Dissertations / Theses on the topic 'Cellules eucaryotes – Résistance au stress'

Mes travaux de recherche portent sur le contrôle du cycle cellulaire chez la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe. Chez S. pombe, cette régulation est assurée principalement par une protéine kinase cycline-dépendante (CDK), nommée Cdc2. Au cours du cycle cellulaire, cette enzyme s’associe avec différentes cyclines (Cig1, Cig2, Puc1 et Cdc13), formant ainsi une variété de complexes CDK-cycline qui confèrent des activités spécifiques à chaque phase du cycle. Cependant, il a été montré que ce réseau complexe peut être simplifié et remplacé par un système minimal, qui consiste en la fusion des deux gènes cdc2 et cdc13, indépendant d’un grand nombre de régulations endogènes. Cette découverte a ainsi permis d'établir un nouveau modèle pour le contrôle du cycle cellulaire eucaryote. Dans ce travail nous avons d’une part, voulu comprendre pourquoi la régulation du cycle cellulaire s’est complexifiée au cours de l’évolution, étant donné qu’une grande partie du circuit endogène semble dispensable. Dans ce but, j’ai investigué les limites du système minimal, quand les cellules sont exposées à différents stress. De manière surprenante, nous avons découvert que la simplification du réseau des CDKs confère aux cellules une résistance au stress réplicative. Nous avons montré que ce phénotype était indépendant de la régulation de l’inhibiteur Rum1 et des points de contrôles. Il résulte plutôt du fait que le cycle cellulaire soit régulé uniquement par Cdc13. Nous avons trouvé que le programme de réplication était inchangé dans les minimale qui présentaient moins de dommage à l’ADN comparé aux cellules sauvages. Nos data suggèrent que l’activité des CDKs associée au cyclines de phase G1/S, représente un moyen alternatif de moduler la réponse au stress. D’autre part, en utilisant le même système dans lequel l’activité des CDKs peut être finement modulée par l’inhibiteur. Nous avons démontré que la transcription périodique des gènes dépendait d’une régulation quantitative par les CDKs. Par conséquence nous proposons le model, l’opposé de ce qui a été suggéré chez la S. cerevisiea. Dans notre model, la progression du cycle cellulaire ainsi que la transcription périodique des gènes sont toutes les deux sous le contrôle de l’activité des CDKs
The cyclin-dependent protein kinases (CDKs) are at the core of cell cycle control. In fission yeast, cell proliferation is regulated by CDK1/Cdc2 in association with the four cyclins Cdc13, Cig1, Cig2 and Puc1 at different stages of the cell cycle. However, this complex endogenous system can be replaced by a minimal module consisting of a fusion between Cdc2 and Cdc13 in the absence of G1/S cyclins. Surprisingly, this minimal CDK network drives the entire cell cycle in a wild type manner. Since a number of aspects of cell cycle control in fission yeast appear to be dispensable, we asked why similarly simplified circuits were not selected over the complex endogenous network during evolution. This led us to investigate the limits of such minimal systems, in particular when challenged by different stresses. Unexpectedly, we uncovered that simplification of the CDK network confers resistance to replication stress. We showed that this phenotype is independent from the CDK inhibitor Rum1 and the existing checkpoint pathways. It solely relies on operating the entire cell cycle with a single cyclin, Cdc13, and is associated with reduced genome instability when replication is challenged. However, it is not the consequence of changes in replication organisation along the chromosomes. Our data suggest that G1/S cyclin-associated Cdc2 activity may represent an alternative as yet unknown means of modulating cellular response to DNA stress. We also took advantage of a derivative of the minimal cell cycle network, in which Cdc2 is made sensitive to specific chemical inhibition. As a result, CDK activity can be externally modulated and cell cycle phases can be precisely controlled. Using this system, we re-visited the interplay between CDK and periodic transcription, a highly conserved process that is critical for proper cell proliferation. In contrast with previous studies in budding yeast, we demonstrate that periodic transcription in fission yeast is not independent from cell cycle progression. On the contrary, our work reveals that cell cycle transcriptional oscillations rely on quantitative changes in CDK activity levels. We therefore propose a new model, in which cell cycle progression and periodic transcription are intimately coupled through their common dependency on a unique input, namely CDK activity levels

