Academic literature on the topic 'CDC25Mm'

Le proteine Ras sono proteine G monomeriche, a basso peso molecolare e dotate di una bassa attività GTPasica intrinseca che svolgono un ruolo chiave nelle vie di trasduzione del segnale coinvolte in processi di crescita e differenziamento cellulare. Ras può funzionare come un vero e proprio interruttore molecolare, trovandosi alternativamente in due stati: uno attivo (legato a GTP) ed uno inattivo (legato a GDP). I passaggi dallo stato attivo a quello inattivo e viceversa possono avvenire spontaneamente, ma la velocità delle due reazioni in questo caso sarebbe molto bassa. Per questo motivo l’attività di Ras è regolata da due classi di proteine. Le proteine GAP (GTPase Activating Protein) sono in grado di catalizzare una più efficiente idrolisi del nucleotide da GTP a GDP, portando all’inattivazione di Ras. I GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors), invece, sono in grado di favorire la dissociazione del nucleotide idrolizzato ed il conseguente scambio GDP/GTP, contribuendo alla modulazione positiva del pathway. Varianti mutate dei geni ras sono state identificate con alta incidenza in molteplici forme di patologie tumorali. Per tale ragione le proteine Ras sono considerate target molecolari d’eccellenza nella terapia di disordini proliferativi. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato come una singola sostituzione amminoacidica all’interno del GEF Ras-specifico Cdc25Mm sia in grado di convertire lo stesso in una proteina dotata di proprietà dominanti negative, capace di inibire specificamente l’attività di Ras in vitro e di attenuarne il circuito di segnalazione in vivo, diminuendo il potenziale oncogenico di fibroblasti murini trasformati dall’oncogene k- ras. Inoltre, recentemente abbiamo dimostrato come anche singoli peptidi isolati dall’intero GEF (derivati dalle zone recanti le mutazioni puntiformi di cui sopra) mantengano, almeno parzialmente tali proprietà. Scopo della presente tesi è lo sviluppo di peptidi derivati del GEF Cdc25Mm come agenti Ras inibitori e la loro validazione in linee cellulari di tumore alla vescica. Considerato il meccanismo d'azione di tali peptidi, un requisito fondamentale per il loro funzionamento nei modelli cellulari d'interesse è la presenza di una correlazione tra il fenotipo trasformato di quest'ultimi e lo stato di attivazione di Ras. Dal momento che dati di letteratura suggeriscono un coinvolgimento del fattore di crescita IGF-I nelle patologie tumorali della vescica e dato il noto collegamento tra tale fattore di crescita ed il pathway di Ras, abbiamo inizialmente analizzato gli effetti della stimolazione da IGF-I su due linee cellulari derivate da carcinoma alla vescica (5636 e T24). Sorprendentemente tale fattore di crescita non ha evidenziato grandi effetti sul potenziale proliferativo delle linee oggetto di studio, rivelandosi tuttavia estremamente efficace nello stimolare una aumentata motilità cellulare, come evidenziato da saggi di migrazione, invasione e wound-healing. A livello molecolare tali effetti sono accompagnati da un forte innalzamento dei livelli di Ras•GTP e dalla successiva attivazione delle vie di segnalazione a valle di Ras, come MAPK e AKT. La stimolazione da IGF-I è inoltre in grado di determinare la fosforilazione e l'attivazione di Paxillina (una proteina adattatrice nota per il suo importante ruolo nei