Dissertations / Theses on the topic 'Cellule vegetale'

La transformation de vegetaux par agrobacterium tumefaciens est une technique abondamment utilisee pour transmettre des genes d'interet agronomique a des plantes economiquement interessantes. Neanmoins, le mecanisme moleculaire permettant la transformation genetique par agrobacterium tumefaciens est incompletement explique. Une des interrogations majeures est la facon dont le complexe t produit par l'agrobacterie est capable de traverser le plasmalemme de la cellule vegetale. Pour repondre a cette question, nous avons compare le mecanisme de la transformation a l'infection virale de cellules animales. Les nombreuses similitudes qui existent dans l'organisation des virus animaux (adenovirus, parvovirus) et celle du complexe t d'agrobacterium tumefaciens nous a incite a penser que ce dernier entrait dans les cellules vegetales par un mecanisme analogue a celui de ces virus, l'endocytose. Nous avons alors etudie l'hypothese de l'endocytose du complexe t. Pour cela des inhibiteurs de l'endocytose ont ete employes. Apres verification de leurs effets sur l'endocytose chez arabidopsis thaliana, leurs effet sur le transfert du complexe t de l'agrobacterie vers la cellule vegetale ont ete analyses. Il apparait que certains (cytochalasine b, brefeldine a, monensine et phorbol-12-myristate-13-acetate) inhibent la transformation transitoire de cellules d'arabidopsis thaliana. Par ailleurs, nous avons pu montrer par immunolocalisation que la proteine vire2, la proteine la plus representee dans le complexe t, etait excretee dans le milieu extracellulaire. Cette excretion est indispensable a la fonction de cette proteine. Ainsi, notre travail montre que la proteine vire2 est excretee par la bacterie, avant de penetrer dans la cellule vegetale par un mecanisme, potentiellement similaire a l'endocytose de virus animaux ou de toxines bacteriennes.

Des cellules isolees d'erable (acer pseudoplatanus l. ) cultivees dans une solution nutritive complete ou depourvue de fer ont ete comparees afin d'etudier les impacts d'une deficience en fer sur la cellule vegetale non photosynthetique. En premier lieu, nous avons observe que l'absence de fer dans le milieu de culture ralentit le rythme des divisions cellulaires et impose un arret de croissance apres 1 a 1,5 generations. A l'issue de la phase de division, les cellules presentent une senescence rapide et meurent de facon prematuree. Dans le but de cerner les evenements responsables de ces perturbations physiologiques, nous avons explore quelques fonctions metaboliques majeures de la cellule d'erable: la synthese des grandes chaines polycarbonees insaturees et la respiration. Ainsi, l'analyse des acides gras insatures et des carotenoides a montre que la carence de fer bloque severement certains mecanismes membranaires de desaturation en cis et en trans respectivement: la desaturation du c18:2 en c18:3 par les desaturases microsomiales et/ou plastidiales; la desaturation du phytoene, precurseur des carotenoides, par la phytoene desaturase de l'enveloppe plastidiale. L'implication du fer dans ce dernier systeme n'etait pas connue jusqu'a present. Pendant l'installation de la carence de fer, la respiration basale des cellules reste normale. Toutefois, la vitesse de la respiration decouplee ne cesse de decroitre sous l'effet du dysfonctionnement progressif de la succinate deshydrogenase: seul le transfert des electrons via le complexe ii de la chaine respiratoire est en effet altere, malgre une depletion generalisee en centres fer-soufre et en cytochromes mitochondriaux. A l'issue de la phase de division, les mitochondries fonctionnent au maximum de leurs capacites sans pouvoir repondre integralement aux besoins energetiques du metabolisme. S'ensuit alors un effondrement de l'activite respiratoire, associe a une disparition totale des cretes de la membrane interne des mitochondries. La desorganisation de la fonction respiratoire sous l'influence de la carence de fer est probablement le facteur responsable de la mort des cellules d'erable

Une etude detaillee de la structure a ete entreprise afin d'examiner les relations existant entre l'organisation nucleaire et l'activite cellulaire. Les noyaux de nephrolepis biserrata ont une structure chromerique sans chromocentre. L'analyse cytologique en microscopie phtonique et electronique montre que la structure chromaticienne du noyau de l'apicale est tres diffuse. L'application de la cytophotometrie a balayage permet d'obtenir des donnees quantitatives. Dans les cellules mitotiquement actives, la proportion d'adn condense ne varie pas au cours du cycle mais la densite moyenne augmente lors du passage en phase g2. La proportion d'adn condense, en volume et en teneur, est plus faible dans les nouyaux de la cellule apicale et des derivees que dans ceux des autres cellules du meristelme. Une relation entre l'organisation de la chromatine et les fonctions du noyau a pu etre degagee. L'ensemble de ces resultats permet de rapprocher les proprietes de l'apicale de celles des cellules zygotiques

Mise en evidence des activites enzymatiques generatrices de potentiel membranaire; etude de leur potentialite de fonctionnement dans le materiel dormant et non dormant puis comparaison des potentialites existantes dans les 2 types de materiels. L'etude des proprietes de l'atpase (difference de lambda m) constitue un argument en faveur d'un remaniement membranaire au cours de la levee de dormance. Etablissement de nouvelles correlations intercellulaires a courte distance conferant de nouvelles proprietes morphogenetiques aux bourgeons

Un systeme oscillatoire tres caracteristique des parois cellulaires des cellules vegetales est constitue par l'assemblage helicoidal. Par des recherches methodologiques de demasquage et de dissection des edifices microfibrillaires, par une analyse stereoscopique et par une modelisation des variations dans l'espace et dans le temps, on etablit la dynamique, la gamme et les modalites d'adaptation du systeme en fonction de la differenciation cellulaire afin de mieux comprendre la morphogenese parietale

L'objectif de ce travail est d'identifier des proteines associees a la morphodynamique de l'appareil de golgi dans les cellules vegetales. Trois groupes de proteines ont ainsi ete etudies : 1) des proteines associees aux membranes golgiennes. Nous definissons deux anticorps monoclonaux, mac254 et mac266, comme des marqueurs du golgi a l'echelle optique. Une etude comparative avec jim84, seul monoclonal reconnu comme marqueur du golgi, montre que tous ces anticorps decrivent differentes sous-familles de proteines portant toutes des branchements sucre de type lewis a. De plus, un marquage differentiel de surfaces cellulaires suggere une regulation de l'exportation des proteines reconnues fonction de l'environnement cellulaire. 2) des proteines candidates a la regulation du mouvement des unites golgiennes dans le cytoplasme. Nous avons initie une etude sur les proteines rho et les proteines de type myosine et spectrine qui pourraient jouer un role entre la dynamique de l'actine et les mouvements golgiens. Les resultats ne permettent pas d'identifier de myosine ou de spectrine participant au mouvement golgien. Ils soulignent la difficulte d'etudier les proteines rho par des approches classiques de toxines. Par contre ils indiquent qu'une petite proteine de 18 kda reconnue par les anticorps animaux anti-rac1 est associee aux membranes golgiennes, probablement par la face cis du golgi. 3) un complexe proteique, le coatomere, connu dans la cellule animale pour initier le bourgeonnement de vesicules mantelees de type copi a partir des membranes golgiennes. Nous avons mis en evidence une proteine de 100 kda reconnue par des anticorps anti--cop, associee aux membranes golgiennes. Une analyse par spectrometrie de masse definit cette proteine comme une -cop vegetale. Au moins deux autres proteines, qui pourraient etre associees a -cop et former un complexe de type coatomere, ont ete visualisees : -cop et -cop. Enfin la surexpression de arf1, petite proteine g en charge du recrutement du coatomere sur la membrane golgienne, retarde notamment son developpement. Une quatrieme partie reprend ces experiences dans un modele cellulaire a croissance apicale, le tube pollinique. Ces donnees sont discutees dans le contexte de la regulation de la morphodynamique du golgi.

L'absorption d'herbicides par des cultures traitees represente un phenomene quantitativement mal connu. La connaissance de cet acte physiologique conditionne l'etablissement de modeles previsionnels pour la dissipation des herbicides dans l'environnement. Le present travail a porte sur l'absorption de l'atrazine par le mais a differents stades, en conditions controlees. L'etape premiere de cette absorption est passive et correspond a un double processus de diffusion et de partition lipides/eau, concernant les cellules racinaires, et apparait comparable a ce qui se passe entre un milieu aqueux et un organite isole fonctionnel comme une mitochondrie ou un chloroplaste. Notre etude de partition entre composes inertes de lipophilie diverse, presents a l'etat liquide ou solide (lecithines, glycerides satures, cires, alcanes solides, cellulose, lignine) et proches chimiquement de ceux rencontres dans le vegetal, a permis de mesurer des coefficients de partition qui ont les valeurs maximales pour les lecithines et les cires et sont tres faibles pour la cellulose, la lignine et les alcanes solides. La vitesse de diffusion dans chacun de ces composes est tres variable, et n'a une valeur tres elevee que dans l'eau et les composes hydrophiles. Il ressort de cette etude que l'atrazine se concentre dans les lipides cellulaires de maniere a atteindre une concentration cellulaire apparente proche du double de celle du milieu pour des cellules moyennement riches en lipides. Le mouvement diffusif de cette molecule doit se produire essentiellement dans l'eau. Cette situation, observee soit dans des cellules d'erable vivantes soit dans des plantules de mais tuees, differe totalement de celle constatee dans les plantules de mais vivantes qui surconcentrent puissamment les derives de l'atrazine (d'un facteur 7 a 12) parce qu'elles sont capables de les transformer en derives hydroxyles avec une tres grande intensite. L'hydroxylation de l'atrazine chez le mais est un processus chimique d'hydrolyse qui se produit activement a ph legerement acide en presence des benzoxazinones accumulees par cette plante a des concentrations tres fortes (10 a 15 mm) vraisemblablement pour l'essentiel dans la vacuole. Les processus enzymatiques de conjugaison de l'atrazine, inoperants sur les derives hydroxyles, ne jouent certainement qu'un role tres mineur en conditions agronomiques. Les produits d'hydroxylation ne ressortent des cellules qui les ont elabores qu'avec une grande difficulte, soit vers le milieu de culture soit vers les vaisseaux du bois. Le processus d'entrainement par le flux transpiratoire, des racines vers les parties aeriennes, est donc lent et complexe. L'absorption racinaire de l'atrazine chez le mais est favorisee par l'hydroxylation qui optimise la difference de concentration entre le milieu et l'espace aqueux interne