La photocatalyse est un procédé d'oxydation avancée qui consiste en l'activation du dioxyde de titane sous UV pour générer des espèces oxydantes. Ces dernières sont capables d'inactiver les cellules vivantes. Nos travaux ont porté sur l'analyse des mécanismes antimicrobiens de la photocatalyse à l'échelle cellulaire et moléculaire sur le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae, champignon unicellulaire. Le traitement photocatalytique affecte de manière drastique la cultivabilité de cette levure. La diminution de la cultivabilité a été reliée à la perte de l'intégrité membranaire et à la perte de l'activité enzymatique intracellulaire, analysées par cytométrie en flux. L'exposition des levures à la photocatalyse provoque des dommages à toutes les macromolécules (acides nucléiques, lipides membranaires, protéines) et par conséquent aux structures cellulaires ce qui engendre la libération de constituants cellulaires (ions, acides aminés), de même que la formation de produits de dégradation (malondialdéhyde, acides organiques). Ces dommages peuvent être liés à un stress oxydant intracellulaire suggéré par l'accumulation des ions superoxyde dans les cellules traitées et l'augmentation de la résistance pour les souches surexprimant des enzymes de dégradation des ROS. Enfin, l'étude de l'impact de la photocatalyse sur des organismes fongiques ayant un impact environnemental ou sur la santé, a révélé l'existence de cellules ou de structures fongiques résistantes. Ces résultats ont apporté des éléments de connaissance inédits sur l'impact de la photocatalyse sur les cellules eucaryotes fongiques et ouvrent de nouvelles perspectives notamment dans la compréhension du phénomène de résistance
Photocatalysis is an advanced oxidative process that generates reactive oxygen species (ROS) and inactivates living cells. The aim of this work was to have a better understanding of the antimicrobial mechanisms generated by photocatalytic treatment. The cellular impact was monitored using the unicellular fungal model, Saccharomyces cerevisiae yeast. Photocatalysis reduces drastically the cultivability of yeast cells. Flow cytometry analyses revealed that the decrease of cell cultivability was related to both damages in plasma membrane and loss of intracellular enzymatic activity. During exposure to photocatalysis, multiple cellular macromolecules are damaged (lipids, proteins, nucleic acids). These damages are responsible for cellular structure dysfunction leading to a release of intracellular compounds (ions, amino acids) and the formation of by-products and pollutant (carboxylic acids, malondialdéhyde). The increase of intracellular superoxide ions amounts and the higher resistance of yeast strains overexpressing ROS detoxifying enzymes suggested an intracellular oxidative status responsible for described macromolecular damages. Finally, exploring photocatalytic treatment on other environmental and health impact fungi revealed the presence of resistant cells or structures. For the first time, an interdisciplinary work focusing on cellular impacts of photocatalysis was monitored leading to a better understanding and to new perspectives

