Dissertations / Theses: 'Cassures double brin de l'ADN'

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Foray, Nicolas. "Cassures double brin de l'adn, cassures chromosomiques et radiosensibilite des cellules humaines." Paris 11, 1997. http://www.theses.fr/1997PA11T021.

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Boubakour-Azzouz, Imenne. "Réparation des cassures double brin de l'ADN et stabilité génomique dans les cellules de mammifères." Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077221.

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Abstract:

La réparation des cassures double brin de l'ADN (CDBs) est critique pour la survie cellulaire. Les deux voies principales qui assurent la réparation des CDBs chez les eucaryotes, le end-joining (EJ) et, à un moindre degré, la recombinaison homologue (RH), peuvent être mutagènes. Le but de mon travail de thèse a été de déterminer si certaines conditions de stress peuvent affecter l'équilibre efficacité versus fidélité de la réparation des cellules souches embryonnaires (ES) murines. Dans une première étude, nous avons examiné si deux CDBs colinéaires induites par la méganucléase I-Scel, à 9 kpb de distance, dans des régions non-homologues, peuvent provoquer des réarrangements génomiques par EJ. Parallèlement, nous avons développé un système d'étude de réparation des CDBs à l'aide de substrats extra-chromosomiques. Les CDBs sont mimées par des plasmides linéarisés in vitro avant leur transfection dans les cellules ES, plasmides qui peuvent être réparés par EJ ou par RH avec un plasmide portant une séquence homologue. Nous avons analysé les effets d'un stress (privation de sérum) qui bloque la prolifération des cellules ES, sur la contribution de chaque mécanisme de réparation, EJ et RH, et la « fidélité » de réparation de chacun. Nos systèmes ne nous ont pas permis de mesurer de façon précise les fréquences de RH et de EJ. Ils nous ont toutefois permis de montrer que dans des situations de stress qui conduisent à l'apparition de CDBs, la fidélité de la réparation peut ne pas être affectée
Repair of DNA double-strand breaks (DSBs) is critical for cell survival. However, both DSBs repair mechanisms, end-joining (EJ) and, to a lesser extent, homologous recombination (HR), can be mutagenic. The aim of my thesis work was to determine whether specific stress conditions can affect the balance between efficiency and fidelity of DSBs repair in murine embryonic stem cells (ES). In a fîrst study, we investigated whether two colinear DSBs induced by the méganuclease l-Scel 9 kbp apart, in two non-homologous regions, can trigger genomic rearrangements by end-joining. In a second study, we have developed a strategy based on plasmids recombination. Linear plasmids, used to mimic DSBs, are transfected in ES cells where they are repaired by EJ or HR with a plasmid sharing a homologous region. We analysed the effects of a growth-limiting stress (serum starvation) on the respective contributions of NHEJ and HR, and their fidelity. The Systems did not allow us to precisely determine the NHEJ and HR frequencies. However, our studies showed that in stress conditions induced by multiple DSBs, repair fidelity can be increased

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Moretton, Amandine. "Mécanismes de maintenance de l'intégrité de l'ADN mitochondrial humain suite à des cassures double-brin." Thesis, Université Clermont Auvergne‎ (2017-2020), 2017. http://www.theses.fr/2017CLFAC047/document.

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Abstract:

Les mitochondries sont des organites qui possèdent leur propre ADN (ADNmt), codant pour des gènes de la chaine respiratoire. La réparation des dommages dus aux ROS, une réplication défectueuse ou d’autres sources exogènes tels des agents chimiothérapeutiques ou des irradiations ionisantes peuvent générer des cassures double-brin (CDB) de l’ADNmt. L’ADNmt code pour des protéines essentielles à la production d’énergie, et des systèmes de maintenance de l’intégrité de ce génome efficaces sont donc nécessaires pour la viabilité des cellules. En effet des mutations de l’ADNmt sont présentes dans de nombreuses pathologies comme les myopathies mitochondriales, les cancers et les maladies neurodégénératives. Cependant les processus responsables de la maintenance de l’ADNmt suite à des CDB restent controversés.Pour élucider les mécanismes impliqués, nous avons généré des CDB mitochondriales en utilisant une lignée cellulaire humaine exprimant de manière inductible l’enzyme de restriction PstI liée à une séquence d’adressage mitochondrial. Nos résultats montrent, dans notre système, une première phase de dégradation de l’ADNmt lésé avec une cinétique rapide, n’impliquant pas l’autophagie ou l’apoptose, suivie de la ré-amplification d’ADNmt intact dans un deuxième temps. Contrairement à d’autres études nous n’avons pas pu détecter d’évènements de réparation des CDB mitochondriales générées. Nous avons ensuite cherché à identifier les protéines impliquées dans la dégradation de l’ADNmt lésé que nous observons, mais aucune nucléase testée ne semble responsable de ce processus. Des approches plus globales sont mises au point pour identifier de nouveaux acteurs, notamment un crible RNAi à grande échelle. Parallèlement nous nous intéressons aussi à une famille de phosphohydrolases, les Nudix, et à leur rôle protecteur en assainissant le réservoir de nucléotides libres
Mitochondria are organelles that possess their own genome, the mitochondrial DNA (mtDNA). Repair of oxidative damages, defective replication, or various exogenous sources, such as chemotherapeutic agents or ionizing radiations, can generate double-strand breaks (DSBs) in mtDNA. MtDNA encodes for essential proteins involved in ATP production and maintenance of integrity of this genome is thus of crucial importance. Mutations in mtDNA are indeed found in numerous pathologies such as mitochondrial myopathies, neurodegenerative disorders or cancers. However, the mechanisms involved in mtDNA maintenance after DSBs remain unknown.To elucidate this question, we have generated mtDNA DSBs using a human inducible cell system expressing the restriction enzyme PstI targeted to mitochondria. Using this system, we could not find any support for DSBs repair of mtDNA. Instead we observed a loss of the damaged mtDNA molecules and a severe decrease in mtDNA content, followed by reamplification of intact mtDNA molecules. We have demonstrated that none of the known mitochondrial nucleases are involved in mtDNA degradation and that DNA loss is not due to autophagy, mitophagy or apoptosis but to a selective mechanism. Our study suggests that a still uncharacterized pathway for the targeted degradation of damaged mtDNA in a mitophagy/autophagy-independent manner is present in mitochondria, and might provide the main mechanism used by the cells to deal with DSBs. Global approaches are ongoing to identify proteins involved in degradation of damaged mtDNA following DSBs, mainly an RNAi screen targeting 80 nucleases. In parallel we are interested in a family of phosphohydrolases named Nudix and their putative protective role in sanitizing the nucleotides pool in mitochondria

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Baudat, Frédéric. "Distribution des cassures double-brin meiotiques de l'adn sur le chromosome iii de saccharomyces cerevisiae." Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA112020.

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Abstract:

Au cours des deux divisions successives de meiose, la segregation ordonnee des chromosomes d'une cellule diploide permet la formation de cellules haploides. Dans la premiere partie de ce manuscrit, les differents mecanismes assurant la disjonction des chromosomes homologues lors de la premiere division sont decrits, en soulignant le role important de la recombinaison meiotique dans saccharomyces cerevisiae et d'autres organismes eucaryotes. L'etude de points chauds de recombinaison meiotique a permis de montrer chez s. Cerevisiae que des cassures double-brin (cdbs) transitoires formees dans des regions preferentielles sont a l'origine des evenements de recombinaison. La seconde partie de l'introduction est consacree au mecanisme de la recombinaison meiotique dans la levure s. Cerevisiae, particulierement aux elements qui controlent la formation des cdbs meiotiques. Au cours de ce travail, nous avons determine la distribution (positions et frequences) des cdbs meiotiques sur l'ensemble du chromosome iii (340 kilobases), montrant son caractere non aleatoire. Tout d'abord, la grande majorite de ces cdbs est localisee dans un intervalle intergenique contenant un promoteur de transcription. Par ailleurs, la distribution globale des cdbs a l'echelle du chromosome revele une organisation en domaines de plusieurs dizaines de kilobases : deux domaines (un sur chaque bras chromosomique) contiennent l'essentiel des cassures du chromosome, tandis que trois domaines n'ont pratiquement pas de cdbs. L'etude de la manipulation de grands fragments chromosomiques semble indiquer que la formation de ces domaines chauds ou froid pour la formation de cdbs est une propriete intrinseque de leur sequence, qui permet de definir un niveau d'organisation du chromosome dont la nature n'est pas connue. La comparaison entre la carte genetique et la distribution des cdbs sur le chromosome iii corrobore l'hypothese d'une initiation de la majorite des evenements de recombinaison par ces cdbs.

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Buisson, Rémi. "Rôles du suppresseur de tumeurs PALB2 dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN." Doctoral thesis, Université Laval, 2012. http://hdl.handle.net/20.500.11794/25970.

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Abstract:

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.
Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r

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Hoff, Grégory. "Réparation des cassures double-brin et variabilité chromosomique chez Streptomyces." Thesis, Université de Lorraine, 2016. http://www.theses.fr/2016LORR0288/document.

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Abstract:

Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactéries
Ionizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria

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Landmann, Cedric. "Rôles et régulations de Polo et BubR1 sur les cassures double-‐brin de l'ADN en mitose." Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0852/document.

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Abstract:

La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé
The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation

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Jacquemont, Céline. "Rôle des gènes BRCA et FANC dans la réponse cellulaire aux cassures double brin de l'ADN." Paris 5, 2004. http://www.theses.fr/2004PA05N01S.

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Abstract:

L'objectif de mon travail de thèse a été de mieux comprendre le rôle des gènes BRCA (prédisposition familiale aux cancers du sein) et FANC (anémie de Fanconi) dans la gestion des cassures double brin de l'ADN (CDB). La progression du cycle cellulaire en présence de CDB et le recrutement des protéines impliquées dans la gestion de ces lésions ont été étudiées dans les cellules humaines. J'ai montré que la présence d'un seul allèle muté de BRCA1 abolit le blocage de la réplication de l'ADN en présence de CDB et réduit / ralenti le recrutement aux sites des dommages de certains protéines majeurs de la réponse cellullaire à ces lésions. La diminution importante de la quantité de la protéine BRCA1 sauvage présente dans les cellules hétérozygotes pour BRCA1 après exposition aux radiations ionisantes, pourrait être à l'origine de ces anomalies. Au contraire, dans les cellules BRCA2 +/- et BRCA2 -/-/FANCD, en présence de CDB, le blocage de la progression du cycle cellulaire s'effectue normalement
The aim of my thesis work was to better understand the role of BRCA and FANC genes, respectively implicated in familial breast and ovarian cancers and in Fanconi anemia (predisposing to leukaemia), in cellular response to DNA double strand breaks (DSB). The cell cycle progression in the presence of DSB and the recruitment of poteins involved in the processing of these lesions were studied. We demonstrated that a single mutated BRCA1 allele is sufficient to abrogate the intra S-phase checkpoint in the presence of DSB, and to impair the recruitment at sites of lesions of key proteins involved in DNA damage response. The severe reduction of the overall BRCA1 protein level observed in ionizing radiation-treated BRCA1 heterozygogous cells may be at origin of the observed defects. In contrast, in BRCA2 +/- and BRCA2 -/-/ FANCD1cells, the arrest of cell cycle progression is fully efficient in response to DSB

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Arnould, Coline. "Rôle de l'organisation 3D de la chromatine dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN." Thesis, Toulouse 3, 2020. http://www.theses.fr/2020TOU30141.

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Abstract:

La réparation des cassures double-brin de l'ADN (DSB) est essentielle pour préserver l'intégrité du génome. Suite à l'apparition de DSB dans le génome, la PI3K kinase ATM permet la phosphorylation du variant d'histone H2AX sur un large domaine chromatinien de l'ordre du mégabase, qui constituera ainsi un foyer de réparation. La façon dont ces foyers sont assemblés aussi rapidement pour établir un environnement nucléaire favorable à la réparation n'est pas encore connue. Les TAD (Topologically Associated Domains) correspondent à des régions chromatiniennes organisées en 3D dans le noyau et sont déjà connus comme étant impliqués dans des processus cellulaires tels que la transcription ou la réplication. Cependant leur rôle dans la réparation de l'ADN n'est pas encore connu à ce jour. Nous avons ainsi pu montrer que les TAD sont des unités fonctionnelles de la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN puisqu'ils servent de matrice à la formation des foyers de réparation. En effet, nous avons montré que la phosphorylation de H2AX sur un TAD entier est permise grâce à un processus d'extrusion de boucle de chromatine dépendant des cohésines et ayant lieu de part et d'autre de chaque DSB. Ces travaux ont permis de montrer le rôle majeur de la conformation des chromosomes dans la maintenance de l'intégrité du génome tout en mettant en évidence pour la première fois un exemple de modification de la chromatine grâce au processus d'extrusion de boucle de chromatine. D'autre part, nous avons montré que les TAD du génome entier sont renforcés en réponse aux DSB et jouent un rôle majeur dans la répression transcriptionnelle qui a lieu en cis des DSB. Enfin, nous avons démontré que des TAD entiers contenant une DSB sont capables de se déplacer au sein du noyau pour se regrouper entre eux en G1. De façon importante, nous avons montré que ce regroupement des TAD endommagés peut conduire à la formation de translocations, évènement pouvant mener à l'apparition de cancers
DNA Double-Strand Breaks (DSBs) repair is essential to safeguard genome integrity. Upon DSBs, the ATM PI3K kinase rapidly triggers the establishment of a megabase-sized, ƴH2AXdecorated chromatin domains which further act as seeds for the formation of DNA Damage Response (DDR) foci. How these foci are rapidly assembled in order to establish a "repairprone" environment within the nucleus is yet unclear. Topologically Associating Domains (TADs) are a key feature of 3D genome organization that regulate transcription and replication, but little is known about their contribution to DNA repair processes. We found that TADs are functional units of the DDR, instrumental for the correct establishment of ƴH2AX/53BP1 chromatin domains in a manner that involves cohesin-mediated loop extrusion on both sides of the DSB. Indeed, we showed that H2AX-containing nucleosomes are rapidly phosphorylated as they actively pass by DSB-anchored cohesin. This work highlights the critical impact of chromosome conformation in the maintenance of genome integrity and provides the first example of a chromatin modification established by loop extrusion. In another hand, we found that TADs of the wole genome are reinforced following DSB induction and that TADs play a major role in the down-regulation of the transcription which takes place in cis of DSBs. Finally, we found that damaged-TADs can move across the nucleus to cluster together in the G1 phase of the cell cycle. We also found that damaged-TADs clustering can lead to the formation of translocations, which are often at the origin of cancers

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Saidj, Rachid. "Les gènes BRCA et FANC : implication dans la réparation des cassures double brin de l'ADN chez l'homme." Paris 5, 2006. http://www.theses.fr/2006PA05P609.

