à des anomalies structurales du flagelle (plicature du flagelle, disjonction entre la PI et la PP, atrophie de l’annulus). Ce modèle indique que la protéine TAT1 pourrait avoir un rôle structural dans le maintien de l’annulus et dans la mise en place du flagelle. Par ailleurs, la protéine TAT1 possédant une activité de transport d’anions, il est vraisemblable qu’elle puisse influer directement sur la régulation de la mobilité et de la capacitation puisqu’il est bien établi que les échanges ioniques sont essentiels au contrôle de ces deux processus.En effet, les ions chlorure, bicarbonate et calcium participent à l’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA, au cours des processus de mobilité et de capacitation (i.e. processus de maturation ayant lieu dans le tractus génital féminin et conférant au spermatozoïde un mouvement hyperactivé et la capacité à interagir avec l’ovocyte).Plusieurs travaux ont montré une interaction physique et fonctionnelle des membres de la famille SLC26 avec le canal chlorure/bicarbonate CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) dont les mutations sont responsables de la mucoviscidose. De manière intéressante des données récentes ont montré l’expression de CFTR dans le spermatozoïde et son rôle dans la régulation des flux de chlorure au cours de la capacitation. Au cours de ma thèse, nous avons testé la coopération entre les protéines TAT1 et CFTR ; nous avons pu montrer que la protéine TAT1 est capable d’interagir physiquement avec CFTR et de stimuler son activité de transport d’anions, suggérant qu’in vivo les deux protéines forment un complexe moléculaire impliqué dans la régulation des flux de chlorure et de bicarbonate dans le spermatozoïde.Tout comme TAT1, plusieurs membres de la famille SLC26 ont une expression tissulaire spécifique. Par ailleurs, les mutations génétiques de certains SLC26 sont associées à des pathologies humaines (surdité, diarrhée chlorurée congénitale et chondrodysplasie). De par le phénotype du modèle murin Tat1 et l’importance des SLC26 en pathologie humaine, TAT1 constitue un bon candidat dans la recherche des causes génétiques des asthénozoospermies humaines.Le laboratoire a mis en place au cours de ma thèse, un projet de recherche de mutations du gène TAT1 dans les asthénozoospermies humaines. Le séquençage des régions codantes du gène TAT1 dans une cohorte de 147 hommes infertiles par asthénozoospermie a ainsi permis d’identifier des variations de séquence inédites du gène chez 7 sujets. L’étude in vitro de certains variants indique pour trois d’entre eux une instabilité des formes mutantes associée à un défaut de stimulation du canal CFTR, in vitro. Par ailleurs, les spermatozoïdes de ces patients présentent d’importantes anomalies flagellaires dans la mise en place de la pièce intermédiaire, compatible avec un rôle de la protéine TAT1 et de ses partenaires (les septines) dans la genèse du flagelle
TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) belongs to the SLC26 family of anion transporters, which is implicated in cellular homeostasis of different epithelia. TAT1 is exclusively expressed in male germ cells, in human and mouse. On mature spermatozoa, TAT1 is located at the annulus, a ring-shaped structure composed of different septins polymers (1, 4, 6, 7 and 12), at the junction of the midpiece (MP) and principal piece (PP) of the flagellum.The knock-out mouse model of Tat1 gene shows a male infertility by complete asthenozoospermia (lack of sperm motility) and capacitation defects combined with flagellar structural abnormalities (flagella bending, MP and PP disjunction and atrophy of the annulus). This model suggests that the TAT1 protein could fulfill structural roles in the annulus and during flagellum biogenesis. Moreover TAT1 displayind an anion transport activity, it could also be implicated in the control of sperm motility and capacitation by regulating anions exchannges, which are well known to be essential for both processes.Indeed, chloride, bicarbonate and calcium ions are involved in the activation of the cAMP/PKA pathway, controlling sperm motility and capacitation processes (i.e. maturation events occuring in the female genital tract and providing the spermatozoa an hyperactivation movement and the ability to interact with oocyte).Several