Les centres Fer-Soufre (Fe-S) sont des cofacteurs ubiquitaires apparus aux origines de la vie. Deux systèmes, Isc et Suf, conservés des procaryotes aux eucaryotes permettent l’assemblage et le transfert des centres Fe-S vers les apo-protéines cibles. Dans le modèle bactérien E.coli, Isc est considéré comme système de ménage et Suf est utilisé dans des conditions de stress. Un réseau de régulation complexe permet la spécialisation de ces systèmes en fonction des conditions environnementales. En particulier, le facteur transcriptionnel IscR et l’ARN non-codant RyhB sont impliqués dans la régulation de la biogenèse en réponse à la carence en fer. J’ai étudié le rôle de RyhB dans la résistance à l' antibiotique gentamicine. Nous avons montré que la résistance induite par RyhB est dû à l’inhibition de l’activité des complexes respiratoires Nuo et Sdh. Ces complexes sont essentiels à l’entrée de la gentamicine dans la bactérie. RyhB inhibe directement la traduction des complexes et indirectement leur maturation en centres Fe-S . ceci conduit à la résistance par diminution d'entrée de la gentamicine dans la cellule. J’ai aussi participé à un travail révélant le rôle de RyhB dans la régulation d’ErpA, un transporteur essentiel des centres Fe-S. Nous avons pu mettre en évidence que l’expression d’erpA est répriméepar IscR en condition riche en fer et par RyhB lorsque le fer est limitant. Ce circuit de régulation a priori « incohérent » aboutit à une expression bimodale du transporteur, ce qui permet de coordonner l’utilisation des différents transporteurs de centres Fe-S d’E.coli en fonction des conditions de croissance
Iron-sulfur (Fe-S) clusters are ancient cofactors involved in plethora of biological processes. Two major Fe-S biogenesis systems, Isc and Suf, present in both prokaryotes and eukaryotes, allow the synthesis of these important cofactors. The bacterium E.coli possesses both systems, making it an important model for Fe-S biogenesis. In this bacterium, Isc is considered as the housekeeping system while Suf is responsible for synthesis of Fe-S clusters in adverse conditions. Intricate regulatory pathways control the use of these machineries in function of the environmental conditions. In particular, iron starvation is detrimental to Fe-S cluster biogenesis which is why it is highly regulated by the IscR transcriptional regulator and the non-coding RNA RyhB. I have studied the role of RyhB in the resistance to gentamicin, a bactericidal antibiotic that targets the ribosome. We have found that RyhB induces resistance to gentamicin by inhibiting the activity of the respiratory complexes Nuo and Sdh. These complexes, which contain numerous Fe-S clusters, are crucial for gentamicin uptake. RyhB directly inhibits the translation of nuo and sdh and indireclty inhibits the maturation of the complexes leading to gentamicin resistance.I also participated in a study that unveiled the role of RyhB and the transcriptional factor IscR in the regulation of ErpA, an essential transporter of Fe-S clusters in E. coli. IscR and RyhB form an incoherent circuit that regulates erpA in medium with antagonist iron content. These regulations allow the fine-tuning of erpA expression in function of iron availability and coordination of Fe-S cluster transporter usage in E. coli

Le développement de cancer entraîne une dérégulation du métabolisme du cuivre (Cu) qui a notamment été étudiée par analyse de la composition isotopique naturelle du Cu. Les cellules tumorales hépatiques sont enrichies en isotopes lourds du Cu par rapport aux cellules péri-tumorales. Le but de cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de cette différence, en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae dont les mécanismes de réduction et d'import du Cu sont proches de ceux de l'Homme. En mutant les gènes codants pour les importateurs ou les réductases du Cu, j’ai montré que son import protéique génère un enrichissement intracellulaire en isotopes légers du Cu, qui est modulé par l'activité des réductases. Une modélisation numérique m’a permis de montrer que le flux de Cu par les importateurs haute-affinité Ctr est linéairement et négativement corrélé à la composition isotopique du Cu. Ce flux étant modulé par la capacité de réduction membranaire du Cu, j’ai pu lier l'enrichissement en isotopes lourds du Cu des cellules hépatiques tumorales à une diminution de l'activité des réductases membranaires. Par ailleurs, pour un même fond génétique, j'ai mis en évidence une corrélation entre un