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Abstract:

Les gènes BRCA et FANC, impliqués respectivement dans la prédisposition familiale au cancer du sein et dans l'anémie de Fanconi, font partie des gènes suppresseurs de tumeurs de type " caretakers " et jouent un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome. Ces gènes sont étroitement associés et pourraient participer dans une voie métabolique commune. L'objectif de mon travail de thèse à été de mieux comprendre leur rôle dans la réparation des cassures double brin de l'ADN (CDB) chez l'Homme. En utilisant des approches moléculaires basées sur l'utilisation de substrats extrachromosomiques ou intégrés dans le génome, porteurs de CDB-modèles, nous avons examiné l'impact de l'inactivation de ces gènes, par ARN interférant, sur le fonctionnement des deux voies majeures de réparation des CDB : la voie End-Joining (EJ) et la Recombinaison Homologue (RH). Nous avons montré que : (i) la déplétion de BRCA1 affecte sévèrement le processus EJ ; (ii) le lien moléculaire entre BRCA1 et cette voie de réparation est l'association de BRCA1 avec XRCC4, l'un des acteurs principaux de ce mécanisme : (iii) les produits des gènes FANCF et FANCG, appartenant au core complexe FANC, contrôlent la voie EJ, mais ne sont pas impliqués dans la RH ; (iv) FANCJ et FANCD1/BRCA2, dont l'action se situe en aval du complexe FANC (comme BRCA1), contrôlent la RH. En conclusion, l'ensemble des résultats montre que la voie BRCA/FANC intervient dans la réparation des CDB et suggère une spécialisation fine des gènes qui y participent
The BRCA and FANC genes (respectively implicated in breast cancer predisposition and in Fanconi anemia) are classified as “caretakers” tumor suppressor genes and are involved in the maintenance of genomic stability. These genes are tightly associated and could participate in a common pathway. The aim of my thesis work was to improve our understanding of there function in the DNA double strand break (DSB) repair in Human cells. By using molecular approaches based on intra- or extra- chromosomal substrates, carrying model-DSB, we studied the impact of siRNA mediated depletion of these factors on the two major DSB repair pathways in mammalian cells: End-joining (EJ) and Homologous Recombination (HR). We have shown that: (i) BRCA1 depletion severely impairs the EJ pathway, (ii) the novel interaction between BRCA1 and XRCC4 (a key actor of EJ), constitutes a molecular and functional link between BRCA1 and this repair pathway; (iii) depletion of the Fanconi genes products FANCF and FANCG, which belong to the core complex, leads to an impairment of EJ but does not affect HR; (iv) FANCJ and FANCD1/BRCA2 which act downstream of the complex, control HR. On conclusion, our work shows that the BRCA/FANC pathway is implicated in DSB repair, and suggests a tight specialisation of each gene

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Baldeyron, Céline. "Implication des gènes BRCA et FANC dans la réparation des cassures double brin de l'ADN chez l'Homme." Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077199.

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Laulier, Corentin. "Impact des protéines de la famille Bcl-2 sur la réparation des cassures double-brin de l'ADN." Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112136.

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Abstract:

Les systèmes de réparation de l’ADN permettent le maintien de l’intégrité du génome en assurant un contrôle entre variabilité et stabilité du génome. Le stress génotoxique est un stimulus majeur du déclenchement de l’apoptose. Les cassures double brin (CDB) de l’ADN notamment sont les plus toxiques pour la cellule. Bcl-2 étant anti-apoptotique, sa surexpression rend les cellules plus résistantes aux stress génotoxiques. Nous avons ici étudié comment des cellules protégées contre l’apoptose par Bcl-2 gèrent la présence de cassures dans leur génome. Dans cette thèse, nous montrons que l’ancrage de Bcl-2 à la mitochondrie est nécessaire et suffisant pour inhiber la RH. De plus, la surexpression de Bcl-2 inhibe la formation des foci BRCA1. Confirmant l’hypothèse que cette diminution des foci BRCA1 est liée à l’inhibition de la RH, l’ancrage de Bcl-2 à la membrane mitochondriale est également suffisant pour inhiber l’induction des foci BRCA1. En revanche, une surexpression de BRCA1 permet de compenser l’inhibition de RH par Bcl-2. Une analyse par microscopie montre que Bcl-2 induit une localisation anormale de BRCA1. Nous montrons aussi que Bcl-2 affecte la réparation des CDB par NHEJ (Non-Homologous-End-Joining). Enfin, nous avons confirmé les effets de Bcl-2 sur la réparation des cassures double brins dans des lignées de lymphomes B présentant une surexpression de Bcl-2. Les protéines de la famille Bcl-2 ayant des effets antagonistes sur la régulation de l’apoptose, nous avons tenté de déterminer si cet antagonisme entre membre pro et anti-apoptotiques existe également pour la régulation de la RH. L’expression de protéines pro-apoptotiques telles que Bax ou Bid inhibe la RH induite par une CDB. Ce travail montre que contrairement à l’antagonisme qui existe entre les membres de la famille Bcl-2 pour la régulation de l’apoptose, la surexpression de membres aussi bien pro qu’anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 inhibe la RH
In addition to the canonical anti-apoptotic role of Bcl-2, there is also accumulating evidence showing that it has a negative impact on genome stability. In this thesis, we show that Bcl-2 family members, including the only-BH3 Bid protein, inhibit homologous recombination (HR) independently of their role in apoptosis. We show that while the BH3 domain of Bcl-2 is not required for HR repression, its transmembrane (TM) domain is essential for this process. We further show that recombinant Bcl-2 bearing a specific mitochondrial anchoring TM, but not a reticulum endoplasmic anchoring TM, causes full HR repression. Consistently, only HR-repressing Bcl-2 forms impair the foci formation of BRCA1 protein, a breast tumor suppressor essential for HR. Hence, our data uncover an important molecular end-point of the mitochondrial retrograde response that affects the maintenance of nuclear genome stability

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Eschenbrenner, Anne. "Nature des cassures de l'ADN responsables des effets biologiques des rayonnements ionisants." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066135.

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Bombarde, Oriane. "La stabilité télomérique : étude fondamentale et applications thérapeutiques." Toulouse 3, 2009. http://thesesups.ups-tlse.fr/785/.

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Abstract:

Dans la plupart des cellules somatiques, en absence de la télomérase, les extrémités des chromosomes appelées télomères, raccourcissent au cours des divisions cellulaires, jusqu'à atteindre une taille limite qui définit la capacité proliférative des cellules. La réactivation de la télomérase provoque une prolifération infinie des cellules : c'est l'immortalisation cellulaire, un processus clé de la cancérogenèse. La molécule ID3-010 présente in vitro pour les structures en G-quadruplex (se formant au niveau des télomères) une affinité 10000 fois supérieure par rapport aux duplex ADN. Malgré une bonne inhibition de la télomérase in vitro, cette molécule s'est révélée inapte à provoquer l'arrêt de prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les télomères sont peu réactifs vis à vis des mécanismes de religature de ces cassures. Le mécanisme C-NHEJ ("non-homologous end-joining" classique) est majoritairement responsable de la réparation des CDB dans les cellules humaines. Dans un 2ème projet, j'ai étudié les mécanismes d'inhibition de la C-NHEJ aux télomères. J'ai montré que l'inhibition de la C-NHEJ est basée sur une compétition entre les protéines télomériques TRF2/RAP1 et les protéines de la C-NHEJ, KU et DNA-PKcs. De façon paradoxale, ces protéines de la C-NHEJ sont nécessaires à la stabilité télomérique car leur absence conduit à des fusions dépendantes d'un mécanisme alternatif de ligation (B-NHEJ). Il est proposé un modèle de double protection des télomères contre leur ligature dans lequel les protéines TRF2/RAP1 inhibent la C-NHEJ via un contrôle négatif de KU et DNA-PKcs qui en retour inhibent la voie B- NHEJ
In absence of telomerase, telomere decrease during cells divisions, until a limitant length which define the proliferative capacity of cells. Reactivation of telomerase causes a infinite proliferation of cells : it's cell immortalization, a key process of cancerogenesis. ID3-010 molecule had in vitro an affinity 10000 fold high for G-quadruplex (structures formed in telomere) rather than DNA duplex. Despite of a good inhibition of telomerase in vitro, this molecule can't inhibit cancer cell proliferation. Contrary to DNA double strand break (DSB), natural extremities of telomere don't react with ligation or signalization mechanisms. C-NHEJ mechanism (classical non-homologous end-joining) repairs most of DSB in human cells. In the second project of my thesis, I study the inhibition mechanism of C-NHEJ in telomere. I show with ligation and pulldown experiment that inhibition of C-NHEJ is supported by a competition between telomeric proteins TRF2/RAP1 and C-NHEJ proteins KU and DNA-PKcs. Paradoxically, KU and DNA-PKcs are necessary to telomeric stability. Indeed, lack of this proteins causes fusions with a alternative ligation mechanism (B-NHEJ). We propose a model of double protection of telomere against ligation in which TRF2/RAP1 inhibit C-NHEJ via a negative control of KU and DNA-PKcs, themselves inhibit B-NHEJ

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Pouthier, Thomas. "Mise en évidence de cassures double brin de l'ADN induites par irradiation de kératinocytes humains en microfaisceau alpha." Phd thesis, Université Sciences et Technologies - Bordeaux I, 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00353412.

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Abstract:

Comprendre les modes d'interaction des rayonnements ionisants avec la matière vivante, notamment lors de l'exposition à de faibles doses telles que celles que l'on peut trouver dans un environnement industriel ou dans la nature, reste un enjeu majeur pour l'évaluation du risque associé. Il s'agit d'un problème de société qui n'a pu malheureusement trouver de réponse dans les études épidémiologiques classiques dans la mesure où les quelques données fiables concernent plutôt des expositions accidentelles à des doses beaucoup plus élevées. L'exposition naturelle représente pourtant la première source dans la vie courante juste devant les sources d'origines médicales (radiologie, radiothérapie). Ce type d'exposition est très difficile à reproduire en laboratoire sur des lignées cellulaires. La méthode principalement utilisée, basée sur l'irradiation aléatoire de populations cellulaires, consiste à calculer le nombre moyen de particules ayant interagi par cellule et repose ainsi sur des lois de distribution statistique (loi de Poisson). En plus des inévitables impacts multiples, la variété des cibles intracellulaires touchées (noyau, cytoplasme), les effets indirects induits par les impacts sur les cellules voisines ou simplement extracellulaires sont autant de phénomènes qui compliquent alors sérieusement l'interprétation des données.

Dans ce contexte, un microfaisceau de particules  a été développé au CENBG pour réaliser des irradiations ciblées à l'échelle sub-cellulaire avec une précision de quelques micromètres. Il est ainsi possible de contrôler le nombre exact de particules délivrées par cellule (jusqu'à la dose ultime d'un ion par cellule), de prédéterminer avec précision le point d'impact et d'irradier certaines cellules tout en vérifiant la réponse de cellules voisines.

La validation de ce dispositif a été réalisée au cours de ce travail de thèse, sur des kératinocytes humains exprimant une protéine recombinante nucléaire fluorescente (histone H2B-GFP) en mettant en évidence des dommages nucléaires radio-induits spécifiques et dose-dépendant. La combinaison de techniques telles que le microfaisceau d'ions, la microscopie confocale et l'analyse quantitative numérique a permis de mesurer, in situ et à l'échelle de la cellule unique, la cinétique de phosphorylation de la protéine histone H2A.X et d'aborder ainsi l'étude des processus de réparation de l'ADN et d'induction de l'apoptose. Les résultats expérimentaux ont validé la méthodologie développée en démontrant la reproductibilité du tir et le contrôle de la dose grâce à la mise en évidence d'une relation dose-effet qui a été également étudiée en fonction du temps.

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Fedor, Yoann. "Nouveau biomarqueur en temps réel de cassures double-brin de l'ADN et génotoxicité de la cytolethal distensing toxin." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/2029/.

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Abstract:

L'ADN est constamment la cible de dommages, provenant aussi bien de sources endogènes (propriétés intrinsèques de la macromolécule, métabolisme cellulaire. . . ) qu'exogènes (radiations, contaminants alimentaires. . . ). Parmi ces dommages, les cassures double-brin de l'ADN (CDB) représentent une des lésions les plus cytotoxiques. En réponse à ce danger, la cellule dispose de voies de détection et signalisation impliquant le recrutement de protéines. Au cours de cette réponse des modifications post-traductionnelles de protéines de signalisation et de réparation sont produites au niveau du site de cassure comme, par exemple, la phosphorylation de H2AX, un variant de l'histone H2A. Cette voie de signalisation permet d'une part d'activer les points de contrôle du cycle cellulaire pour stopper la prolifération et, d'autre part, de stimuler les systèmes de réparation de CDB afin de restaurer l'intégrité de l'ADN. Une réparation infidèle des CDB peut aboutir à des additions/délétions de bases, voir des réarrangements chromosomiques, à l'origine de cancers. Ainsi, élucider les causes et les mécanismes responsables de la formation des CDB en réponse à des stress génotoxiques et suivre leur prise en charge par la cellule sont des éléments importants pour la compréhension de la génotoxicité. Des techniques permettant d'analyser la formation des CDB (immunofluorescence, électrophorèse en champs pulsé, COMET neutre. . . ) existent, mais elles ne permettent d'analyser l'état de l'ADN qu'à un instant fixe. La première partie de mon travail de thèse a été de créer un outil innovant, permettant de détecter et suivre la formation de CDB en temps réel, sur cellules vivantes. Cet outil repose sur la technologie des nanobodies, anticorps monochaines produits uniquement chez les camélidés et certains requins. Nous avons fait exprimer un nanobody intracellulaire dirigé contre H2AX phosphorylé (appelé gammaH2AX), qui semble se relocaliser aux CDB créées par microirradiation. La création de cet outil a nécessité l'immunisation d'un lama avec le peptide phosphorylé et l'isolement/le clonage des séquences codantes des nanobodies afin de produire une banque. Les nanobodies spécifiques de gammaH2AX ont été sélectionnés par phage display et leurs séquences ont été exprimées en cellules humaines, fusionnées à un fluorophore afin d'observer leur relocalisation aux CDB en temps réel. La seconde partie de ma thèse a permis de mieux comprendre le mécanisme d'action d'une génotoxine bactérienne, responsable de cancers en modèle murin : la Cytolethal Distending Toxin (CDT). Cette toxine, sécrétée par des bactéries commensales et pathogènes, se localise au noyau des cellules cibles et provoque des CDB. Si le fonctionnement de cette toxine était préalablement décrit comme celui d'une nucléase produisant des CDB directes, mon travail a montré que pour des concentrations équivalentes à la Dose Létale 50, CDT produit d'abord des cassures simple-brin qui dérivent en CDB au cours de la réplication de l'ADN. De plus, la réparation de ces CDB par recombinaison homologue est cruciale pour la survie des cellules exposées à CDT. En conclusion, mon travail de thèse a permis d'une part de développer un outil innovant permettant d'analyser la dynamique en temps réel des CDB en cellules humaine et, d'autre part, d'éclaircir le mécanisme menant à la génotoxicité de CDT, toxine représentant un risque potentiellement cancérigène chez les mammifères. Les apports de ces travaux sont discutés ici
Human DNA is constantly damaged by endogenous (cellular metabolism) or exogenous (radiations, food contaminants) sources. Among these lesions, DNA double-strand breaks (DSB) are the most cytotoxic. To survive to these lesions, a cellular pathway is in charge for the detection and the signaling of DSB. This pathway involves recruitment and post-translationnal modifications of several proteins around the DSB site (like the phosphorylation of a H2A histone variant called H2AX). This signalization pathway elicits cellular checkpoints in order to stop proliferation, and stimulates DSB repair systems in order to restore DNA initial integrity. An error-prone repair of DSB can lead to base additions/deletions, or chromosomal aberrations that can induce cancer. In order to understand genotoxicity, it is important to elucidate causes and mechanisms responsible for DSB formation and to follow their management by the cell. Techniques allowing DSB formation analysis (immunofluorescence, pulse-field gel electrophoresis, neutral COMET assay. . . ) exist, but can only show DNA state for a given point. During the first part of my thesis work, I created a new tool to detect and follow DSB formation in real time, in human cells. This tool rely on nanobody technology, which are miniatures antibodies produced by camelidae species and some sharks. An intracellular nanobody directed against phosphorylated H2AX (gammaH2AX) has been expressed, and seems to relocate to microirradiation-induced DSB. In order to build this tool, anti-gammaH2AX peptides were designed to immunize a llama, and nanobodies coding sequences were isolated/cloned and gathered as a library. Nanobodies specific for gammaH2AX were selected by phage display. Fused to a fluorophore these nanobodies were expressed in human cells in order to analyze their relocalization to DSB in real time. The second part of my phD shed a new light on the mechanism of action of a bacterial génotoxine causing cancers in mouse models: the Cytolethal Distending Toxin (CDT). This toxin is secreted by commensal and pathogenous bacteria, translocate into the nucleus of targeted cells and induces DSB. CDT mechanism of action was previously described as those of a nuclease inducing DSB. But my work demonstrated for lower doses (equivalent to lethal dose 50), that CDT induced first single-strand breaks leading to double-strand breaks through DNA replication. Moreover, homologous recombination repair of these DSB is crucial in order for cells exposed to CDT to survive. In conclusion, thanks to my thesis work, I developed a new tool to analyze real time dynamic of DSB in human cells in one hand. And in another hand, my work shed a new light on the mechanism of action of CDT genotoxicity, a toxin displaying cancer hazard in mammalians. Contributions brought by this work are discussed here

