Dissertations / Theses on the topic 'Cellule staminali neurali'

Le cellule staminali neurali sono presenti, nel cervello dei mammiferi, in quelle aree dove la neurogenesi è mantenuta durante tutta la vita dell’organismo. Una caratteristica importante riguarda la loro abilità di proliferare e migrare nella materia cerebrale attratte dai siti di danno indotto, per esempio, da numerose malattie degenerative e dai tumori cerebrali. Il punto focale del mio dottorato è stato quello di studiare il ruolo di Reelin, proteina della matrice extracellulare fortemente implicata nello sviluppo cerebrale, nelle cellule staminali neurali murine. Mettendo a confronto le cellule “selvatiche” con quelle estratte da topi reeler, caratterizzate dalla mutazione negativa spontanea nel gene, ho osservato che l’assenza di Reelin rallenta la proliferazione delle cellule staminali neurali, così come la formazione delle neurosfere, aggregati sferici in sospensione tipici della crescita in vitro di queste cellule. Inoltre ho dimostrato un ruolo della proteina nel potenziale di differenziazione, favorendo la neuronogenesi in vitro senza modificarne la gliogenesi. Infine ho riscontrato l’incapacità delle cellule reeler di migrare nello stato aggregato chiamato “a catena”, la modalità di migrazione caratteristica delle cellule staminali neurali in vivo. Tutti questi effetti sono parzialmente recuperati dalla somministrazione della proteina esogena alle cellule reeler o con la diretta ingegnerizzazione per ripristinarne l’espressione endogena. Le conclusioni ricavate dal mio studio assegnano a Reelin un ruolo chiave nella biologia delle cellule staminali neurali adulte, intervenendo nella proliferazione, nel differenziamento e nella migrazione, le tre principali caratteristiche che guidano il processo di rigenerazione del tessuto danneggiato.
In the adult mammalian brain, multipotential neural stem cells persist throughout life in those areas where neurogenesis is maintained. A distinctive trait of these cells is their ability to self-renew and to migrate through brain matter to sites of injury, such as those of occurrence of gliomas and neurodegenerative deseases. The aim of my doctorate study was the role of Reelin, an extracellular matrix protein deeply involved in brain development, in newborn mouse neural stem cells (NSCs). By comparing wild type and Reelin knock out reeler stem cells, I show that the absence of Reelin negatively affects proliferation and neurosphere-forming ability, as well as in vitro neuronal differentiation potential. Notably, reeler NSCs are not able to migrate in chains, a migration mode typical of neural precursors homing to injury sites in adult CNS. All these effects are partially rescued by ectopic Reelin supplementation. Overall, my results indicate that Reelin affects all three major features of post-natal NSCs, and that it is required for the proper homing of NSCs to injury sites in adult brain.

In the mouse nervous system, Sox2 is expressed in stem cells and early precursors, and in few mature neurons (Zappone et al., 2000; Ferri et al., 2004). Adult Sox2-deficient mice, in which Sox2 expression is decreased by about 70%, exhibit neural stem/precursor cell proliferative defects in the hippocampus and periventricular zone (Ferri et al., 2004). I performed in vitro differentiation studies on neurosphere derived neural cells. Neural stem cells from Sox2-deficient mice produce reduced numbers of neural progenitors. Moreover, I found the SOX2 is important for the neural progenitors cell cycle progression. I demonstrated that SOX2 promoted the proliferation of neural stem cells through facilitating the G1/S transition with the levels of cyclin D1 and cyclin E expression in neural progenitors samples. Mash1 is an important regulator of neurogenesis in the ventral telencephalon, where it is required both to specify neuronal precursors and to control the timing of their production. Mash1 is required for the generation of neocortical neurons with characteristics of GABAergic interneurons. Moreover, in vivo Sox2 deficiency causes a reduction of GABAergic neurons (Cavallaro M. et al., 2008). These observations point to a possible role for SOX2 togheter with Mash1 in the genesis of neural progenitors of GABAergic neurons. The early neural progenitors, derive from Sox2-deficient mice produce reduced numbers of MASH1 positive cells. In vivo Chromatin immunoprecipitation assays reveal interactions of SOX2 and Mash1 in early neural progenitor cells. My data also suggest that the specific recruitment of these protein to the Mash1 in the ventral telencephalon defines the spatiotemporal activity of MASH1 in the developing nervous system.

Background: Zika virus (ZIKV), West Nile virus (WNV) and dengue virus (DENV) are mosquito-borne flaviviruses that generally cause mild or asymptomatic disease in humans. However, ZIKV infection has been associated with fetal microcephaly and Guillain-Barrè syndrome in adults; WNV infection may evolve to severe neuroinvasive disease in the elderly and immunocompromised subjects; DENV may rarely cause neurological complications in infected individuals. In addition, another emerging mosquito-borne flavivirus, Usutu virus (USUV), which may cause fatal neuroinvasive disease in different bird species, has been recently shown to infect humans but its pathogenicity is unknown. Aim of the study: In the context of the recent outbreak of ZIKV in the Americas and the increasing evidences of an association between ZIKV infection and the occurrence of fetal microcephaly, aim of this study was to investigate the effect of ZIKV infection in human neural cells in comparison with other flavivirus infections. To this aim, ZIKV infectivity, replication kinetics, cytopathic effect (CPE), and induction of innate antiviral responses were investigated in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), hiPSCs-derived neural stem cells (NSCs) and neurons and compared with other flaviviruses, i.e., WNV, DENV and USUV. Methods: NSCs and neurons were differentiated from hiPSCs. hiPSCs, NSCs, and neurons were infected with isolates of ZIKV Asian lineage (KU853013), WNV lineage 2 (KF179640), DENV serotype 2, and USUV Europe lineage 1 (AY453411). Time course experiments were performed to evaluate viral load by qRT-PCR and TCID50, expression of host genes involved in antiviral innate immunity by qRT-PCR, expression of cell differentiation markers by IF and qRT-PCR, cell viability and cell death by flow cytometry. The impact of ZIKV on embryogenesis and neurogenesis was evaluated by infection of hiPSCs and NSCs during neural differentiation and embryo body formation. Results: ZIKV infected and replicated efficiently in NSCs, neurons and hiPSCs. Infection led to typical CPE and cell death by apoptosis. ZIKV infection of hiPSCs, NSCs, and neurons induced the expression of innate immune response genes, especially the cellular pattern recognition receptor (PRR) IFH1 gene (MDA5), IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 (IFIT1) and 2 (IFIT2). Infected embryoid bodies were massively destroyed by ZIKV infection and infected hiPSCs and NSCs died before ending the neural differentiation process. ZIKV replication efficiency in NSCs was significantly higher than that of DENV-2 and USUV, but lower than that of WNV. In particular, WNV replicated more efficiently, induced more cell death and higher levels of antiviral gene expression than ZIKV in NSCs, neurons and hiPSCs. The induction of innate immune response genes in NSCs after infection with ZIKV and DENV-2 infection was milder than after infection with WNV and USUV, in agreement with the adaptation of these viruses to the human host and their ability to shut down the antiviral response. Conclusion: ZIKV infects and replicates efficiently in NSCs and induces cell death abrogating neural development, although less efficiently than WNV. Because of the similarities between flaviviruses in their interactions with host neural cells, it is conceivable that infection of other human cells, such as those involved in the extablishment of the blood-placenta barrier, are crucial for ZIKV-induced damage of the fetal brain.
Presupposti dello studio: Zika virus (ZIKV), West Nile virus (WNV), dengue virus (DENV) e Usutu virus (USUV) sono trasmessi da zanzare ed appartengono al genere Flavivirus della famiglia Flaviviridae. L’infezione da ZIKV è associata a microcefalia fetale e sindrome di Guillan-Barrè; WNV può causare una grave sindrome neuroinvasiva nell’anziano e nei soggetti immunocompromessi; l’infezione da DENV raramente si associa a complicazioni neurologiche; USUV può causare una sindrome neuroinvasiva fatale in diverse specie di uccelli, è stato dimostrato che può infettare pure l’uomo, ma la sua patogenicità resta ancora da chiarire. Scopo: Alla luce della recente epidemia di ZIKV in America e di una probabile associazione tra l’infezione da ZIKV e lo sviluppo di microcefalia fetale, lo scopo di questo studio è stato confrontare l’infezione da ZIKV sulle cellule neurali umane con l’infezione da WNV, DENV e USUV. A tal fine, la cinetica di replicazione, l’effetto citopatico e l’immunità innata indotta dall’infezione virale sono state analizzate in cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), cellule staminali neurali derivate da iPSCs e neuroni. Materiali e metodi: Le NSCs ed i neuroni sono stati differenziati da hiPSCs. I diversi tipi cellulari sono stati infettati con l’isolato di ZIKV lignaggio asiatico (KU853013), WNV lignaggio 2 (KF179640), DENV sierotipo 2 e USUV lignaggio 1 europeo (AY453411). La carica virale è stata valutata a diversi tempi dall’infezione mediante qRT-PCR e TCID50, il livello di espressione dei geni coinvolti nell’immunità innata è stato analizzato mediante qRT-PCR e l’espressione dei markers di differenziamento cellulare mediante IF e qRT-PCR, la sopravvivenza cellulare e l’apoptosi mediante il saggio MTT e analisi dell’attivazione di caspasi-3. L’impatto dell’infezione da ZIKV sull’embriogenesi e la neurogenesi è stato valutato infettando le hiPSCs e le NSCs durante il differenziamento neurale e durante la formazione dei corpi embrioidi. Risultati: ZIKV era in grado di infettare e replicare efficientemente nelle NSCs, nei neuroni e nelle hiPSCs, causando un tipico effetto citopatico e morte cellulare per apoptosi. L’infezione ha indotto un significativo aumento dell’espressione dei geni dell’immunità innata, in particolare dei geni MDA5 (the cellular pattern recognition receptor (PRR) IFH1 gene), IFIT1 (IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats 1) e IFIT2. I corpi embrioidi sono stati distrutti dal virus e le hiPSCs e le NSCs infettate sono morte prima di completare il differenziamento neurale. L’efficienza di replicazione di ZIKV nelle NSCs era maggiore rispetto a quella di DENV-2 e USUV, ma minore rispetto al WNV. Infatti, WNV replicava in modo più efficiente, induceva una maggiore morte cellulare e stimolava una più elevata risposta antivirale rispetto a ZIKV nei diversi tipi cellulari. Conclusione: ZIKV infetta e replica nelle NSCs, inducendo morte cellulare e impedendo lo sviluppo neurale, ma in modo meno efficiente rispetto al WNV. E’ probabile quindi che l’infezione di altri tipi cellulari sia determinante per il danno al sistema nervoso fetale indotto in modo specifico da ZIKV.

