Academic literature on the topic 'Cassures double brin de l'ADN'

L’avènement des nucléases programmables, et de CRISPR-Cas9 en particulier, constitue une réelle rupture technologique dans le domaine de l’ingénierie génétique. Le principe de ces méthodes est relativement simple. Il consiste en premier lieu à générer des cassures double-brin au niveau de régions très précises d’une séquence cible (ADN d’une cellule somatique, germinale, embryonnaire, iPS...). Ces cassures sont ensuite réparées par des mécanismes cellulaires pouvant conduire à l’inactivation des régions modifiées (knock-out, ou KO), ou à l’insertion, par recombinaison homologue, d’un fragment de séquence modèle apporté à la cellule (knock-in, ou KI). Les domaines d’application de ces techniques sont très nombreux : recherche fondamentale, thérapie génique, ingénierie écologique, biotechnologies industrielles, agriculture, etc. Elles ont d’ores et déjà été utilisées à de multiples reprises dans les espèces animales d’élevage. Des exemples d’applications visant à améliorer la santé des animaux (induction de résistances pour des maladies infectieuses à fort impact économique, et/ou à fort potentiel zoonotique), à éviter des pratiques d’élevage compromettant le bien-être animal (écornage, élimination systématique de poussins mâles), ou à modifier les produits (lait, œufs, viande) dans le but d’améliorer leur valeur santé (réduction des allergies), ou nutritionnelle, sont présentés. Le déploiement de ces méthodes soulève de multiples questions (techniques, réglementaires, économiques, éthiques...) qui sont discutées.

La réparation des cassures double brin de l'ADN (CDBs) est critique pour la survie cellulaire. Les deux voies principales qui assurent la réparation des CDBs chez les eucaryotes, le end-joining (EJ) et, à un moindre degré, la recombinaison homologue (RH), peuvent être mutagènes. Le but de mon travail de thèse a été de déterminer si certaines conditions de stress peuvent affecter l'équilibre efficacité versus fidélité de la réparation des cellules souches embryonnaires (ES) murines. Dans une première étude, nous avons examiné si deux CDBs colinéaires induites par la méganucléase I-Scel, à 9 kpb de distance, dans des régions non-homologues, peuvent provoquer des réarrangements génomiques par EJ. Parallèlement, nous avons développé un système d'étude de réparation des CDBs à l'aide de substrats extra-chromosomiques. Les CDBs sont mimées par des plasmides linéarisés in vitro avant leur transfection dans les cellules ES, plasmides qui peuvent être réparés par EJ ou par RH avec un plasmide portant une séquence homologue. Nous avons analysé les effets d'un stress (privation de sérum) qui bloque la prolifération des cellules ES, sur la contribution de chaque mécanisme de réparation, EJ et RH, et la « fidélité » de réparation de chacun. Nos systèmes ne nous ont pas permis de mesurer de façon précise les fréquences de RH et de EJ. Ils nous ont toutefois permis de montrer que dans des situations de stress qui conduisent à l'apparition de CDBs, la fidélité de la réparation peut ne pas être affectée
Repair of DNA double-strand breaks (DSBs) is critical for cell survival. However, both DSBs repair mechanisms, end-joining (EJ) and, to a lesser extent, homologous recombination (HR), can be mutagenic. The aim of my thesis work was to determine whether specific stress conditions can affect the balance between efficiency and fidelity of DSBs repair in murine embryonic stem cells (ES). In a fîrst study, we investigated whether two colinear DSBs induced by the méganuclease l-Scel 9 kbp apart, in two non-homologous regions, can trigger genomic rearrangements by end-joining. In a second study, we have developed a strategy based on plasmids recombination. Linear plasmids, used to mimic DSBs, are transfected in ES cells where they are repaired by EJ or HR with a plasmid sharing a homologous region. We analysed the effects of a growth-limiting stress (serum starvation) on the respective contributions of NHEJ and HR, and their fidelity. The Systems did not allow us to precisely determine the NHEJ and HR frequencies. However, our studies showed that in stress conditions induced by multiple DSBs, repair fidelity can be increased