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SOUSTELLE, CHRISTINE. "Controle de la formation et de la reparation des cassures double-brin meiotiques de l'adn chez saccharomyces cerevisiae." Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA112189.

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Abstract:

La recombinaison meiotique necessaire a la segregation correcte des chromosomes homologues lors de la premiere division de meiose est initiee par des cassures double brin (cdbs) de l'adn. Ces cdbs apparaissent transitoirement au cours de la prophase de meiose i chez s. Cerevisiae et sont reparees par recombinaison homologue. L'etude de ce mecanisme a fait l'objet d'une partie de ce travail de these. Ce processus fait intervenir les produits de nombreux genes, notamment ceux du groupe d'epistasie rad52. L'implication des produits de ces genes, dont les mutants sont sensibles aux rayons x et deficients pour la recombinaison en mitose et en meiose, dans le processus de recombinaison lors de l'etape d'echange de brin entre les deux chromosomes homologues, a ete montre in vivo et in vitro. La caracterisation, presentee ici, d'un mutant de la grande sous-unite du complexe rpa, necessaire in vitro a la stimulation de la reaction d'echange de brin, a permis d'impliquer ce complexe dans la reaction in vivo en meiose. Les phenotypes de ce mutant similaires a ceux presentes par les mutants du groupe d'epistasie rad52 suggerent que cette proteine est impliquee dans la meme etape que les autres membres du groupe. Dans une seconde partie, nous nous sommes interesses au controle en cis de l'initiation de la recombinaison meiotique. En effet, la frequence de recombinaison varie beaucoup le long des chromosomes suggerant que les evenements de recombinaison ne sont pas distribues de facon aleatoire. Des etudes au point chaud de recombinaison arg4 ont notamment montre qu'il existait un controle local de l'initiation de la recombinaison et de la formation des cdbs. Dans ce travail, l'etude de constructions chromosomiques a permis la mise en evidence d'effets du voisinage sur l'initiation de la recombinaison au locus arg4. Les resultats obtenus suggerent l'existence d'elements agissant en cis (sequence activatrice ou inhibitrice ou relations entre sites d'initiation voisins).

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Kapusta, Aurélie. "Réarrangements du génome chez Paramecium tetraurelia : ligases ADN et voies de End-Joining." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112207.

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Abstract:

De façon spectaculaire, à chaque cycle sexuel, le cilié Paramecium remodèle l'intégralité de son génome somatique. Ce processus implique notamment l'excision de dizaines de milliers de courtes séquences (IES), présentant un dinucléotide 5'-TA-3' à chacune de leurs bornes. Les IES interrompant les séquences codantes, leur élimination précise est nécessaire à la survie de la descendance. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double-brin (CDB), dont la géométrie de 4 bases sortantes en 5' centrées sur le TA, permettrait un recollement des extrémités suite à une maturation minimale. Toutefois, les acteurs protéiques impliqués dans l'assemblage final et précis des gènes somatiques restent à établir. En me focalisant sur l'étape finale de réparation, j'ai tout d'abord caractérisé in silico les ligases ADN dépendantes de l'ATP de la paramécie. L'analyse fonctionnelle de la Ligase IV et de son partenaire Xrcc4, impliqués dans une voie cellulaire canonique de réparation des CDB (Non Homologous End-Joining ou NHEJ), a montré qu'ils étaient indispensables à la réparation des CDB introduites lors de l'excision des IES. Mes résultats ont mené à un modèle actualisé d'excision des IES de type « couper & recoller ». J'ai pu y inclure les acteurs protéiques avérés, ou supposés, notamment pour la protection des extrémités cassées et pour l'étape de maturation contrôlée, points déterminants pour une réparation précise hautement reproductible. Ainsi, la paramécie constituerait un excellent organisme modèle pour l'étude de l'implication de la voie NHEJ dans la réparation précise de CDB introduites de façon programmée à l'échelle d'un génome entier
During the sexual cycle of the ciliate Paramecium, the somatic genome is spectacularly and reproducibly rearranged. This process involves two kinds of germline DNA elimination, including the precise excision of tens of thousands of short sequences (Internal Eliminated Sequences or IESs), each one flanked by two 5' - TA- 3' dinucleotides. These developmentally programmed rearrangements are initiated by DNA double-strand breaks (DSBs) that exhibit a characteristic geometry, with 4-base 5' overhangs centered on the conserved TA, and may readily align and undergo ligation with minimal processing. However, the actors involved in the final and precise assembly of somatic genes have remained unknown. My work has been focused on the last step of DNA repair, which first led me to characterize in silico the Paramecium ATP-dependent DNA ligases. Functional analysis of Ligase IV and its partner Xrcc4p, core components of a canonical cellular DSB repair pathway (non-homologous endjoining or NHEJ), showed their requirement both for the repair of IES excision sites and for the circularization of excised IESs. Moreover, my data provide direct evidence for the introduction of initiating double-strand cleavages at both ends of each IES, followed by DSB repair via highly precise end-joining. This led to a "cut-and-close" model, including confirmed or putative actors, mostly involved in the protection of broken ends and their controlled processing, key steps in a highly reproducible and precise repair. Paramecium may therefore be an excellent model organism to study precise DSB repair in genome-wide programmed rearrangements

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Chanut, Pauline. "Comprendre et perturber le choix de la voie de réparation des cassures double brin de l'ADN pour augmenter l'efficacité et la sélectivité des agents anticancéreux génotoxiques." Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30151.

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Abstract:

Parmi les dommages de l'ADN, la cassure double-brin (CDB) constitue la lésion la plus toxique, puisqu'une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer les cellules tumorales. Parmi l'arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie, les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tel que la camptothécine (CPT), sont capables d'induire un type particulier de CDBs à une seule extrémité, générées lors de la collision entre la fourche de réplication et la TOPO1 bloquée sur l'ADN. Ces cassures sont réparées par recombinaison homologue (RH) puisqu'en absence de seconde extrémité, elles ne peuvent être substrats de la jonction d'extrémités non homologues (JENH) qui, pour ligaturer en nécessite deux. L'hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité, et un puissant inhibiteur de la RH. Ainsi, pour la compréhension des mécanismes déterminants le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale. Dans ce contexte, mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute résolution, j'ai d'abord montré que l'hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l'ADN de cellules humaines. J'ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l'action coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une extrémité. La dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l'aide d'un mutant non phosphorylable de ce cluster, j'ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage de l'hétérodimère Ku dépendant de MRE11. Mes travaux suggèrent toutefois l'existence d'une voie additionnelle pouvant éliminer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité. Enfin, j'ai démontré que la persistance de Ku et de la DNA-PKcs aux extrémités de la cassure ne perturbe ni la résection longue distance ni la formation de filament de RAD51 mais compromet la survie cellulaire. Mon second projet de thèse a consisté à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation des CDBs dans le but de potentialiser l'effet de la CPT. Comme l'inhibition d'ATM induit une sensibilisation dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d'identifier d'autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à une extrémité. Sur la base d'un test de cytotoxicité, j'ai réalisé un criblage phénotypique de la chimiothèque du NIH et identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne (NTF) et l'hydrocortisone acétate (HCA) capables de potentialiser l'effet de la CPT. Si la sensibilisation par la NTF semble plutôt associée à la génération d'espèces oxygénées réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule, celle induite par l'HCA n'a pas été reproduit et est toujours en cours d'investigation. Mes travaux de thèse contribuent à la compréhension des mécanismes du choix de la voie de réparation impliqués dans la tolérance des cellules à la CPT et ouvrent des perspectives de ciblage pour potentialiser son pouvoir anti-cancéreux
DNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis- or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase 1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT), are able to generate a particular type of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. They are repaired by homologous recombination (HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining (NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor. Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair pathway. In this context, my first thesis project aimed at deciphering the molecular mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, using High Resolution Microscopy, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit the stable loading of Ku on seDSBs. I established that DNA-PKcs removal from seDSBs relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11 from releasing Ku. However, my work also suggested the existence of an additional mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Finally, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs persistence on seDSBs does not impair long range resection and RAD51 recruitment but compromises cell survival. My second thesis project was dedicated to target the DSB repair pathway choice mechanisms in order to potentiate the effect of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt the repair pathway choice. On the basis of a cytotoxicity assay on mouse embryonic fibroblasts (MEFs), I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection and identified the antibiotic nitrofurantoin (NTF) and hydrocortisone acetate (HCA) as a sensitizer of MEFs to CPT. However, sensitization induced by NTF does not depend on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction of the molecule and sensitization induced by HCA is not reproducible and is still under investigation. My work contributes to extend the knowledge of the repair pathway choice mechanisms involved in cell tolerance to CPT and opens new opportunities to potentiate its anticancerous property

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Taty, Taty Gemael Cedrick. "Rôle des modifications de la chromatine dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN et la stabilité génétique." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30190/document.

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Abstract:

Le génome humain est constamment la cible d'agents qui endommagent l'ADN. Ces dommages sont multiples et variés tels que les cassures simple et double brin (DSB). Les DSBs sont des lésions très toxiques dont l'origine peut être multiple. Les cellules de mammifères réparent les DSBs en utilisant deux mécanismes principaux, la recombinaison homologue (RH) qui est dépendante du cycle cellulaire et utilise la chromatide sœur comme matrice de réparation et la jonction des extrémités non homologues (NHEJ) qui est indépendante du cycle cellulaire et consiste en la ligation des extrémités d'ADN endommagées. Cette réparation a lieu dans un contexte chromatinien qui nécessite un dynamisme pour rendre accessible les sites lésés aux différentes machineries de réparation. Lors de mes travaux, j'ai étudié le remodeleur de la chromatine p400 ainsi que le variant d'histone H2A.Z qui sont deux protéines impliquées dans la dynamique de la chromatine, afin de comprendre leur rôle dans les mécanismes de réparation des DSBs et la stabilité du génome. p400, une ATPase de la famille SWI2/SNF2 participe à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z dans la chromatine. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la déplétion par siRNA du variant d'histone H2A.Z, dans la lignée d'ostéosarcome humain (U2OS) et dans des fibroblastes humains immortalisées, n'a pas d'effets sur la réparation des DSBs. Ces résultats sont corrélés avec une absence de recrutement de H2A.Z au niveau des cassures après étude par micro irradiation laser ou par immunoprécipitation de chromatine. Cependant, la déplétion de H2A.Z affecte la prolifération cellulaire en influençant l'efficacité de clonage et le cycle cellulaire. L'autre partie de mes travaux a mis en évidence que l'ATPase p400 est un frein à l'utilisation de la voie alternative de jonction des extrémités (alt-EJ) qui est un processus de réparation des DSBs très mutagène. L'augmentation des événements du NHEJ-Alternatif et la génération d'instabilité génétique observés lors de la déplétion de p400 par siRNA semblent tributaires de la résection des DSBs par CtIP. Ces résultats indiquent que p400 joue un rôle post-résection dans les étapes plus tardives de la RH. De plus, la déplétion de p400 conduit au recrutement de la polyADP ribose polymérase (PARP) et de l'ADN ligase 3 à la DSB, ce qui provoque la mort sélective de ces cellules lors d'un traitement par des inhibiteurs de PARP. Ces résultats montrent que P400 agit comme un frein pour empêcher l'utilisation du NHEJ-Alternatif et donc l'instabilité génétique
The human genome is constantly targeted by DNA damaging agents. These damages are many and varied, such as single and double strand breaks (DSBs). The DSB are highly toxic lesions whose origin can be multiple. Mammalian cells mainly use two DNA repair pathways to repair DSB, homologous recombination (RH), which is dependent on the presence of the intact homologous copy (the sister chromatid) and on the cell cycle stage and the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which is cell cycle independent and performs direct ligation of the two DNA ends. The repair of DNA damage takes place in a chromatin context that needs to be remodeled to give access to damaged sites. During my work, I studied the chromatin remodeler p400 and the histone variant H2A.Z both involved in chromatin remodeling, to understand their role in DSB repair and genome stability. p400, an ATPase of the SWI2/SNF2 family is involved in the incorporation of H2A.Z in chromatin. I have shown that H2A.Z depletion in the osteosarcoma cell line U2OS and in immortalized human fibroblasts did not alter DSB repair. These results are correlated with the lack of H2A.Z recruitment at DSB observed after local laser irradiation or Chromatin Immunoprecipitation. However, H2A.Z depletion affects cell proliferation and the cell cycle distribution. In addition, I have shown that the chromatin remodeler p400 is a brake to the use of alternative End Joining (alt-EJ) which is a highly mutagenic repair process. The increase in alt-EJ events observed in p400-depleted cells is dependent on CtIP- mediated resection of DNA ends. Moreover, p400 depletion leads to the recruitment of poly(ADP) ribose polymerase (PARP) and DNA ligase 3 at DSB, leading to selective cell killing by PARP inhibitors. Altogether these results show that p400 acts as a brake to prevent alt-EJ dependent genetic instability and underline its potential value as a clinical marker

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Yuan, Ying. "Modulation of DNA double strand breaks end-joining pathway choice by single stranded oligonucleotides in mammalian cells." Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30091.