CD33 is a myeloid cell surface marker absent on normal hematopoietic stem cells and normal tissues but present on leukemic blasts in 90% of adult and paediatric acute myeloid leukaemia (AML) cases. By virtue of its expression pattern and its ability to be rapidly internalized after antibody binding, CD33 has become an attractive target for new immunotherapeutic approaches to treat AML. In this study two immunoconjugates were constructed to contain a humanised single-chain fragment variable antibody (scFv) against CD33 in order to create new antibody-derived therapeutics for AML. The first immunoconjugate was developed to provide targeted delivery of siRNAs as death effectors into leukemic cells. To this purpose, a CD33-specific scFv, modified to include a Cys residue at its C-terminal end (scFvCD33-Cys), was coupled through a disulphide bridge to a nona-d-arginine (9R) peptide carrying a free Cys to the N-terminal. The scFvCD33-9R was able to completely bind siRNAs at a protein to nucleic acid ratio of about 10:1, as confirmed by electrophoretic gel mobility-shift assay. The conjugate was unable to efficiently transduce cytotoxic siRNA (siTox) into the human myeloid cell line U937. We observed slight reductions in cell viability, with a reduction of 25% in comparison to the control group only at high concentration of siTox (300 nM). The second immunoconjugate was constructed by coupling the scFvCD33-Cys to the type 1 ribosome inactivating protein Dianthin 30 (DIA30) through a chemical linking The resulting immunotoxin scFvCD33-DIA30 caused the rapid arrest of protein synthesis, inducing apoptosis and leading ultimately to cell death. In vitro dose-dependent cytotoxicity assays demonstrated that scFvCD33-DIA30 was specifically toxic to CD33-positive cell U937. The concentration needed to reach 50 % of maximum killing efficiency (EC50) was approximately 0.3 nM. The pronounced antigen-restricted cytotoxicity of this novel agent makes it a candidate for further evaluation of its therapeutic potential.

La reconnaissance specifique des eliciteurs par des recepteurs induit une cascade de transduction du signal dont le ca 2 + est le messager secondaire principal. Cette these a pour but de visualiser les signaux calciques induits par les eliciteurs, de definir le role du ca 2 + dans la voie de transduction du signal aux eliciteurs et de decoder cette voie. Des cultures cellulaires de soja et de tomate exprimant l'aequorine, une proteine liant le ca 2 + ont ete utilisees pour cette etude. Les eliciteurs glucosidiques, derivant du pathogene du soja p. Sojae, induisent dans les cellules de soja une augmentation du ca 2 + cytosolique biphasique correlee avec la degradation specifique du rnam du tubb1, un isoforme de -tubuline et l'induction du gene de la 4-coumarate coa ligase (4cl). Des chelateurs de ca 2 + bloquent le signal calcique, la degadation de tubb1 et l'expression de 4cl. De meme, la neomycine qui reduit le second pic du signal calcique biphasique bloque la degradation du messager de tubb1. Le signal calcique induit par l'eliciteur bacterien, la flagelline, a ete etudie dans les cellules de tomate. Cet eliciteur induit un signal calcique cytosolique biphasique correle avec l'induction du gene pr1a1 et l'augmentation de l'activite de l'acc synthase. Des inhibiteurs des canaux anioniques bloquent le signal calcique induit par les glucanes impliquant l'ouverture des canaux anioiniques en amont de l'entree du ca 2 +. Ils bloquent la production de phytoalexines et l'induction du gene de la chalcone synthase mais n'affectent pas la production d'especes d'oxygene actives. Ces observations demontrent pour la premiere fois une divergence dans les voies de signalisation intracellulaires apres perception de l'eliciteur. Ce travail a permis la visualisation de signaux calciques specifiques induits par divers eliciteurs, a souligne l'importance du ca 2 + dans la regulation de l'expression de genes et a etudie l'interaction de la reponse calcique avec d'autres reponses de defense precoces.

Este trabalho avalia as vantagens do uso das fibras curtas de polpa de Eucalipto tanto como alternativa às fibras longas de polpa de Pinus, como também para fibras sintéticas, tradicionalmente usadas no reforço de materiais cimentícios. Os efeitos da morfologia (comprimento, largura, fibrilação, conteúdo de finos, número de fibras por grama, etc.) das fibras celulósicas no processamento, no desempenho mecânico e físico e na microestrutura dos compósitos de fibrocimento foram avaliados. Os compósitos foram avaliados antes e após ciclos de envelhecimento acelerado. Fibras de Eucalipto apresentaram melhor dispersão na matriz cimentícia e forneceram maior densidade de fibras em massa ou em volume, em relação às fibras de Pinus. As fibras curtas permitem um reforço efetivo da matriz frágil, diminuindo a propagação das fissuras, o que contribuiu para o melhor desempenho mecânico dos compósitos após envelhecimento. Estes resultados promissores mostram o potencial apresentado pelas fibras curtas de Eucalipto para reduzir custos, em vista da substituição parcial das fibras sintéticas em processos de cura ao ar, e durante o refino da polpa celulósica. O efeito do branqueamento das fibras também foi avaliado, e mostrou que as fibras branqueadas de Eucalipto são mais reativas para se ligarem por pontes de hidrogênio com a matriz cimentícia. Fibras branqueadas melhoraram a interface entre fibra e matriz, embora apresentassem mais sinais de mineralização (re-precipitação de produtos de hidratação dentro das fibras) do que as fibras não-branqueadas. O refino da polpa celulósica foi utilizado para modificar as propriedades morfológicas das fibras de Eucalipto e Pinus. Os resultados mostraram que são necessárias maiores intensidade de refino na polpa de Pinus para obter valores de retenção de sólidos do cimento similares àqueles obtidos com fibras não-refinadas de Eucalipto. O refino aumentou a capacidade das fibras de capturar as partículas minerais, melhorando a aderência das fibras com a matriz. Esta melhor interface entre fibra e matriz melhorou as propriedades mecânicas dos compósitos aos 28 dias de cura, mas os tornou mais frágeis após os ciclos de envelhecimento acelerado. A modificação química da superfície das fibras foi realizada com o objetivo de melhorar as ligações entre fibra e matriz e diminuir a mineralização da fibra dentro dos compósitos. Esta modificação química foi realizada com Metacriloxipropiltri-metoxisilano (MPTS) e Aminopropiltri-etoxisilano (APTS) e mostrou influenciar significativamente a microestrutura dos compósitos. Ciclos de envelhecimento acelerado diminuíram o módulo de ruptura (MOR) e a tenacidade (TE) dos compósitos com fibras não-modificadas e modificadas; entretanto, compósitos reforçados com fibras modificadas com MPTS apresentaram fibras sem produtos de hidratação do cimento em seu interior, enquanto que fibras modificadas com APTS apresentaram acelerada mineralização. Fibras mineralizadas tornam os compósitos mais frágeis após os ciclos de envelhecimento acelerado. Estas observações são, portanto, muito úteis para o entendimento da contribuição de diferentes condições das fibras (composição química, resistência mecânica, morfologia e propriedades de superfície) para os mecanismos de aderência entre fibras e matriz cimentícia, de mineralização das fibras e de degradação dos compósitos de fibrocimento.
This work evaluates the advantages of using hardwood short fibre pulp (Eucalyptus) as alternative to softwood long fibre pulp (Pinus) and synthetic fibres, traditionally used in reinforcement of cement based materials. The effects of cellulose fibre morphology (e.g., length, width, fibrillation, content of fines and number of fibres per gram) on the processing, on the mechanical and physical performance and on the microstructure of fibre-cement composites were evaluated. Composites were evaluated before and after accelerated ageing cycles. Eucalyptus pulp fibres were better dispersed in the cement matrix and provided higher number of fibres per unitary weight or volume, in relation to Pinus long fibre pulp. The short reinforcing elements lead to an effective crack bridging of the fragile matrix, which contributes to the improvement of the mechanical performance of the composite after ageing. These promising results show the potential of eucalyptus short fibres for reducing costs by both the partial replacement of expensive synthetic fibres in air curing process and the energy savings during pulp refining. The effects of pulp bleaching were also evaluated, and showed that Eucalyptus bleached fibres are more reactive to bond with the cement matrix by hydrogen bonds. Bleached fibres improved the fibre-matrix interface, although they presented more signals of fibre mineralization. Mechanical refining was used to change the morphological properties of Eucalyptus and Pinus pulps. Results show that high levels of refining were necessary for Pinus pulp to obtain cement retention values similar to those obtained by unrefined Eucalyptus pulp. The mechanical refining increased the capacity of the fibres to capture the mineral particles improving the adherence of the fibres with the matrix. This improved fibre-matrix interface led to better mechanical properties at 28 days of cure, but turned brittle the composites after 200 ageing cycles. The chemical surface modification of cellulose pulp fibres was done in order to improve fibre-matrix bonding and to decrease fibre mineralization into the composite. Surface modification of the cellulose pulps was performed with Methacryloxypropyltri-methoxysilane (MPTS) and Aminopropyltri-ethoxysilane (APTS) and showed significant influence on the microstructure of the composites. Accelerated ageing cycles decreased modulus of rupture (MOR) and toughness (TE) of the composites with unmodified and modified fibres, however composites reinforced with MPTS-modified fibres presented fibres free from cement hydration products, while APTS-modified fibres presented accelerated mineralization. Higher mineralization of the fibres led to higher embrittlement of the composite after accelerated ageing cycles. These observations are therefore very useful for understanding the contribution of the different fibre conditions (chemical composition, mechanical strength, morphology and surface properties) to the mechanisms of fibre-matrix adherence, fibre mineralization and degradation of fibre-cement composites.

Le cluster de genes hrp de ralstonia solanacearum est organise en 5 unites de transcription. L'expression des unites 2, 3 et 4 est induite en milieu minimum et depend du gene regulateur hrpb. Nous avons montre que lors de coculture avec des cellules d'arabidopsis thaliana et de tomate, l'expression des unites de transcription du cluster de gene hrp est induite 10 a 20 fois plus qu'en milieu minimum. Cette induction est specifiquement controlee par un gene nomme prha qui code pour une proteine potentielle de 770 acides amines homologue aux recepteurs de siderophores. Toutefois, l'expression de prha ni des genes hrp ne semble etre regulee par le fer. Chez les mutants prha, l'induction des genes hrp est fortement diminuee en presence de cellules d'arabidopsis, partiellement reduite en presence de cellules de tomates, et presque inchangee en milieu minimum. Or, les mutants prha sont hypoagressifs vis a vis d'arabidopsis, mais pleinement pathogenes vis a vis de la tomate, ce qui suggere que la coculture avec des cellules vegetales mime l'interaction plante-pathogene.