2008/2009
The NS culture system is an innovative yet not fully characterized method of culturing neural stem cells (NSCs). Previous reports have described the possibility of isolation of a virtually pure NSC culture from embryonic, fetal or adult NSCs (Conti et al., 2005; Pollard et al., 2006; Sun et al., 2008). These cells, grown in adhesion, are called NS cells and show radial glial characteristics. The present thesis aims to characterize the in vitro and in vivo behaviour of human and mouse NS cells. In the first study, we describe the isolation of a new strain of human striatal NS cells. They show unique features in vitro, and can be efficiently differentiated into neurons. After transplantation in newborn rats, they survive, migrate and differentiate in the host brain. In the second part of the thesis, we show that mouse ES-derived NS cells fuse with cortical pyramidal neurons after transplantation in mice or rats. This process is mediated by microglia, which first fuse with the NS cells and then with the neurons. This NS-microglia-neuron fusion has not been previously described, although it occurs both in vivo and in vitro. In summary, we report here previously undescribed features of the NS cells; our results are relevant to better understanding of NSCs in general and their behaviour after transplantation in the brain.
XXII Ciclo
1981

L’obiettivo del presente lavoro è stata l’identificazione di un ruolo per il recettore degli estrogeni (ER) nel neurosviluppo e nella neurodegenerazione, con particolare attenzione al coinvolgimento delle cellule gliali. E’ noto che gli estrogeni influenzano lo sviluppo, la maturazione ed il differenziamento dei neuroni nel sistema nervoso centrale, e che i suoi recettori mostrano un picco di espressione durante le fasi precoci di neurosviluppo. La zona subventricolare del cervello di topo adulto è una ricca fonte di progenitori neurali. Questi possono essere mantenuti in coltura, in un mezzo chimicamente definito contenente il fattore di crescita epidermico (EGF), sottoforma di neurosfere, che possono differenziarsi in neuroni e glia quando piastrate su laminina in assenza di EGF. Il presente studio ha mostrato che gli ER sono espressi nelle neurosfere sia in sospensione che in adesione, ed in particolare ER mostra un picco di espressione durante le fasi più precoci del differenziamento della neurosfera (6-24 ore). Il trattamento con 17-estradiolo 10nM (17-E2) non influenza significativamente la proliferazione nelle neurosfere in sospensione, ma modifica il differenziamento già dopo 6 ore di piastratura su laminina, con un significativo aumento della percentuale di neuroblasti PSA-NCAM-positivi e, successivamente, a 3 giorni, con un aumento nel numero di neuroni MAP2-positivi. Il trattamento con 17-E2 induce inoltre un aumento nella percentuale di cellule GFAP-positive ed un aumento dei livelli proteici di GFAP, con un effetto marcato a 24 ore di piastratura. In uno studio parallelo, è stata valutata la capacità della glia di mediare gli effetti neuroprotettivi degli estrogeni. Il 17-E2 esercita infatti effetti protettivi anche verso la tossicità da beta-amiloide (AP). Al fine di valutare il coinvolgimento degli astrociti in tale fenomeno, il terreno di coltura condizionato da astroglia pre-trattata con 17-E2 per 4 ore, è stato trasferito su neuroni corticali puri trattati per 24 ore con AP25-35 25M. I risultati ottenuti hanno mostrato una aumentata vitalità dei neuroni corticali, effetto che non appare modificato dal trattamento con l’antagonista dei recettori per gli estrogeni ICI 182,780 addizionato direttamente ai neuroni. Il TGF-1 è stato identificato quale fattore solubile responsabile della neuroprotezione indotta dal 17-E2. I livelli di TGF-1 intracellulare e rilasciato aumentano infatti in seguito al trattamento con 17-E2, ed il contenuto intracellulare di TGF-1 nelle cellule positive si riduce, suggerendo che il 17-E2 stimoli prevalentemente il rilascio di tale citochina. Infine, l’incubazione con anticorpo neutralizzante anti-TGF-1 incide significativamente sulla riduzione della morte neuronale indotta dal terreno condizionato da astrociti trattati con 17-E2. Nell’insieme, i risultati ottenuti puntano verso un ruolo chiave dei recettori degli estrogeni nel neurosviluppo e nella neuroprotezione, ed identificano la glia come target primario per l’azione degli estrogeni.
The aim of the present study was the identification of a role for estrogen receptor (ER) in neurodevelopment and neurodegeneration, focusing on the involvement of glial cells. Estrogen is in fact known to affect development, maturation and differentiation of neurons in the central nervous system and its receptors exhibit a peak of expression during early phases of neurodevelopment. The subventricular zone of the adult mouse brain is a source of progenitor cells which can be grown as neurospheres in a chemically defined medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), and are able to differentiate into neurons and glia when plated on laminin in the absence of EGF. The present study has indicated that ERs are expressed by both floating and adherent neurospheres, with ER showing a peak of expression during the earlier phases of neurosphere differentiation (6-24 hrs). Treatment with 10 nM 17-Estradiol (17-E2) did not significantly affect proliferation in floating neurospheres, but modified progenitor differentiation as early as 6 hours after plating on laminin, with a marked increase in the percentage of PSA-NCAM-positive neuroblasts, and later on at 3 days post-plating with an increase in MAP2-positive neurons. Treatment with 17-E2 also increased the number of GFAP-positive cells and the levels of GFAP protein with a major effect at 24 hours. In a parallel study, the ability of glia to mediate the neuroprotective effect of estrogen has been evaluated. 17-E2 is known to exert neuroprotective activity also against ß-amyloid (ßAP). To evaluate the involvement of astroglia in this effect, the conditioned medium from astrocytes preexposed to 17-E2 for 4 h was transferred to pure rat cortical neurons challenged with 25M AP25-35 for 24 h. The results obtained have shown an increased viability of cortical neurons. This effect is not modified by treatment with the estrogen receptor antagonist ICI 182,780 added directly to neurons. TGF-1 has been identified as the soluble factor responsible for 17-E2-induced neuroprotection. Accordingly, the intracellular and released levels of TGF-1 are increased by 17-E2 treatment, and the intracellular content of TGF-1 in immunopositive cells is reduced, suggesting that 17-E2 stimulates mainly the release of the cytokine. Finally, incubation with a neutralizing anti-TGF-1 antibody significantly modifies the decrease in neuronal death induced by 17-E2 -treated astrocyte-conditioned medium. Taken together these results point to a key role for estrogen receptor both in neurodevelopment and neurodegeneration and identify glia as a major target for estrogen action.