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Abstract:

En réponse aux dommages de son génome, le choix par la cellule de la voie de réparation de l'ADN est un crucial par ses conséquences en termes de mutagénèse et de survie. Pour faire face aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les cellules humaines possèdent deux voies principales qui consistent soit à rejoindre les extrémités de la cassure par jonction d'extrémités non-homologues (voie conventionnelle C-NHEJ), soit à reconstituer par recombinaison homologue la séquence clivée en copiant son double non endommagé présent après la réplication (voie RH). La RH nécessite de dégrader l'un des brins d'ADN de part et d'autre de la cassure. Cette dégradation produit de courts fragments d'ADN simple-brin, connus pour aider à signaler le dommage à la cellule. Dans ce travail, nous avons évalué directement l'effet de ces fragments d'ADN simple brin sur la réparation des CDB dans des expériences biochimiques et cellulaires. Nous montrons que de courts fragments d'ADN simple-brin inhibent la C-NHEJ en inactivant sa protéine clef Ku, tout en stimulant une forme minoritaire de jonction des cassures dite NHEJ alternative (A-EJ). Ces travaux permettent de mieux comprendre comment la réparation par la voie peu connue A-EJ peut s'exprimer dans les cellules mais aussi d'envisager des stratégies pour piloter la réponse des cellules cancéreuses aux thérapies induisant des CDB
In response to DNA damage, the choice made by the cells between DNA repair mechanisms is crucial for mutagenic and survival outcomes. In humans, DNA double-strand breaks are repaired by two mutually-exclusive mechanisms, homologous recombination or end-joining. Among end-joining mechanisms, the main process is classical non-homologous end-joining (C-NHEJ) which relies on Ku binding to DNA ends and DNA Ligase IV (Lig4)-mediated ligation. Mostly under Ku- or Lig4-defective conditions, an alternative end-joining process (A-EJ) can operate and exhibits a trend toward microhomology usage at the break junction. Homologous recombination relies on an initial MRN-dependent nucleolytic degradation of one strand at DNA ends. This process, named DNA resection generates 3' single-stranded tails necessary for homologous pairing with the sister chromatid. While it is believed from the current literature that the balance between joining and recombination processes at DSBs ends is mainly dependent on the initiation of resection, it has also been shown that MRN activity can generate short single-stranded DNA oligonucleotides (ssO) that may also be implicated in repair regulation. In this work, we evaluate the effect of ssO on end-joining at DSB sites both in vitro and in cells. Under both conditions, we report that ssO inhibit C-NHEJ through binding to Ku and favor repair by the Lig4-independent microhomology-mediated A-EJ process. Our data bring new clues in the understanding of the cellular response to DNA double-strand breaks

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Cabal, Ghislain. "Implications fonctionnelles de l’organisation de la chromatine : Rôles du pore nucléaire chez saccharomyces cerevisiae." Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112172.

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Abstract:

Dans le noyau des cellules eucaryotes, la chromatine ainsi que les processus métaboliques qui l’accompagnent ne sont pas distribués de manière aléatoire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle que pouvait jouer cette organisation dans la régulation de la réparation de l’ADN et de la transcription. J’ai participé à la mise au point de méthodes permettant de localiser in vivo un locus chromosomique unique et de le suivre au court du temps chez la levure Saccharomyces cerevisiae. J’ai ainsi pu montrer que les gènes GAL sont confinés dans des territoires bien définis et que leur mobilité est très contrainte. Par ailleurs, lorsqu’ils sont transcrits, les mouvements de ces gènes sont confinés le long de l’enveloppe nucléaire. Mes travaux ont également montré que le complexe d’initiation de la transcription SAGA interagissant avec le promoteur et les pores nucléaires (NPC) via la machinerie d’export des ARNm, était responsable de l’ancrage des gènes GAL à l’enveloppe nucléaire. Ces résultats constituent la première description du mécanisme de "gene gating". L’utilisation des techniques d’imagerie cellulaire, nous a aussi permis de montrer que la réparation des cassures de l’ADN dans les régions subtélomériques dépendait de leur ancrage aux NPC. Enfin, l’implication des pores dans le contrôle de la réparation de l’ADN a été confortée par l’identification d’interactions fonctionnelles entre certaines nucléoporines, et des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN. Ensembles mes travaux démontrent l’importance des NPC dans l’organisation fonctionnelle de la chromatine chez S. Cerevisiae
In the nucleus of eukaryotic cells, chromatin and nuclear processes are not randomly distributed. During my PhD thesis, I have focused on the role of nuclear organization may play in regulating transcriptional regulation and DNA metabolism. To investigate this assumption, I developed an experimental system able to monitor the movement and sub-nuclear position of a single tagged genetic locus in the yeast Saccharomyces cerevisiae. When tracked in the nuclear volume over time, I found chromatin to undergo very constrained movement. Interestingly, I show that transcriptional activation of the GAL genes leads to the confinement of their motility towards the nuclear periphery. I further demonstrate that members of the SAGA transcription initiation complex and mRNA export factors mediate this recruitment by physically linking the activated GAL genes to nuclear pore complexes (NPC). These results prove for the first time that the ‘gene gating’ mechanism occurs in living cells. Additionally, I participated in a study showing that binding of chromosome ends to the NPC is essential for efficient DNA double strand break repair in subtelomeric region. I also performed a genetic screen revealing an exciting genetic interaction network of nucleoporins with the DNA repair machinery and chromatin remodeling complexes. Altogether the studies I carried out during my PhD uncover the role of the NPC in chromatin organization and consequently in regulating nuclear processes

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Vannier, Jean-Baptiste. "Rôle de protéines de la réparation des cassures double brin dans l'homéostasie télomérique chez Arabidopsis thaliana." Phd thesis, Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00725958.

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Abstract:

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées dont l'un des rôles est d'empêcher le raccourcissement progressif de l'extrémité des chromosomes suite à la réplication et à l'instabilité génomique due à la recombinaison de l'extrémité de chromosomes. Malgré le rôle des télomères dans la protection de l'extrémité des chromosomes contre les mécanismes de réparation de l'ADN et de recombinaison, de nombreuses protéines de ces voies jouent des rôles essentiels dans l'homéostasie télomérique et la stabilité des chromosomes. Parmi elles, la protéine RAD50 appartenant au complexe MRE11/RAD50/XRS25(NBS1) et l'endonucléase structure spécifique XPF/ERCC1 sont localisées aux télomères ; ces deux complexes connus pour leur rôle dans les voies de réparation de l'ADN ainsi que dans les études sur la recombinaison. Nous avons identifié deux rôles différents pour la protéine RAD50 dans la maintenance télomérique et dans la protection des extrémités des chromosomes, en contexte de présence et absence de la télomérase. L'absence d'AtRAD50 augmente significativement le nombre de fusions chromosomiques impliquant des télomères raccourcis. Nous proposons que ce rôle protecteur des télomères raccourcis de RAD50 est le résultat de sa fonction de contraindre la recombinaison entre chromatides soeurs et ainsi d'éviter les évènements de fusions par les extrémités. Nous avons recherché le ou des mécanismes impliqué(s) dans ces évènements de fusions chromosomiques chez les mutants atrad50 en réalisant des croisements entre les plantes déficientes pour ATRAD50 et des plantes déficientes pour des gènes codant des protéines des voies de réparation par recombinaison non-homologue et homologue. Au contraire de la situation en cellules de mammifères, nous n'avons pas observé d'instabilité chromosomique chez les plantes mutantes correspondantes pour XPF (AtRAD1) or ERCC1 (AtERCC1). Cependant, en absence de la télomérase, la mutation de l'un de ces deux gènes entraîne une augmentation précose et significative de l'instabilité chromosomique sans accélération générale de la perte des répétitions télomériques, mais associée à la présence de fragments ADN extrachromatiques visibles en cytologie. Une analyse intensive par FISH a permis d'identifier ces ADN comme des bras entiers spécifiques de deux chromosomes. Nos données indiquent un rôle protecteur de RAD1/ERCC1 comme l'invasion de l'ADN simple brin télométrique dans des séquences télomériques interstitielles. Le fait que les mutations de rad1 (ou ercc1) augmentent dramatiquement l'instabilité chromosomique des mutants télomérase a des implications très importantes pour les modèles des rôles de la recombinaison aux télomères.

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Choudjaye, Jonathan. "Etude de l'organisation spatiale de la réparation des cassures double-brins de l'ADN." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30390.

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Abstract:

Les cassures Double-brin de l'ADN (DSBs) sont une menace majeure pour la stabilité du génome. Afin de se protéger des effets délétères de ces dommages, les cellules activent une voie de réponse aux cassures double-brins (DDR) qui comprend des évènements qui conduisent à la reconnaissance et à la réparation de ces cassures ainsi qu'à un délai du cycle cellulaire. Cette DDR repose largement sur 2 membres de la famille des PI3K-like kinase, ataxia telangiectasia mutated (ATM) et DNA Protein Kinase (DNAPK) dont les fonctions respectives lors de la réparation restent controversées. Grâce à l'utilisation d'une lignée cellulaire contenant l'enzyme de restriction AsiSI combinée à de la cartographie par ChIP-chip, de l'analyse de la réparation de cassures séquence-spécifique ainsi qu'à de la microscopie haute résolution, j'ai pu, au cours de ma thèse mettre en évidence que aussi bien ATM que DNAPK sont recrutées sur une région confinée autour des DSBs. Cependant, une fois recrutées, elles présentent des fonctions non-redondantes que ce soit pour la ligation des cassures ou pour l'établissement des domaines yH2AX. Concernant la réparation, DNAPK est absolument requise pour la ligation des extrémités de la cassure alors que ATM est dispensable mais promeut la fidélité. En revanche, ATM est la principale kinase requise pour l'établissement des domaines yH2AX et ce quelque soit la cassure. J'ai aussi pu mettre en évidence le fait que plusieurs cassures induites par AsiSI sont capables de se regrouper au sein d'un "foyer de réparation" et ce de manière dépendante d'ATM et indépendante de DNAPK. Cette étude éclaircit les rôles respectifs des kinases ATM et DNAPK que ce soit pour la ligation des extrémités ou l'établissement des domaines yH2AX. Enfin elle a permis de mettre en évidence un nouveau rôle d'ATM dans l'organisation spatiale de la réparation et plus précisemment dans le regroupement de plusieurs DSBs au sein de "foyers de réparation" afin d'être réparées
DNA Double Strand Breaks (DSBs) form a major threat to the genome stability. To circumvent the deleterious effects of DSBs, cells activate the DNA damage response (DDR), which comprises events that lead to detection and repair of these lesions, as well as a delay in cell cycle progression. This DDR largely rely on two members of the PI3K-like kinase family : ataxia telangiectasia mutated (ATM) and DNA Protein Kinase (DNAPK), whose respective functions during the DDR remains controversial. Using a cell line, expressing the AsiSI restriction enzyme, combined with high resolution ChIP-chip mapping, sequence-specific DSB repair kinetics analysis and advanced high resolution microscopy, we uncovered that both ATM and DNA-PK are recruited to a confined region surrounding DSBs. However, once present at the DSB site, they exhibit non-overlapping functions on end-joining and yH2AX domain establishment. At the repair level, DNAPK is absolutely required for end-joining while ATM is dispensable although promoting repair fidelity. By contrast, ATM is the main kinase required for the establishment of the histone mark yH2AX at all breaks. We also clearly demonstrated that multiple AsiSI-induced DSBs are able to associate within "repair foci", in a manner that strictly depends on ATM, but not DNAPK, activity. Our study shed light on the respective roles of ATM and DNAPK regarding end joining and yH2AX domain establishment. Lastly it allowed us to uncover a function of ATM in the spatial organisation of the repair, more precisely in the clustering of multiple breaks within "repair foci" in order to be repaired

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Joshi, Niraj Gaurishankar. "Rôles et régulation des protéines de l'anémie de Fanconi dans les voies de réparation des cassures double-brin de l'ADN." Doctoral thesis, Université Laval, 2016. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27340.

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Abstract:

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη.
Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.

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Marcinkova, Zuzana. "Signalisation et réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les gliomes : modulation de la réponse aux traitements chimio-radiothérapeutiques." Grenoble 1, 2007. http://www.theses.fr/2007GRE10098.

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Abstract:

6000 nouveaux cas de tumeurs du système nerveux sont dépistés chaque année en France et leur pronostique reste incertaine. Nos travaux visent à éclaircir la réponse moléculaire et cellulaire de cette pathologie suite aux traitements radio-chimiothérapiques. Une nouvelle voie de réparation des cassures double-brin de l'ADN dépendant de la protéine MRE II mais indépendante de la phosphorylation de H2AX a été mise en évidence. Les caractéristiques radiobiologiques des 3 modèles de gliomes de rongeurs et de 7 modèles de gliomes humaines ont été analysées. Des dysfonctionnements de la protéine BRCAI en réponse aux radiations ou au cisplatine ont été observés dans la majorité de ces modèles testés, soulevant la question du rôle de cette protéine dans les traitements anti-gliomes ainsi que dans la gliomagenèse. Nous avons étudié l'effet de quelques drogues inhibitrices de protéine kinases sur la qualité de réparation par la recombinaison ou par la suture. Le défaut de réparation résulte du blocus de voies de signalisation causé par ces traitements ciblés. Les caractéristiques radiobiologiques d'un syndrome génétique associé aux tumeurs du système nerveux périphérique et central, la neurofibromatose de type 1 (NFI), ont été analysées. La NFI a montré une radiosensibilité modérée, associée à une faible déficience de réparation de l'ADN par suture mais une forte activité de MRE Il
6000 new cases of tumours of the nervous system are detected each year in France and their prognostic stay uncertain. This thesis aims to provide new insights in the molecular and cellular response ofbrain tumours to radio-chemotherapy. A DNA double-breaks repair depending on the MREII protein but independent of the phosphorylation of H2AX emerged from the study of artefacts of the immunofluorescence technique. The radiobiological characteristics of the 3 rodent glioma celllines and 7 human glioma celllines were analyzed. Functional impairments of the BRCAI protein in response to radiation and/or cisplatin were observed in the majority of the models tested, raising the question of the role of this protein in the anti-glioma treatments and in gliomagenesis. We studied the effect of sorne protein kinases inhibitors on the quality of damage repair by the recombination or the DNA end-joining repair. The defect of repair results from the blockade of signaling pathways caused by these targeted treatments. The radiobiological characteristics of the neurofibromatosis of the type 1 (NFl), a genetic syndrome associated the tumors of the peripheral and central nervous system, were analyzed. NFI appeared to be a syndrome with moderated radiosensitivity, associated with a weak deficiency ofDNA end-joining repair but with a strong activity ofMRE11

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Vahidi, Ferdousi Leyla. "Etude de la réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les cellules souches du muscle squelettique et leurs progéniteurs." Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066335.