Ce manuscrit decrit des contributions a l'etude des activites nucleotidases des cellules vegetales. La hplc a ete utilisee pour la mesure de la charge energetique et les transformations des nucleotides lors du stress osmotique et de l'isolement des protoplastes. Cette technique permet de suivre la balance energetique des nucleotides et leur evolution simultanee dans differentes conditions. A partir de ces experiences, nous suggerons que l'integrite de la membrane plasmique et la regulation de la charge energetique doivent etre des indices importants pour l'etude de la regeneration des protoplastes. Puisque la vacuole est un organite regulateur de la pression osmotique, l'interaction entre les nucleotides adenyliques et le tonoplaste a ete soigneusement examinee par hplc. En plus de l'activite atpase, une nouvelle activite phosphotransferase est caracterisee sur cette membrane, qui permet la conversion de l'adp en atp et amp. Ce resultat illustre l'interet de la hplc dans l'enzymologie des nucleotides ou les methodes classiques ne permettent pas de detecter cette interconversion. Il a ete aussi demontre que le pyrophosphate est une source d'energie par inversion de l'activite atpase ne presence de l'adp. Les nucleotides non adenyliques, sont aussi hydrolyses par le tonoplaste et leur aptitude a generer le gradient de proton est compare a l'atp. Le gtp et l'itp sont significativement hydrolyses sans contribution importante au gradient de proton. Tous ces resultats, illustrent la complexite du metabolisme des nucleotides, en particulier dans le compartiment vacuolaire, et ouvrent de nouvelles perspectives dans la regeneration et la culture des protoplastes

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-01-15T11:45:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1448345 bytes, checksum: a83f2b152e3e1ed2e0720b2e5c9c54e9 (MD5)
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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A organogênese de brotos a partir de raízes (rootsuckers) permite a propagação vegetativa daArabidopsis lyrata, o parente mais próximo daArabidopsis thaliana. Utilizando um sistema in vitro, o presente estudo objetivou compreender melhor a propagação vegetativa nessa espécie modelo A. lyrata, no que se refere ao desenvolvimento morfológico de suckers, à capacidade de propagação vegetativa em diferentes condições de crescimento in vitro e à identificação de genes potencialmente envolvidos na formação do meristema apical dos brotos.O surgimentodos suckers ocorreu após 30 dias, mais freqüentemente na região axilar das raízes laterais. Os cortes transversais das raízes mostraram uma estrutura primária típica diarca e após cerca de 25 dias, pode-se observar o crescimento secundário da raiz, como indicado pela formação do câmbio. Conclui-se que a emergência do sucker assemelha-se à iniciação das raízes laterais a partir do periciclo, tecido que dá origem ao câmbio vascular durante o crescimento secundário. Em relação às condições de crescimento in vitro, a força total no meio MS induziu o maior número de suckers por planta, seguido por alta concentração de sacarose (3%).Exposição à luz e privação de sacarose não são estritamente necessários para a formação de suckers. Nossos dados também revelaram que a auxina promove a formação dos brotos. Máximas de auxina vascular são necessários para desencadear a iniciação da raiz lateral, sugerindo que a formação de suckers promovida por auxina ocorre provavelmente por mecanismos semelhantes. A avaliação de diferentes genes relacionados a meristema apical, demonstram que o gene STM pode ser um marcador para distinguir as células responsáveis pela formação de suckers. Arabidopsis lyrata provou ser um excelente modelo para estudos de organogênese em raíz e posteriores estudos usando esse sistema de reproduçãopara detectar marcadores epigenéticos através das várias gerações de propagação clonal.
Shoot organogenesis from roots (root suckers) allows vegetative propagation of Arabidopsis lyrata, the closest relative of Arabidopsis thaliana, in addition to sexual propagation and is an important trait associated with the root system. Using an in vitro system, we aimed to better understand the vegetative propagation in the model species A. lyrata, in what regards the morphological development of root suckers, the ability of vegetative propagation in different in vitro growth conditions, and identifying genes potentially involved in the formation of the new shoot apical meristem.Root sucker appearanceoccurred after30 days,most frequently in the axils of lateral roots. Root cross-sections showed a typical diarch primary structure and after 25 days, secondary root growth could be observed, as indicated by formation of the cambium. According to our data,root sucker emergence resembles the initiation of lateral roots from the pericycle, the tissue that gives rise to the vascular cambium during secondary growth. Regarding the in vitro growth conditions, full strength of MS induced the highest number of root suckers per plant, followed 3% of sucrose. However, light exposure and sucrose deprivation are not strictly required for sucker formation. Our data also revealed that auxin promotes root suckering. Vascular auxin response maxima are required to trigger lateral root initiation, suggesting that auxin- promoted sucker formation likely occurs by similar mechanisms. The evaluation of different shoot apical meristem related genes, suggests that the STM gene can be a potential marker to identify cells responsible in driving sucker formation. Arabidopsis lyrata proved to be an excellent model for further studies using root suckers, for example to study epigenetic marks throughout generations of clonal propagation.

La sécheresse est un stress majeur pour les plantes qui ont développé de nombreuses stratégies pour y faire face. La réponse la plus rapide à un stress hydrique est la fermeture des pores stomatiques qui limite les pertes d'eau par évapo-transpiration. La phytohormone acide abscissique (ABA) participe à cette réponse en modifiant la turgescence des cellules de garde. La protéine kinase OST1 d'Arabidopsis thaliana contrôle les étapes précoces de la transduction du signal ABA dans ces cellules. Au cours de cette thèse, nous avons cherché à comprendre les mécanismes de régulation de la kinase OST1. Nous avons d'abord montré que la protéine 10xHis-OST1 produite chez E.coli est active et s'autophosphoryle. Ceci nous a permis d'identifier des résidus phosphorylés, cibles potentielles de kinases ou phosphatases régulant l'activité de OST1 dans la plante. L'importance de ces résidus a d'abord été étudiée in vitro par l'analyse de l'activité de protéines recombinantes mutées sur les résidus phosphorylés. Puis nous avons étudié l'impact de ces mutations dans la plante en réalisant des tests de complémentation du mutant ost1 et des tests d'activité kinase après immunoprécipitation des différentes versions de la protéine OST1. La même stratégie appliquée à l'étude de versions tronquées de OST1 nous a permis d'analyser son domaine C-terminal. Nous avons ainsi identifié plusieurs éléments structuraux critiques pour l'activité de OST1 et sa fonction dans la plante. Enfin, notre analyse des différents allèles mutants ost1 suggère que OST1 régule les flux transpiratoires en réponse à un stress hydrique à deux niveaux distincts, dans les cellules de garde et les tissus vasculaires.

Les extensines, proteines structurales de la paroi, constituent un ensemble de proteines particulier. A chaque gene d'extensine correspond un mode de regulation, et probablement a chaque proteine, une fonction particuliere dans la paroi. Cette etude a ete realisee a la fois dans le contexte de la plante et dans celui des proliferations cellulaires pour mieux comprendre le(s) role(s) que pourrai(en)t jouer la(les) proteine(s) de type ext 1. 4 dans la mise en place ou la structuration de la paroi. La famille de genes ext 1. 4 partiellement caracterisee chez n. Tabacum comporterait quatre membres presentant de forts degres d'identite entre eux. Nous avons montre que le gene ext 1. 4 est principalement exprime dans les tissus de la plante soumis a des contraintes mecaniques et dans des proliferations cellulaires induites par des hormones de croissance en analysant des plantes transgeniques comportant des genes chimeres de type promoteur ext 1. 4/-glucuronidase. Ce patron d'expression suggere que la proteine joue un role dans le renforcement des parois de cellules soumises a des contraintes mecaniques et dans la structuration des parois de cellules non organisees en tissu. Les modes de regulation du gene ext 1. 4 en reponse a des contraintes mecaniques, dans des cals, dans des suspensions cellulaires et dans des protoplastes, ont ete precise en localisant des elements cis-regulateurs dans ses regions non codantes : (i) des regions comportant des elements tissu- ou cellule-specifiques ont principalement ete localisees dans la region proximale du promoteur ; (ii) des elements modulant positivement ou negativement le niveau d'expression du gene ext 1. 4 sont repartis le long de la region 5 non codante ; (iii) la region 3 non codante semble moduler le niveau d'expression de facon tissu-specifique a un niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Enfin, de nouveaux modeles ont ete etablis pour faciliter les etudes de regulation et de fonction.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-03-28T18:52:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2058567 bytes, checksum: a9054d3d3fe5556e202af07cd80f55f6 (MD5)
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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
A proteína BiP demonstra participar da imunidade inata e atenuar eventos de morte cellular induzido por estresse do retículo endoplasmático (RE) e osmótico. Plantas transgências com níveis elevados de BiP foram utilizadas para avaliar se BiP controla o desenvolvimento e morte culular porgramada (PCD) hipersensitiva. Sob condições normais, o transcriptoma induzido por BIP revelou uma robusta regulação negativa de genes envolvidos em PCD hipersensitiva e uma regulação positiva de genes relacionados a patógenos. A superexpressão de BIP atrasou a senescência foliar e acelerou a PCD hipersensitiva disparada por Pseudomonas syringae pv. tomato em plantas de soja e tabaco monitoradas por marcadores de PCD em plantas. O atraso da senescência foliar mediada por BiP correlacionou com a atenuação do sinal de morte celular mediada por proteínas ricas em asparagina (NRP) e inibição da ativação da resposta a proteínas mal dobradas (UPR). Além disso, sob ativação biológica da sinalização ácido salicílico (SA) e PCD hipersensitiva, a superexpressão de BiP inibiu antagonicamente a via UPR. Assim a indução de sinais de morte celular induzidas por NRP e mediadas por AS ocorre por uma via distinta da UPR. Os dados indicam que durante a PCD hipersensitiva, BiP regula positivamente a sinalização de morte celular mediada por NRP por meio de um mecanismo indefinido que é ativado por sinalização de AS e relacionado ao funcionamento do RE. Em contraste, a regulação negativa de BiP durante a senescência foliar pode ser ligada a capacidade de mediar a ativação de UPR e sinais de morte celular mediada por NRP. Assim, BiP pode funcionar como regulador positivo ou negativo de eventos de morte ceular.
The binding protein (BiP) has been demonstrated to participate in innate immunity and attenuate ER- and osmotic-stress-induced cell death. Here, we employed transgenic plants with manipulated levels of BiP to assess whether BiP also controlled developmental and hypersensitive programmed cell death (PCD). Under normal conditions, the BiP-induced transcriptome revealed a robust down-regulation of the genes involved in developmental PCD and an up-regulation of the genes involved in hypersensitive PCD triggered by non-host- pathogen interactions. Accordingly, BiP overexpression delayed leaf senescence and accelerated the hypersensitive PCD triggered by Pseudomonas syringae pv. tomato in soybeans and tobacco, as monitored by measuring hallmarks of PCD in plants. The BiP- mediated delay of leaf senescence correlated with the attenuation of N-rich protein (NRP)- mediated cell death signaling and the inhibition of the senescence-associated activation of the unfolded protein response (UPR). In contrast, under biological activation of SA signaling and hypersensitive PCD, BiP overexpression further induced NRP-mediated cell death signaling and antagonistically inhibited the UPR. Thus, the SA-mediated induction of NRP cell-death signaling occurs via a pathway distinct from UPR. Our data indicate that during the hypersensitive PCD, BiP positively regulates the NRP cell-death signaling through a yet undefined mechanism that is activated by SA signaling and related to ER functioning. In contrast, BiP’s negative regulation of leaf senescence may be linked to the its capacity to mediate the UPR activation and NRP cell death signaling. Therefore, BiP can function either as a negative or positive regulator of PCD events.
Tese enviada pela secretaria do curso por e-mail, em 28-03-17