fenomeni di migrazione cellulare) e la sua colocalizzazione con FAK (Focal Adhesion Kinase) a livello dei punti di adesione focale. Infine, tale attivazione di Paxillina, così come l'aumentata motilità cellulare indotta da IGF-I, risulta essere dipendente, in modo diretto o indiretto, dall'attività di MAPK e AKT. L'utilizzo di inibitori chimici di suddette vie o di siRNA specifici per le suddette chinasi in grado di regolarne negativamente l'espressione è in grado di attenuare infatti gli effetti indotti da IGF-I sia a livello biochimico sia a livello fenotipico. Nel complesso, questi dati evidenziano come il pathway dell'IGF-I sia di fondamentale importanza nella regolazione della motilità in cellule tumorali di vescica, fenomeno strettamente collegato al potenziale metastatico. Questi stessi dati suggeriscono inoltre l'importanza per questi stessi fenomeni di due vie di trasduzione parallele (MAPK e AKT), la cui attivazione potrebbe tuttavia essere guidata da un unico segnale a monte, ovvero l'innalzamento dei livelli di Ras•GTP. Per questo motivo lo sviluppo di molecole Ras inibitorie altamente specifiche, in grado di attenuare il circuito di segnalazione a monte di entrambe le suddette vie, potrebbe risultare di enorme interesse per il trattamento della patologia in esame. Per questo motivo abbiamo esplorato la possibilità di migliorare le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche dei peptidi derivati da Cdc25Mm e dotati di proprietà Ras sequestranti. Allo scopo di ottenere una migliore veicolabilità in cellula, ad esempio, tali peptidi sono stati ingegnerizzati tramite l'aggiunta della sequenza responsabile delle proprietà auto-penetranti della proteina Tat. Tale sequenza (PTD, Protein-Transduction-Domain, aa 47-57 YGRKKRRQRRR) è costituita prevalentemente da aminoacidi carichi positivamente ed è in grado di veicolare l’internalizzazione di molteplici proteine, fungendo da carrier. Abbiamo innanzitutto dimostrato, tramite saggi di transattivaizone fos-luciferasici, come l'aggiunta di tale dominio non alteri in maniera significativa le proprietà inibitorie dei peptidi di partenza e come tali peptidi siano in grado di essere effettivamente internalizzati da cellule di mammifero (fibroblasti murini NIH3T3) qualora somministrati nel mezzo di coltura. Successivamente la ricerca è proseguita con l'ottenimento di varianti più piccole dei peptidi in oggetto, presumibilmente dotate di migliori proprietà farmacocinetiche e facilmente sintetizzabili a livello industriale. È stato quindi effettuato un design struttura-guidato, sulla base degli elementi di struttura primaria e secondaria maggiormente coinvolti nell’interazione Ras•GEF. Le varianti minimizzate sono state quindi selezionate sulla base delle proprietà Ras inibitorie misurate tramite saggi di transattivazione fos-luciferasici ed i candidati più promettenti ottenuti tramite sintesi chimica. Dato il ruolo cruciale emerso a carico delle vie di trasduzione a valle di Ras nei fenomeni di migrazione ed invasioni stimolati dalla presenza di IGF-I in linee cellulari di vescica, tali peptidi sono stati testati in saggi di migrazione ed invasione nei modelli cellulari caratterizzati precedentemente. Tutti i peptidi Ras inibenti, anche se con intensità diversa, si sono rivelati estremamente attivi nel ridurre l'aumentata motilità indotta da IGF-I delle cellule in esame a concentrazioni sub-μM.