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Abstract:

Les cassures double brin (CDB) de l’ADN sont des lésions dangereuses qui peuventêtre produites par des agents physiologiques et environnementaux. La réparation inefficace desCDB dans les cellules souches adultes (CSA), qui sont au sommet de la hiérarchie cellulaire,peut affecter leur capacité d’auto-renouvellement et également le processus de régénération.Le maintien de la stabilité génomique est fondamental et l’altération de ce processus accélèrele vieillissement et peut engendrer des cancers (cellules souches cancéreuses).Les CSA du muscle squelettique (cellules satellites, CS) sont responsables del’homéostasie et de la régénération musculaire. Après activation, les CS quiescentesprolifèrent, régénèrent les myofibres et reconstituent le pool, en s’auto-renouvelant.Ce projet de thèse a eu pour but d’étudier la réparation des CDB dans les CS et leursdescendants, au cours de la différenciation. Nous avons montré que les CS réparent les CDBplus efficacement et plus fidèlement que les cellules différenciées, avec l’implication du NHEJet de DNA-PK. Cette efficacité dépend plus de l’état de différenciation que de la proliférationet la niche a un impact mineur. De plus, des expériences avec des mutants de réparation,apoptose et différenciation suggèrent un mécanisme spécifique de réparation des CDB dans lesCS, qui pourrait être lié à l’architecture distincte de la chromatine de ces cellules. Ces étudesdevraient aider à comprendre comment le maintien de l’intégrité de l’ADN préserve le pooldes CS, influence la régénération et le vieillissement et protège de la carcinogenèse
DNA double strand breaks (DSBs) are dangerous DNA lesions that are generated byphysiological and environmental DNA agents. Mismanagement of DSBs in adult stem cellsthat are at the top of the hierarchy generating the differentiated tissue, can affect their selfrenewalcapacity and the fate of their progeny. Maintenance of genome stability throughrobust DNA repair is fundamental for tissue regeneration, and impairment of this processaccelerates aging and may lead to cancers (cancer stem cells).Adult muscle stem cells (satellite cells, SCs) sustain skeletal muscle homeostasis andregeneration. Upon activation, quiescent SCs proliferate thereby regenerating muscle fibersand reconstituting the satellite cell pool by self-renewing.This thesis project aims to study DSB repair in SCs and their progeny, duringdifferentiation. We showed that muscle SCs repair DSBs more efficiently and, surprisingly,more accurately than differentiated cells by implicating NHEJ and DNA-PK. The repairefficiency is more a function of the differentiation status than of the replication status ofmyogenic cells, and the niche has a minor effect on the repair efficiency of SCs. Moreover,experiments with DSB repair, apoptosis and differentiation mutants suggest that SCs repairDSBs through a specific mechanism, that may be linked to the distinct chromatin architectureof these cells. These studies should help understanding how the maintenance of genomestability preserves SCs pool, influence regeneration and aging and protect fromcarcinogenesis

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Vahidi, Ferdousi Leyla. "Etude de la réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les cellules souches du muscle squelettique et leurs progéniteurs." Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066335.

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Abstract:

Les cassures double brin (CDB) de l’ADN sont des lésions dangereuses qui peuventêtre produites par des agents physiologiques et environnementaux. La réparation inefficace desCDB dans les cellules souches adultes (CSA), qui sont au sommet de la hiérarchie cellulaire,peut affecter leur capacité d’auto-renouvellement et également le processus de régénération.Le maintien de la stabilité génomique est fondamental et l’altération de ce processus accélèrele vieillissement et peut engendrer des cancers (cellules souches cancéreuses).Les CSA du muscle squelettique (cellules satellites, CS) sont responsables del’homéostasie et de la régénération musculaire. Après activation, les CS quiescentesprolifèrent, régénèrent les myofibres et reconstituent le pool, en s’auto-renouvelant.Ce projet de thèse a eu pour but d’étudier la réparation des CDB dans les CS et leursdescendants, au cours de la différenciation. Nous avons montré que les CS réparent les CDBplus efficacement et plus fidèlement que les cellules différenciées, avec l’implication du NHEJet de DNA-PK. Cette efficacité dépend plus de l’état de différenciation que de la proliférationet la niche a un impact mineur. De plus, des expériences avec des mutants de réparation,apoptose et différenciation suggèrent un mécanisme spécifique de réparation des CDB dans lesCS, qui pourrait être lié à l’architecture distincte de la chromatine de ces cellules. Ces étudesdevraient aider à comprendre comment le maintien de l’intégrité de l’ADN préserve le pooldes CS, influence la régénération et le vieillissement et protège de la carcinogenèse
DNA double strand breaks (DSBs) are dangerous DNA lesions that are generated byphysiological and environmental DNA agents. Mismanagement of DSBs in adult stem cellsthat are at the top of the hierarchy generating the differentiated tissue, can affect their selfrenewalcapacity and the fate of their progeny. Maintenance of genome stability throughrobust DNA repair is fundamental for tissue regeneration, and impairment of this processaccelerates aging and may lead to cancers (cancer stem cells).Adult muscle stem cells (satellite cells, SCs) sustain skeletal muscle homeostasis andregeneration. Upon activation, quiescent SCs proliferate thereby regenerating muscle fibersand reconstituting the satellite cell pool by self-renewing.This thesis project aims to study DSB repair in SCs and their progeny, duringdifferentiation. We showed that muscle SCs repair DSBs more efficiently and, surprisingly,more accurately than differentiated cells by implicating NHEJ and DNA-PK. The repairefficiency is more a function of the differentiation status than of the replication status ofmyogenic cells, and the niche has a minor effect on the repair efficiency of SCs. Moreover,experiments with DSB repair, apoptosis and differentiation mutants suggest that SCs repairDSBs through a specific mechanism, that may be linked to the distinct chromatin architectureof these cells. These studies should help understanding how the maintenance of genomestability preserves SCs pool, influence regeneration and aging and protect fromcarcinogenesis

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Malivert, Laurent. "Analyse moléculaire des facteurs de réparation de l'ADN et de leur répercussion sur le système immunitaire : étude de Cernunnos, un facteur de NonHomologous End-Joining." Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077080.

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Abstract:

Le système immunitaire subit de nombreuses cassures double-brin (cdb) de l'ADN, provoquées par des éléments exogènes, ou programmées par la cellule lors de processus physiologiques importants comme la recombinaison V(D)J, qui permet le développement, la diversité et la maturation du système immunitaire. Chez les mammifères, les cdb de l'ADN sont majoritairement réparées par le système de réparation des extrémités non homologues (ou NHEJ), composé de sept facteurs : Ku70 , Ku80 , DNA-PKcs, Artémis, XRCC4, DNA LigaselV et Cernunnos (ou XLF), facteur le plus récemment identifié par notre équipe. Une déficience du NHEJ conduit à une immunodéficience combinée sévère (SCID), à des anomalies du développement, et à des prédispositions au cancer. Ce travail de Thèse revient sur la constitution d'une cohorte de patients SCID grâce à un outil biochimique d'analyse du NHEJ in vitro et sur l'identification de Cernunnos, gène responsable de leur défaut moléculaire. Nous montrons aussi que XRCC4 et Cernunnos partagent des homologies de séquence et de structure, mais ont des fonctions distinctes de réparation de l'ADN. Nous prouvons que Cernunnos appartient au complexe de ligature, constitué de XRCC4 et de DNA LigaselV, et rapportons les dépendances entre ces partenaires. Enfin, en utilisant des mutants de Cernunnos générés in vitro et une série d'essais fonctionnels in vivo, nous démontrons entre autres que la région C-terminale de Cernunnos n'est pas essentielle à sa fonction et définissons la zone d'interaction de Cernunnos avec XRCC4. Toutes ces données établissent que Cernunnos est un élément important de la machinerie du NHEJ, dont la fonction reste cependant encore à préciser
The immune System is the target of lots of DNA double-strand breaks (dsb), issued from exogenic elements, but also programmed by the cell itself during important physiological processes like the V(D)J Recombination, which allows the development, diversity and maturatiom of the immune System. In mammals, the majority of DNA dsb are processed by the NonHomologous End-Joining pathway (NHEJ), composed of seven factors : Ku70, Ku80 , DNA-PKcs, Artemis, XRCC4, DNA LigaselV and Cernunnos (or XLF), the most recent factor identified by our team. A NHEJ defect leads to a severe combined immunodeficiency (SCID), to which developmental abnormalities and cancer prédisposition can be added. This Thesis work starts with the constitution of a SCID patients's cohort by an improved in vitro NHEJ assay and the identification of Cernunnos, the gene responsible of their defect. We also show that XRCC4 and Cernunnos share homologies of sequence and structure, but have distinct DNA Repair functions. We prove that Cernunnos is part of the ligation complex, constituted by XRCC4 and DNA Ligase IV and we report the interdependance of these partners within the complex. Then, by using in vitro generated Cernunnos mutants (point mutations, protein deletions, and chimeras between XRCC4 and Cernunnos) and different in vivo functional assays, we demonstrate for example that the C-terminal domain of Cernunnos is not required for its function, and define the interaction surface of Cernunnos with XRCC4. All these data establish that Cernunnos is a major component of the NHEJ machinery, even if its function stillneeds to be precised

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Slade, Dea. "Mécanisme moléculaire de la réparation de l'ADN chez Deinococcus radiodurans." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066758.

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Abstract:

Deinococcus radiodurans est une bactérie qui présente une exceptionnelle résistance à de nombreux stress génotoxiques qui fragmentent notamment son génome en une multitude de segments. Nous avons montré que la réassociation des fragments générés dépend d’un nouveau mécanisme moléculaire, qui implique l’activité interdépendante de la recombinaison et de la réplication de l’ADN. Dans une première étape, la majorité des fragments est réassemblée par la voie de « synthèse étendue par appariement des brins » (extended synthesis-dependant strand annealing ou ESDSA). Les protéines RecA et RadA initient la synthèse de nouveaux brins en utilisant comme matrice l’ADN complémentaire d’un fragment chevauchant appartenant à une autre copie génomique de la même cellule. Polymérase III est essentielle pour l’initiation de la synthèse réparatrice de l’ADN, tandis que les ADN Polymérases III et I sont nécessaires pour l’élongation de la synthèse. Dans une seconde étape, les longs fragments linéaires reconstitués sont réassemblés en chromosomes circulaires par recombinaison homologue dépendante de RecA.

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Chabot, Thomas. "Modulation de l'activité du Rad51 par le récepteur tyrosine kinase c-Met dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN." Thesis, Nantes, 2020. http://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show.action?id=360755d5-6a18-407f-9af7-fe215a83747f.

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Abstract:

L'instabilité génomique due à la dérégulation des voies de réparation de l'ADN peut être à l’initiation de cancer et entraîner par la suite une résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie. La compréhension de ces mécanismes biologiques est donc essentielle dans la lutte contre le cancer. RAD51 est la protéine centrale de la voie de réparation des cassures double-brin de l'ADN par recombinaison homologue. Cette réparation conduit à une réparation fidèle de l'ADN. L'activité recombinase de la protéine RAD51 est finement régulée par des modifications post- traductionnelles telles que la phosphorylation. Au cours de la dernière décennie, de plus en plus d’études, suggèrent l'existence d'une relation entre les récepteurs à activité tyrosine kinases, souvent suractivés et impliqués dans l’agressivité et la prolifération cancéreuse, et la réparation de l'ADN. Parmi ces récepteurs à activité tyrosine kinases, le duo c-Met/HGF-SF est souvent muté, sur exprimé ou activé constitutivement dans de nombreux cancers et son inhibition a été montrée comme induisant une diminution de la réparation par recombinaison homologue. Au travers de cette thèse, nous montrons pour la première fois que c-Met est capable de phosphoryler la protéine RAD51 sur quatre résidus tyrosine localisés principalement dans l'interface monomère- monomère du nucléofilament de la recombinase humaine. Nous montrons l’implication de ces phosphorylations sur l’activité de RAD51 dans les différentes étapes de la recombinaison homologue. L'ensemble des résultats obtenus suggère le rôle possible de ces modifications dans la régulation de RAD51 et souligne l'importance de c-Met dans la réponse aux lésions de l'ADN
Genomic instability due to deregulation of DNA repair pathways may be at the onset of cancer and subsequently lead to resistance to chemotherapy and radiotherapy. Understanding these biological mechanisms is therefore essential in the fight against cancer. RAD51 is the core protein of the homologous recombinant double-stranded DNA repair pathway. This repair leads to faithful DNA repair. The recombinase activity of the RAD51 protein is finely regulated by post-translational modifications such as phosphorylation. Over the last decade, more and more studies have suggested the existence of a relationship between receptors with tyrosine kinase activity, which are often overactivated and involved in aggressiveness and cancer proliferation; and DNA repair. Among these receptors with tyrosine kinase activity, the c-Met/HGF-SF duo is often mutated, over-expressed or constitutively activated in many cancers and its inhibition has been shown to induce a decrease in repair by homologous recombination. Through this thesis, we show for the first time that c-Met is able to phosphorylate the RAD51 protein on four tyrosine residues located mainly in the human recombinase nucleofilament monomer- monomer interface. We show the implication of these phosphorylations on the activity of RAD51 in the different steps of homologous recombination. All the results obtained suggest the possible role of these modifications in the regulation of RAD51 and underline the importance of c-Met in the response to DNA damage

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Robert, Flavie. "TRRAP,une protéine plateforme : Fonction d'un co-facteur de l'acétylation des histones dans la réparation des cassures double brin de l'ADN." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2005/ROBERT_Flavie_2005.pdf.