Medium-sized spiny neurons (MSNs) are the only neostriatum-projection neurons, and their degeneration underlies some of clinical features of Huntington's disease. We used human developmental biology and exposure to key neurodevelopmental molecules to drive human pluripotent stem (hPS) cells into MSNs. In a feeder-free adherent culture, ventral-telencephalic specification is induced by BMP/TGF-β inhibition and subsequent SHH/DKK-1 treatment. The emerging FOXG1+/GSX2+ telencephalic progenitors are then terminally differentiated, resulting in the systematic line-independent generation of FOXP1+/FOXP2+/CTIP2+/calbindin+/DARPP-32+ MSNs. Similarly to mature MSNs, these neurons carry dopamine- and A2a-receptors, elicit typical firing pattern, and show inhibitory postsynaptic currents, as well as dopamine neuromodulation and synaptic integration ability in vivo. When transplanted into the striatum of quinolinic acid-lesioned rats, hPS-derived neurons survive and differentiate into DARPP-32+-neurons, leading to a restoration of apomorphine-induced rotation behaviour. In summary, hPS cells can be efficiently driven to acquire a functional striatal fate using an ontogeny-recapitulating stepwise method. Moreover, we have established stable HD-iPS cell lines that recapitulating, in vitro, features of the disease can be used for investigating disease mechanisms that underlie HD, representing a platform for in vitro human developmental neurobiology studies and drug screening approaches.

Inhibition of microglia-mediated neuroinflammation is an important terapeuthic target in order to avoid cognitive and motor impairment in brain ischemia . Reportedly, neural stem cell (NSC) brain grafts have neuroprotective effecs 1. It has been proposed that these positive effects are not caused only by NSC proliferation and generation of new neurons, but also by a modulation of the brain lesion environment 2. Our primary aim was to ascertain whether NSC were capable of modifying microglial activation in vitro. We used ATP as inflammatory stimuli, since it is massively released from damaged neurons and is responsible of activation of microglia during ischemia3. We demonstrated that N9 murine microglia cells incubated with conditioned media (CM) from NSC culture have a blunted response to ATP. In fact, ATP stimulation of N9 cells preincubated with CM at different passages induced a reduced release of intracellular calcium compared to controls (Fig.1). Moreover, CM preincubation significantly inhibited the expression of inflammatory cytokines like TNF-alfa, COX-2, and IL-10 that are up-regulated after ATP stimulation (Fig.2) Reportedly, high-dose ATP (>1mM) exposure is detrimental both for neurons and microglial cells4. We tested CM action of survival of N9 microglia treated with 3mM ATP for 24 hours. CM preincubation for 24 hours was capable of significantly reducing N9 mortality induced by ATP treatment (Fig.3). In conclusion NSC release soluble factors that have an antinfiammatory action blunting N9 response to ATP stimulation.