moindre enrichissement en isotopes légers du Cu et une résistance accrue à un médicament anticancéreux, le cisplatine. De plus, le traitement au cisplatine entraîne un enrichissement des cellules en isotopes lourds du Cu d'autant plus petit que la souche est résistante au cisplatine. Ainsi, ces résultats montrent que la mesure de la composition isotopique du Cu avant et après traitement au cisplatine pourrait permettre de suivre l'apparition d’une chimiorésistance chez les malades, caractérisée par un enrichissement en isotopes lourds du Cu dans les tumeurs, ce qui ouvre la voie au développement d'un nouveau biomarqueur non-invasif de l'apparition d'une résistance au cisplatine
Cancer development leads to Cu metabolism disregulation which were especially studied by the natural copper (Cu) isotopic composition. Hepatocellular carcinoma (hCC) are enriched in heavy Cu isotopes compared to peri-tumoral cells. The goal of this thesis is to identify the mechanism responsible for this difference. I used the yeast Saccharomyces cerevisiae where Cu reduction and Cu import mechanism are close to the human. By mutating the genes coding for Cu reductases or Cu importers, I showed that protein Cu import generate an intracellular light Cu enrichment which is modulated by Cu reductases activity. With a numerical modelisation I calculated that the Cu flux through high-affinity Cu importers is linearly and negatively correlated to the natural Cu isotopic composition. This flux is modulated by the cell reduction ability. Therefore, I have linked the heavy Cu isotopes enrichment in hCC to a lower reductases activity. Besides, for a same genetic background, I observed a correlation between a lower light Cu enrichment and an higher resistance to a anti-tumoral drug, the cisplatin. Moreover, I observed that cisplatin treatment leads to an enrichment in heavy Cu isotopes which is lower for resistant to cisplatin strains. Those results shown that the Cu isotopes measurement in tumors before and after the cisplatin treatment might be used to trace the chemoresistance apparition in patient with cancer which is characaterize by a tumoral heavy Cu isotopes enrichment. This results might pave the way to the development of a new prognosis biomarker of the cisplatin resistance apparition

L’apoptose est une mort cellulaire programmée nécessaire à l’homéostasie tissulaireau cours du développement. Les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à échapper àl’apoptose. Restaurer la capacité des cellules tumorales à mourir est une stratégiethérapeutique qui permettrait de lutter contre le cancer. Il est donc important d’identifier denouvelles cibles au sein de la signalisation apoptotique et de tester de nouvelles molécules.La mitochondrie, intégrateur central des signaux de mort cellulaire et actrice de l’exécution de l’apoptose, est une cible de choix pour développer des thérapies anti-tumorales.L’ANT (Adenine Nucleotide Translocase) est la protéine majoritaire de la membrane internemitochondriale. Elle est possède une fonction de transporteur ATP/ADP, en conditionphysiologique, et suite à un stimulus apoptotique, acquiert une activité de pore létal. Ainsi, ilest intéressant d’inhiber la fonction transporteur et d’activer la fonction pore d’ANT pourinduire l’apoptose. Il existe quatre isoformes d’ANT : ANT1, 2, 3 et 4. Nous avons étudié lerôle d’ANT4, récemment identifiée, dans la signalisation apoptotique. Notre étude montre lerôle anti-apoptotique d’ANT4 dans des cellules cancéreuses et l’intérêt d’ANT comme ciblethérapeutique anti-cancéreuse.Une augmentation de l’expression de protéines anti-apoptotiques, l’adaptation auxstress cellulaires et l’activation de voies de survie sont les mécanismes les plus fréquemmentdécrits pour expliquer la chimiorésistance du mélanome. A l’aide de modèles cellulaires, nousavons étudié la capacité de deux nouvelles molécules : Withaférine A (WFA) et Plumbagine(PBG) à stimuler l’apoptose et déterminé les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avonsmontré la capacité de WFA à induire spécifiquement la voie mitochondriale de l’apoptose decellules