Resultats obtenus chez melilotus alba et acer pseudoplatanus. Methodologie permettant l'obtention de vacuoles isolees et d'une fraction cytosolique purifiee. Identification, caracterisation et localisation dans la cellule, des systemes proteolytiques responsables de la degradation des proteines. Specificite des proteases vis-a-vis de differents substrats proteiques. Definition d'un modele d'etude permettant une approche in vivo du phenomene afin d'apprecier le niveau d'intervention de la vacuole dans les processus proteolytiques

A associação de tecnologias como transgenia, genômica e proteômica aos programas de melhoramento convencional de árvores, pode acelerar o processo de obtenção de exemplares com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. A parede celular vegetal é extremamente importante para este setor industrial, pois fornece polissacarídeos como celulose e hemiceluloses. A UDP-glucose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glucose, precursor relevante na interconversão de nucleotídeoaçúcares que constituem os monômeros desses polissacarídeos. O objetivo deste trabalho foi clonar os cDNAs que codificam a UGPase, extraídos do tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.) e da raiz de eucalipto (Eucalyptus grandis), e inseri-los por meio de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, respectivamente, no genoma de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto, para alterar o fluxo de carbono de modo a aumentar o conteúdo de pentosanas (xilose e arabinose). O maior teor de pentosanas é benéfico economicamente para a indústria de papel e celulose, pois diminui a energia consumida no refino da polpa além de benificiar a qualidade do papel que se torna mais resitente ao rasgo. O impacto da superexpressão do gene ugp nas plantas de tabaco e de eucalipto obtidas da transformação genética, foi avaliado por meio de análises bioquímicas e morfológicas. A análise de Southern blot indicou uma a quatro cópias do transgene no DNA genômico de dez linhagens T2 de tabaco, e uma cópia em uma linhagem T0 de eucalipto. A análise de qPCR mostrou que todas as linhagens T2 de tabaco apresentaram expressão do gene ugp exógeno, sendo que em quatro o nível de expressão foi maior que nas demais. As linhagens com menor expressão do gene ugp exógeno, com exceção de uma delas, também expressaram menos o gene ugp endógeno, sugerindo que nessas linhagens algum mecanismo de regulação atuou alterando a expressão desse gene, tanto endógeno, quanto exógeno. As linhagens transgênicas de tabaco foram morfologicamente semelhantes às plantas controle quando comparadas quanto à altura da planta, comprimento de internós, área foliar total, diâmetro do caule e massa seca da raiz. As alterações nos tabacos transgênicos, em relação aos controles, verificadas através das análises químicas, foram estatisticamente mais significativas na medula caulinar, onde houve aumento no conteúdo dos monossacarídeos e dos ácidos urônicos. As poucas diferenças encontradas no tecido xilemático sugerem que a planta, de alguma forma, tende a alterar menos a composição da parede celular secundária, do que da parede primária. Também sugerem que o metabolismo dos carboidratos pode afetar o conteúdo de lignina, embora seja sintetizada por outra rota metabólica. A parede celular primária, analizada utilizando a medula das plantas de tabaco e folhas de eucalipto, mostrou um aumento no conteúdo de pentosanas, o que não foi observado na análise de plântulas de tabaco.
Assossiating technologies like transgenesis, genomics and proteomics with conventional forestry breeding can accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. Plant cell wall is extremely important for this industry, providing polysaccharides like cellulose and hemicelluloses. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important forerunner for nucleotide sugars that constitute the monomers of these polysaccharides. The goal in this work was to clone the cDNAs that encode UGPase, extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber, and eucalypt (Eucalyptus grandis) root, and transfer through genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens, respectively, in tobacco (Nicotiana tabacum) plants and eucalypts, in order to change the carbon flux, increasing the pentosans (arabinose and xylose) content. Higher pentosans content is economicaly important for the paper and pulp industry, as decreases energy consumption at pulp refining and also can benefit paper quality that becomes more resistant to rip. The impact of the ugp gene overexpression over tobacco and eucalypt plants obtained through genetic transformation were morphological and biochemicaly evaluated. Southern blot analysis showed one to four copies of the transgene in the genomic DNA of ten tobacco T2 lines, and one copy in one eucalypt T0 line. The qPCR analysis showed that all tobacco T2 lines expressed exogenous ugp gene, being the expression level in four of them biger than the others. Lines that expressed less exogenous ugp gene, with exception of one of them, equally had less endogenous ugp gene expression level, suggesting that in these lines, some kind of regulation acted changing the gene expression. The transgenic tobacco lines were morphologicaly similar to the control plants when compared for total height, internode lenght, total leaf area, stem diameter and root dry mass. Alterations in transgenics tobacco plants, in relation to controls, checked by chemical analysis, were statisticaly more significants in the pith, where the monosaccharides and uronic acids contents increased. The few diferences founded in the xilematic tissue sugest that the plant, somehow, tends to change less the secondary cell wall composition than the primary wall. They also suggest that the carbohydrate metabolism can affect lignin content, thought it\'s sintetizaded in another metabolic pathway. The primary cell wall, evaluated using tobbaco plants pith and eucalypt leaves, showed an increase in pentosanas content, that wasn\'t observed analising tobacco seedlings.

On propose un modèle approché d'efflux qui se réduit au modèle classique quand le taux de croissance est nul. Les relations exactes de calcul des paramètres cellulaires dans le modèle classique sont également établies. On montre que l'utilisation habituelle de relations approchées est source d'erreurs numériques qui peuvent dans certains cas, être supérieures aux incertitudes expérimentales. Les flux unidirectionnels sont calculés dans le domaine de validité des relations linéaires flux-forces. Ces résultats permettent d'interpréter avec succès nombre de mesures expérimentales de l'influx initial en fonction de la concentration extérieure

No Brasil, o Eucalyptus grandis tem sido uma das espécies mais cultivadas dentro do gênero, devido ao seu potencial produtivo e às desejáveis características da madeira. Vários estudos têm avaliado o efeito da adubação na produtividade de florestas plantadas, mas poucos avaliaram os efeitos na qualidade da madeira, sobretudo as espécies latifoliadas. Recentemente, o lodo de esgoto tem sido usado como adubo em plantios florestais. No presente estudo, avaliou-se o efeito da aplicação de lodo de esgoto tratado (biossólido) (0 a 40 t ha-1 base seca) e de adubo mineral nos atributos físicos, químicos, anatômicos e de polpação da madeira de Eucalyptus grandis Hill Ex Maiden (Coff’s Harbour) com cinco anos de idade. A área experimental localizase no município de Itatinga, São Paulo. O tipo de solo ocorrente na área foi caracterizado como Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico psamítico (argila = 120 g kg-1 na camada 0-20 cm). O clima foi caracterizado como mesotérmico úmido (Cwa), segundo a classificação de Köeppen. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso com 4 repetições. As parcelas experimentais tinham 100 plantas, plantadas no espaçamento de 3,0 m x 2,0 m. Nas avaliações dendrométricas, considerou-se as parcelas com bordadura dupla. Foi medido o diâmetro à altura do peito (DAP), a altura e o volume sólido das árvores. Para as avaliações relativas à qualidade da madeira, amostraram-se 8 árvores com DAP dentro da classe de maior freqüência de cada tratamento. De cada árvore foram retirados 5 discos com 4 cm de espessura a 0%, 25%, 50%, 75% e 100% da altura comercial, definida como aquela correspondente ao diâmetro de 6,0 cm com casca. De cada disco descascado foram retiradas quatro cunhas de 90º. A primeira cunha foi utilizada para a determinação da massa específica básica, a segunda e a terceira dera origem a amostras compostas por árvore para as análises de polpação e produção de serragem, respectivamente; e a quarta cunha foi mantida como reserva. As caracterizações físicas, químicas, anatômicas e a polpação da madeira foram realizadas de acordo com as normas da ABTCP, TAPPI e ABNT. Os resultados mostraram que o lodo de esgoto diminuiu a densidade básica da madeira, o que se constatou está relacionado à diminuição da espessura da parede das fibras. O teor de celulose não foi modificado. O decréscimo de densidade da madeira, promovido pela adubação com lodo de esgoto, foi compensado pelo aumento de produtividade de madeira. O rendimento bruto gravimétrico da polpação aumentou e o número kappa diminuiu com a aplicação de lodo de esgoto. O poder calorífico da madeira não foi alterado. O lodo de esgoto diminuiu o teor de elementos de transição (Mn, Fe, Cu e Zn) na madeira, o que pode ser um efeito benéfico, pois implica em menor consumo de reagentes durante o branqueamento da polpa.
Eucalyptus grandis is the most planted species in Brazil due to its wood productivity and quality. Several studies have evaluated the effect of fertilization on productivity of forest plantations, but few evaluated this silvicultural practice on wood quality, especially to hardwood species. Recently, the sewage sludge has been used as fertilizer in forest plantations. In this paper, the effect of growing rates of treated sewage sludge (biosolid) (0 to 40 Mg ha-1 dry base) and one rate of mineral fertilizer on anatomical, chemical, physical attributes and pulping of Eucalyptus grandis wood were evaluated. The trees were with five years old. The experimental area locates at Itatinga county, state of São Paulo, Brazil. The soil in the area was characterized as a Red- Yellow Latosol Dystrophic (clay = 120 g kg-1 at 0-20 cm layer). The climate was characterized as a humid mesothermic (Cwa), according to the classification of Köeppen. The plots were established in a randomized complete block design, with 6 treatments and 4 replicates. Each plot consisted of 100 trees (10 x 10), planted at a spacing of 3.0 m x 2.0 m. Tree growth was measured In all plots as: height, diameter at breast height (DBH) and volume of wood. Samples of 8 trees belonging to more often DBH were collected. Of each tree were removed 5 disks (4 cm thick) at 0, 25, 50, 75 and 100% of the commercial height. From each disk barked were removed four wedges of 90º. The first wedge was used for the determination of the basic density, the second and third gave origin to composed samples for tree used for pulping analyses and sawdust production, respectively; and the fourth wedge was maintained as reservation. The physical, chemical and anatomical characterization and the wood pulping were made in agreement with the norms of the Brazilian Pulp and Paper Technical Association, Brazilian Technical Norms Association and Technical Association of the Pulp and Paper Industry. The sewage sludge reduced the basic density of wood, which was related to the decrease of the wall thickness of the fibers. The cellulose content was not modified. The decrease of wood density promoted by sewage sludge application was compensated by increase of wood growth. The rough yield gravimetric of the pulping increased and the kappa number reduced with the sewage sludge application. The calorific power of the wood was not altered. The sewage sludge reduced the transition elements content (Mn, Fe, Cu and Zn) in the wood, what maybe a beneficial effect because imply in minor consume of reagents during the pulp bleaching.