In the last decade, multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) demonstrated a significant therapeutic efficacy, particularly in cell therapy approaches aiming at tissue regeneration. MSCs exert their action via trophic support, induction of angiogenesis, immunomodulation and reduction of necrosis at affected tissues. Importantly, these regenerative and protective properties are largely associated to MSC secretome. Unfortunately, cell-based approaches not always meet the criteria for a smooth translation to the clinic. For instance, the use of stem cells in pathologies with a very short therapeutic window, such as few hours, is not compatible with the requested minimal criteria for MSC release, before administration to the patient. Notwithstanding, in the regenerative medicine field, the MSC mechanism of action paradigm was recently extended to include the action of extracellular vesicles (EVs), which are cytoplasm-containing cellular bodies secreted by a wide range of cell types. Intriguingly, many studies reported that EVs generated by MSCs are able to recapitulate the majority of the regenerative properties of parental MSCs. Starting from these premises, the objectives of the present doctoral research project were: to address EV-mediated cell-to-cell communication as novel MSC mechanism of action; to address reprogrammed MSC-EV generation; to define, for the first time in the literature, stem cell EV molecular content (e.g.: miRNome), comparing reprogrammed to non-reprogrammed MSC-EVs; to challenge stem cell-EV therapeutic potential in a model of acute tissue damage, as a proof-of-concept for feasibility and effectiveness of a stem cell-based albeit cell-free regenerative strategy. Intriguingly, EVs may be produced in a ready-to-use formulation, so that clinicians could use them as soon as a therapeutic need arises, also in the case of an urgent one. In this way, EV-shuttled MSC regenerative properties could exert beneficial effects also on pathologies currently lacking any cell therapy option. To develop this innovative therapeutic strategy, MSCs were isolated from different tissues and their biological properties were evaluated in order to choose the MSC source most suitable for the implementation of the project. Thus, both MSC transcriptome and immunophenotype were addressed. MSCs from adult sources (e.g.: bone marrow) showed senescence-related features in vitro, correlated to donor’s age in vivo. On the other hand, MSCs from perinatal tissues (e.g.: cord blood) showed a phenotype more similar to that of pericytes, which are the in vivo progenitors of MSCs. Therefore, cord blood was chosen as MSC source, also in the prospective of clinical translation, since public banking of cord blood units for clinical use already exists worldwide. Next, thanks to an extended analysis of the stromal populations present in cord blood, a MSC subpopulation showing higher proliferation properties and significantly longer telomeres was isolated. In addition, the standard cord blood MSC isolation protocol was improved, leading to an efficiency of 80%. Eventually, MSC secretome-associated anti-inflammatory and anti-apoptotic properties were observed in vitro and in vivo. In order to investigate if EVs contributed to MSC paracrine properties, MSC-EV secretion and regenerative properties were assessed. The MSC-EV therapeutic effectiveness was challenged in an in vitro model of acute tissue damage. Intriguingly, MSC-EVs could rescue damage-induced cell mortality, showing the same protective effect of parental MSCs. In spite of the use of a high proliferative cord blood MSC subpopulation, primary cultures still show a limited lifespan. In order to increase their replicative potential and to better exploit their EV production, induced cellular reprogramming was tested on MSCs as an alternative to traditional immortalization techniques. In this way, MSC-derived cell lines endowed with unlimited lifespan were generated, and permanent modification of their genome was avoided. The next step was to confirm the generation of EVs from reprogrammed MSCs, since reprogramming drastically changes cell identity. Furthermore, the EV miRNome load of reprogrammed and non-reprogrammed MSCs was addressed. Importantly, the majority of miRNAs were common between the two samples, indicating that reprogramming did not change the EV miRNA content. This result could have relevant consequences on the functional features of reprogrammed MSC-EVs, since EV-mediated miRNA transfer from donor to target cells was proposed as one of MSC mechanisms of action. In the last part of this doctoral research, stem cell (non-reprogrammed and reprogrammed MSCs)-EV therapeutic effectiveness was addressed and compared to that of parental MSCs. In order to do that, an organotypic ex vivo mouse model of brain ischemia was used. This model recapitulated the modulation of some ischemic damage-related parameters, including increased secretion of inflammatory cytokines, high tissue necrosis and the impairment of neuronal and astrocytic cell populations. Therefore, this model mimicked early phase events of brain ischemia, whose thrombolytic clinical treatment must be administered within 3-6 hours of first signs of ischemia. Notably, stem cell-EVs were tested for the first time in this pathological context to verify their potential role in tissue regeneration. Strikingly, stem cell-EV administration to affected tissues showed significant neuroprotective properties, which were comparable to those of parental MSCs. Importantly, the ischemic damage-related parameters previously described were rescued. In particular, inflammatory-associated parameters underwent the most statistically significant decrease, showing levels similar to or better than those of the uninjured brain tissue. This is of uttermost importance, considering that chronic inflammation is detrimental to tissue regeneration. To conclude, the results of the present PhD thesis confirmed the feasibility of stem cell EV-based therapies in regenerative medicine approaches. In the future, this innovative EV therapy may be applied to pathological contexts currently without a cell therapy option. In the framework of advanced therapy medicinal products, the new drug would be the EVs, rather than the parental stem cells. Finally, EVs could play the role of ready-to-use anti-inflammatory molecule carriers, in order to guarantee a rapid therapeutic action for the regeneration of injured tissues.
Negli ultimi anni, le cellule stromali mesenchimali multipotenti umane (CSM) hanno mostrato una grande efficacia terapeutica, soprattutto in approcci di terapia cellulare aventi come obiettivo la rigenerazione tissutale. L’azione delle CSM avviene attraverso supporto trofico, induzione di angiogenesi, modulazione della risposta immunitaria e diminuzione della necrosi a livello dei tessuti colpiti. Inoltre, recente letteratura ha dimostrato che queste capacità rigenerative e protettive sono in larga parte associate al secretoma delle CSM. Purtroppo, gli approcci di terapia cellulare non sono sempre traslabili alla clinica. Ad esempio, l’utilizzo di cellule staminali in patologie caratterizzate da una finestra terapeutica molto stretta, dell’ordine di poche ore, non è compatibile con la necessità di scongelare e valutare i minimi standard di qualità delle CSM prima della somministrazione al paziente. Nonostante ciò, il paradigma del meccanismo d’azione delle CSM nel campo della medicina rigenerativa si è ulteriormente arricchito. Infatti, molti recenti studi hanno dimostrato che le vescicole extracellulari, ossia porzioni di citoplasma delimitate da membrana cellulare secrete dalle CSM, sono in grado di riprodurre la maggior parte delle proprietà rigenerative delle CSM stesse. Date queste premesse, gli obiettivi del progetto di ricerca del presente Dottorato sono stati i seguenti: indagare la comunicazione intercellulare tramite vescicole extracellulari quale innovativo meccanismo d’azione delle CSM; studiare la produzione di vescicole extracellulari da parte di CSM riprogrammate, e, per la prima volta in letteratura, definirne il contenuto molecolare (es.: miRNoma), a confronto con le CSM d’origine; testare il potenziale terapeutico di vescicole extracellulari da cellule staminali in un modello di danno tissutale acuto, come proof-of-concept della funzionalità di una strategia terapeutica cell-free. Infatti, le vescicole extracellulari potrebbero essere prodotte in formulazioni pronte all’uso, a immediata disposizione per ogni richiesta clinica, anche urgente. In questo modo le proprietà rigenerative delle CSM potrebbero essere veicolate dalle vescicole extracellulari anche in contesti patologici attualmente senza alcuna opzione di terapia cellulare. Per lo sviluppo di questa innovativa strategia terapeutica, CSM isolate da vari tessuti sono state caratterizzate e confrontate in base al loro trascrittoma e al loro immunofenotipo, allo scopo di valutarne le proprietà biologiche e quindi scegliere le CSM più adatte all’implementazione del progetto di Dottorato. Le CSM da tessuti adulti (e.g.: midollo osseo) hanno mostrato in vitro caratteristiche di senescenza correlate all’età del donatore in vivo. Al contrario, le CSM da tessuti perinatali (e.g.: sangue di cordone ombelicale) hanno mostrato un fenotipo più simile a quello dei periciti, ossia i progenitori delle CSM in vivo. Quindi, tenuto conto anche della traslabilità clinica, il sangue di cordone ombelicale è stato scelto come fonte di CSM, visto che la raccolta e la crioconservazione di unità di sangue placentare a fini terapeutici è già una realtà clinica. In seguito, un’analisi estesa delle popolazioni stromali presenti nel sangue di cordone ombelicale ha portato alla definizione di una sottopopolazione di CSM dotata di maggiori capacità proliferative e con una lunghezza del telomero significativamente più alta. Inoltre il protocollo standard di isolamento delle CSM da sangue di cordone ombelicale è stato migliorato, arrivando ad un’efficienza di circa 80%. Infine, le proprietà anti-infiammatorie e anti-apoptotiche del secretoma delle CSM sono state studiate sia in vitro che in vivo. Al fine di verificare se le vescicole extracellulari contribuissero alle proprietà paracrine delle CSM, se ne è caratterizzata la secrezione e se ne sono indagate le proprietà rigenerative. Una chiara efficacia terapeutica da parte delle vescicole extracellulari di CSM è stata dimostrata in un modello in vitro di danno tissutale acuto, in cui le vescicole extracellulari hanno eguagliato i risultati ottenuti con le CSM stesse. Nonostante l’utilizzo di CSM dalle elevate proprietà proliferative, la loro lifespan in coltura, in quanto cellule primarie, rimane limitata. Allo scopo di aumentarne il potenziale replicativo e di sfruttarne al meglio così la produzione di vescicole extracellulari, le CSM sono state sottoposte alla riprogrammazione cellulare indotta. In questo modo sono state generate linee cellulari derivate da CSM dal potenziale di crescita illimitato, evitando però di modificarne il genoma come nelle tradizionali tecniche di immortalizzazione. Siccome la riprogrammazione implica una modificazione radicale dell’identità della cellula d’origine, il passo successivo è stato quello di confermare la capacità di questa nuova popolazione di generare vescicole extracellulari, poi opportunamente caratterizzate. In particolare, il miRNoma delle vescicole extracellulari da cellule riprogrammate è stato oggetto di studio e di confronto con quello delle vescicole extracellulari delle CSM d’origine. Si è così potuto dimostrare che la maggior parte dei miRNA era presente nelle vescicole extracellulari sia prima che dopo la riprogrammazione. Ciò indica che il processo di riprogrammazione non ne ha alterato in modo sostanziale il contenuto. Questo potrebbe avere importanti ricadute sugli aspetti funzionali delle vescicole extracellulari da CSM riprogrammate. Infatti è stato ipotizzato che il trasferimento di miRNA specifici da cellule donatrici a cellule target mediato dalle vescicole extracellulari sia uno dei meccanismi d’azione delle CSM. Nell’ultima parte di questo progetto di Dottorato, l’utilità terapeutica delle vescicole extracellulari da cellule staminali (CSM e CSM riprogrammate) è stata confrontata con quella delle CSM d’origine. A tale scopo è stato utilizzato un modello ex vivo di ischemia cerebrale, in cui è stato osservato il movimento di alcuni parametri di danno ischemico acuto, tra cui un picco di produzione di citochine infiammatorie, una forte necrosi tissutale e una riduzione delle popolazioni cellulari neuronali e astrocitiche. Questo particolare modello mima infatti la fase acuta di questa condizione patologica, il cui trattamento a base di agenti trombolitici deve avvenire entro 3-6 ore dall’insorgenza dei primi sintomi. Quindi le vescicole extracellulari prodotte dalle CSM riprogrammate sono state testate per la prima volta in questo contesto patologico per verificare se potessero esercitare una funzione rigenerativa. La loro somministrazione al tessuto colpito dal danno ischemico ha generato uno spiccato effetto neuroprotettivo, pari a quello delle CSM d’origine, che ha riportato a valori simili a quelli del tessuto cerebrale non danneggiato i parametri di danno sopra descritti. Il risultato più interessante e statisticamente significativo è stato soprattutto a carico di quei parametri legati ai processi infiammatori, i quali sfavoriscono il recupero del danno tissutale. In conclusione, i risultati presentati in questa tesi di Dottorato confermano la possibilità di utilizzo di vescicole extracellulari secrete da cellule staminali in strategie di medicina rigenerativa. Questa innovativa extracellular vesicle therapy potrebbe in futuro essere applicata in contesti patologici per i quali ad oggi non è praticabile una terapia cellulare. A questo punto, nel quadro dei prodotti medicinali per le terapie avanzate, il “farmaco” non sarebbe più la cellula staminale, ma le rispettive vescicole extracellulari. Queste acquisirebbero così il ruolo di carrier di molecole antinfiammatorie, pronte all’uso e capaci di garantire un’azione terapeutica tempestiva per la rigenerazione di tessuti danneggiati.