Les phosphatases à double spécificité de la famille CDC25 jouent un rôle prépondérant à différents points du cycle cellulaire en activant les complexes CDK/Cyclines. Afin de restreindre l'activation de ces complexes, les CDC25s, au nombre de trois (A, B et C) dans les cellules de mammifères, sont finement régulées au cours du cycle cellulaire tant au niveau de leur activité, de leur localisation que de leur stabilité. La phosphatase CDC25B, en activant initialement le complexe CDK1/Cycline B au niveau des centrosomes, est considérée comme le starter de la mitose. Bien que dégradée par le protéasome, peu d'informations sur la régulation de sa dégradation étaient connues. Le but de ce travail a donc été de caractériser le(s) mécanisme(s) impliqué(s), ainsi que les déterminants moléculaires présents sur CDC25B, régulant sa stabilité au cours du cycle cellulaire. Une étude in cellulo de différents mutants ponctuels de la protéine nous a permis d'identifier le motif DDGFVD comme étant nécessaire à l'interaction de CDC25B avec la protéine F-Box TrCP. La perte de cette interaction entraîne une stabilisation de CDC25B à la transition métaphase-anaphase. Cette stabilisation anormale de CDC25B engendre un retard de sortie de mitose accompagné de défauts cellulaires caractéristiques d'une instabilité génétique accrue et d'une fragmentation du matériel péricentriolaire. Par ailleurs, par vidéomicroscopie nous avons observé que les cellules exprimant le mutant stabilisé de CDC25B présentent des caractéristiques morphologiques différentes des cellules exprimant la protéine sauvage, avec une vitesse de déplacement plus importante. Sachant que la surexpression de CDC25B est détectée dans de nombreux cancers généralement très agressifs, et que, comme nous l'avons montrée, une stabilisation de CDC25B en mitose induit une instabilité génétique, nous pouvons supposer que dans certains cancers cette surexpression pourrait résulter d'un défaut de dégradation de la phosphatase. Aussi, une meilleure compréhension des mécanismes de dégradation de CDC25B permettrait d'envisager le développement d'approches thérapeutiques ayant pour but d'agir sur sa stabilité<br>CDC25 proteins are highly conserved dual specificity phosphatases that play an essential role by activating the CDK/Cyclin complexes all along the cell cycle. To restrain CDK/Cyclin activities, these phosphatases must be tightly regulated in terms of activity, localization and stability. One of the three mammalian members, CDC25B, is considered as the starter of the mitosis through the activation of CDK1/Cyclin B complexes at the centrosomes, at the G2-M transition. This protein is known to be degraded by the proteasome but the exact mechanisms involved in this process are still unclear. To obtain a deeper insight into the regulation of CDC25B stability, we have investigated the molecular determinants and the exact mechanisms involved in CDC25B degradation in vitro as well as in cellulo. Analysis of various mutants of CDC25B led us to identify the DDGFVD motif as a motif required for the interaction of CDC25B with the F-box protein TrCP. The lack of interaction causes a stabilisation of the phosphatase in metaphase-anaphase transition. This stabilisation entails a delay in mitotic exit and several cellular defects related to genetic instability, and the fragmentation of pericentriolar matrix during mitosis. Videomicroscopy's observations indicate that cells expressing the stabilized mutant of the CDC25B exhibit an increased mobility compared to cells expressing wild type protein. Since CDC25B is frequently overexpressed in many cancers cells and that a stabilisation of the protein entails genetic instability, we propose that in some cancers this overexpression could be a consequence of a lack of CDC25B degradation. A better understanding of mechanisms regulating CDC25B degradation could lead to new therapeutical approaches focused on the control of CDC25B stability

The Cdc25 phosphatases are highly conserved from yeast through humans and play pivotal roles in regulating the activities of cyclin-dependent kinases (Cdks). Cdc25A is one of three human Cdc25 family members, and has previously been shown to be overexpressed in numerous cancers and to transform rodent fibroblasts. Cdc25A therefore represents a rational target for chemotherapeutic development. Further, a thorough understanding of its biology and regulation in normal and transformed cells may facilitate the development of strategies to specifically interfere with the proliferation of cancerous cells. In this work I describe experiments which demonstrate that bisperoxoVanadium compounds, and specifically bpV(Me2Phen), inhibit Cdc25A phosphatase in vitro and in vivo. Further, these compounds cause cell-cycle arrest, are cytotoxic to cancer cells, and slow the growth of tumours in mouse models. With respect to the fundamental biology of Cdc25A, I have identified a sequence element (NLS) responsible for nuclear localization of Cdc25A phosphatase. An analysis of this sequence demonstrated high conservation of flanking phosphoacceptor sites, notably Serine 292. S292 was predicted to be a consensus PKA or CamKII substrate. Using site-directed mutagenesis I have shown that S292 is the sole site of PKA phosphorylation in vitro. The functional importance of S292 phosphorylation was investigated via transfections of phospho-mimetic mutants of S292 (S292E) expressed as GFP-fusion proteins; these studies indicate that S292 phosphorylation may promote nuclear localization. Studies by other groups have indicated that S292 is a phosphorylation site for inhibitory kinases, namely Chk1 and Chk2 (4). I generated a phospho-specific antibody to this site and demonstrate by immunofluorescence and western blotting an unexpected pattern of S292 phosphorylation associated with nuclear bodies and the mitotic apparatus. I provide evidence to suggest that these sites represent local fine-tuning of Cdc25A, allowing Cdk activity to be controlled at the level of specific subcellular structures. These studies highlight the complexity of Cdc25 regulation and indicate a previously unappreciated degree of control of their activity such that these enzymes exist in multiple discrete pools within a given cell.