Des limitations nutritionnelles, provoquees par une diminution des concentrations en acide 2,4 dichlorophenoxyacetique et en ions phosphates, entrainent un ralentissement de croissance suffisant pour maintenir la stabilite du ploymere d'inclusion de cellules de catharanthus roseus. Simultanement, une stimulation de la synthese d'ajmalicine est observee. Dans ces conditions, l'immobilisation des cellules dans l'alginate stabilise leur activite metabolique sur une periode d'au moins 600 heures. La production specifique d'ajmalicine atteint alors 970mug/sec et est multipliee d'un facteur 50 par rapport a celle observee lors d'une culture sur milieu d'entretien. En reacteur continu, l'utilisation de cellules immobilisees a ete possible sur une duree de 2 mois. Le mecanisme d'excretion repond a une loi de diffusion simple. La productivite obtenue est faible mais elle peut etre amelioree par un abaissement de ph du milieu de culture qui entraine une modification de l'equilibre de diffusion. Des traitements de permeabilisation membranaire (mannitol, dimethylsufoxyde) n'augmentent la productivite du systeme que si la resultante entre leurs effets sur la repartition des metabolites entre les cellules et le milieu et sur les taux de biosynthese est positive

Durant le cycle cellulaire des cellules vegetales, les organites comme les mitochondries et les plastes, doivent se diviser pour etre transmis aux cellules filles. Du fait de la complexite des organismes multicellulaires, nous n'avons que tres peu d'informations en ce qui concerne le controle de la division de ces organelles. La proteine bacterienne ftsz, l'ancetre de la tubuline, a ete impliquee a la fois dans la division des proplastes dans les cellules en division, et dans la division des chloroplastes dans les cellules differenciees. Nous avons utilise les cellules hautement synchronisables de tabac (by2), afin d'analyser l'expression des genes ftsz dans des cultures non-synchronisees et synchronisees. Dans ce but, nous avons tout d'abord caracterise 5 adnc codant pour cette proteine dans le tabac. Ensuite grace a une sonde specifique de la famille ftsz1 codant les proteines adressees dans les plastes, ainsi que d'un anticorps ne detectant que cette proteine, nous montrons une expression constitutive des genes de cette famille dans les cellules non-synchronisees, quelle que soit la phase de culture consideree. Cette expression est en accord avec la division plastidiale a la fois dans les cellules en expansion et dans les cellules en division. Par contre, le profil d'expression dans les cellules synchronisees, avec une faible expression durant la phase s et une augmentation durant la phase g2, culminant avec les cellules en mitose, suggere que la division plastidiale est couplee au cycle cellulaire par la regulation du gene ftsz.

L'objectif de ce travail est de mettre en exergue les avantages et les inconvénients d'introduire des microfibres végétales, issues du recyclage du carton, dans les bétons autoplaçants BAP, et plus précisément leur influence sur la durabilité aux cycles gel-dégel. Une méthodologie expérimentale a été mise en place pour la formulation des BAP fibrés devant répondre aux exigences suivantes : classe d'exposition XF2, classe de consistance de type Dmoy=68±2 cm. Elle repose sur la théorie de la compacité maximale pour le dosage des particules solides et sur la méthode du mortier de béton équivalent, MBE, pour le dosage en adjuvants. En partant de la composition du BAP de référence, les microfibres végétales ont été introduites à six pourcentages volumiques distincts par rapport au volume du ciment. Une campagne d'essais expérimentaux réalisée sur les MBE fibrés, a montré que l'introduction des microfibres à un dosage compris entre 21% et 41% améliore leurs propriétés physiques et mécaniques. A l'échelle des BAP, les résultats expérimentaux ont montré que les BAP fibrés aux dosages précédents, BAPF 21% et BAPF 41%, possèdent une porosité et une perméabilité plus faibles que le BAP de référence et par conséquent des caractéristiques mécaniques plus élevées. La résistance au gel-dégel des bétons autoplaçants, BAP de référence, BAPF 21% et BAP formulé avec un entraîneur d'air ainsi que de deux bétons vibrés le premier de référence et second contenant 15% en volume du ciment des microfibres, a été étudiée en soumettant ces bétons à des cycles gel-dégel selon la norme NF P18-425. Les résultats obtenus montrent que les bétons additionnés des microfibres végétales sont plus sensibles aux cycles gel-dégel. L'effet nocif des microfibres s'explique par leur nature hydrophile associée à une faible perméabilité des bétons additionnés. De plus, le rôle des granulats sur la sensibilité à l'action du froid a été discuté. Il a été conclu que les granulats silico-calcaires poreux et fragiles sont à éviter dans les bétons destinés aux environnements gélifs
The aim of this work is to emphasize the advantages and disadvantages of introducing vegetable based microfibers, resulting from cardboard recycling, in self compacting concrete SCC, and especially their influence on the frost durability. An experimental methodology has been developed for SCC formulation based on following requirements: class of environmental exposure XF2, slump flow Dmoy = 68 ± 2 cm. It is based also on the maximum packing theory for the determination of solid particles content and the method of concrete equivalent mortar, CEM, for superplasticizer dosage. Starting from the SCC of reference composition, vegetable based microfibers were introduced at six different volumetric percentages related to cement volume. A campaign of experimental tests performed on fibred CEM showed that the introduction of microfibers at a volumetric dosage between 21% and 41% improved physical and mechanical properties. On the SCC scale, the experimental results have shown that fibred SCC at previous dosages, FSCC 21% and FSCC 41%, have porosity and permeability lower than the SCC of reference and consequently higher mechanical properties. Frost resistance of , SCC of reference, FSCC 21% and a SCC formulated with an air-entraining as well as two vibrated concretes, the first of reference and second containing 15% microfibers by volume of cement, was studied by subjecting them to freeze-thaw cycles according to NF P18-425. The results show that microfibers added concretes are more susceptible to frost damage. The harmful effect of vegetable based microfibers is explained by their hydrophilic nature associated to a low permeability of fibred concrete. Furthermore, the role of aggregates on the frost sensitivity was discussed. It was concluded that the porous and fragile lime aggregates should be avoided in concrete intended for cold climate

Sous l'effet de glycopeptides extraits de parois du mycelium de (phytophtora parantica nicotianae) et appeles eliciteurs, les cellules de tabac en culture synthetisent de grandes quantites d'ethylene. L'etude de l'hormone aux differentes etapes de sa voie de biosynthese montre une stimulation rapide et transitoire de l'activite acc-synthase, vraisemblablement par synthese de novo de l'enzyme, entrainant l'augmentation du taux intracellulaire d'acc sans pour autant modifier celui du n-malonyl-acc. (. . . )

L'hévéa est un arbre qui revêt un fort intérêt à l'échelle mondiale. Il représente la seule source de caoutchouc naturel commercialement exploitée. La demande grandissante de cette matière première a conduit à l'initiation de nombreuses recherches visant à augmenter la production de latex. La biosynthèse du caoutchouc à partir du saccharose se déroule dans le cytoplasme (latex) des cellules laticifères, hétérotrophes et dépourvues de plasmodesmes, les cellules laticifères disposeraient d'un équipement membranaire de transporteurs actifs spécifiques, afin de répondre à leurs besoins importants en photoassimilats.Toutefois, le rôle de ces transporteurs dans la physiologie des cellules laticifères n'a jamais été élucidé. Ce travail propose la première étude moléculaire des co-transporteurs H+ / sucres solubles et H+ / polyol (quebrachitol) au sein des cellules laticifères, en relation aves la production de latex. Ce travail a permis l'identification des premiers co-transpoteurs de saccharose d'hexoses et de polyols chez l'hévéa. Dix gènes de trasporteurs ont été clonés dans les cellules laticifères : 7 transporteurs putatifs de saccharose (HbSUT1A, HbSUT B, HbSUT2A, HbSUT2B, HbSUT2C, HbSUT4, HbSUT5), 1 transporteur putatif d'hexoses (HbHXT1) et 2 transporteurs putatifs de polyols (HbPLT1, HbPLT2). Ensuite les caractérisations physiologiques et moléculaires fines de ces transporteurs ont permis la mise en evidence du rôle potentiel et complémentaire de HbSUT1B, HbHXT1et HbPLT2 dans la production de latex, HbSUT1B et HbHXT1 seraient impliqués dans la régulation de la régénération du latex, alors que HbPLT2 interviendrait dans le contrôle de l'écoulement. Ces trois gènes sont proposés en tant que marqueurs moléculaires potentiels de production.