Les mitochondries sont des organites qui possèdent leur propre ADN (ADNmt), codant pour des gènes de la chaine respiratoire. La réparation des dommages dus aux ROS, une réplication défectueuse ou d’autres sources exogènes tels des agents chimiothérapeutiques ou des irradiations ionisantes peuvent générer des cassures double-brin (CDB) de l’ADNmt. L’ADNmt code pour des protéines essentielles à la production d’énergie, et des systèmes de maintenance de l’intégrité de ce génome efficaces sont donc nécessaires pour la viabilité des cellules. En effet des mutations de l’ADNmt sont présentes dans de nombreuses pathologies comme les myopathies mitochondriales, les cancers et les maladies neurodégénératives. Cependant les processus responsables de la maintenance de l’ADNmt suite à des CDB restent controversés.Pour élucider les mécanismes impliqués, nous avons généré des CDB mitochondriales en utilisant une lignée cellulaire humaine exprimant de manière inductible l’enzyme de restriction PstI liée à une séquence d’adressage mitochondrial. Nos résultats montrent, dans notre système, une première phase de dégradation de l’ADNmt lésé avec une cinétique rapide, n’impliquant pas l’autophagie ou l’apoptose, suivie de la ré-amplification d’ADNmt intact dans un deuxième temps. Contrairement à d’autres études nous n’avons pas pu détecter d’évènements de réparation des CDB mitochondriales générées. Nous avons ensuite cherché à identifier les protéines impliquées dans la dégradation de l’ADNmt lésé que nous observons, mais aucune nucléase testée ne semble responsable de ce processus. Des approches plus globales sont mises au point pour identifier de nouveaux acteurs, notamment un crible RNAi à grande échelle. Parallèlement nous nous intéressons aussi à une famille de phosphohydrolases, les Nudix, et à leur rôle protecteur en assainissant le réservoir de nucléotides libres
Mitochondria are organelles that possess their own genome, the mitochondrial DNA (mtDNA). Repair of oxidative damages, defective replication, or various exogenous sources, such as chemotherapeutic agents or ionizing radiations, can generate double-strand breaks (DSBs) in mtDNA. MtDNA encodes for essential proteins involved in ATP production and maintenance of integrity of this genome is thus of crucial importance. Mutations in mtDNA are indeed found in numerous pathologies such as mitochondrial myopathies, neurodegenerative disorders or cancers. However, the mechanisms involved in mtDNA maintenance after DSBs remain unknown.To elucidate this question, we have generated mtDNA DSBs using a human inducible cell system expressing the restriction enzyme PstI targeted to mitochondria. Using this system, we could not find any support for DSBs repair of mtDNA. Instead we observed a loss of the damaged mtDNA molecules and a severe decrease in mtDNA content, followed by reamplification of intact mtDNA molecules. We have demonstrated that none of the known mitochondrial nucleases are involved in mtDNA degradation and that DNA loss is not due to autophagy, mitophagy or apoptosis but to a selective mechanism. Our study suggests that a still uncharacterized pathway for the targeted degradation of damaged mtDNA in a mitophagy/autophagy-independent manner is present in mitochondria, and might provide the main mechanism used by the cells to deal with DSBs. Global approaches are ongoing to identify proteins involved in degradation of damaged mtDNA following DSBs, mainly an RNAi screen targeting 80 nucleases. In parallel we are interested in a family of phosphohydrolases named Nudix and their putative protective role in sanitizing the nucleotides pool in mitochondria

Au cours des deux divisions successives de meiose, la segregation ordonnee des chromosomes d'une cellule diploide permet la formation de cellules haploides. Dans la premiere partie de ce manuscrit, les differents mecanismes assurant la disjonction des chromosomes homologues lors de la premiere division sont decrits, en soulignant le role important de la recombinaison meiotique dans saccharomyces cerevisiae et d'autres organismes eucaryotes. L'etude de points chauds de recombinaison meiotique a permis de montrer chez s. Cerevisiae que des cassures double-brin (cdbs) transitoires formees dans des regions preferentielles sont a l'origine des evenements de recombinaison. La seconde partie de l'introduction est consacree au mecanisme de la recombinaison meiotique dans la levure s. Cerevisiae, particulierement aux elements qui controlent la formation des cdbs meiotiques. Au cours de ce travail, nous avons determine la distribution (positions et frequences) des cdbs meiotiques sur l'ensemble du chromosome iii (340 kilobases), montrant son caractere non aleatoire. Tout d'abord, la grande majorite de ces cdbs est localisee dans un intervalle intergenique contenant un promoteur de transcription. Par ailleurs, la distribution globale des cdbs a l'echelle du chromosome revele une organisation en domaines de plusieurs dizaines de kilobases : deux domaines (un sur chaque bras chromosomique) contiennent l'essentiel des cassures du chromosome, tandis que trois domaines n'ont pratiquement pas de cdbs. L'etude de la manipulation de grands fragments chromosomiques semble indiquer que la formation de ces domaines chauds ou froid pour la formation de cdbs est une propriete intrinseque de leur sequence, qui permet de definir un niveau d'organisation du chromosome dont la nature n'est pas connue. La comparaison entre la carte genetique et la distribution des cdbs sur le chromosome iii corrobore l'hypothese d'une initiation de la majorite des evenements de recombinaison par ces cdbs.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.
Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r

Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactéries
Ionizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria

La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé
The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation

L'objectif de mon travail de thèse a été de mieux comprendre le rôle des gènes BRCA (prédisposition familiale aux cancers du sein) et FANC (anémie de Fanconi) dans la gestion des cassures double brin de l'ADN (CDB). La progression du cycle cellulaire en présence de CDB et le recrutement des protéines impliquées dans la gestion de ces lésions ont été étudiées dans les cellules humaines. J'ai montré que la présence d'un seul allèle muté de BRCA1 abolit le blocage de la réplication de l'ADN en présence de CDB et réduit / ralenti le recrutement aux sites des dommages de certains protéines majeurs de la réponse cellullaire à ces lésions. La diminution importante de la quantité de la protéine BRCA1 sauvage présente dans les cellules hétérozygotes pour BRCA1 après exposition aux radiations ionisantes, pourrait être à l'origine de ces anomalies. Au contraire, dans les cellules BRCA2 +/- et BRCA2 -/-/FANCD, en présence de CDB, le blocage de la progression du cycle cellulaire s'effectue normalement
The aim of my thesis work was to better understand the role of BRCA and FANC genes, respectively implicated in familial breast and ovarian cancers and in Fanconi anemia (predisposing to leukaemia), in cellular response to DNA double strand breaks (DSB). The cell cycle progression in the presence of DSB and the recruitment of poteins involved in the processing of these lesions were studied. We demonstrated that a single mutated BRCA1 allele is sufficient to abrogate the intra S-phase checkpoint in the presence of DSB, and to impair the recruitment at sites of lesions of key proteins involved in DNA damage response. The severe reduction of the overall BRCA1 protein level observed in ionizing radiation-treated BRCA1 heterozygogous cells may be at origin of the observed defects. In contrast, in BRCA2 +/- and BRCA2 -/-/ FANCD1cells, the arrest of cell cycle progression is fully efficient in response to DSB

La réparation des cassures double-brin de l'ADN (DSB) est essentielle pour préserver l'intégrité du génome. Suite à l'apparition de DSB dans le génome, la PI3K kinase ATM permet la phosphorylation du variant d'histone H2AX sur un large domaine chromatinien de l'ordre du mégabase, qui constituera ainsi un foyer de réparation. La façon dont ces foyers sont assemblés aussi rapidement pour établir un environnement nucléaire favorable à la réparation n'est pas encore connue. Les TAD (Topologically Associated Domains) correspondent à des régions chromatiniennes organisées en 3D dans le noyau et sont déjà connus comme étant impliqués dans des processus cellulaires tels que la transcription ou la réplication. Cependant leur rôle dans la réparation de l'ADN n'est pas encore connu à ce jour. Nous avons ainsi pu montrer que les TAD sont des unités fonctionnelles de la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN puisqu'ils servent de matrice à la formation des foyers de réparation. En effet, nous avons montré que la phosphorylation de H2AX sur un TAD entier est permise grâce à un processus d'extrusion de boucle de chromatine dépendant des cohésines et ayant lieu de part et d'autre de chaque DSB. Ces travaux ont permis de montrer le rôle majeur de la conformation des chromosomes dans la maintenance de l'intégrité du génome tout en mettant en évidence pour la première fois un exemple de modification de la chromatine grâce au processus d'extrusion de boucle de chromatine. D'autre part, nous avons montré que les TAD du génome entier sont renforcés en réponse aux DSB et jouent un rôle majeur dans la répression transcriptionnelle qui a lieu en cis des DSB. Enfin, nous avons démontré que des TAD entiers contenant une DSB sont capables de se déplacer au sein du noyau pour se regrouper entre eux en G1. De façon importante, nous avons montré que ce regroupement des TAD endommagés peut conduire à la formation de translocations, évènement pouvant mener à l'apparition de cancers
DNA Double-Strand Breaks (DSBs) repair is essential to safeguard genome integrity. Upon DSBs, the ATM PI3K kinase rapidly triggers the establishment of a megabase-sized, ƴH2AXdecorated chromatin domains which further act as seeds for the formation of DNA Damage Response (DDR) foci. How these foci are rapidly assembled in order to establish a "repairprone" environment within the nucleus is yet unclear. Topologically Associating Domains (TADs) are a key feature of 3D genome organization that regulate transcription and replication, but little is known about their contribution to DNA repair processes. We found that TADs are functional units of the DDR, instrumental for the correct establishment of ƴH2AX/53BP1 chromatin domains in a manner that involves cohesin-mediated loop extrusion on both sides of the DSB. Indeed, we showed that H2AX-containing nucleosomes are rapidly phosphorylated as they actively pass by DSB-anchored cohesin. This work highlights the critical impact of chromosome conformation in the maintenance of genome integrity and provides the first example of a chromatin modification established by loop extrusion. In another hand, we found that TADs of the wole genome are reinforced following DSB induction and that TADs play a major role in the down-regulation of the transcription which takes place in cis of DSBs. Finally, we found that damaged-TADs can move across the nucleus to cluster together in the G1 phase of the cell cycle. We also found that damaged-TADs clustering can lead to the formation of translocations, which are often at the origin of cancers