Generating neural stem cells and neurons from reprogrammed human astrocytes is a potential strategy for repair in neurological diseases. It has been recently showed that astrocytes from murine cerebral cortex can be differentiated into neurons by the forced expression of a single transcription factor (Heinrich et al., 2010). While these studies have evaluated astrocyte conversion in the murine context, a similar possibility has yet to be demonstrated in human cells. An essential element for developing such applications with therapeutic value is a thorough comprehension of the mechanisms that regulate reprogramming of adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) (Hanna et al., 2010) or directly into another committed lineage, such as fibroblasts converted into neurons and also specific neuronal subpopulations like dopaminergic neurons (Pang et al., 2011, Caiazzo et al., 2011). Here we demonstrate the possibility to obtain progenitors and mature cells of the neural fate directly from human cortical astrocytes with a dedifferentiation into neural stem/progenitor phenotype. Even if for the purpose of autologous cell transplantation in neurological disorders, fibroblasts from patients resemble a much more suitable source of neurons than astrocytes from patients, nevertheless, shading light in the mechanisms that make possible to reprogram astrocytes into NSCs is useful for the final goal of using these cells as endogenous cell source for in situ neural repair in the CNS without any invasive cell graft. Human astrocytes can be reprogrammed into iPSCs, with similar efficiencies to other cells, using the viral expression of four reprogramming factors (Oct4, Sox2, Klf4, and cMyc) (Riuz et al., 2008). Remarkably, overexpression of a single factor like OCT4 in adult cells can induce full reprogramming, as when it is expressed in NSCs (human and mouse) (Kim et al., 2009 a, b) or promote the formation of another phenotype, such as the generation of blood cells with its expression in human fibroblasts (Szabo et al., 2010). These data suggest that the effect of these stem reprogramming factors changes in relationship to the lineage and the differentiation stage of the cells expressing them. In the current work, using the individual expression of OCT4, SOX2, or NANOG, we demonstrated and characterized the direct neural fate conversion of human astrocytes into multipotent neural progenitors, in vitro and in vivo. These cells were generated in a manner that is independent of iPSC production. Individual ectopic expression of the reprogramming factors OCT4 or SOX2 or NANOG into astrocytes, together with specific cytokine/culture conditions, activated the neural stem gene program and induced the generation of cells expressing neural stem/precursors markers. This change of lineage commitment was obtained also in pure CD44+ mature astrocytes and did not require passing through a pluripotent state. These unique astrocytes-derived neural stem cells gave rise to neurons, astrocytes and oligodendrocytes, and showed in vivo engraftment properties. ASCL1 expression further promotes the acquisition of a neuronal phenotype in vitro and in vivo. ASCL1 expression further promotes the acquisition of a neuronal phenotype in vitro and in vivo (Kim et al., 2009). To develop a broader understanding of astrocytes reprogramming we performed a methylation analysis demonstrating that epigenetic modifications underlie this process. These observations indicated that the sites of epigenetic and gene expression changes during reprogramming of astrocytes to NSCs are tightly linked to genes that are functionally important for pluripotency. These data demonstrate restoration of multipotency from human astrocytes, and point out a possible application of cellular reprogramming to endogenous CNS cells for repair of neurological disorders.

Spinal muscular atrophy (SMA), characterized by selective loss of lower motor neurons, is an incurable genetic neurodegenerative disease.and represents one of the most common genetic causes of infant mortality. Patients with SMA exhibit muscle weakness and hypotonia. Stem cell transplantation is a potential therapeutic strategy for SMA and other motor neuronal diseases. In this study, we analized the therapeutic capacity of different stem cells sources in order to improve SMA phenotype in a SMA murine model. First of all we isolated spinal cord neural stem cells (NSCs) from mice expressing green fluorescent protein (GFP) only in motor neurons and assessed their therapeutic effects on the phenotype of SMA mice. Intrathecally grafted NSCs migrated into the parenchyma and generated a small proportion of motor neurons. Treated SMA mice exhibited improved neuromuscular function, increased life span, and improved motor unit pathology NSC transplantation positively affected the SMA disease phenotype, indicating that transplantation of NSCs may be a possible treatment for SMA. However primary NSC as stem cell source have limited translational value. Thus we used alternative stem cells sources, NSC derived from wild-type embryonic stem cells (wt-ESCs) and from a drug-selectable embryonic stem cell line (OSG-ESC. This cells have promise as an unlimited source of NSCs for transplantation. We found that ESC-derived NSCs can differentiated into motor neuron in vitro, and, when intrathecally transplanted into SMA mice survived, migrated, ameliorated behavioral and life-span and may confer neuroprotection in SMA mice. NSCs obtained using a drug-selectable ESC line (positively for neuroepithelial cells and negatively for undifferentiated cells) yielded the greatest improvements. As with cells originating from primary tissue, the ESC-derived NSCs integrated appropriately into the parenchyma, expressing neuron- and motor neuron-specific markers. Our results suggest translational potential for the use of pluripotent cells in NSC-mediated therapies and highlight potential safety improvements and benefits of drug-selection for neuroepithelial cells.

La degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) del mesencefalo ventrale è considerata uno dei segni distintivi della malattia di Parkinson (PD) e del Parkinsonismo. La loro suscettibilità al danno e la loro adattabilità e plasticità sono state inizialmente studiate in modelli animali per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari e l'azione delle terapie farmacologiche. La recente introduzione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) e lo sviluppo di protocolli per la loro differenziazione in neuroni con un fenotipo DA ha permesso la valutazione diretta dei meccanismi cellulari del PD e del Parkinsonismo, il meccanismo d'azione dei farmaci antiparkinsoniani e le applicazioni esplorative di vari aspetti della terapia cellulare. Lo scopo di questa tesi è la generazione e la caratterizzazione fenotipica di neuroni DA umani utilizzabili come strumento per lo sviluppo di una varietà di dispositivi terapeutici basati sulla terapia cellulare, in particolare dispositivi elettronici impiantabili interamente organici. Questi dispositivi sono stati progettati per essere impiantati in modelli animali di PD per una terapia loco-regionale guidata da stimoli elettrici e chimici per supportare l'attecchimento dei precursori dei neuroni DA, massimizzando la loro differenziazione e funzione. Al fine di ottenere precursori di neuroni DA umani di alta qualità e riproducibili che siano in grado di differenziarsi e maturare in neuroni DA funzionali che rispondono a stimoli elettrici e chimici, questo lavoro è stato organizzato in quattro sottoprogetti principali. Il primo sottoprogetto è stato dedicato all'ottimizzazione dei metodi di differenziazione delle iPSCs umane in precursori dei neuroni DA mesencefalici utilizzando un protocollo precedentemente pubblicato (Fedele et al. 2017). Questi precursori dei neuroni DA possono essere espansi per diversi passaggi e conservati in azoto liquido per qualsiasi uso futuro. Il secondo sottoprogetto è stato dedicato alla differenziazione dei precursori DA mesencefalici in neuroni DA maturi che sono stati caratterizzati mediante immunofluorescenza, PCR quantitativa, HPLC ed analisi elettrofisiologiche. Il fenotipo DA dei neuroni è stato studiato testando la loro risposta a due agonisti dopaminergici (pramipexolo e piribedil) attualmente utilizzati per il trattamento del PD. Dati recenti hanno dimostrato un effetto neurotrofico prodotto da un agonista antiparkinsoniano del recettore DA D2/D3, il ropinirolo (Collo et al. 2018). Sulla base di questi risultati, sono stati valutati gli effetti cellulari e molecolari di pramipexolo e piribedil sui neuroni DA umani studiando i cambiamenti morfologici correlati alla plasticità strutturale e l'attivazione delle vie intracellulari. Sono state studiate anche le proprietà neuroprotettive e neurorigenerative di questi due agenti farmacologici. Il terzo sottoprogetto è stato dedicato allo studio degli effetti della stimolazione elettrica sulla plasticità strutturale dei neuroni DA umani. Diversi lavori hanno dimostrato che la stimolazione elettrica può promuovere la differenziazione neuronale e la crescita dei neuriti di vari tipi di cellule neuronali in vitro, tra cui PC12 e cellule staminali neurali umane. Il quarto sottoprogetto è stato dedicato alla generazione di iPSCs umane da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) donate da nuovi controlli sani e pazienti affetti da un Parkinsonismo, l’atrofia multisistemica (MSA). I cloni di iPSCs ottenuti dal controllo e dal paziente sono stati sottoposti a caratterizzazione fenotipica per esaminare la presenza di marcatori di pluripotenza mediante immunofluorescenza, PCR quantitativa, analisi del cariotipo, pluripotenza e capacità di differenziazione nei tre foglietti embrionali. Le iPSCs sono state successivamente differenziate in neuroni DA mesencefalici e valutate per la loro risposta farmacologica agli agonisti dopaminergici.
The degeneration of dopaminergic (DA) neurons of the ventral mesencephalon is considered one of the hallmarks in Parkinson’s disease (PD) and Parkinsonism. Their susceptibility to damage and their adaptability and plasticity were initially studied in animal models in order to understand the cellular and molecular mechanisms and the action of pharmacological therapeutics. The recent introduction of human inducible pluripotent stem cells (iPSCs) technology and the development of protocols for their differentiation into neurons with a DA phenotype has permitted the direct evaluation of cellular mechanisms of PD and Parkinsonism, the mechanism of action of anti-parkinsonian drugs and the exploratory applications of various aspects of cell therapy. The aim of this thesis was the generation and phenotypic characterization of human DA neurons amenable to be used as a tool for the development of a variety of therapeutic devices based on cell therapy, in particular implantable whole-organic electronic devices. These devices were designed to be implanted in animal models of PD for a loco-regional therapy driven by electrical and chemical stimuli to support the engraftment of DA neuron precursors, maximizing their differentiation and function. In order to achieve high quality and reproducible human DA neuron precursors that are able to differentiate and mature into functional DA neurons that respond to electrical and chemical stimuli, therefore amenable to the above described use, this work was organized in four main subprojects. The first subproject was dedicated to the optimization of the methods of differentiation of human iPSCs into mesencephalic DA neuron precursors using a previously published protocol (Fedele et al. 2017). These DA neuron precursors can be expanded for several passages and stored in liquid nitrogen for any future use. The second subproject was dedicated to the differentiation of mesencephalic DA precursors into mature DA neurons that were characterized by immunofluorescence, quantitative PCR, HPLC and electrophysiological analyses. The DA phenotype of the neurons was investigated by testing their response to two dopaminergic agonists (i.e., pramipexole and piribedil) currently used for the treatment of PD. Recent data have demonstrated a neurotrophic effect produced by an anti-parkinsonian DA D2/D3 receptor (D2R/D3R) agonist, ropinirole (Collo et al. 2018). Based on these findings, the cellular and molecular effects of pramipexole and piribedil on human DA neurons were evaluated by studying morphological changes related to structural plasticity and the activation of intracellular pathways. The neuroprotective and neuroregenerative properties of these two pharmacological agents were also studied. The third subproject was dedicated to the study of the effects of the electrical stimulation on the structural plasticity of human DA neurons. Several reports have shown that electrical stimulation can promote neuronal differentiation and neurite growth of various neuronal cell types in vitro, including PC12 (Jing et al. 2019) and human neural stem cells (Stewart et al. 2015). The fourth subproject was dedicated to the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) donated from a novel set of healthy controls and patients affected by a Parkinsonism, i.e., the multiple system atrophy (MSA). The iPSC clones obtained from the control and the patient underwent a phenotypic characterization to examine the presence of pluripotency markers by immunofluorescence and quantitative PCR analysis, karyotype analysis, pluripotency and trilineage differentiation potential. The iPSCs were subsequently differentiated into mesencephalic DA neurons and assessed for their pharmacological response to dopaminergic agonists.

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una sottopopolazione di cellule tumorali con caratteristiche di cellule staminali, ovvero autorinnovamento (capacità di riformare un tumore dello stesso tipo) e capacità di "differenziarsi" in cellule che costituiscono la massa tumorale. Questi segni distintivi li rendono responsabili di eventi come recidiva del tumore, metastasi e resistenza ai farmaci. Per questo è molto importante capire quali sono i «fattori» fondamentali per il loro mantenimento. È interessante notare che gli stessi fattori di trascrizione possono essere responsabili del mantenimento sia delle cellule staminali normali che delle cellule staminali tumorali. In particolare sappiamo che il fattore di trascrizione "staminale" Sox2, un importante regolatore delle cellule staminali neurali, è sovraespresso anche nei tumori cerebrali. Nei gliomi, Sox2 è essenziale per mantenere CSC. Nel glioma di alto grado di topo (pHGG), la delezione di Sox2 causa l'arresto della proliferazione cellulare e l'incapacità di riformare i tumori in vivo; 134 geni sono significativamente derepressi. Per identificare i geni che mediano gli effetti della delezione di Sox2, ho overespresso nelle cellule pHGG nove tra i geni più upregolati e ho identificato quattro geni, Cdkn2b, Ebf1, Zfp423 e Hey2, che hanno ridotto fortemente la proliferazione cellulare in vitro e la tumorigenesi cerebrale in vivo. Mediante la mutagenesi CRISPR / Cas9, o inibizione farmacologica, di ciascuno di questi geni, individualmente, ho dimostrato che la loro attività è essenziale per l'arresto della proliferazione causato dalla delezione di Sox2. Questi antioncogeni inibiti da Sox2 hanno anche inibito la clonogenicità in linee di cellule staminali tumorali primarie derivate dal glioblastoma umano. Questi esperimenti identificano fattori anti-oncogenici critici la cui inibizione da parte di Sox2 è coinvolta nel mantenimento della CSC, definendo nuovi potenziali bersagli terapeutici per i gliomi. (Barone et al., 2020; Barone et al., 2018) Oltre a questo lavoro, che costituisce la parte principale del mio lavoro di tesi, ho contribuito a comprendere la funzione di Sox2 nelle cellule staminali neurali normali derivate dal cervello. Qui, studi genome-wide (ChIA-PET; ChIPseq; RNAseq) ci hanno portato a capire che Sox2 agisce nella regolazione genica, a livello genome-wide, mantenendo e regolando una rete genome-wide di interazioni a lungo raggio nella cromatina, collegare promotori genici a stimolatori distanti (Bertolini et al, 2019). Questa nuova prospettiva sulla funzione molecolare di Sox2 ci ha permesso di identificare nuovi geni regolati da Sox2, identificando il legame di SOX2 con esaltatori distanti (ChIPseq), permettendoci di capire quale gene controllano questi potenziatori, attraverso le nostre mappe di interazione a lungo Dati RNAseq). Questo ci ha portato a identificare nuovi importanti mediatori a valle della funzione Sox2 nell'auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali (Pagin et al, in corso di revisione).
Cancer Stem Cells (CSCs) are a tumor cell sub-population with stem-cell features, i.e. self- renewal (ability to re-form a tumor of the same type) and the ability to “differentiate” into cells constituting the tumor bulk. These hallmarks make them responsible for events such as tumor relapse, metastasis and drug resistance. For this reason it is very important to understand which are the «factors» fundamental for their maintenance. Interestingly, the same transcription factors may be responsible of the maintenance of both normal stem cells and cancer stem cells. In particular we know that the “stemness” transcription factor Sox2, a major regulator in neural stem cells, is also overexpressed in brain tumors. In gliomas, Sox2 is essential to maintain CSC. In mouse high-grade glioma pHGG, Sox2 deletion causes cell proliferation arrest and inability to reform tumors in vivo; 134 genes are significantly derepressed. To identify genes mediating the effects of Sox2 deletion, I overexpressed into pHGG cells nine among the most derepressed genes, and identified four genes, Cdkn2b, Ebf1, Zfp423 and Hey2, that strongly reduced cell proliferation in vitro and brain tumorigenesis in vivo. By CRISPR/Cas9 mutagenesis, or pharmacological inactivation, of each of these genes, individually, I showed that their activity is essential for the proliferation arrest caused by Sox2 deletion. These Sox2-inhibited antioncogenes also inhibited clonogenicity in primary human glioblastoma-derived cancer stem-like cell lines. These experiments identify critical anti-oncogenic factors whose inhibition by Sox2 is involved in CSC maintenance, defining new potential therapeutic targets for gliomas (Barone et al, Glia, under revision; Barone et al, 2018). Further to this work, constituting the main part of my thesis work, I contributed to understand Sox2 function in normal, brain-derived neural stem cells. Here, genome-wide studies (ChIA- PET; ChIPseq; RNAseq) led us to understand that Sox2 acts in gene regulation, at the genome- wide level, by maintaining and regulating a genome-wide network of long-range interactions in chromatin, connecting gene promoters to distant enhancers (Bertolini et al, 2019). This new perspective on Sox2 molecular function allowed us to identify novel Sox2-regulated genes, by identifying SOX2 binding to distant enhancers (ChIPseq), enabling us to understand which gene these enhancers control, through our long-range interaction maps (ChIA-PET and RNAseq data). This led us to identify important new downstream mediators of Sox2 function in neural stem cell self-renewal (Pagin et al, under revision).