publications have reported a physical and functionnal interaction between SLC26 family members and the chloride/bicarbonate CFTR channel (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), which mutations are responsible of cystic fibrosis. Interestingly, recent data showed CFTR expression in spermatozoa and its role in the regulation of chloride fluxes during capacitation. During my thesis, we tested TAT1 and CFTR cooperation; we showed that TAT1 can interact physically with CFTR and stimulate its anion transport activity, suggesting that in vivo they form a molecular complex involved in the regulation of chloride and bicarbonate fluxes during sperm capacitation.Like TAT1, several SLC26 family members have a tissue specific expression. Furthermore genetic mutations in several SLC26 members result in human pathology such as deafness, congenital chloride diarrhea and chondrodysplasia. According to the phenotype of the KO Tat1 mouse model and the role of SLC26 members in human pathology, TAT1 constitutes a good candidate for the search of genetic causes of human asthenozoospermia.During my thesis, the laboratory has set up, a research project aiming at identifying mutations in the TAT1 gene that are responsible for human asthenozoospermia.Sequencing of the TAT1 gene coding regions in a cohort of 147 infertile men presenting with asthenozoospermia allowed us to identify several new sequence variations in in the TAT1 gene. In vitro study of these variants shows that 3 of them are associated with protein instability and abrogate CFTR stimulation. Besides, patients sperm show important flagellar abnormalities in the midpiece, consistent with a role of TAT1 and its partners (septins) in flagellum biogenesis

Le spermatozoïde doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, nommée capacitation, lui permettant ainsi d'acquérir son pouvoir fécondant. La phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques, observée durant la capacitation, fait partie des modifications que doit subir le spermatozoïde pour être en mesure de féconder l'ovule. Au cours des dernières années, plusieurs tyrosine kinases, les enzymes responsables de cette phosphorylation, ont été identifiées dans les spermatozoïdes de différents mammifères. Des études réalisées par l'utilisation d'inhibiteurs de ces enzymes ont démontré que les membres de la famille des src pouvaient être, en partie, responsables de l'élévation du contenu en phosphotyrosine lors de la capacitation. Il a donc été entrepris de détecter la présence des différents membres de cette famille dans les spermatozoïdes. Au cours de l'étude pour l'identification des tyrosine kinases de la famille des src dans le spermatozoïde, des isofolmes codant pour yes, lyn, lck et hck ont été identifiés. De plus, un isofonne tronqué de hck, nomlné hck-tr, a été identifié dans les cellules germinales haploïdes de taureau. Le but de ce projet de doctorat était donc de déterminer si la protéine hck et/ou son isoforme tronqué étaient impliqués dans la capacitation, réaction de l'acrosome et l'hyperactivité; processus menant à la fécondation. La première partie du projet avait pour objectif de confirmer la présence des ARNm encodant les isoformes de hck dans les cellules germinales et déterminer si la protéine correspondante était exprimée au niveau des spermatozoïdes matures. Les résultats obtenus ont permis de confirmer la présence des messagers identifiés et de montrer la présence, par l'utilisation d'anticorps spécifiques, des deux protéines dans les différentes cellules spermatogéniques. La caractérisation de ces isoformes a par la suite été entreprise permettant ainsi la localisation de hck -tr dans le testicule et le spermatozoïde bovin. La présence d'une forme active de la kinase pleine longueur a, quant à elle, été démontrée dans le testicule ainsi que dans les spermatozoïdes épididymaires et éjaculés. La dernière partie du projet consistait en la détermination des rôles potentiels que pouvaient avoir les isoformes de hck dans les événements menant à la fécondation. Hck-tr pourrait ainsi agir comme un inhibiteur puisque sa présence a provoqué une importante diminution de l'activité enzymatique de hck. Les résultats obtenus ont aussi permis d'identifier plusieurs protéines qui interagissaient spécifiquement avec hck, hck-tr ou les deux isoformes. Bien que certaines de ces protéines soient associées à des structures présentes dans la tête du spermatozoïde, la majorité des candidats identifiés sont retrouvés au niveau du flagelle. Cette étude permettra de mieux comprendre les implications de cette tyrosine kinase dans la phosphorylation en tyrosine observée durant la capacitation, la réaction de l'acrosome et l'hyperactivation du spermatozoïde