Les gènes BRCA et FANC, impliqués respectivement dans la prédisposition familiale au cancer du sein et dans l'anémie de Fanconi, font partie des gènes suppresseurs de tumeurs de type " caretakers " et jouent un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome. Ces gènes sont étroitement associés et pourraient participer dans une voie métabolique commune. L'objectif de mon travail de thèse à été de mieux comprendre leur rôle dans la réparation des cassures double brin de l'ADN (CDB) chez l'Homme. En utilisant des approches moléculaires basées sur l'utilisation de substrats extrachromosomiques ou intégrés dans le génome, porteurs de CDB-modèles, nous avons examiné l'impact de l'inactivation de ces gènes, par ARN interférant, sur le fonctionnement des deux voies majeures de réparation des CDB : la voie End-Joining (EJ) et la Recombinaison Homologue (RH). Nous avons montré que : (i) la déplétion de BRCA1 affecte sévèrement le processus EJ ; (ii) le lien moléculaire entre BRCA1 et cette voie de réparation est l'association de BRCA1 avec XRCC4, l'un des acteurs principaux de ce mécanisme : (iii) les produits des gènes FANCF et FANCG, appartenant au core complexe FANC, contrôlent la voie EJ, mais ne sont pas impliqués dans la RH ; (iv) FANCJ et FANCD1/BRCA2, dont l'action se situe en aval du complexe FANC (comme BRCA1), contrôlent la RH. En conclusion, l'ensemble des résultats montre que la voie BRCA/FANC intervient dans la réparation des CDB et suggère une spécialisation fine des gènes qui y participent
The BRCA and FANC genes (respectively implicated in breast cancer predisposition and in Fanconi anemia) are classified as “caretakers” tumor suppressor genes and are involved in the maintenance of genomic stability. These genes are tightly associated and could participate in a common pathway. The aim of my thesis work was to improve our understanding of there function in the DNA double strand break (DSB) repair in Human cells. By using molecular approaches based on intra- or extra- chromosomal substrates, carrying model-DSB, we studied the impact of siRNA mediated depletion of these factors on the two major DSB repair pathways in mammalian cells: End-joining (EJ) and Homologous Recombination (HR). We have shown that: (i) BRCA1 depletion severely impairs the EJ pathway, (ii) the novel interaction between BRCA1 and XRCC4 (a key actor of EJ), constitutes a molecular and functional link between BRCA1 and this repair pathway; (iii) depletion of the Fanconi genes products FANCF and FANCG, which belong to the core complex, leads to an impairment of EJ but does not affect HR; (iv) FANCJ and FANCD1/BRCA2 which act downstream of the complex, control HR. On conclusion, our work shows that the BRCA/FANC pathway is implicated in DSB repair, and suggests a tight specialisation of each gene

La protection des extrémités des chromosomes eucaryotes est vitale pour la stabilité du génome. Chez les mammifères, le complexe Shelterine est responsable de cette protection car il inhibe la réponse aux cassures double brin et les machineries de réparation. Ce chapitre explore les caractéristiques structurales et biochimiques de ce complexe et le rôle de ses divers composants.