de mélanome par un mécanisme dépendant de la production d’espèces activées del’oxygène (EAO) qui déclenchent la voie mitochondriale et de la diminution du niveaud’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. En revanche, PBG induit une mortapoptotique et une mort nécrotique des cellules de mélanomes. Dans les deux cas, PBG agitpar l’augmentation des EAO suite au déclenchement d’un stress du reticulum endoplasmique.WFA et PBG sont donc deux molécules pro-oxydantes capables d’induire la mort des cellulesde mélanome en tirant partie de leur vulnérabilité au stress oxydant.Nos travaux ont participé à la mise en évidence d’une cible thérapeutique anticancéreusepotentielle et de deux agents capables d’induire la mort cellulaire dans un contextede chimiorésistance
Apoptosis is a programmed cell death process necessary for tissue homeostasis duringdevelopment. Cancer cells acquire the capacity to evade apoptosis. Restoring tumor cellsability to die is a therapeutic strategy against cancer. It is therefore important to identify newtherapeutic targets within the apoptotic signaling and to test new molecules.Mitochondrion being a central integrator of cell death signals and a key player inapoptosis execution, it is a target of choice to develop new anticancer therapies. ANT(Adenine Nucleotide Translocase) is the main protein of the inner mitochondrial membrane. Itpresents a ADP/ATP transporter function in physiological conditions and acquire a lethal poreactivity upon apoptotic stimulus. It is thus interesting to inhibit the transporter function and- 6 -activate ANT pore function in order to induce apoptosis. There are four isoforms: ANT1, 2, 3and 4. We studied the role of the recently discovered ANT4 in apoptotic signaling. Our studyemphasize ANT4 anti-apoptotic role in cancer cells and ANT potential as an anticancertherapeutic target.Increase in anti-apoptotic proteins, adaptation to cellular stress and activation ofsurvival pathways are the main mechanisms responsible for chemoresistance. Using cellularmodels we studied the ability of two molecules: Withaferin A (WFA) and Plumbagin (PBG)to stimulate apoptosis and determined the molecular mechanisms involved. We showed WFAcapacity to specifically induce the mitochondrial pathway of apoptosis in melanoma cellsthrough reactive oxygen species (ROS) generation leading to mitochondrial pathwayactivation and the decrease in anti-apoptotic protein Bcl-2 expression level. However, PBG isresponsible for apoptosis and necrosis induction in melanoma cells. In both cases PBG actsthrough an increase in ROS following endoplasmic reticulum stress. WFA and PBG are thustwo pro-oxidant molecules able to induce the death of melanoma cells by taking advantage oftheir vulnerability to oxidative stress.Our work took part in the demonstration of a potential anticancer target and two agentsable to induce cell death in a context of chemoresistance

Les tumeurs mammaires sont connues pour présenter une grande hétérogénéité intratumorale qui contribue à l’échec thérapeutique et à la progression de la maladie. L’origine de dette hétérogénéité s’explique principalement par l’organisation hiérarchique des tissus tumoraux où plusieurs sous-populations de cellules souches de cancer du sein (bCSC) sont capables de s’auto-renouveler et de maintenir l’architecture oligoclonale de la tumeur. Dans la mesure où les bCSC stimulent la croissance tumorale, résistent aux thérapies conventionnelles et initient le développement des métastases, il est indispensable de développer des thérapies spécifiques ciblant ces cellules. L’élaboration d’une telle stratégie nécessite la compréhension des propriétés moléculaires intrinsèques des bCSC. Pour mieux comprendre leur biologie, nous avons isolé les bCSC de différentes xénogreffes dérivées de tumeurs de patientes et établit leurs profil d’expression génique. Nous avons identifié un programme transcriptionnel pouvant être impliqué dans la réduction du stress réplicatif (SR) des bCSC . Nous avons montré que comparé aux non-bCSC, les bCSC présentent une sur-activation de la recombinaison homologue qui leur permet de réduire leur niveau de SR. Nous avons ensuite montré en réalisant un essai clinique que l’inhibition de cette voie permet de les sensibiliser à des agents génotoxique. Ces travaux identifient le SR comme le talon d’Achille des bCSC et mettent en évidence la recombinaison homologue comme cible potentielle pour sensibiliser les BCSC aux thérapies conventionnelles