As pesquisas com os peptídeos hormonais de plantas se iniciaram na década de noventa com a descoberta da sistemina. Hoje existem diversos peptídeos identificados, e alguns deles já em avançado estágio de caracterização. O envolvimento desta classe de moléculas em diversas funções básicas e específicas da biologia dos vegetais despertou o interesse da comunidade científica. Dentre os peptídeos em fase de caracterização, destacam-se os representantes da família RALF. Os peptídeos RALF estão presentes em basicamente todo o reino vegetal, desde o musgo Physcomitrela pattens até as plantas superiores mono e dicotiledôneas. A conservação destes peptídeos no reino vegetal sugere um importante papel na fisiologia vegetal, e evidências recentes indicam a participação de RALF em processos básicos do desenvolvimento das plantas. O mecanismo pelo qual o peptídeo RALF atua e é percebido pela célula constitui etapa fundamental para sua caracterização funcional. Para tanto, no presente trabalho foram empregadas técnicas para identificação de proteínas de interação com RALF. Os resultados indicam que este peptídeo possivelmente tem sua atividade regulada pelo íon cálcio, através da interação com uma proteína de ligação a cálcio que, assim como o RALF, é secretada para o apoplasto. Estes dados colocam RALF em um cenário até o momento inédito no mecanismo de ação hormonal em plantas. A exemplo de animais e leveduras, observou-se também que o processamento de RALF ocorre em um sítio dibásico. A mutação de um dos aminoácidos deste sítio foi suficiente para impedir processamento do peptídeo in vivo e in vitro. A utilização de extratos protéicos da fração microsomal de Arabidopsis no ensaio in vitro indica que esta atividade é desempenhada por uma protease presente no sistema de endomembranas celular, provavelmente da classe das convertases. Os resultados publicados marcam o início dos estudos de caracterização do processamento de prohormônios em plantas.
The peptide hormone research has begun during the 90s decade with the systemin discovery. Nowadays several peptides have already been identified, and some of them are further characterized. The involvement of these molecules with a range of basic and specific biological functions has raised the scientific communitys interest. Among the peptides being studied, the RALF family is particularly intriguing. The RALF peptides can be found throughout the plant kingdom, from the moss Physcomitrella patens to the mono and dicot plant groups. The conserved occurrence of these peptides along the plant kingdom suggests an important role in the plant physiology field. Recent evidences indicate that RALF plays a role in basic mechanisms of plant development. The RALF mechanism of action and its perception by the cell are fundamental information in order to characterize this peptide function. In the present work experiments to identify RALF interacting proteins were employed. The results indicate that RALF peptides activity is possibly regulated by the calcium ion. This regulation is mediated by the interaction with a calcium binding protein. This calcium binding protein was found to be secreted to the apoplast. Presented data suggests that RALF is regulated by a mechanism never described before in the plant hormone research field. As previously described in animals and yeast the RALF propeptide processing takes place in a dibasic site. A single amino acid site specific mutation disrupted peptide processing in vivo and in vitro. The correct processing is mediated by proteases of the Arabidopsis microsomal fraction. This processing seems to occur at the endomembrane system, possibly catalized by a convertase class enzyme. The published results points the beginning of the peptide processing studies in plants.

Pour obtenir des plantes resistantes aux inhibiteurs de l'hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (hppd), nous avons souhaite construire une voie metabolique contournant l'hppd en introduisant les genes codant l'hydroxyphenylpyruvate oxydase (hppo) et la 4-hydroxyphenylacetate 1-hydroxylase. Nous decrivons ici l'identification de trois genes bacteriens codant ces deux activites enzymatiques. - le gene hppo, identifie chez arthrobacter globiformis, code l'hppo (e. C. 1. 2. 3. -) qui catalyse l'oxydation du 4-hydroxyphenylpyruvate en 4-hydroxyphenylacetate (4-hpa). C'est la premiere fois que la proteine est purifiee et le gene identifie. - les gene hpah et hpac, identifies chez p. Acidovorans, codent respectivement les proteines hpah et hpac. La combinaison de ces deux proteines produit l'activite enzymatique 4-hydroxyphenylacetate 1-hydroxylase (e. C. 1. 14. 13. 18). L'hpah convertirait le 4-hpa en un metabolite non encore identifie. Ce metabolite serait ensuite convertit en homogentisate par l'hpac. Enfin, nous avons acquis des informations sur le metabolisme de la tyrosine par des cellules vegetales en utilisant la rmn du carbone-13. Nous avons mis en evidence un transporteur de tyrosine localise sur le plasmalemme des cellules d'acer en culture. C'est la premiere fois qu'un transporteur a haute affinite (15 m ; ph 6,2) presentant un ph optimum alcalin (ph 7,0 a 7,8) est caracterise. Nous avons aussi demontre que la tyrosine s'accumule dans la vacuole, apres une phase de latence. Le metabolisme de la tyrosine est etudie dans les cellules d'acer et d'arabidopsis. Le 4-hpa semble identifie comme provenant de la tyrosine seulement dans les cellules d'arabidopsis. Au vue des resultats obtenus, l'analyse par 1 3c-rmn devrait pouvoir etre utilisee pour evaluer les plantes transgeniques obtenues apres introduction des trois genes.

L'intérêt des substances d'origine naturelle, potentiellement anti-tumorales nous a amené à nous intéresser aux saponines triterpéniques et stéroïdiques de plantes issues de la biodiversité africaine de la famille des Araliaceae et des Dracaenaceae. En effet, des études antérieures menées sur quelques plantes de ces deux familles ont conduit à l'obtention de molécules complexes et originales possédant d'excellentes propriétés cytotoxiques, immuno-modulatrices, anti-inflammatoires. Au vu de ces résultats nous avons entrepris des investigations pharmaco-chimiques sur Cussonia arborea (Araliaceae), Dracaena deisteliana et Dracaena arborea (Dracaenaceae), plantes médicinales couramment utilisées en pharmacopée traditionnelle africaine pour traiter différentes maladies. Les travaux menés ont conduit à l'isolement de 31 composés purs en utilisant les différentes techniques analytiques du laboratoire notamment les diverses techniques de chromatographie liquide successive à pression atmosphérique, moyenne pression et flash chromatographie sur silice en phase normale et en phase inverse. Les structures ont été déterminées par les méthodes de spectrométrie de masse en source FAB et de spectroscopie de RMN 1D et 2D (COSY, TOCSY, NOESY, HMBC et HSQC). Parmi les 07 composés purs obtenus des écorces de Cussonia arborea, 5 sont des nouvelles saponines triterpéniques dont un dérivé de l'acide ursolique, un dérivé de l'hédéragénine et trois dérivés de l'acide oléanolique, tous disubstitués en position 3 et 28 par des chaînes oligosaccharidiques. 13 composés purs sont obtenus à partir des feuilles de Cussonia arborea, dont 7 nouvelles saponines triterpéniques dérivés de l'acide ursolique, de l'acide 23-hydroxyursolique, de l'hédéragénine et de l'acide oléanolique dont 04 d'entre elles sont obtenues sous forme de mélanges inséparables d'isomères acide oléanolique/acide ursolique et hédéragénine/acide 23-hydroxyursolique. A partir des écorces de Dracaena arborea et des tiges de Dracaena deisteliana, nous avons isolé et caractérisé 10 saponines stéroïdiques dont 4 nouvelles et une sapogénine. Les activités de certains de ces produits purs ont été évaluées sur deux lignées de cellules cancéreuses coliques humaines HCT 116 et HT-29.