A fosfatase Cdc25B atua na progressão do ciclo celular através da ativação de complexos Cdk/Ciclina. Atualmente, nos modelos estruturais propostos do domínio catalítico da Cdc25B não estão incluídos os últimos 16 resíduos da região C-terminal. Este segmento tem importante papel no reconhecimento do substrato proteico e pode estar envolvido na complexação de pequenas moléculas com a Cdc25B. Assim, o principal objetivo desta tese foi avaliar a flexibilidade conformacional do domínio catalítico completo da Cdc25B em solução através de simulações computacionais e por medidas experimentais de ressonância magnética nuclear (RMN). A similaridade entre as estruturas cristalográficas e em solução foi confirmada pela previsão de ângulos diedrais &#966;/&#968; da cadeia principal a partir dos deslocamentos químicos (CS) e pela concordância entre os acoplamentos dipolares residuais (RDC) medidos e calculados a partir da geometria cristalina. Medidas de parâmetros de relaxação de 15N e RDC evidenciaram a presença de desordem conformacional na região C-terminal, em acordo com a ausência de densidade eletrônica desse segmento no experimento de difração de raios-X. Através da comparação entre CS experimentais e previstos de simulações de dinâmica molecular (DM) longas (total de 6&#181;s de duração) foram apontados artefatos de cristalização, possíveis erros nos campos de força usados nas simulações, falhas na composição do sistema simulado e estados conformacionais populados pela Cdc25B em solução distintos da geometria cristalográfica. De maneira geral, os CS previstos a partir das simulações para a flutuação estrutural dos resíduos da região C-terminal desordenada estão em acordo com os valores experimentais, sugerindo que os estados conformacionais deste segmento foram razoavelmente bem amostrados nas simulações. Em particular, verificou-se que o contato tipo cátion-&#960; entre as cadeias laterais dos resíduos 550W do C-terminal desordenado e 482R do núcleo proteico, ausente na estrutura cristalográfica, pode ser importante em solução. A formação desse contato na simulação de DM também está de acordo com medidas experimentais de perturbação de deslocamentos químicos (CSP) entre construções completa e truncada do domínio catalítico da Cdc25B. Assim, através do uso conjunto de simulações computacionais e medidas experimentais foi possível obter uma representação mais completa e realista da flexibilidade conformacional do domínio catalítico da Cdc25B em solução, incluindo a determinação de possíveis contatos intramoleculares entre a região C-terminal desordenada e o núcleo proteico. Essas informações poderão ser usadas na construção de um ensemble conformacional da Cdc25B.<br>Cdc25B phosphatase acts on the progression of cell cycle through the activation of Cdk/Cyclin complexes. Currently, the proposed structural models of Cdc25B catalytic domain lack the last 16 residues from the C-terminal region. This segment is important for protein substrate recognition and might be involved in small molecule binding to Cdc25B. Thus, the main goal of this thesis was to evaluate the conformational flexibility of the complete catalytic domain from Cdc25B through computer simulations and experimental nuclear magnetic resonance (NMR) measurements. Similarity between crystal and in solution structures was confirmed by the prediction of backbone &#966;/&#968; dihedral angles from chemical shifts (CS) and by the agreement between observed and back-calculated residual dipolar couplings (RDC). 15N relaxation and RDC measurements pointed to the conformational disorder of the C-terminal region, in agreement with the X-ray diffraction experiment where this segment showed no electronic density. Comparison between experimental and predicted CS from long molecular dynamics (MD) simulations (6&#181;s total running time) pointed to the presence of crystallographic artifacts, possible deficiencies in simulation force fields, inaccurate composition of the simulated system and conformational states visited by Cdc25B in solution that were not observed in the crystallographic geometry. Generally, CS predicted from simulations for the structural fluctuation of the disordered C-terminal region were in agreement with experimental values, suggesting that the simulations sampled the conformational states populated by this segment reasonably well. In particular, a cation-&#960; contact not observed in the crystal structure between side chains of residue 550W from the disordered C-terminal tail and residue 482R from the protein core might be important in solution. This contact is also in agreement with experimental chemical shift perturbations (CSP) measured between complete and truncated constructs of Cdc25B catalytic domain. Therefore, the joint use of computer simulations and experimental measurements allowed the achievement of a more complete and realistic representation of the conformational flexibility of the Cdc25B catalytic domain in solution, including intramolecular contacts between the disordered C-terminal region and the protein core. This information might be used to obtain a conformational ensemble of Cdc25B.