The aim of this work was the study of trophic properties of MSCs on sensitive neurons in culture. In particular we tested the MSCs’s capacity of myelination in order to use these cells for demyelinating disease therapies. MSCs are adult, multipotent and undifferentiated stem cells derived from bone marrow and isolated by plastic adherence. DRG from 15-day old Sprague-Dawley rat embryos were removed and cultured on a substrate of rat-tail collagen in AN2 medium supplemented with 5 ng/ml NGF. In a previous study our lab demonstrated that MSCs are able to rescue DRG dissociated neurons and to support their long-lasting survival in presence of NGF when co-cultured at direct contact. In this work we characterized cultured DRG neurons cellular death by means of cytofluorimetric, immunofluorescences and electron microscopy tecniques, demonstrating that neuronal cultures died for apoptosis and that MSCs protected neurons from this kind of death. We then investigate if the trophic role of MSCs was mediated by the release of soluble factors. We demonstrated that cocultures MSCs conditioned medium didn’t improve neuronal survival. We also investigated if MSC express constitutively on their surface some molecules able to improve neuronal survival by plating neurons on paraformaldehyde fixed MSCs (0,5%, 4%) and even in this case neurons died as the untreated control neurons. Therefore we concluded that the effect of MSCs on neuronal survival was mainly mediated by direct contact. We also observe in electron microscopy some point of contact between MSCs and neurons, and using a vital fluorescent cytoplasmatic stain we demonstrated the possibility of a passage of material between the two populations. By immunofluorescences we observed the presence only in cocultures of connexin 32, 36 and 42, which are proteins involved in neuronal gap junction formation. Connexin 32 was found in correspondence of neuronal and MSC membrane, suggesting that there were connection between neurons and MSC. We also demonstrated by electron microscopy the presence of axonal myelination only in neurons in cocultures. The myelin production was not due to the presence of satellite cells in our cultures, because we eliminated them with fluorodesoxyuridin that kills proliferating cells, as confirmed by immunofluorescences experiment with two markers of glial cells, GFAP and S100. Moreover the myelin production is neither due to transdifferentiation of MSCs, as demonstrated by immunofluorescences. The myelin presented in cocultures is few but it is compact and functional, presenting Node of Ranvier and morphological characteristic similar to myelin of neuronal and Schwann cells cocultures. In conclusion in this work we demonstrated that MSC can myelinate neuronal processes in culture, without transdifferentiating in Schwann cells. These results can be the base of more elaborate studies on human MSCs and on other types of neurons, like SNC neurons, to confirm the validity of MSC even on SNC, in order to identify a possible therapy for demyelinating disease with stem cells.

Wolfram syndrome (WS) is a rare genetic disorder caused by mutations in the WFS1 gene leading to a wide spectrum of clinical dysfunctions, among which blindness, diabetes and psychiatric traits are the most prominent. WFS1 encodes for the ER-resident transmembrane protein wolframin (WFS1), whose structure and functions are only partially understood, making the comprehension of the aetiopathological events underlying the syndrome yet incomplete. The following thesis project aims at better deciphering wolframin function under physiological and pathological conditions. In particular, we focused on the study of both recessive and dominant forms of WS1. Firstly, we established relevant cellular models from human derived samples to unveil pathological mechanisms at the root of specific WS1 symptoms (PART I). Noticeably, to our knowledge this is the first report of patient’s specific neuronal characterisation. Besides the described role played by wolframin in counteracting cellular stress, we shed light on two undescribed pathological mechanisms. The first one implies glial population, which exerts a peculiar non-cell-autonomous activity further damaging WFS1 knock out neurons. This toxicity appears to be prompted by ER stress pathways occurring in mutant astrocytes, which cause their activation and subsequent secretion of inflammatory mediators. In this scenario, the use of specific molecules able to mitigate the triggering event, such as chemical chaperones, positively affecting neuronal cultures, preventing cell death (PART II and III). Besides, neuroinflammation appears to be a hallmark of WS1 murine tissues too, preceding retinal ganglion cell loss. This feature is most likely responsible for the early visual defects observed in mutant mice (PART IV). In addition, after structural and functional studies on dominant mutants, we described for the first time a new putative role played by WFS1 in autophagy regulation via its LC3 binding domains. Our findings indicate that wolframin oligomerisation might not only be a key event in its functioning, but also the cause of dominant pathology, as suggested by mutants’ aggregation tendency (PART V). Finally, the study of WS1 psychiatric features in knock out mice, uncovered DA-related neurodegenerative and behavioural defects occurring during disease. Nonetheless, electrophysiological recordings of MSNs residing within the NAc, unveiled their basal excitability propensity due to the altered capacitance of these cells. Furthermore, the impaired D1R-mediated response elicited by DA, further addressed their overexcitability to a defective channel tuning, thus implying that wolframin loss compromises dopaminergic signalling (Part VI). Overall, this work provides deeper understanding on WS1 pathophysiology, highlighting the importance of characterising specific mutations in relevant cellular settings to unveil novel pathways and possible therapies.
La sindrome di Wolfram (WS) è una rara malattia genetica causata da mutazioni nel gene WFS1 che porta a un ampio spettro di sintomi, tra cui le più importanti sono cecità, diabete e tratti psichiatrici. WFS1 codifica per la proteina transmembrana wolframina (WFS1) che risiede nell'ER e la cui struttura e funzione sono solo parzialmente comprese, rendendo ancora incompleta la comprensione degli eventi eziopatologici alla base della sindrome. Il seguente progetto di tesi mira a decifrare meglio la funzione della wolframina in condizioni fisiologiche e patologiche. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio delle forme sia recessive che dominanti di WS1. In primo luogo, abbiamo stabilito modelli cellulari rilevanti da campioni derivati dall'uomo per svelare i meccanismi patologici alla radice dei sintomi specifici della WS1 (PARTE I). A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto sulla caratterizzazione neuronale specifica di pazienti. Oltre al ruolo descritto svolto dalla wolframina nel contrastare lo stress cellulare, abbiamo fatto luce su due meccanismi patologici non descritti. Il primo attribuisce alla popolazione gliale, una peculiare attività non cello-mediata che danneggia ulteriormente i neuroni già difettivi di WFS1. Questa tossicità sembra essere indotta dallo stress dell'ER che si verifica negli astrociti mutanti, che ne causa la loro attivazione e la successiva secrezione di mediatori dell'infiammazione. In questo scenario, l'utilizzo di molecole specifiche in grado di mitigare l'evento scatenante, quali chaperon chimici, ha effetti positivi sulle colture neuronali, prevenendone la morte cellulare (PARTE II e III). Inoltre, la neuroinfiammazione sembra essere un segno distintivo anche dei tessuti murini WS1, che precede la perdita delle cellule gangliari retiniche. Questa caratteristica è molto probabilmente responsabile dei primi difetti visivi osservati nei topi mutanti (PARTE IV). In secondo luogo, studi strutturali e funzionali sulle mutazioni dominanti, ci hanno permesso di identificare per la prima volta un nuovo ruolo putativo svolto da WFS1 nella regolazione dell'autofagia attraverso i suoi domini di legame LC3. I nostri risultati indicano che l'oligomerizzazione della wolframina potrebbe non essere solo un evento chiave nel suo funzionamento, ma anche la causa delle patologie dominanti, come suggerito dalla tendenza all'aggregazione dei mutanti (PARTE V). Infine, lo studio delle caratteristiche psichiatriche della WS1 in topi knock out, ha rivelato eventi neurodegenerativi e difetti comportamentali correlati alla dopamina (DA) che si verificano lungo il decorso della malattia. Le registrazioni elettrofisiologiche dei neuroni MSN che risiedono all'interno del NAc, hanno messo alla luce una loro basale propensione all'eccitabilità dovuta all'alterata capacità di queste cellule. L'alterazione della risposta suscitata dalla DA e mediata dal recettore D1R, ci ha permesso di attribuire questa sovraeccitabilità a una modulazione difettiva dei canali ionici, indicando così che la perdita di wolframina compromette la segnalazione dopaminergica (Parte VI). Nel complesso, questo lavoro fornisce una comprensione più profonda della fisiopatologia WS1, evidenziando l'importanza di caratterizzare mutazioni specifiche in contesti cellulari specifici per svelare nuovi meccanismi e possibili terapie.