Le spermatozoïde, afin d'être en mesure de féconder l'ovule, doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, regroupées sous le terme capacitation. De ces modifications, une augmentation de la phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques spécifiques ainsi qu'une augmentation du Ca²⁺ intracellulaire sont observées. Il a été démontré que la phosphorylation sur résidu tyrosine associée à la capacitation des spermatozoïdes est sous le contrôle étroit du Ca²⁺, de la voie AMPc/PKA et des dérivés actifs de l'oxygène. De plus, il a été montré que la libération des réservoirs de Ca²⁺ par la thapsigargine, un inhibiteur spécifique des Ca²⁺ -ATPase du réticulum endoplasmique et sarcoplasmique (SERCA), pouvait provoquer l'augmentation de la phosphorylation en tyrosine et ce, dépendante des tyrosines kinases de la famille de src. Tous ces éléments suggèrent qu' il y a une Ca²⁺-ATPase sensible à la thapsigargine présente dans les spermatozoïdes permettant l'accumulation de Ca²⁺ dans les réservoirs et qu'au moins un membre de la famille de src dont l'activité est Ca²⁺ -dépendante est présente dans les spermatozoïdes. Dans un premier temps, j'ai identifié la Ca²⁺-ATPase SERCA2. C'est la première étude qui démontre que ce type de Ca²⁺ -ATPase est présente dans les spermatozoïdes de mammifères. La présence de SERCA2 au niveau de l'acrosome dans les spermatozoïdes humains, murins et bovins, suggère que cette Ca2+ -ATPase puisse contrôler la [Ca2+]i en accumulant le Ca²⁺ au niveau de l'acrosome. Puisque src est modulée positivement par le Ca²⁺, j'ai vérifié sa présence et son rôle dans les spermatozoïdes humains. Dans cette étude, j'ai clairement démontré que l'activité de src est Ca²⁺ dépendante et modulée positivement par la voie AMPc/PKA. De plus, la kinase src semble active tout au long de la capacitation et pourrait donc contribuer à l'augmentation de la phosphorylation associée à la capacitation. Enfin, j'ai tenté d' identifier des substrats de src par deux approches différentes. L'identification de ces protéines permettra de mieux comprendre le rôle de cette tyrosine kinase dans les fonctions Ca²⁺ -dépendantes du spermatozoïde.

La protéine TAT1/SLC26A8 a été isolée dans le laboratoire comme une cible des GTPases Rho, exclusivement exprimée dans le testicule humain adulte. Elle appartient à la famille des protéines de transport SLC26 et l'équipe a précédemment montré sa localisation à la membrane plasmique des cellules germinales mâles aux stades spermatocyte et spermatide, ainsi que son activité vis-à-vis des anions sulfate et chlorure. Durant ma thèse, j'ai caractérisé un modèle d'inactivation du gène Tatl chez la souris (Knock ouf) et mis en évidence l'importance de la protéine Tatl pour la différenciation et la mobilité des spermatozoïdes. Ainsi, les souris mâles Tat1-/- sont stériles suite à une asthénozoospermie sévère et des défauts structuraux des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes Tat1-/- présentent une atrophie de l'annulus, structure en forme d'anneau située à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, une disjonction PI/PP, une plicature du flagelle et une cassure de l'axonème; par ailleurs les spermatozoïdes TaT1-/- présentent une absence d'hyperphosphorylation en conditions capacitantes. En accord avec ce phénotype, nous avons montré que chez l'homme comme chez la souris, la protéine TAT1 est également exprimée dans le spermatozoïde mature où elle se localise à l'annulus. De manière à tester l'implication de la protéine TAT1 dans les infertilités masculines humaines, nous avons réalisé des immunodétections de la protéine TAT1 sur des frottis de spermatozoïdes de sujets asthénozoospermiques. Le criblage d'une cohorte de 75 sujets a permis d'isoler un patient présentant une asthénozoospermie modérée associée à une absence de marquage TAXI à l'annulus. Par microscopie électronique