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Abstract:

L'initiation de la transcription est une étape clé de la régulation de l'expression des gènes codant pour les protéines. Le complexe TFIID, formé de TBP et des TAFs (TBP associated factors), est au cœur de ce processus car il reconnaît le promoteur du gène, et déclenche la formation du complexe de pré-initiation (PIC). Le complexe TFTC (TBP free TAF containing complex) peut lui aussi initier la transcription, malgré l'absence de TBP. Conservé de la levure à l'homme, il possède en sus une activité d'acétylation des queues d'histones, et participe à l'ouverture de la chromatine. TRRAP, sa plus grande sous unité, est le sujet d'étude de cette thèse. Le gène trrap est essentiel au développement embryonnaire, et influence le cycle cellulaire. Au niveau moléculaire, la protéine est la cible de nombreux activateurs de la transcription. Cependant, sa fonction propre était mal connue au début de ce travail, d'autant plus que TRRAP appartient par sa structure à une famille de kinase (PI3K), mais n'en possède pas l'activité enzymatique. Un protocole d'immuno-purification et d'analyse par spectrométrie de masse, complété par des contrôles biochimiques, nous a permis de mettre en évidence une interaction stable entre TRRAP et le complexe Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN), indépendamment de TFTC. MRN est un acteur central de la réponse cellulaire aux cassures double brin de l'ADN. Notre étude de la fonctionnalité de cette interaction a montré que MRN associé à TRRAP est dépourvu d'activité d'acétylation des histones. En revanche, elle apporte les preuves in vitro et in vivo que TRRAP a un rôle spécifique dans la réparation et la signalisation des cassures double brin de l'ADN, comme ATM et ATR qui sont d'autres protéines PI3K. La participation de TRRAP à de nombreuses structures multiprotéiques, suggère que cette grande protéine se comporte en plateforme de communication et d'échange entre les machineries cellulaires de transcription, de réparation et de modification de la chromatine. Ce manuscrit présente par ailleurs des résultats indépendants, portant sur la caractérisation par spectrométrie de masse d'une modification post-traductionnelle de l'histone H3 spécifique de la mitose
Transcription initiation is a key event in the regulated expression of protein-coding genes. The general transcription factor TFIID, containing TBP and TAFs (TBP associated factors), plays a central role in transcription, because it recognizes the promoter, and triggers pre-initiation complex formation. TFTC (TBP free TAF containing complex) is another complex able to initiate transcription. TFTC possesses Histone Acetyltransferase (HAT) activity and thus participates in chromatin opening. These studies focus on TRRAP, TFTC's largest subunit. Trrap gene is essential to embryonic development, and indirectly influences the cell cycle. Moreover, TRRAP protein is targeted by DNA binding activators of transcription. Despite the fact that TRRAP structurally belongs to the family of PI3K kinase, which regulates cellular response to genotoxic stress, its in vivo function is not well understood. Immunoprecipitation and mass spectrometry analysis, associated to biochemical controls, reveal a stable interaction between TRRAP and Mre11-Rad50-Nbs1 complex (MRN) independent of TFTC. MRN is a critical component of DNA double strand break (DSB) cellular response. Functional studies of the TRRAP-MRN complex have shown that it does not possess HAT activity. Nevertheless, in vitro and in vivo evidences demonstrate that TRRAP, like other members of the PIKK family, plays a specific role in DNA DSB repair and signalling. Taken together, our studies give an insight into TRRAP function as a transcription co-factor. We propose to discuss in which TRRAP acts as a molecular platform, allowing communication between the cellular processes of DNA transcription, DNA repair, and chromatin remodeling. Independently, this manuscript summarizes the results of another study, addressing the mass spectrometry characterisation of a mitosis-specific post-translational modification of histone H3

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Hardy, Sara. "Etudes fonctionnelles des complexes multiprotéiques contenant la protéine TRRAP : Implication de hTRRAP dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2005/HARDY_Sara_2005.pdf.

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Forand, Anne. "Caractérisation de la réponse des cellules germinales mâles néonatales à un stress génotoxique." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077123.

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Abstract:

La fertilité d'un individu et l'intégrité du génome de sa descendance dépendent, en partie, du nombre et de la qualité des cellules germinales qui se mettent en place durant la vie fœtale et néonatale Nous nous sommes particulièrement intéressés aux gonocytes néonataux murins qui sont les précurseurs des spermatogonies souches. Nous avons étudié in vivo leur réponse à un stress génotoxique (irradiation y), à court et à moyen terme, en la comparant à celle des spermatogonies néonatales. Nous avons montré que les gonocytes sont plus sensibles à l'induction de cassures double brin de l'ADN (CDBs) que les spermatogonies. Après irradiation en phase S de leur cycle cellulaire, les gonocytes s'accumulent en phase G1 alors que les spermatogonies se bloquen préférentiellement en G2/M. Par ailleurs, la réparation des CDBs est plus rapide dans les gonocytes. Même si une dose de 2 Gy n'altère pas la fertilité des animaux irradiés, elle induit une diminution significative de la production spermatique. Ceci suggère une atteinte du pool de cellules souches due à l'apoptose massive des gonocytes après activation de la voie intrinsèque. Nous avons montré que PUMA est un régulateur essentiel de cette voie dans les gonocytes. L'irradiatior à la même dose de spermatogonies induit de la mort cellulaire, cependant des phénomène? compensatoires, probablement liés à la présence de cellules souches plus radio-résistantes, se mettent en place. Ainsi, à l'âge adulte, ni l'histologie testiculaire, ni la production spermatique ne sont altérées chez les animaux irradiés. L'ensemble de ces données suggère qu'il existe, dans le! cellules germinales, des mécanismes particulièrement sensibles permettant de diriger ces cellules vers la mort en réponse à un stress génotoxique, plutôt que de risquer la transmission d< mutations issues d'une mauvaise réparation des lésions de leur ADN
The fertility of an individual and the integrity of the genome of its progeny depend partly on the number and the quality of the germ cells, which are set up during foetal and neonatal life. We were particularly interested in the neonatal gonocytes, which are the precursors of the spermatogonia stem cells. We studied their short and long-term in vivo response to genotoxic stress (y-rays) by comparing it with that of neonatal spermatogonia. We showed that gonocytes are more sensitive to the induction of DMA double strand breaks (DSBs) than spermatogonia. After irradiation in phase S of their cell cycle, gonocytes are blocked in the following G1 phase whereas spermatogonia are blocked preferentially in G2/M. In addition, the repair of DSBs is faster in gonocytes than ir spermatogonia. Even if a dose of 2 Gy does not alter the fertility of the irradiated animals, it induces a significant reduction in sperm counts. This suggests an impairment of the spermatogonial stem pool due to a strong apoptosis of gonocytes after activation of the intrinsic pathway. We showed that PUMA is an essential regulator of this pathway in gonocytes. Irradiatior of spermatogonia with the same dose induces cellular death, however compensatory mechanisms probably related to the presence of more radio-resistant stem cells, are activated. Thus, in the adult, neither the testicular histology, nor the sperm counts were affected. Altogether, these date suggest the existence of particularly sensitive mechanisms in germ cells, permitting to direct these cells towards death in response to genotoxic stress, rather than to risk the transmission o-mutations resulting from DMA lesion misrepair

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Jacob, Sandrine. "Impact du système de réparation des mésappariements de bases dans la réponse des cancers colorectaux aux inhibiteurs de topoisomérases." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066165.

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Delacote, Fabien. "La réparation des cassures double brin de l'ADN chez les mammifères:intervention séquentielle de la recombinaison non homologue puis de la recombinaison homologue." Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA11T046.

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Chayot, Romain. "Réparation des causes double brin de l'ADN par le mécanisme de non homologous end joining : des bactéries aux cellules souches." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066028.

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Abstract:

Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont contribué à démontrer que la réparation des cassures double brin (CDBs) de l’ADN par End Joining (raboutage des extrémités) est un mécanisme flexible, qui s’est adapté aux contraintes des organismes et également à celles des types cellulaires. Le Proto End Joining, que nous avons mis en évidence chez Escherichia coli, est hautement mutagène. C’est un mécanisme de secours, qui utilise des protéines également employées lors de la Recombinaison Homologue (recBCD) et vraisemblablement lors de la réplication de l’ADN (LigA). Ceci fait naître des interrogations, d’un point de vue évolutif, sur l’origine ou la co-origine des mécanismes de réplication/réparation. Le minimalisme et la flexibilité des protéines du PEJ bactérien contrastent avec la panoplie de protéines hautement spécialisées utilisées par le NHEJ chez les mammifères. Nous savions que la polymérase µ, une polymérase de la famille X, n’était pas indispensable pour l’organisme. Néanmoins, nous démontrons que cette protéine perfectionne la machinerie du NHEJ. Elle rend le complexe synaptique plus efficace et accélère la réparation des CDBs. Les conséquences de ce perfectionnement se manifestent par une meilleure réponse de la cellule aux dommages de l’ADN et finalement par une sénescence cellulaire moins accentuée. Enfin, les données préliminaires sur les cellules satellites du muscle squelettique murin, cellules indifférenciées en charge du maintien de l’homéostasie du tissu, indiquent que le NHEJ est optimisé, extrêmement rapide et très efficace. Il reste à savoir si cette plus grande efficacité est également associée à une plus grande fidélité du NHEJ.

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Mouche, Audrey. "Stabilité du génome et rôle des INGs dans la réponse aux dommages de l'ADN." Thesis, Rennes 1, 2017. http://www.theses.fr/2017REN1B015.

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Abstract:

ING2 et ING3 (Inhibitor of Growth 2 and 3) sont des protéines suppressives de tumeurs appartenant à une famille de 5 protéines ING1 à ING5. Le travail de thèse a consisté à étudier l’implication des protéines ING2 et ING3 dans la réponse aux dommages à l’ADN. Les fonctions d’ING3 en tant que gène suppresseur de tumeur sont peu connues. L’étude principale a été d’analyser l’impact de l’inhibition d’ING3 sur la réponse aux cassures double brins de l’ADN. De plus, une étude antérieure de l’équipe a observé que l’inhibition de la protéine ING2 était associée à l’accumulation de H2AX, un marqueur des cassures double brins de l’ADN. Ainsi nous avons également cherché à savoir si ING2 pouvait jouer un rôle dans la signalisation et la réparation des cassures double brins de l’ADN. Nous montrons pour la première fois un rôle d’ING3 dans la signalisation et la réparation des cassures double brins. En effet, ING3 joue un rôle crucial dans la signalisation des cassures permettant la phosphorylation et l’activation de la kinase ATM. En accord avec ces fonctions, ING3 est impliquée dans la réparation des cassures double brins par NHEJ et HR ainsi que dans la recombinaison de classe des immunoglobulines. Nous avons également montré l’implication d’ING2 dans la réponse aux cassures double brins de l’ADN. En effet, ING2 est nécessaire pour le recrutement de la protéine médiatrice de la réponse aux dommages 53BP1. Nos travaux montrent que ING2 est nécessaire pour la réparation par le mécanisme de la NHEJ. L’étude de son implication dans le mécanisme de recombinaison de classe des immunoglobulines montre qu’ING2 est un acteur essentiel de la voie classique de la NHEJ. Ces travaux identifient, pour la première fois, une fonction de type « caretaker » pour ING3 dans la réponse aux cassures doubles brins. Nous montrons une nouvelle fonction de type « caretaker » pour ING2 qui joue un rôle dans la stabilité du génome via son implication dans la réponse aux cassures double brins de l’ADN
ING2 and ING3 (Inhibitor of Growth 2 and 3) are tumor suppressor proteins belonging to the ING family (ING1 to ING5). The aim of my research project was to analyze the involvement of ING2 and ING3 proteins in response to DNA damages. The functions of ING3 as a tumor suppressor gene are little known. In the present study, we have investigated the impact of ING3 inhibition in response to DNA double strand breaks. Previous study in the lab showed . In addition, a previous study in the lab found that inhibition of ING2 protein is associated with the accumulation of H2AX, a marker of DNA double-strand breaks. Thus, we also demonstrate that ING2 plays a role in the signaling and repair of DNA double-strand breaks. In the present study, we describe for the first time the involvement of ING3 in the signaling and repair of DNA double-strand breaks. ING3 allowed the phosphorylation and activation of the ATM kinase and the repair of double strand breaks by NHEJ and HR as well as in immunoglobulin class switch recombination. We also show the involvement of ING2 in this process. Indeed, ING2 is necessary for 53BP1 recruitment in response to DNA damages and repair by the mechanism of NHEJ. ING2 was also an essential actor for the class switch recombination demonstrated that ING2 is an essential actor of the classical NHEJ pathway. This work identifies, for the first time, a "caretaker" function for ING3 in the response to DNA double strand breaks; and . We show a new caretaker function for ING2 that plays a role in the stability of the genome through its involvement in DNA damage response

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Badie, Christophe. "Influence de la réparation sur la courbe de survie :les cassures double brin de l'ADN et les aberrations chromosomiques de lignées fibroblastiques humaines." Paris 11, 1995. http://www.theses.fr/1995PA11T015.

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Bouton, Katia. "Identification et caractérisation de partenaires de la protéine SPO11 chez la souris." Montpellier 1, 2007. http://www.theses.fr/2007MON1T035.

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Abstract:

La protéine SPO11 est codée par un gène uniquement exprimé en méiose, et indispensable pour la ségrégation réductionnelle des chromosomes en première division de méiose et donc pour la fertilité. SPO11 catalyse la formation de Cassures Double-Brin (CDB) de l'ADN qui initient les événements de recombinaison méiotique. Chez S. Cerevisisiae, cette étape de CDB requiert neuf autres protéines. Contrairement à SPO11 qui est très conservée chez tous les eucaryotes, les autres protéines impliquées spécifiquement dans la formation des CDB chez S. Cerevisiae n'ont pas d'orthologues identifiés à ce jour. Mon projet de thèse a consisté à identifier et analyser des partenaires de SPO11 chez la souris. Par différentes méthodes, en particulier avec la mise en oeuvre de cribles double-hybride dans la levure, nous avons obtenu deux partenaires potentiels de SPO11 : MEI1 et SAAL1. Dans cette étude, l'interaction de SPO11 avec ces deux partenaires a été confirmée grâce à différentes méthodes : à partir de protéines traduites in vitro, in cellulo par transfection de cellules et in vivo par co-précipitation. De plus, nous avons pu montrer que MEI1 et SAAL1 interagissent, ce qui nous permet de proposer que ces trois protéines interagissent dans un même complexe. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à caractériser ces différents partenaires : étude de l'expression du gène et localisation de la protéine. Une analyse bio-informatique de SAAL1 et MEI1 a révélé que ces deux protéines possèdent une similitude de structure avec les importines nous permettant d'émettre l'hypothèse que ces deux protéines interviendraient pour la localisation cellulaire de SPO11 dans les cellules méiotiques.

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Mézard, Christine. "Reparation des cassures double-brin de l'adn par recombinaison homologue, homeologue et illegitime au cours de la transformation de la levure saccharomyces cerevisiae." Paris 6, 1994. http://www.theses.fr/1994PA066191.

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Abstract:

La premiere partie de ce manuscrit est une revue des donnees concernant la recombinaison homeologue dans differents organismes, les modes de reparation des cassures double-brin par recombinaison homologue ou par recombinaison illegitime et les caracteristiques de certains genes impliques dans ces reparations. Nous avons developpe un systeme experimental pour etudier les differentes voies de reparation, au cours de la transformation de la levure s. Cerevisiae, d'une cassure double-brin plasmidique creee in vitro, par recombinaison avec une sequence partenaire situee sur la meme molecule ou sur une autre molecule. La reparation des cassures double-brin par recombinaison entre des sequences homeologues p450 ayant 73% d'identite est efficace et a lieu par des mechanismes de recombinaison homologue. L'analyse des jonctions de ces chimeres montre qu'elle se situe dans des blocs d'identite de taille variable (4 a 22 nucleotides) partages par les sequences parentales. Lorsque les sequences ont un faible niveau d'identite (52%), la recombinaison homeologue est peu efficace. Les proteines p450 hybrides obtenues ont conserve les activites de l'un ou l'autre des parents ou acquis des activites des deux proteines parentales. Dans la souche sauvage de s. Cerevisiae, les cassures double-brin sont preferentiellement preparees par recombinaison homologue. Dans le mutant rad52, la reparation par recombinaison intermoleculaire est abolie. Par contre, la recombinaison intra moleculaire a lieu mais avec une efficacite faible. Ces resultats sont interpretes dans le cadre des modeles de reparation des cassures double-brin par recombinaison homologue et illegitime

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Dagva, Oyut. "Vers la compréhension du rôle de NucS dans l'évolution du génome de Streptomyces." Electronic Thesis or Diss., Université de Lorraine, 2024. http://www.theses.fr/2024LORR0031.