Title: Role and potential of endothelial progenitor cells in cerebral vasospasm Abstract: Background and aim: Despite many treatment approaches, cerebral vasospasm and delayed ischemic neuronal damage (DIND) still represent a serious threat to patients with subarachnoid haemorrhage (SAH). Endothelial progenitor cells (EPC) have been involved as prognostic indicators in several vascular diseases and mesenchymal stem cells already have shown some benefits in ischemic injury. Aim of this study was to investigate the therapeutic potential of endothelial progenitor cells (EPC) and mesenchymal stem cells (MSC) in attenuating or preventing vasospasm and DIND in patients with SAH. Methods: Given the emergent role of DIND as a result of multifactorial hypoperfusion stress in the outcome of SAH patients, the efficacy of EPC and MSC in reducing neuronal damage has been evaluated in an in vitro model of ischemia, namely the oxygen glucose deprivation (OGD), on primary rat cortical neuronal cultures. Further, we tested in a clinical observational study SAH patients with and without vasospasm for different recruitment patterns of circulating EPC. To this purpose arterial blood samples were collected at various timepoints from admission to discharge of the patients. On these samples real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed to detect gene expression relative to EPCs, since cytofluorimetric analysis appeared not sensitive enough to detect this rare cell population. Results: Though present results need further confirmation, in vitro it was observed that both MSC and EPC treatment through conditioned medium or co-culture in transwell- although with some differences - mediate a survival advantage for OGD stressed neurons. Furthermore stem cell mediated treatment showed efficacy even when applied 24 hours after OGD stress induction. RT-qPCR results from a small sample of SAH patients might indicate an early mobilization of EPC related gene expression in subjects that do not develop vasospasm with a peak around day 4, whereas the expression of these genes remain invariably low in patients that develop vasospasm as in controls not affected by SAH. Conclusions: MSCs and EPCs seem to have an important potential role in preventing DIND in vitro as well as EPC recruitment might associate with lack of vasospasm in SAH patients. Further studies are needed to confirm these results and to prove a causal relationship between EPCs and vasospasm protection.

Le cellule staminali cerebellari normali fanno parte della grande famiglia delle cellule staminali somatiche, deputate a sostituire le cellule che muoiono per omeostasi fisiologica del tessuto o per un danno. Tali cellule mantengono alcune delle caratteristiche versatili delle cellule staminali embrionali. In particolare sono dotate della capacità di auto-rinnovamento indefinito e di multipotenza, difatti sono in grado di differenziare in più linee cellulari. Le cellule staminali neuronali sono state identificate in molte aree del cervello adulto e risiedono anche nel cervelletto postnatale. Meccanismi aberranti di sviluppo neuronale e cerebellare possono portare alla formazione neoplasie che nel cervelletto prendono il nome di Medulloblastoma, il più frequente tumore cerebrale maligno in età infantile. In tale neoplasia si può riscontrare un’attivazione aberrante della via del segnale di Hedgehog come conseguenza di cambiamenti genetici ed epigenetici che colpiscono vari componenti della via del segnale. Negli ultimi anni è stato proposto un modello alternativo per l’evoluzione del cancro. Questo nuovo modello stabilisce l’esistenza di un ordine gerarchico dove una cellula tessuto-specifica, chiamata “cancer stem cell”, acquisisce o mantiene le proprietà di auto-rinnovamento, multipotenza e di generazione di un tumore sia in vitro che in vivo. Il miR-326 è un noto inibitore della via del segnale di Hedgehog nei granuli cerebellari (Ferretti et al. 2008), ne abbiamo valutato l’espressione nelle cellule staminali neuronali normali e di medulloblastoma sia umane che murine e, come atteso, il miR-326 è poco espresso in tutti i modelli cellulari analizzati. Inoltre, tali cellule, se sottoposte a stimoli differenziativi, esprimono nuovamente il miR-326 evidenziandone un’ipotetica funzione nel differenziamento cerebellare. Abbiamo confermato l'azione di tale microRNA come inibitore della via del segnale di Hegehog non solo mediante l'inibizione di Smoothened ma anche mediante il nuovo target da noi identificato, Gli2. Abbiamo inoltre riscontrato una netta riduzione della proliferazione e della capacità clonogenica delle cellule staminali in presenza del miR-326. Il miR-326 è localizzato all’interno del primo introne del gene della β-arrestina1. Valutando l’espressione della β-arrestina1 nei vari contesti cellulari analizzati, abbiamo riscontrato le stesse modulazioni del miR-326 confermando l’ipotesi bioinformatica che i due geni fossero sotto il controllo dello stesso promotore. Abbiamo confermato che la β-arrestina1 agisce come inibitore del ciclo cellulare attivando p27, come già descritto in letteratura.
 Abbiamo caratterizzando la regione regolatoria comune dei geni miR-326 e β-arrestina1 evidenziando come tali geni siano regolati mediante metilazione del DNA, difatti la loro espressione viene ripristinata grazie all’utilizzo dell’agente demetilante 5’- aza-2’deossicitidina.
 Essendo noto in letteratura la correlazione di EZH2 con la metilazione del DNA e la sua funzione nelle modificazioni istoniche, abbiamo dimostrato la sua presenza sulla regione regolatoria ed anche la contemporanea presenza di un dominio bivalente ad indicare un ulteriore livello di regolazione trascrizionale ed a sottilineare l’importanza di tali geni per il differenziamento neuronale.
 Data la possibile implicazione nella proliferazione delle cellule staminali di medulloblastoma causata dalla deregolazione dell’espressione dei due geni, abbiamo utilizzato un nuovo composto, MC2055, inibitore di EZH2. Abbiamo dimostrato che grazie a trattamenti con tale composto, otteniamo la risoluzione del dominio bivalente e, quindi, l’espressione dei due geni con conseguente arresto della proliferazione.