L'activation séquentielle des Kinases Dépendantes des Cyclines (CDK), associées à leur sous-unité régulatrice la cycline, contrôle la progression des cellules eucaryotes dans le cycle cellulaire. L'activité des complexes CDK/cycline est notamment régulée par une balance entre phosphorylation inhibitrice (Wee, Myt) et déphosphorylation activatrice par les phosphatases CDC25. Dans les cellules humaines, trois phosphatases à double spécificité CDC25A, B et C sont impliquées dans la régulation de ces complexes en différents points du cycle cellulaire. CDC25A agit à la transition G1/S alors que CDC25C contrôle l'entrée en mitose. Par contre, CDC25B agirait en phase S ainsi qu'à la transition G2/M. L'existence de trois variants de CDC25B (B1, B2 et B3) issus d'un épissage alternatif pourrait expliquer cette controverse. Afin d'étudier les rôles et les implications de chaque variant de CDC25B, nous avons d'abord étudié leur régulation par la protéine kinase CK2, kinase qui pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la transition G2/M. Nos études in vitro ont démontré que CK2 phosphoryle les trois variants de CDC25B mais pas la protéine CDC25C. Une analyse par spectrométrie de masse de CDC25B indique qu'au moins deux résidus, les sérines 186 et 187, sont phosphorylés in vitro par CK2. De plus, CDC25B interagit avec CK2 in vitro et in vivo dans des cellules humaines et d'insectes. Enfin, la phosphorylation de CDC25B par CK2 augmente son activité phosphatase in vitro ainsi qu'in vivo. CK2 est donc un régulateur positif de l'activité catalytique des CDC25B. Au cours du cycle cellulaire ou en réponse aux points de contrôle, CDC25B est également régulée au niveau de sa localisation intracellulaire. En effet, la phosphatase réalise une navette entre le cytoplasme et le noyau, navette qui peut être régulée notamment par phosphorylation. Nous avons montré que la protéine kinase AKT/PKB phosphoryle in vitro CDC25B sur la sérine 353 et qu'elle provoque son accumulation dans le cytoplasme. L'activation d'AKT/PKB par le peroxyde d'hydrogène reproduit la relocalisation de CDC25B. Par contre, si la mutation de la sérine 353 abolit sa phosphorylation par AKT/PKB, elle n'induit qu'un retard dans la relocalisation cytoplasmique de CDC25B ce qui indique que d'autres mécanismes participent à ce phénomène. Ainsi nos différents travaux ont permis d'identifier deux nouveaux régulateurs de CDC25B, CK2 qui régule son activité catalytique et AKT/PKB qui participe au contrôle de sa localisation intracellulaire, et nous permettent de mieux comprendre la régulation de cette phosphatase même si de nombreux partenaires doivent encore être identifiés.