à transmission, nous avons observé l'absence complète de l'annulus et une disjonction PI/PP. Ces résultats inédits suggèrent que chez l'homme comme chez la souris, l'intégrité de l'annulus conditionne la mobilité et la différenciation flagellaire des spermatozoïdes. Finalement, afin de déterminer si le rôle de la protéine Tatl dans le contrôle de la mobilité du spermatozoïde fait intervenir son activité de transport anionique, j'ai crée deux mutants ponctuels de la protéine TAT1 (D95N et G218V); ces mutations précédemment décrites dans la littérature abolissent l'activité de transport des protéines SLC26 mais préservent leur adressage à la membrane plasmique. In vitro, y ai vérifié que les mutants TAT1 D95N et TAT1 G218V présentent une expression quantitativement normale et un adressage correct à la membrane plasmique des cellules COS. Si comme attendu, ces mutations induisent, in vitro, une perte de l'activité de transport d'anions, elles seront introduites (de manière indépendante) dans le gène Tatl murin pour la création de modèles d'étude de type « Knock in »
We have previously identified TAT1/SLC26A8 as a potential target of Rho GTPases, exclusively expressed in human adult testis. TAT1 is a member of the SLC26 family and we have shown that TAT1 is located at the plasma membrane of germ cells at spermatocyte/spermatid stages and exhibits a transport activity towards sulfate and chloride anions. During my thesis, I characterized the phenotype of mice with a targeted disruption of Tat gene (knock out) and showed that Tatl protein is essential for sperm flagella differentiation and motility. Hence, Tat1-/- males are sterile due to severe asthenozoospermia and structural defects of the spermatozoa. Tatr spermatozoa display an atrophia of the annulus (the ring shape structure connecting the midpiece to the principal piece), a midpiece-principal piece disjunction and hairpin-like bending of the flagella leading to the disruption of the axonemal structure. In addition, we observed that Tat1-/- spermatozoa do not display the phosphorylation profile required for sperm capacitation. According to this phenotype, we showed that TAT1 is also expressed in mature sperm where it is specifically localized at the annulus. In order to investigate the implication of TAT1 in human asthenozoospermia, we performed imunodetection of TAT1 on sperm smear preparations from a cohort of 75 asthenozoospermic subjects. We identified one patient with a moderate asthenozoospermia associated with the absence of TAT1 staining at the annulus. By transmission electron miscroscopy, we observed complete lack of the annulus and midpiece-principal piece disjunction in spermatozoa from the patient. This case, so far unique, suggests that in human the integrity of the annulus is also required for proper sperm motility and flagella differentiation. Finally, in order to address the role of TAT1 anion transport activity in the control of sperm motility and capacitation, I generated two mutants (D95N and G218V) in TAT1 sequence, based on published data concerning mutations in SLC26 proteins that abolish transport activity without affecting plasma membrane localization. I analyzed these mutants, in vitro, and showed normal expression level and proper localization of the proteins at plasma membrane of COS cells. If, as we expect, these mutations inhibit TAT1 transport activity in vitro, we will proceed to their introduction into the murine Tatl gene in order to generate « knock in » mouse models

La dégradation des fonctions de reproduction masculine dans les dernières décennies, et par suite, la baisse du taux de fertilité chez l'homme a renforcé les démarches de recherche des causes d'infertilité masculine, qu'elles soient génétiques, ou environnementales, mettant en œuvre les perturbateurs endocriniens ou d'autres produits reprotoxiques. Par ailleurs, les traitements palliatifs tels que l'aide médicale à la procréation ne permettent qu'à 1 couple sur deux d'obtenir une grossesse. La recherche vise donc également à définir de nouvelles pistes d'amélioration de ces techniques. Les phospholipases A2 (PLA2) sont des enzymes abondamment exprimées dans les organes reproducteurs mâles, le sperme éjaculé et dans le tractus génital femelle. Elles jouent des rôles importants dans la capacitation, la