Breast tumors are known to present a major intratumoral heterogeneity that contributes to therapy failure and disease progression. The origin of this cellular heterogeneity is mainly explained by a hierarchical organization of tumor tissues where several subpopulations of self-renewing breast cancer stem cells (bCSCs) sustain the long-term oligoclonal maintenance of the neoplasm. bCSCs drive tumor growth, resist to conventional therapies and initiate metastasis development. Thus, developing bCSC-targeting therapies is becoming a major challenge requiring the understanding of the unique molecular circuitry of bCSC as compared to non-bCSC. To better understand the biology of these cells, we isolated bCSCs from different patient–derived xenografts (PDXs), derived fom breast tumors, and established their gene expression profiles. We identified a bCSC core transcriptional program that may be implicated in the reduction of the replicative stress in CSC: overexpression of genes implicated in dNTP metabolism and homologous recombination (HR). Our results show that HR plays a major role in SR regulation of bCSC and that bCSC are more resistant to RS than non-bCSC, We realized a preclinical assay in PDX and showed that HR inhibition prevent bCSC expansion Cisplatin-induced, suggesting a sensitization of the bCSC to the chemotherapy. Our results identify replication stress as the Achilles’ heel of bCSC and highlights HR as potential targets for anti-bCSC therapy

Le stress oxydant, par la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène, est impliqué dans de nombreux processus dont la carcinogenèse. Afin de mieux comprendre l'implication des radicaux libres de l'oxygène (RLO) dans les mécanismes de cytotoxicité et de résistance tumorale de différents types cellulaires vis-à-vis des anticancéreux, nous avons caractérisé le statut oxydant de deux lignées tumorales résistantes (GLC4 et K562) ou non à l'adriamycine (ADR), avant et après traitement par cet agent. La réponse obtenue après traitement par l'ADR ou le sélénium est très différente entre les lignées GLC4 et K562 et dépendante de la sensibilité ou de la résistance à l'ADR. Ce travail démontre d'une part l'importance des RLO et des systèmes antioxydants cellulaires dans la chimiothérapie. D'autre part, notre travail montre que les effets du sélénium sur la cellule cancéreuse varient selon les types cellulaires et pourraient dans certains cas interférer avec le traitement
Oxidative stress, by overexpression of reactive oxygen species (ROS), is implicated in numerous processes such as carcinogenesis. In order to better understand the involvement of oxygen free radicals (OFR) in tumoral cytotoxicity and resistance mechanisms of antineoplastic drugs in different cell types, we characterized oxidative status of two different tumoral cell lines (GLC4 and K562) resistant or not to adriamycin (ADR), before and after a treatment with this drug. The obtained response by ADR or selenium treatment is very divergent between both GLC4 and K562 cells and sensitive or resistant phenotype. This work clearly demonstrates the interest of OFR and cellular antioxidant systems in chemotherapy. Although preventive role of selenium has been well characterized, our work showed that its effect on cancer cells is depending on cellular type and may interfere with the treatment