Este trabalho objetivou relacionar a produtividade agroindustrial da cana-de-açúcar com o aproveitamento do nitrogênio (N) das adubações sucessivas em cana-planta e soqueiras, em sistema de cultivo mínimo sem o revolvimento do solo ou escarificações das entrelinhas na reforma do canavial ou após os cortes, respectivamente - e quantificar a contribuição da palhada proveniente da colheita mecanizada na nutrição da cultura. O experimento foi instalado em março de 2005, em um Latossolo Vermelho Eutrófico muito argiloso da Fazenda Santa Terezinha, Jaboticabal, SP e foi conduzido durante quatro ciclos agrícolas consecutivos até julho de 2009. O delineamento experimental na cana-planta foi blocos casualizados, com quatro tratamentos (doses de N-uréia 0, 40, 80 e 120 kg ha-1 no sulco de plantio, juntamente com 120 kg ha-1 de P2O5 e K2O) e quatro repetições (parcelas de 48 sulcos x 15 m). Nos ciclos de 1ª a 3ª soqueiras, as parcelas de cana-planta foram subdivididas em outros quatro tratamentos (0, 50, 100 e 150 kg ha-1 de N) e quatro repetições (subparcelas de 12 linhas x 15 m). Na 3ª soqueira a adubação com N foi de 100 kg ha-1 em todas as parcelas, visando detectar efeitos residuais das fertilizações anteriores na produtividade da cana no 4º ciclo. Em todas as parcelas dos ciclos de soqueiras também aplicou-se 150 kg ha-1 de K2O como KCl. Na dose 80 kg ha-1 de N em cana-planta, foram instaladas microparcelas contendo uréia e/ou material vegetal marcado com 15N, simulando os resíduos anteriores à reforma (palhada, PAR ou rizomas, RAR da variedade RB855536) remanescentes no solo após o cultivo mínimo. O objetivo foi avaliar a contribuição do fertilizante-15N e dos resíduos vegetais-15N na nutrição nitrogenada da cultura em ciclos consecutivos. Após o corte da cana-planta, novas microparcelas contendo palhada pós colheita (PPC-15N, variedade SP81-3250) foram dispostas nos tratamentos 800 e 80150 kg ha-1 de N em cana-planta e soqueiras, respectivamente, para avaliar a contribuição do N-PPC na nutrição da cultura e a influência do N aplicado em soqueiras na disponibilização do N-PPC. Um estudo complementar foi desenvolvido em sacos telados contendo PAR-15N em cana-planta (dose 80 kg ha-1 de N) e PPC- 15N em soqueiras (doses 80-0 e 80-150 kg ha-1 de N), visando quantificar a decomposição dos resíduos durante os ciclos agrícolas e possíveis diferenças na intensidade da decomposição devido às aplicações de N em cana-planta e em soqueiras respectivamente. Nos quatro ciclos consecutivos avaliou-se a: i) produtividade agroindustrial (TCH, Mg de cana ha-1 de colmos e TPH, Mg ha-1 de pol) e características tecnológicas da matéria-prima (pol % cana e fibra %) em função dos tratamentos de N em cana-planta e soqueiras; ii) recuperação do 15Nuréia, 15N-PAR, 15N-RAR e 15N-PPC pela parte aérea da cultura (colmos, folhas secas e ponteiro) e o balanço de carbono (C) e N no sistema solo-planta e iii) decomposição da PAR e PPC pela redução da matéria seca (MS), do C, 10 macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg e S) e carboidratos estruturais (lignina, celulose e hemicelulose). A TCH e TPH foram influenciadas pelas doses de N no plantio e nas soqueiras subseqüentes. Houve resposta linear na produtividade agroindustrial da cana-planta às doses de N do plantio e na média dos quatro ciclos agrícolas. Porém, não houve interação entre as doses de N em cana-planta e soqueiras. O tratamento 120100 kg ha-1 de N em cana-planta e soqueiras proporcionou a maior TCH acumulada nos quatro ciclos consecutivos, porém o tratamento 12050 kg ha-1 de N foi o mais viável economicamente. A recuperação do N-uréia de plantio foi mais alta no primeiro ciclo (24, 7 kg ha-1 ou 31% da dose aplicada) decrescendo ao longo ciclos agrícolas subsequentes (5%; 4% e 3%, respectivamente). O balanço de N após os quatro ciclos (2006 a 2009) indicou 43% (34,4 kg ha-1) de recuperação do Nuréia pela parte aérea da cultura, 0,2% permaneceu nos rizomas, 20% no solo e 37% foram contabilizados como perdas. Para os resíduos vegetais PAR e RAR as recuperações na parte aérea foram de 28% e 23% da quantidade inicial (14,2 e 7,4 kg ha-1, respectivamente). Em média, 0,2% do N-resíduos vegetais permaneceu nos rizomas, 52% no solo e 22% foram perdas. A soma da recuperação do N-PAR e NRAR de foi de 24,4 kg, ou seja, 39% da contribuição total de N destes resíduos, indicando serem fontes de N a longo prazo para a cana-de-açúcar. Houve correlação entre a recuperação acumulada do N-uréia e N-resíduos vegetais com a evapotranspiração acumulada dos quatro ciclos agrícolas. A recuperação do N-PPC pela parte aérea da cultura praticamente dobrou após três ciclos, devido à aplicação de N em soqueiras, 17% vs. 31% (6,9 e 12,6 kg ha-1 de N, respectivamente). O restante do N-PPC permaneceu nos rizomas (0,3% e 0,4%), no solo (69% e 61%) ou resultaram em perdas (13,4% e 7,6%). Não houve alterações nos estoques de C e N do solo com a adição de N-uréia ou N-resíduos vegetais. A decomposição da PAR e PPC foi influenciada pelas aplicações de N em cana-planta e soqueiras e pela ação biológica ao longo dos ciclos agrícolas avaliados. Essa degradação ocorreu devido à redução da relação C:N, do crescimento de raízes sob a palhada, perdas de MS, C, N, macronutrientes e carboidratos estruturais da palhada ao longo dos ciclos agrícolas. Para a PAR e PPC, a degradação da MS foi de 96% e 73% após quatro e três anos, respectivamente. Os macronutrientes que apresentaram maiores liberações foram o K 98% e 92%; Mg 97% e 70% e o Ca 95% e 55%, da quantidade inicial dos nutrientes (kg ha-1) aplicadas via PAR e PPC, respectivamente. Após quatro ciclos agrícolas os teores (g kg-1) de lignina, celulose e hemicelulose da PAR decresceram 60%, 29% e 70%. Para a PPC a redução foi de 47%, 35% e 70% em três ciclos. A degradação dos carboidratos estruturais foi influenciada pelas condições climáticas ocorridas durante os ciclos agrícolas e pela composição bioquímica inicial dos resíduos (carboidratos e nutrientes totais). Não houve diferença na degradação da MS da PPC devido à aplicação de N em soqueiras, porém houve diferença na degradação do C, na liberação de Ca, na concentração de raízes e na decomposição da lignina quando se realizou a adubação com N sobre a palhada em soqueiras
This work aimed to relate the agroindustrial yield of sugarcane with nitrogen (N) fertilization in successive cropping cycles in plant-cane and ratoons under minimum tillage system - without soil plowing or interows scarification in crop renewal and after the harvesting seasons, respectively - and to quantify the contribution of straw from mechanical harvesting on crop N nutrition. The field trial was planted in March 2005 in a very clayey Rhodic Eutrustox at Santa Terezinha Farm, Jaboticabal, Sao Paulo State and was conducted during four consecutive cropping cycles until July 2009. The plant-cane trial was designed as randomized blocks with four treatments (N-urea in increasing rates 0, 40, 80 and 120 kg ha-1 at planting added to 120 kg ha-1 P2O5 and K2O) and four replicates (48 furrows of 15 m length). For the ratoon-cane trial, (1st to 3rd ratoons) the plant-cane plots were subdivided into other four treatments (0, 50, 100 and 150 kg ha-1 N) and four replicates (12 rows x 15 m). The N fertilization of the 3rd ratoon was leveled to 100 kg ha-1 in all plots in order to detect residual effects of previous N fertilizations on sugarcane yield in this cycle. All ratoon cycles also received 150 kg ha-1 K2O as KCl. It has been installed microplots containing 15N-urea and/or 15N-labeled plant material at the 80 kg ha-1 N dose in plant-cane, simulating the crop residues prior to renewal (trash PAR or rhizomes, RAR of RB855536 variety) and which remained in soil after minimum tillage. The objective was to assess the contribution of N-fertilizer and N-residues in sugarcane N nutrition in consecutive cycles. After the plant-cane harvesting, new microplots containing post harvest trash (PPC-15N, variety SP81-3250) were placed in treatments 80-0 and 80- 150 kg N ha-1 in plant-cane and ratoons, respectively, aiming to assess the contribution of N-PPC in crop nutrition and the influence of N applied to ratoons in the N-PPC availability for sugarcane uptake. An additional study was conducted in litter bags containing PAR-15N in plant-cane (dose 80 kg ha-1 N) and PPC-15N in ratoons (doses 80-0 and 80-150 kg N ha-1) in order quantify the decomposition of trash during the crop cycles and possible differences in the decomposition rates due to N applications in plant-cane (PAR) and ratoons (PPC), respectively. In the four consecutive cycles were evaluated: i) Agroindustrial yields (TCH, Mg cane ha-1 stalks and TPH, Mg ha-1 of sugar) and raw material quality (pol% cane and fiber%) in plantcane and ratoon treatments; ii) Recovery of urea-15N, PAR-15N, 15N- RAR and 15NPPC by crop above ground parts (stalks, dry leaves and tips) and carbon (C) and N balances in the soil-plant system and iii) decomposition of PAR and PPC as reduction of dry matter (DM), C, nutrients (N, P, K, Ca, Mg and S) and structural carbohydrates (lignin cellulose and hemicellulose). The agroindustrial yields (TCH and TPH) were influenced by N rates at planting and subsequent ratoons. It hás been found linear response in crop yield due to N rates at planting and in the average of four crop cycles. However, no responses were detected in the interaction between 12 N doses in plant or ratoon cane. The highest accumulated yield (TCH) in four consecutive cycles was obtained in treatment 120-100 kg ha-1 N in plant-cane and ratoons, but treatment 120-50 kg ha-1 N has been found as the more economically viable. The recovery of N-urea applied in plant-cane was higher in the first cycle (24, 7 kg ha-1 or 31% of the applied dose) and decreased over subsequent crop cycles (5%, 4% and 3% respectively). The N balance after four cycles (2006-2009) showed 43% (34.4 kg ha-1) of total N-urea recovery by the crop above ground parts, 0.2% was found in the rhizomes, 20% in soil and 37% were counted as losses. Cane trash N-PAR and N-RAR recoveries in the above ground parts were 28% and 23% of the initial amount of N applied as crop residues (14.2 and 7.4 kg ha-1, respectively). On average, 0.2% of N-plant residues remained in the rhizomes, 52% in the soil and 22% were accounted as losses. The total recovery of N-PAR N-and RAR was 24.4 kg, or 39% of the total N of these residues, indicating that they are long term N sources for the sugarcane crop. There had been found a close correlation between the cumulative recovery of N-urea and N-residues with the accumulated evapotranspiration of the four crop cycles. The N-PPC recovery by sugarcane above ground parts almost doubled after three cycles due to N application in ratoons, 17% vs. 31% (6.9 and 12.6 kg ha-1 N, respectively). In other compartments, 0.3% and 0.4% of N-PPC remained in the rhizomes, 69% and 61%) in the soil and 13.4% and 7.6%) resulted in losses. There was detected no major changes in soil C and N stocks C due to the addition of N-urea and N-residues. The decomposition of PAR and PPC was influenced by N fertilizations in plant-cane and ratoons cane and by biological action over the cropping cycles. The major effects detected as trash decomposed over the agricultural cycles were the reduction in residues C:N ratio, sugarcane root growth under the trash blanket, and losses of DM, C, N, macronutrients and structural carbohydrates. The DM degradation of PAR and PPC was 96% and 73% after four and three years respectively. The nutrients that showed higher release rates were K 98% to 92%, Mg 97% to 70% Ca and 95% to 55% of the initial amount of nutrients (kg ha-1) sourced by PAR and PPC residues, respectively. After four agricultural cycles, the levels (g kg-1) of lignin, cellulose and hemicellulose from PAR decreased 60%, 29% and 70%, and for PPC the reduction was 47%, 35% and 70% in three cycles. The degradation of structural carbohydrates was influenced by climatic conditions that occurred during the agricultural cycles and the initial biochemical composition those residues (total carbohydrates and nutrients content). There was no difference in DM degradation of PPC due to N application in ratoons, however there were differences in C degradation, in the release of Ca, concentration of roots and in the decomposition of lignin when N- fertilizer has been applied over the trash blanket

El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A).
Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS.
Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor.
S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat.
Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat.
El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A).
Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS.
Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor.
Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado.
Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato.
The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A).
A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS.
It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end.
A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme.
Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis.

Des recherches sur la micropropagation in vitro du muguet ont été envisagées pour répondre à 2 prothèses majeurs rencontrées dans les cultures traditionnelles : la faiblesse des taux de multiplication (2 à 3 par an) et la dégradation de l'état sanitaire des cultures avec leur âge. Différents types de tissus ont été introduits in vitro : boutons floraux, rachis de l'inflorescence et fragments de rhizomes. Les néoformations observées à partir des boutons floraux sont de type bouton floral en présence d'ana (1 à 4 mg/l) et d'une cytokinine à noyau purine (bap, kin, 2ip, z) ou à noyau urée (thidiazuron). La section longitudinale des boutons floraux a considérablement augmenté leur réactivité. Une phase de prolifération, qu'il est possible d'entretenir pendant une longue période, a été obtenue en présence de tdz (2 mg/l) et d'ana (1 mg/l). Des bourgeons végétatifs ont été régénérés sur des explants en phase de prolifération après transfert sur un milieu contenant de la bap (4 mg/l), en présence d'ana. Seulement 25% des explants ont régénéré des bourgeons végétatifs qui sont obtenus soit dormants soit en début de croissance aérienne. L'enracinement des bourgeons en début de croissance aérienne est réalisé après développement complet des feuilles sur un milieu dépourvu de régulateurs de croissance (pourcentage d'enracinement de l'ordre de 95%). Un traitement de 8 semaines a +4c permet la levée de dormance pour 98 à 100% des bourgeons. Apres enracinement le vitroplant va terminer son cycle végétatif in vitro. Lorsque la senescence des feuilles est complète, on obtient une vitrogriffe qui peut être plantée directement à l'extérieur. Par ailleurs, une approche de la conformité du matériel issu de culture in vitro a été effectuée par la détermination du nombre de chromosomes et par électrophorèse de protéines. Ce type d'étude a également permis la caractérisation de plusieurs variétés appartenant à l'espèce convallaria majalis L.