réaction acrosomique (RA) et la fécondation. Nous avons montré au laboratoire que la PLA2 murine secrétée de groupe X (mGX) est présente dans l'acrosome des spermatozoïdes de souris. Elle est libérée au cours de la RA et s'avère un inducteur puissant de la RA. Les mécanismes permettant ces effets sont encore mal connus. Par l'utilisation d'inducteurs et d'inhibiteurs des PLA2, sur des modèles murins wild type ou KO pour certaines PLA2, ce travail montre que durant la capacitation, l'activation des iPLA2 β permet de déclencher une RA spontanée dans une sous-population spécifique de spermatozoïdes. Au cours de la RA induite par la progestérone (P4), On a pu aussi valoriser le rôle des iPLA2 β qui initie la cascade de la RA et permet que les sPLA2 soient activées pour amplifier le déroulement de la réaction acrosomique. Par ailleurs, ce travail montre que l'effet de mGX sur le taux de fécondation et de développement embryonnaire ne dépend pas du taux de la RA. Cet effet obtenu grâce à mGX n'est pas observé avec d'autres sPLA2 (murine ou humaine), ni avec la P4 ce qui lui confère une propriété espèce dépendante
For the last ten years, the impairment of the male reproductive functions has highly increased, while the use of assisted reproductive techniques has also increased. Despite this evolution, the pregnancy rates obtained in in vitro fertilization (IVF) remain low, as only one in two couples will obtain a pregnancy after 4 attempts. Research has to discover new ways to gain in reproductive impact. Hence, many studies have recently been developed to test molecules that could improve the IVF results. Phospholipases A2 (PLA2s) are part of these molecules. They play an important role, because of their abundant expression in: male reproductive organs, in ejaculated sperm and in the female tract. Several studies have suggested a role for members of the secreted phospholipase A2 family in capacitation, acrosome reaction (AR), and fertilization. We demonstrated previously that sperm from mGX knock-out mice had a severely impaired fertilization potential in vitro, but the molecular nature of these enzymes and their specific functions have remained elusive. Our aims were to study the mechanism of the acrosome reaction by focusing on different kinds of PLA2 using inhibitors and knockout mice for each type of PLA2. We demonstrate the importance of iPLA2β in spontaneous AR occurring during capacitation. We also show that iPLA2β and sPLA2 of group X are both involved in progesterone (P4)-induced AR in mouse sperm. In addition we show that in the mouse neither P4 nor any of the other sPLA2s tested are able to mimic the IVF improvement obtained with mGX-treatment. We also demonstrate that this improvement obtained with phospholipase A2 murine group X is not dependent on the rate of AR. These results demonstrate that sPLA2s are not commutable in the context of mouse sperm fertility, indicating that group X sPLA2 is unique to improve fertility outcome

La baisse de la fertilité masculine mondiale ces dernières décennies est devenue préoccupante. Ainsi, un homme sur quinze est subfertile. Si les causes de la baisse de fertilité semblent être essentiellement liés à l'environnement et au mode de vie, il est essentiel de comprendre tous les mécanismes qui régulent le pouvoir fécondant du spermatozoïde afin d'optimiser les techniques de procréation médicalement assistée. Le développement de nouveaux axes de recherche, expérimentaux et théoriques, pour identifier les mécanismes sous-jacents de l'infertilité masculine est indispensable. C'est dans ce contexte, de développement de nouvelles stratégies expérimentales que se situe ce travail de thèse. La stratégie que j'ai employée ici est la recherche de nouveaux outils pharmacologiques à partir de venin d'animaux par des tests d'activités biologiques. Cette recherche nous a permis de mettre en évidence une nouvelle voie de régulation de la physiologie spermatique : la voie des phospholipases A2 secrétées. Ainsi, nous avons montré pour la première fois que les phospholipases A2 secrétées, régulent 4 étapes clé de la fécondation : la capacitation, la mobilité spermatique, la réaction acrosomique et l'interaction gamétique.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.
Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.