Le réflexe naturel d’une cellule eucaryote, soumise à un stress (ex : radiations, drogues anti-cancers…), est d’activer des mécanismes de défense afin de s’adapter aux conditions extrêmes imposées, leur permettant de survivre. Un des mécanismes activé en condition de stress est l’inhibition de l’initiation de la traduction menant à la formation de granules de stress (GS). Les GS sont des corps cytoplasmiques dynamiques renfermant des facteurs d’initiation de la traduction, des ARNms, des protéines de liaison à l’ARN ainsi que des molécules de signalisation impliquées dans les voies de mort cellulaire. La formation des GS fut identifiée comme un évènement clé inactivant les voies de mort cellulaire, constituant donc un mécanisme majeur de survie, qui dans le cas du cancer peut engendrer une chimiorésistance. Nous avons précédemment conduit un criblage des facteurs d’initiations de la traduction impliqués dans la formation des GS. Ces travaux (Mazroui et al, 2006 ; Mokas et al, 2009) ont permis d’identifier plusieurs facteurs dont l’inactivation induit la formation des GS. Par contre, l’inactivation du facteur eIF4E, qui est responsable de la reconnaissance des ARNms lors de l’initiation de la traduction, n’induit pas la formation des GS. Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence un nouveau rôle du facteur d’initiation de la traduction eIF4E ainsi que son partenaire eIF4GI dans la formation des GS induites par le traitement chimiothérapeutique Bortezomib. Ce rôle est stimulé par la voie oncogénique mTORC1, qui est la voie de signalisation responsable de l’interaction eIF4E-eIF4GI. De plus, notre étude a démontré que l’inhibition spécifique d’eIF4E, d’eIF4GI ou l’inactivation de mTORC1 empêche l’activation des voies anti-apoptotiques associées au GS, sensibilisant ainsi les cellules cancéreuses aux traitements chimiothérapeutiques. Néanmoins, la formation des GS n’est pas restreinte au Bortezomib. En effet, notre criblage des drogues chimiothérapeutiques a identifié le Sorafenib (Nevaxar®) et le Lapatinib (Tykerb/Tyverb®) comme deux puissants inducteurs des GS au sein des cellules cancéreuses. En conclusion, ces travaux ont mis en lumière un nouveau mécanisme de formation des GS ainsi que deux potentiels inducteurs d’assemblage de ces granules.
The natural reflex of a eukaryotic cell under stress (e.g.: radiation, anti-cancer drugs, thermal or oxidative stress) is to activate defense mechanisms to adapt to extreme conditions imposed, allowing them to survive. One mechanism activated under stress conditions is the inhibition of translation initiation leading to the formation of stress granules (SG). SG are dynamic cytoplasmic body containing translation initiation factors, mRNAs, RNA binding proteins and signaling molecules involved in cell death pathways. SG formation was identified as a key event inactivating cell death pathways, thus establishing a major survival mechanism, which in the case of cancer can lead to drug resistance. We previously conducted a screening of the translation initiation factors involved in the SG formation. These works (Mazroui et al, 2006; Mochas et al, 2009) have identified several factors that inactivation induces the formation of GS. For cons, the inactivation of factor eIF4E, which is responsible for the recognition of mRNAs during translation initiation, does not induce the formation of SG. My thesis has highlighted a new role for the translation initiation factors eIF4E and its partner eIF4GI in the SG formation induced by chemotherapeutic drug Bortezomib. This role is stimulated by oncogenic mTORC1 pathway, which is the key regulator of the eIF4E-eIF4GI interaction. In addition, our study demonstrated that specific inhibition of eIF4E, eIF4GI or the inactivation of mTORC1 prevents anti-apoptotic pathways associated with SG and sensitizing cancer cells to chemotherapeutic treatments. The SG formation is not restricted to Bortezomib. Indeed, our screening of chemotherapeutic drugs has identified Sorafenib (Nevaxar ®) and Lapatinib (Tykerb / Tyverb ®) as two potent inducers of SG in cancer cells. Our results indicate that the mechanism of action of these two drugs appears to be similar to Bortezomib and they induce the formation of SG by inhibiting translation initiation. In addition, the formation of SG induced by Sorafenib or Lapatinib also seems to depend on the eIF4E-eIF4GI complex formation. Therefore, my work provides a general role of eIF4E-eIF4GI interaction in the assembly of SG and the cancer cells resistance to chemotherapy.