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Abstract:

Les Streptomyces, bactéries ubiquistes des sols forestiers, présentent une grande plasticité génomique. Ces bactéries possèdent un chromosome linéaire hautement compartimenté avec, en son centre, une région conservée au travers du genre, bordée par des extrémités ou bras chromosomiques particulièrement variables et sujets à la recombinaison. La réparation des cassures double-brin (DSB), dommage le plus délétère pour une cellule vivante, constitue un moteur majeur de la plasticité et de l'évolution du génome chez les Streptomyces. Une source potentielle de DSB a été découverte récemment : l'endonucléase NucS. Cette dernière joue un rôle clé au sein du système de correction des mésappariements (MMR) non-canonique, présent chez les archées et plus sporadiquement chez les bactéries avec les actinobactéries. L'objectif de ce travail est de comprendre si l'activité de NucS est impliquée dans la stimulation de la recombinaison chez les Streptomyces. Nos investigations ont révélé que la déplétion en NucS entraine une augmentation significative du taux de mutation et un phénotype colonial marqué. Les tests d'activité in vitro montrent que NucS génère une DSB au site des mésappariements G/T, G/G et T/T. Son activité est augmentée en présence du facteur de processivité de la réplication β-clamp suggérant que NucS cible les mésappariements post-réplicatifs. Une expérience d'accumulation de mutations sur le long-terme (60 cycles de croissance) montre que NucS corrige plus favorablement les mésappariements conduisant à une transition qu'à une transversion. Une augmentation graduelle du nombre de transitions depuis l'origine de réplication vers les extrémités du chromosome a été caractérisée. Ce résultat original révèle que NucS est davantage sollicitée dans les régions terminales, et pourrait favoriser la recombinaison en générant des DSB. L'augmentation de la fréquence de réarrangements dans les régions terminales dans un contexte où la fréquence des mésappariements réplicatifs est accrue renforce cette hypothèse. En effet, les mésappariements sont le substrat de NucS et la cassure double brin résultant de son activité induirait la recombinaison. Ces résultats ouvrent la voie de la compréhension de ce mécanisme paradoxal de maintien de l'intégrité du génome ; pourquoi casser le génome pour mieux le réparer ? La diversification génétique résultant de la plasticité du génome pourrait justifier de la sélection d'un tel mécanisme de réparation. Enfin, la diversification du métabolisme spécialisé chez ces organismes du sol revêt un intérêt majeur pour leur adaptation à l'écosystème, et aussi pour l'identification de nouvelles molécules d'intérêt biotechnologique
Streptomyces are ubiquitous bacteria in forest soils known for their remarkable genomic plasticity. These bacteria possess a highly compartmentalized linear chromosome, with a central region shared across the genus. This central region is bordered by variable chromosomal ends or arms that are prone to recombination. The repair of double-strand breaks (DSB), the most harmful cellular damage, is a major driver of genome plasticity and genome evolution in Streptomyces. Recently, a potential source of DSB has been identified: the endonuclease NucS, which plays a pivotal role in the non-canonical mismatch repair system (MMR) present in archaea and sporadically in bacteria, particularly in actinobacteria. The objective of this study is to determine whether NucS activity is involved in stimulating recombination in Streptomyces. Our investigations unveil that NucS depletion results in a significant increase of the mutation rate and in a marked colonial phenotype. In vitro activity tests showed that NucS generates DSB at G/T, G/G, and T/T mismatches. Its activity is enhanced in the presence of the replication processivity factor β-clamp, indicating that NucS targets post-replicative mismatches. A long-term mutation accumulation experiment conducted over 60 sporulation cycles have demonstrated that NucS is more prone to correct mismatches leading to transitions than transversions. A crescent-increase in the number of transitions from the replication origin towards the chromosome ends is observed. This original finding suggests that NucS is more active in terminal regions and could promote recombination by generating DSB. The increased frequency of rearrangements in the terminal regions in a mutant exhibiting an elevated frequency of replicative mismatches supports this hypothesis. These findings advance our understanding of this paradoxical mechanism for maintaining genome integrity: why break the genome in order to repair it better? The genetic diversification arising from genome plasticity could explain the selection of such a repair mechanism. Finally, the diversification of specialized metabolism in these soil-dwelling bacteria is of great interest both for their adaptation to the ecosystem and for the identification of new molecules with biotechnological interets

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Grabarz, Anastazja. "Réparation des cassures double brin de l'adn chez les mammifères : rôle des protéines MRE11 et BLM dans l’initiation de la ligature d’extrémités non homologues (NHEJ )." Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112172.

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Abstract:

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont des lésions qui peuvent conduire à des réarrangements génétiques. Deux voies sont impliquées dans la réparation de ces dommages: la recombinaison homologue (HR) et la ligature d’extrémités nonhomologues (NHEJ).Au laboratoire un substrat intrachromosomique permettant de mesurer l’efficacité et la fidélité du NHEJ à été mis en place (Guirouilh-Barbat 2004). Cette approche a permis de démontrer l’existence d’une voie alternative à KU qui utilise des microhomologies présentes de part et d’autre de la cassure - le NHEJ alternatif (Guirouilh-Barbat 2004, Guirouilh-Barbat et Rass 2007). Les travaux de ma thèse consistent à caractériser les principaux acteurs de cette voie. En absence de KU, cette voie alternative du NHEJ, s'initierait tout d’abord parla résection d'extrémités d’ADN non protégées. Nous avons montré que l’activité nucléasique de MRE11 est nécessaire à ce mécanisme. La surexpression de MRE11 conduit à une stimulation du NHEJ, contrairement à l’extinction de la protéine par siRNA, résultant en une baisse de son efficacité de deux fois. Nos résultats montrent également que les protéines RAD50 et CtIP agissent dans la même voie que MRE11. De plus, dans les cellules déficientes pour XRCC4, la MIRIN – un inhibiteur du complexe MRN - conduit à une chute de l'efficacité de la réparation, démontrant le rôle de MRE11 dans la voie alternative du NHEJ. Nous avons aussi montré que MRE11 peut agir de manière dépendante et indépendante de la kinase ATM (Rass et Grabarz, Nat Struct Mol Biol 2009). L'initiation de la résection de la cassure doit être ensuite poursuivie par une dégradation plus importante de l'ADN qui est assuré par les protéines Exo1 et Sgs1/Dna2 chez la levure. Chez les mammifères, des études in vitro suggèrent un modèle similaire à deux étapes. Nous avons choisi de nous intéresser au rôle de la protéine BLM, qui est l’un des homologues humains de la RecQ hélicase Sgs1, dans la résection. Nos expériences montrent que l’absence de BLM diminue l’efficacité du NHEJ. De plus, l’extinction de BLM conduit à une augmentation d’évènements infidèles lors de la réparation par NHEJ et l’apparition d’évènements de résection de grande taille (>200nt). Ceci suggère que BLM protège contre de longues résections lors de la mise en place du NHEJ alternatif. De manière cohérente, BLM est impliquée dans la protection contre la résection dépendante de CtIP lors des étapes précoces de la recombinaison homologue. En conclusion, nos résultats montrent un rôle prédominant de BLM dans la protection contre un excès de résection médiée par CtIP. BLM interagit avec 53BP1 aux sites de dommages de manière dépendante d’ATM afin de réguler le processus de résection, en contrecarrant l’action de BRCA1. Ceci souligne à nouveau le rôle essentiel de BLM dans la protection contre la résection et la favorisation de la conversion génique sans crossing-over, ce qui est primordial pour le maintien de la stabilité du génome
DNA double strand breaks (DSBs) are highly cytotoxic lesions, which can lead to genetic rearrangements. Two pathways are responsible for repairing these lesions : homologous recombination (HR) and non homologous end joining (NHEJ). In our laboratory, an intrachromosomal substrate has been established in order to measure the efficiency and the fidelity of NHEJ in living cells (Guirouilh-Barbat 2004). This approach led us to identify a KU-independent alternative pathway, which uses microhomologies in the proximity of the junction to accomplish repair – the alternative NHEJ (Guirouilh-Barbat 2004, Guirouilh-Barbat et Rass 2007). The goal of my thesis consisted in identifying and characterising major actors of this pathway. In the absence of KU, alternative NHEJ would be initiated by ssDNA resection of damaged ends. We showed that the nuclease activity of MRE11 is necessary for this mechanism. MRE11 overexpression leads to a two fold stimulation of NHEJ efficiency, while the extinction of MRE11 by siRNA results in a two fold decrease. Our results demonstrate that the proteins RAD50 and CtIP act in the same pathway as MRE11. Moreover, in cells deficient for XRCC4, MIRIN – an inhibitor of the MRN complex – leads to a decrease in repair efficiency, implicating MRE11 in alternative NHEJ. We also showed that MRE11 can act in an ATM-dependent and independent manner (Rass et Grabarz Nat Struct Mol Biol 2009). The initiation of break resection needs to be pursued by a more extensive degradation of DNA, which is accomplished in yeast by the proteins Exo1 and Sgs1/Dna2. In human cells, in vitro studies have recently proposed a similar model of a two-step break resection. We chose to elucidate the role of one of the human homologs of Sgs1 – the RecQ helicase BLM – in the resection process. Our experiments show, that he absence of BLM decreases the efficiency of end joining by NHEJ, accompanied by an increase in error-prone events, especially long-range deletions (>200nt). This suggests that BLM protects against extensive resection during alternative NHEJ. Furthermore, BLM is implicated in the protection against CtIP-dependent resection at the initiation of HR. In conclusion, our results show a major role of BLM in protecting against an excess of resection, mediated by the MRN cofactor – CtIP. BLM interacts with 53BP1 at sites of damage, in an ATM-dependent manner, in order to regulate the resection process and counteract BRCA1 activity. This underlines the novel role of BLM in the protection against resection and favouring gene conversion events without crossing-over, which is substantial for maintaining genomic integrity

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Drouet, Jérôme. "Mobilisation de protéines de la voie de jonction d'extrémités non homologues en réponse aux cassures double-brin de l'ADN dans les cellules de mammifère." Toulouse 3, 2004. http://www.theses.fr/2004TOU30243.

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Abstract:

Les cellules sont constamment exposées à de multiples facteurs endogènes ou exogènes susceptibles de compromettre l’intégrité de leur génome. Parmi les différents types de lésions de l’ADN, les cassures double-brin (CDB) sont considérées comme les dommages les plus cytotoxiques, du fait de leur pouvoir potentiellement létal voire cancérogène. Face à ce danger permanent, les cellules disposent de systèmes enzymatiques de réparation adaptés. La NHEJ (Non Homologous End Joining) est considérée comme la voie majoritaire de réparation des CDB chez les eucaryotes supérieurs. Le mécanisme biochimique précis de la NHEJ est encore largement méconnu, et l’essentiel des connaissances provient d’expériences réalisées in vitro. Dans un premier temps, nous avons testé la validité physiologique du modèle biochimique de la NHEJ, par une approche in vivo de fractionnement cellulaire optimisé basée sur une technique d’extraction par du détergent. Nous avons confirmé l’assemblage des principaux complexes de réparation, DNA-PK et Xrcc4 / DNA ligase IV, en présence de CDB in vivo, dans différentes lignées cellulaires humaines. Nous avons décrit pour la première fois un recrutement de Xrcc4 strictement dépendant de la présence physique de la DNA ligase IV, et proposons un modèle d’un rôle de la phosphorylation de Xrcc4 dans le recrutement optimisé de la DNA ligase IV sur les CDB. Nous avons de plus observé une mobilisation spécifique du complexe Xrcc4 / DNA ligase IV vers la matrice nucléaire en réponse aux CDB, et proposons un rôle de la matrice nucléaire comme site spécialisé de réparation des CDB présentant des extrémités complexes. .
Cells are constantly exposed to a variety of endogenic and exogenic factors likely to compromise their genome integrity. Among the various kinds of DNA lesions, double-strand breaks (DSB) are considered as the most cytotoxic damages due to potentially lethal, and possibly carcinogenic, effects. Facing this permanent danger, cells are equipped with adapted repairing enzymatic systems. The NHEJ (Non Homologous End Joining) is considered as the major DSB-repairing process in the case of superior eucaryotes. The precise biochemical mechanism used by the NHEJ is still not well known, and most of the present knowledge is based on in vitro experiments. In a first step, we have tested the physiological validity of the NHEJ biochemical model by an in vivo approach using optimized cell fractioning, based on a detergent-mediated extraction technique. We have confirmed the assembly of the major repairing complexes, DNA-PK and Xrcc4 / DNA ligase IV, in the presence of DSB in vivo, in several human cell lines. We have described for the first time a Xrcc4 recruitment, strictly dependent on the physical presence of DNA ligase IV, and we propose a model for the role of Xrcc4 phosphorylation on the optimized recruitment of DNA ligase IV in double-strand breakages. In addition, we observed a specific mobilization of the Xrcc4 / DNA ligase IV complex toward the nuclear matrix in response to DSB, and we propose that the nuclear matrix acts as a specialized DSB-repairing site exhibiting complex extremities. .

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Cohen, Sarah. "Le rôle de senataxine dans la résolution des hybrides ARN : ADN aux cassures double brins de l'ADN." Thesis, Toulouse 3, 2019. http://www.theses.fr/2019TOU30125.