Au cours de ce travail de these nous avons caracterise un adnc correspondant a la proteine t (1560 pb) du complexe de la glycine decarboxylase. Il possede un cadre de lecture ouvert de 1220 pb codant pour un peptide mature de 378 acides amines. La sequence primaire ainsi que la masse deduite (40 961 da) ont ete confirme respectivement par microsequencage et par mesure au spectrometre de masse. Dans la perspective d'une etude structurale, nous avons reussi a surexprimer chez e. Coli la proteine t en construisant un vecteur d'expression produisant un arnt rare chez les bacteries. L'etude de l'expression de la proteine t ainsi que de ses transcrits a montre qu'ils sont principalement presents dans les tissus folaires et semblent subir une forte induction a la lumiere. De plus, nous avons demontre que les transcrits correspondant aux proteines de la gdc (p, h et t) sont exprimes des le 4#i#e#m#e jours de developpement de la plante avec un pic au 7#i#e#m#e jour. . A ce stade, la faible representation des proteines de la gdc (p, h et t), suggere l'existence d'un controle post-transcriptionnel de l'expression de leurs genes. Nous avons egalement isole et sequence le gene codant pour la proteine t. Ce gene, compose de quatre exons, possede deux sites d'initiations dont l'un presente une sequence riche en pyrimidine proche de la sequence inr (initiator element). Enfin, l'analyse de la region promotrice a permis de caracteriser trois regions consensus qui semblent etre impliquees dans la regulation a la lumiere et dans la specificite tissulaire

Les protéines LIM constituent une famille de molécules régulatrices possédant dans leur séquence protéique un ou plusieurs motifs en doigts de zinc – les domaines LIM – dont la fonction principale est de diriger les interactions protéine-protéine. Les protéines LIM ont ainsi la capacité d'interagir avec de multiples partenaires protéiques, et participent à l'assemblage et au maintien de certains des complexes macromoléculaires présents au sein de la cellule. La plupart des protéines LIM ont été caractérisées dans les cellules animales, où elles sont impliquées dans l'organisation du cytosquelette d'actine, ainsi que dans la régulation de la transcription. A ce jour, seules quelques protéines LIM ont été décrites chez les végétaux. La fonction de ces protéines LIM végétales reste encore à identifier. Afin de préciser le rôle des protéines LIM chez le tournesol, nous avons choisi comme modèle expérimental le protoplaste d'hypocotyle de tournesol, en raison de la possibilité de moduler son développement en fonction des conditions de culture.
Nous avons étudié l'expression des gènes LIM précédemment décrits chez le tournesol dans les protoplastes par RT-PCR. Nous avons détecté un transcrit pour le gène HaWLIM-1, mais pas pour les deux autres gènes HaPLIM-1 et HaPLIM-2. Des anticorps polyclonaux spécifiques de la protéine HaWLIM-1 reconnaissent en immunoblot deux polypeptides distincts, dont les masses moléculaires sont respectivement de 52 kDa et 78 kDa. Ces masses moléculaires sont nettement supérieures à la taille attendue pour la protéine HaWLIM-1. Ces résultats indiquent que la protéine n'est pas présente sous forme de monomères dans les protoplastes, mais qu'elle participe à la formation de complexes protéiques stables.
L'étude par immunocytologie de la localisation intracellulaire de la protéine HaWLIM-1 révèle que cette protéine est présente simultanément dans deux compartiments distincts : le noyau et le cytoplasme. Dans le noyau, elle s'accumule préférentiellement dans le nucléole, et pourrait jouer un rôle dans la régulation de la transcription des gènes des ARNr, ou dans l'assemblage des ribosomes. Dans le cytoplasme, différentes approches, incluant des expériences de double-marquage et de déstructuration de composants du cytosquelette, ont permis de mettre en évidence une très forte colocalisation de la protéine HaWLIM-1 avec les microtubules, ce qui suggère un rôle pour cette protéine dans l'organisation du cytosquelette.
Lors de la culture des protoplastes, le gène HaWLIM-1 s'exprime constamment, avec cependant des variations dans le niveau d'expression. Des expériences d'immunoblot utilisant les anticorps spécifiques de la protéine HaWLIM-1 indiquent que de nouveaux polypeptides, de masses moléculaires égales à 35 kDa, 42 kDa et 64 kDa, apparaissent au cours de la culture. Cette observation suggère que la protéine HaWLIM-1 possède la capacité de s'associer et de se dissocier avec de nouveaux complexes protéiques au cours du développement. La protéine HaWLIM-1 est associée aux microtubules pendant tous les stades de la division : elle est présente au niveau de la bande préprophasique à la fin de l'interphase, au niveau du fuseau mitotique pendant la mitose, et au niveau du phragmoplaste pendant la cytokinèse. Ces observations semblent indiquer que la protéine HaWLIM-1 occupe une fonction importante au niveau des microtubules.

L'évolution de la régulation de l'expression des gènes participe à l'évolution de leur fonction. L'existence de profils d'expression spécifiques évitant la redondance fonctionnelle expliquerait le maintien des gènes dupliqués dans les génomes. La PCR quantitative en temps réel se révèle adaptée à l'étude de l'expression des familles de gènes présentant des niveaux très variés et des séquences proches. Le génome modèle d'Arabidopsis thaliana contient une famille d'ARN hélicases à boîte DEAD (RH) de 58 membres, i.e. environ deux fois plus que n'en comptent les génomes d'animaux ou celui de la levure. L'expression transcriptionnelle de 20 AtRH a été obtenue par RT-PCR quantitative dans neuf organes différents. Dans cette famille de gènes " de ménage ", deux AtRH présentent des profils spécifiques alors que les 18 autres AtRH présentent le même profil spatial, mais des niveaux d'expression transcriptionnelle très différents. L'élément régulateur principal du niveau transcriptionnel est la présence simultanée d'une boîte TATA caractéristique et d'un intron en 5' UTR. Dès lors que la boîte TATA est présente, il y a une corrélation positive significative entre la taille de l'intron en 5' UTR et le niveau d'expression. Notre travail sur l'expression des AtRH permet d'introduire un scénario sur la dynamique évolutive des gènes dupliqués qui forment une même branche terminale d'un arbre phylogénétique et dont le niveau d'expression diffère fréquemment. Après la duplication d'un gène fortement transcrit, l'altération de l'activité transcriptionnelle des copies se produirait par des événements successifs de suppression de la boîte TATA et/ou de l'intron en 5' UTR.

A hidrolipodistrofia ginóide, popularmente denominada de celulite, é caracterizada como um processo distrófico que produz alterações estruturais dos elementos presentes na pele, como: modificações no tecido conjuntivo, comprometimento da microcirculação periférica cutânea, hipertrofia e hiperplasia dos adipócitos e edema. Os flavonóides são utilizados como substâncias ativas em preparações anticelulíticas por reduzirem a permeabilidade capilar. Os objetivos estabelecidos para esta pesquisa foram: (1) desenvolver emulsões cosméticas com finalidades anticelulíticas; (2) validar metodologia analítica para o doseamento de flavonóides totais, equivalentes em rutina, por espectrofotometria na região do ultravioleta; (3) avaliar a estabilidade física, físico-química e química das formulações. Formulações cosméticas anticelulíticas foram desenvolvidas contendo o extrato vegetal comercial de Trichilia catiguá Adr. Juss (e) Ptychopetalum olacoides Bentham (Slimbuster® H1), padronizado em flavonóides totais, equivalentes em rutina, e avaliadas quanto à estabilidade física, físico-química e química. Para sua quantificação, o método espectrofotométrico na região do ultravioleta a 361,0 nm foi empregado, comparando-se com rutina padrão secundário de referência (T = 96,1%). A avaliação da estabilidade envolveu três condições distintas de temperatura (5,0 + 0,5; 24 + 2 e 40,0 + 0,5 °C), pelo período de três meses, e as variáveis analisadas foram as características organolépticas, valor de pH, viscosidade aparente e teor de flavonóides totais. A metodologia foi validada quanto à linearidade, limites de detecção e quantificação, especificidade e pesquisa de interferentes, recuperação do padrão, precisão e exatidão intra e inter-dias. Os resultados da estabilidade indicaram que o teor de flavonóides totais, equivalentes em rutina, sofreu decaimento inferior a 10% nas condições de exposição à luz solar direta e/ou indireta, à temperatura ambiente (24 + 2 °C) e de refrigerador (5,0 + 0,5 °C), sendo que a 40,0 + 0,5 °C, condição de estufa, ocorreu redução de, aproximadamente, 35%.
Gynoid hydrolipodystrophy, popularly known as cellulite, is characterized as a dystrophic process that generates structural alterations of skin elements, as: connective tissue modifications, cutaneous microcirculation abnormalities, hypertrophy and hyperplasia of adipocytes and edema. Flavonoids are employed as raw materials in anticellulitic products by their capability to reduce capillary permeability. The objectives established for this research were: (1) development of anticellulitic cosmetic emulsions; (2) analytical method validation for total flavonoids, expressed in rutin, by ultraviolet spectrophotometry; (3) physical, physicochemical and chemical stability assay for the preparations. Anticellulitic cosmetic formulations containing the Trichilia catigua Adr. Juss (and) Ptychopetalum olacoides Bentham commercial extract (Slimbuster® H1), standardized in total flavonoids, expressed in rutin, were developed and their physical, physicochemical and chemical stability was assessed. Flavonoids were quantified within the ultraviolet spectrophotometric method at 361.0 nm as rutin equivalents by comparison with secondary standard rutin (T = 96.1%). Stability assay was conducted in three temperature conditions (5.0 + 0.5; 24 + 2 e 40.0 + 0.5 °C) and the following parameters were analyzed: aspect, color and odor, pH and apparent viscosity values and flavonoid content. Analytical methodology was validated determining linearity, limits of detection and quantification, specificity and interferent assay, recovery and intra and inter-run precision and accuracy. Results from stability evaluation have indicated decrease of flavonoid content inferior than 10% at sunlight exposure (room temperature, 24 + 2 °C) and at 5.0 + 0.5 °C; high temperature (40.0 + 0.5 °C) has reduced the flavonoid content at, approximately, 35%.