The dual specificity Cdc25 phosphatases regulate mitosis and are expressed in eukaryotes. Cdc25 phosphatases have an active site motif, HCX5R, in common with other phosphatases. However, unlike the classical tyrosine phosphatases, they can dephosphorylate phospho-threonine in addition to phospho-tyrosine and have a much shallower active site. Increased expression of Cdc25 is correlated with poor prognosis in a range of cancers. In particular, increased expression of Cdc25C has been associated with prostate cancer making this protein an attractive target for drug discovery. However, drug discovery for these proteins has been hampered due to the shallow nature of the active site, difficulty in identifying specific inhibitors and toxicity. The thesis aim was to structurally and biochemically characterize Cdc25C using a range of techniques which include NMR, SAXS and X-ray crystallography in order to aid future drug design. The Characterisation of the Cdc25C full length revealed the regulatory domain to be intrinsically disordered and flexible. Construct and solution conditions were optimised to improve the solubility of the Cdc25C catalytic domain. Although, the \(^1\)H, \(^1\)\(^5\)N HSQC was well dispersed backbone assignments proved to be refractory. From a panel of inhibitors tested a few were shown to bind via WaterLOGSY and \(^1\)H-\(^1\)\(^5\)N HSQC.

La phosphatase CDC25A active les complexes CDK/Cycline permettant la progression à travers le cycle cellulaire eucaryote. Cette phosphatase agit lors de la phase G1 et en transition G1/S en activant les complexes CDK2/Cycline E et CDK2/Cycline A, et a aussi été décrite comme un régulateur de la mitose à travers la déphosphorylation du complexe CDK1/Cycline B. De manière importante, CDC25A est retrouvée sur-exprimée dans de nombreux cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires conduisant à sa sur-expression ne sont pas encore clairement identifiés. Nous avons recherché l'implication de CDC25A dans la prolifération des cellules de leucémies aiguës myéloïdes (LAM) en réponse à l'adhésion sur une matrice extracellulaire de fibronectine. Nous avons constaté une augmentation de la prolifération de ces cellules, concomitante avec une entrée en phase S accélérée, ainsi qu'avec l'augmentation du niveau d'expression de CDC25A. A l'inverse, la prolifération de cellules hématopoïétiques normales CD34+ est inhibée par leur adhésion sur fibronectine, et le niveau d'expression de CDC25A y est fortement diminué, suggérant que la réponse en terme de prolifération dépendante de l'adhésion est modifiée lors du processus de leucémogénèse. .<br>The CDC25A phosphatase activates cyclin-dependent kinase complexes, allowing timely ordered progression throughout the eukaryotic cell cycle. This phosphatase acts during the G1 phase and at the G1/S transition by activating the CDK2/cyclin E and CDK2/cyclin A complexes, and was also described as a mitotic regulator through dephosphorylation of the Cyclin B/CDK1 complex. Importantly, CDC25A is up-regulated in various cancers, and the molecular mechanisms leading to this up-regulation are far from being understood. First, we investigated the implication of CDC25A in adhesion-dependent proliferation of acute myeloid leukemia cells (AML). We observed an increased rate of proliferation of AML cells when adhered to fibronectin, concomitant with accelerated S phase entry and accumulation of CDC25A, in contrast to normal CD34+ cells, in which both CDC25A level and cell proliferation were decreased upon adhesion to fibronectine. Importantly, both CDC25A siRNA and a CDC25s pharmacological inhibitor impaired this adhesion-dependent proliferation. The PI3-Kinase/AKT pathway appears to be a major regulator of CDC25A stability in this system. These data suggest that the adhesion-dependent proliferation properties of hematopoïetic cells may be modified during leukemogenesis. We then investigated the status of CDC25A in other hematological malignancies such as Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALCL) expressing the NPM-ALK oncogene, Chronic Myeloid Leukemia induced by the fusion protein BCR-ABL and AML expressing a mutated form of FLT3-receptor : FLT3-ITD. In these three models, CDC25A protein levels are abnormally increased by the presence of theses oncogenes and the PI3-Kinase pathway is also essential for this process. .