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Abstract:

Les gènes transcriptionellement actifs peuvent être la source de l'instabilité du génome via de nombreux mécanismes. Ces gènes sont caractérisés par la formation de structures secondaires telles que les hybrides ADN : ARN. Ils se forment lorsque l'ARN sortant l'ARN polymérase II s'hybride au simple brin d'ADN. De nombreuses études ont montrées que l'accumulation de ces hybrides peut mener à la création de dommages à l'ADN. Parmi ces dommages, les Cassures Double Brins (CDB) sont les plus dangereuses pour la cellule puisqu'elles peuvent produire des mutations et des réarrangements chromosomiques. Il existe deux mécanismes de réparation majeurs dans la cellule : la Jonction Non-Homologue des Extrémités (NHEJ) et la Recombinaison Homologue (HR). Mon équipe a récemment montré que les CDB localisées dans les gènes transcrits sont préférentiellement réparés par HR. De plus, de nombreuses études ont montrées une interaction entre transcription et réparation des CDB. Au vue de ces résultats, nous avons donc émis l'hypothèse que les gènes transcriptionellement actifs pourraient être réparés par un mécanisme spécifique nécessitant l'activité de protéines associées à la transcription : "Réparation couplée à la transcription". Durant ma thèse, je me suis intéressée au rôle de deux protéines dans la réparation des régions transcrites en utilisant la lignée cellulaire DIvA (DSB Induction via AsiSI) qui permet l'induction de cassures annotées sur tout le génome. Premièrement, nous avons montré que la réparation des CDB dans des loci transcrits nécessitent une hélicase ADN : ARN connue : sénataxine (SETX). Après induction d'une cassure dans un gène, SETX est recrutée ce qui permet la résolution d'hybride ADN : ARN (cartographié par DRIP-seq). Nous avons aussi montré que SETX permet le recrutement de RAD51 et limite les jonctions illégitimes des CDB et par conséquent promeut la survie des cellules après induction des cassures. Cette étude montre que les CDB dans les loci transcrits requièrent la résolution spécifique des hybrides ADN : ARN par SETX pour permettre une réparation précise et est absolument indispensable pour la survie cellulaire. Deuxièmement, nous avons montré une interaction entre SETX et Bloom (BLM) une G4 DNA hélicase dans la réparation des CDB dans les régions transcrites. Nous avons montré que BLM est aussi recrutée au CDB dans les loci transcrits où elle est nécessaire à la résection et à la fidélité de réparation. De façon importante, nous avons montré que la déplétion de BLM restaure le défaut de survie cellulaire observé dans les cellules déplétées pour SETX après induction des CDB. La déplétion d'autres hélicases G4 (RTEL1, FANCJ) promeut aussi la survie des cellules déplétées pour SETX après dommages. Ces résultats suggèrent une interaction entre les hélicases G4 et la résolution des hybrides ADN : ARN dans la réparation des gènes actifs. En conclusion, ces études permettent une meilleure compréhension de la spécificité de la réparation des régions transcrites du génome, et notamment l'identification de protéines impliquées dans la "Réparation couplée à la Transcription"
Actively transcribed genes can be the source of genome instability through numerous mechanisms. Those genes are characterized by the formation of secondary structures such as RNA-DNA hybrids. They are formed when nascent RNA exiting RNA polymerase II hybridizes single stranded DNA. Numerous studies have shown that RNA-DNA hybrids accumulation can lead to DNA damages. Among those damages, DNA double strand breaks (DSB) are the most deleterious for cells since they can generate mutations and chromosomal rearrangements. Two major repair mechanisms exist in the cell: Non-Homologous End-Joining (NHEJ) and Homologous recombination (HR). My lab showed recently that DSB occurring in transcribed genes are preferentially repaired by HR. Moreover, multiple studies have shown a cross talk between transcription and DSB repair. Those results led us to propose that actively transcribed genes could be repaired by a specific mechanism implicating proteins associated with transcription: "Transcription-coupled DSB repair". During my PhD, using the DIvA (DSB Induction via AsiSI) cell line allowing the induction of annotated DSB through the genome, I worked on 2 projects focusing on DSB repair in transcribed genes. First, we showed that DSB repair in transcribed loci requires a known RNA: DNA helicase: senataxin (SETX). After DSB induction in an active gene, SETX is recruited which allows RNA-DNA hybrid resolution (mapped by DRIP-seq). We also showed that SETX activity allows RAD51 loading and limits DSB illegitimate rejoining and consequently promotes cell survival after DSB induction. This study shows that DSB in transcribed loci require specific RNA-DNA hybrids removal by SETX for accurate repair. Second, we showed an interplay between SETX and Bloom (BLM) a G4 DNA helicase in DSB repair induced in transcribed loci. We showed that BLM is also recruited at DSB in transcribed loci where it promotes resection and repair fidelity. Strikingly, we showed that BLM depletion rescued the survival defects observed in SETX depleted cells following DSB induction. Knock down of other G4-helicases (RTEL1, FANCJ) also promoted cell survival in SETX depleted cells upon damage. Those data suggest an interplay between G4 helicases and RNA: DNA resolution for DSB repair in active genes. Altogether, these studies promote a better understanding of the specificity of DSB repair in transcriptionally active genes, and notably identification of proteins involved in "Transcription-coupled DSB repair"

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Wu, Pei-Yu. "Le complexe de ligation dans la réaction de réparation des cassures de l'ADN par recombination non homologué." Toulouse 3, 2008. http://www.theses.fr/2008TOU30064.

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Abstract:

Les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont produites lors d'événements physiologiques ou physiopathologiques comme la recombinaison V(D)J, le blocage de fourches de replication, ou bien induites par des agents physiques ou chimiques à activité clastogène. Les CDB représentent une lésion hautement toxique et sont réparées par recombinaison homologue ou par recombinaison non-homologue (NHEJ). Chez les mammifères, la voie NHEJ représente le processus majoritaire de réparation responsable de la survie cellulaire après endommagement de l'ADN. Suite à la production de CDB, par exemple par des rayonnements ionisants (RI), l'he��térodimère Ku70/80 se lie aux extrémités de la cassure et recrute la sous-unité catalytique DNA-PKcs. Ce Complexe-1 ou DNA-PK (i. E Ku70/Ku80/DNA-PKcs) forme une synapse qui maintient rapprochées les extrémités de la cassure, acquiert une activité sérine-thréonine kinase qui par auto-phosphorylation de la DNA-PKcs induit un changement de conformation favorisant le recrutement du 2ème complexe impliqué dans la ligation des extrémités. Ce Complexe-2 est un hétérotrimère composé de XRCC4, Ligase IV et Cernnunos-XLF. Ce travail a eu pour objectif de mieux comprendre les interactions internes et externes des partenaires du Complexe-2. Nous avons établi le domaine minimal d'interaction fonctionnelle de la Ligase IV (XIR-BRCT2) avec XRCC4 et montré que son expression cellulaire induit une sensibilisation au RI et autres agents clastogènes. Le mécanisme de sensibilisation repose sur un déplacement de la Ligase IV du Complexe-2 suivie de sa dégradation aboutissant à une perte de recrutement stable du complexe sur la chromatine endommagée. .
DNA double-strand breaks (DSBs) are the most lethal threats among all the DNA damages in cells. They can arise not only endogenously from normal physiological processes such as V(D)J recombination or toxic lesions like DNA replication forks collapses, but also exogenously from DNA damaging agents like ionizing radiation (IR) or radiomimetic compounds. In mammals, DSBs are mainly repaired by homologous recombination (HR) during S and G2 phases of the cell cycle when sister chromatids are available, and, more predominantly, in all the phases of cell cycle by the non-homologous end-joining (NHEJ) pathway without any requirement for homology guidance. The NHEJ machinery is also involved in V(D)J recombination to rearrange B-cell immunoglobulin and T-cell receptor genes. Deficiency in NHEJ consequently results in hypersensitivity to IR, immunodeficiency, as well as chromosomal instability. After DSBs induction, Ku70/Ku80 heterodimer binds to free DNA ends, allowing the subsequent recruitment and activation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs). The resulting DNA-PK holoenzyme (i. E. Ku/DNA-PKcs or Complex-1) tethers two DNA termini and form the synaptic complex that may further activates DNA-PKcs by several (auto)phosphorylation events. Upon activation, Complex-1 undergoes conformational changes to accommodate the ligation complex (Complex-2) and accessory factors that make DNA ends compatible with ligation, when necessary. Complex-2 comprises XRCC4, DNA LigIV (LigIV) and the more recently identified factor Cernunnos-XLF (Cer-XLF). The three partners interact with each other and Complex-2 also binds Complex-1 and accessory factors, thus accounting for its highly efficient end-joining activity. In this work we aimed at characterizing the intimate interaction network between Complex-2 factors. .

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Menchon, Grégory. "Criblage virtuel et fonctionnel sur le complexe XRCC4/ADN ligase IV/Cer-XLF de ligature des cassures double-brin de l'ADN : application en radiosensibilisation tumorale." Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30395.

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Abstract:

En cancérologie, la radiothérapie est une des armes essentielles pour éradiquer les cellules tumorales. Les cassures des deux brins de l'ADN dites "double-brin" qu'elle induit sont particulièrement toxiques et constituent la principale cause de mort cellulaire. La NHEJ (Jonction d'Extrémités Non-Homologues) est la voie métabolique majeure de réparation de ces cassures double-brin de l'ADN et par ce mécanisme, les cellules humaines adoptent une résistance à la radiothérapie. Ce mécanisme de réparation constitue donc une cible de choix pour un traitement anticancéreux combiné en vue d'augmenter la sensibilité des cellules cancéreuses aux rayons ionisants (radiosensibilisation). Au cours du mécanisme NHEJ, la ligature finale des extrémités d'ADN est assurée par le complexe protéique tripartite: XRCC4/ADN Ligase IV/Cernunnos-XLF. Les interfaces protéiques concernées représentent toutes des cibles potentielles dans une stratégie rationnelle d'isolement de molécules inhibitrices, guidée par les structures tridimensionnelles de chaque protéine. A travers des expériences de criblage virtuel et de validation à la fois biophysique et biochimique, nous avons isolé les premières molécules capable de prévenir in vitro les interactions protéine-protéine pour les complexes XRCC4/Lig4 et XRCC4/Cer-XLF, respectivement. Ces composés sont des points de départ pour l'élaboration d'inhibiteurs potentiels de plus haute affinité grâce à l'apport de la biologie structurale, en vue d'un effet radiosensibilisant cellulaire
Radiotherapy is a major weapon used against cancer. Radio-induced DNA double strand breaks (DSB) are the main lesions responsible for cell death. Non-homologous end-joining (NHEJ) is a predominant DSB repair mechanism which contributes to cancer cells resistance to radiotherapy. NHEJ is thus a good target for strategies which aim at increasing the radio-sensitivity of tumors. Through in silico screening and biophysical and biochemical assays, our objective was to find specific ligands for the XRCC4/Lig4 and XRCC4/Cer-XLF protein-protein interactions involved in NHEJ. Here, we isolated the first compounds able to prevent their interaction in vitro. These early stage inhibitors are promising tools for cancer therapy with the hope to develop more specific compounds for cellular assays through the 3D structure of the protein/inhibitor complexes

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Marmignon, Antoine. "Couplage entre introduction et réparation des cassures double brin pendant les réarrangements programmés du génome de Paramecium tetraurelia." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00923174.

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Abstract:

L'élimination programmée d'ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double brin (CDB) de l'ADN et la préservation de l'intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l'introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l'excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l'élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L'implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l'excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n'y a pas de jonctions d'excision formées et les extrémités cassées s'accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L'hypothèse d'une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l'utilisation de microhomologie, a été émise. C'est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d'extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l'ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d'un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l'introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.

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Mosbach, Valentine. "Contraction de répétitions de trinucléotides par induction ciblée d'une cassure double brin." Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066040.

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Abstract:

Les répétitions de trinucléotides sont des séquences répétées en tandem pouvant subir, chez l'homme, de larges expansions à l'origine de nombreuses maladies génétiques. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est due à l'expansion d'une répétition CTG en 3'UTR du gène DMPK. Les mécanismes d'instabilités des répétitions, peu connus, reposeraient sur leur capacité à former des structures secondaires constituant un obstacle aux mécanismes impliquant une synthèse d'ADN. Nous avons montré qu'une TALEN induisant une cassure double brin dans les répétitions CTG à l'origine de la DM1 insérées chez la levure Saccharomyces cerevisiae permettait de manière efficace et spécifique d'aboutir après réparation à leur contraction. Le mécanisme de réparation est dépendant uniquement de deux gènes, RAD50 et RAD52, suggérant la formation de structures aux extrémités de la DSB devant être retirées pour initier la réparation, suivis d'une réaction de SSA entre les répétitions aboutissant à leur contraction. L'efficacité et spécificité d'un système CRISPR-Cas9 à contracter ces répétitions chez la levure ont été comparées à la TALEN. L'induction de CRISPR-Cas9 n'aboutit pas à la contraction des répétitions mais à des réarrangements chromosomiques suggérant un manque de spécificité et un mécanisme de réparation différent de celui de la TALEN. Enfin, nous avons étudié si ces nucléases peuvent contracter ces répétitions CTG à des tailles non pathologiques dans des cellules de mammifères. L'induction de la TALEN dans des cellules de souris transgéniques DM1, puis dans des fibroblastes humains de patients DM1 montre des résultats préliminaires encourageant de contraction des répétitions
Trinucleotides repeats are a specific class of microsatellites whose large expansions are responsible for many human neurological disorders. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is due to an expansion of CTG repeats in the 3’UTR of DMPK gene, which can reach thousands of repeats. Molecular mechanisms leading to these large expansions are poorly understood but in vitro studies have shown the capacity of these repeats to form secondary structures, which probably interfere with mechanisms involving DNA synthesis. We shown that a TALEN used to induce double-strand break (DSB) in DM1 CTG repeats integrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae is specific and leads to highly efficient repeat contractions after repair. Mechanism involved in TALEN-induced DSB only depends of RAD50 and RAD52 genes, suggesting the formation of secondary structures at DSB ends that need to be removed for repair initiation, followed by an intramolecular recombinaison repair such as SSA between repeats leading to their contraction. We compared the efficiency and specificity of a CRISPR-Cas9 and the TALEN to contract CTG repeats in yeast. Surprisingly, CRISPR-Cas9 induction do not lead to repeat contraction but to chromosomal rearrangement, suggesting a lack of specificity and a different repair mechanism than with the TALEN. At last, we studied whether these nucleases could contract CTG repeats to a non-pathological length in mammalian cells. Finally, TALEN induction in DM1 transgenic mice cells, and in DM1 human fibroblasts show promising repeat contractions

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Marangoni, Elisabetta. "La protéine KU86 : une cible pour la modulation de la radiosensibilité des cellules de mammifères." Paris 11, 2000. http://www.theses.fr/2000PA11T069.

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Abstract:

Les cassures double brin de - l'ADN (CDB) sont considérées comme les lésions majeures responsables de la mort cellulaire inquite par les radiations ionisantes. Dans les cellules de mammifères elles sont réparées par un mécanisme de ligation qui implique différents complexes de protéines, dont le complexe DNA-PK (DNA-dependent Protein Kinase). Ce complexe DNA-PK est composé d'un hétérodimère à fonction régulatrice, Ku70/Ku86, impliqué dans la détection et la liaison aux CDB, et d'une large sous-unité catalytique (DNA PKcs). Le but de notre travail a été de cibler la protéine Ku86 dans des cellules de rongeurs et humaines radiorésistantes, afin de diminuer sa fonction (détection des CDB) et donc d'augmenter la radiosensibilité de ces cellules. Nous avons utilisé des approches de dominance négative et d'antisens dans les différents modèles cellulaires. Les résultats obtenus dans les fibroblastes nous ont permis de conclure que la protéine Ku86 est nécessaire pour l'activation du complexe DNA-PK et que son activation conduit à une déficience importante dans la réparation des CDB et à une augmentation significative de la radiosensibilité. L'utilisation d'oligonucléotides antisens a mis en évidence des troubles sévères dans la prolifération cellulaire quand les niveaux de la protéine Ku86 sont fortement diminués, ce qui pourrait suggérer un nouveau rôle de l'hétérodimère Ku70/Ku86. Les résultats obtenus dans les cellules tumorales humaines ont été variables selon l'approche utilisée et semblent confirmer l'importance du complexe DNA-PK dans la réponse aux radiations ionisantes, en suggérant toutefois que d'autres mécanismes de réparation des CDB pourraient compenser l'absence de Ku86 et contribuer au phénotype radiorésistant de certaines lignées tumorales.

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Dissertations / Theses on the topic 'Cassures double brin de l'ADN'

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