Les cellules vivantes, lorsqu'elles sont constamment exposées au stress, sont capables de réagir de manière complexe en faisant intervenir divers réseaux de régulation intracellulaire. Leur régulation contrôle par exemple le devenir cellulaire en réponse à un stress oxydatif. Lorsque les mécanismes défensifs parviennent à faire face au stress, une rétroaction négative est impliquée et la cellule survit, sinon la cellule meurt. L'un des principaux mécanismes défensifs repose sur l'interaction entre le flux métabolique et le stress oxydatif, exploitant le rôle dualiste du peroxyde d'hydrogène, agissant à la fois comme une molécule de signalisation et de dommages. Nos travaux visent à identifier les molécules clés impliquées dans le devenir cellulaire et à suivre leur dynamique au niveau de la cellule unique, à l'aide de la microscopie de fluorescense. Dans un premier temps, nous concevons un système expérimental inspiré des études de chimiotaxie pour contrôler en permanence la dose appliquée de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à la lignée cellulaire du cancer du sein (MCF7). Le choix de la méthode de stimulation joue un rôle important dans notre étude. En effet, afin de délivrer une concentration constante de stimulus aux cellules de mammifères, un milieu de culture cellulaire H2O2 non réactif avec H2O2 est choisi. En utilisant un système fluidique, le taux de production intracellulaire de H2O2 est contrôlé en faisant varier la concentration externe de H2O2. La délivrance et l'élimination du stimulus sont ainsi effectuées assez rapidement (plus rapidement que la consommation cellulaire) pour étudier les réponses cellulaires dynamiques. Lors d'une stimulation constante, une dynamique d'adaptation est observée, ce qui suggère que des rétroactions négatives sont impliquées dans la protection cellulaire contre le stress. La variabilité d'une cellule à l'autre est observée et quantifiée à l'aide de paramètres d'adaptation identifiés. Des résultats préliminaires de la dépendance de la modulation du pH par l'état métabolique cellulaire sont discutés. Les caractéristiques d'adaptation ne sont pas représentées lorsque les sources de carbone sont complètement éliminées du milieu externe. Ce résultat souligne le rôle du glucose dans le mécanisme de défense cellulaire. Un autre résultat important est celui de la dynamique de rétroaction qui dépend de la dose de H2O2 appliquée aux cellules: une stimulation plus forte implique une réponse plus forte. C'est un premier facteur limitant que nous avons identifié lors de la quantification de la réponse de mort cellulaire au stress H2O2. Les résultats de la réponse à la dose de mort cellulaire suggèrent que le destin de la cellule (survie ou mort) dépend également à la fois du contrôle du stimulus et de l'état métabolique cellulaire. Afin d'identifier les voies métaboliques impliquées dans la rétroaction négative induite par le stress oxydatif, des molécules clés régulant la voie Phosphate Pentose (PPP) sont modulées. Nous concluons que l'orchestration du réseau moléculaire est plus complexe et que le PPP n'est pas le seul réseau impliqué dans la défense cellulaire. Nous concluons que l'orchestration du réseau moléculaire est plus complexe et que PPP est le réseau principal mais pas le seul impliqué dans la défense cellulaire. Dans ce manuscrit, une conception expérimentale est présentée afin d'étudier les réponses d'adaptation au stress oxydatif observée en temps réel. Nos expériences confirment la cinétique d'adaptation rapide du NAD(P)H déjà observée dans la littérature. Nous identifions, pour la première fois, un deuxième mécanisme de régulation où le système de glutathion se rétablit en 30 min pendant la stimulation contrôlée par H2O2. Le métabolisme du glucose soutient la régénération de ce système antioxydant et le réseau PPP est ainsi identifié comme le principal retour négatif dans l'adaptation moléculaire observée ici
Living cells, when constantly exposed to stress, are able to respond in a complex manner involving various intracellular regulation networks. Their regulation controls for instance the cellular fate outcome in response to an oxidative stress. When defensive mechanisms manage to cope against stress, a negative feedback is involved and cell survive, otherwise cell dies. One of a key defensive mechanism relies on the interplay between metabolic flux and oxidative stress exploiting the dualistic role of hydrogen peroxide, acting both as signalling and damaging molecule. Our work aims to identify key molecules involved in cellular fate and to monitor their dynamics at the single cell level, using fluorescent microscopy. In a first step, we design an experimental system inspired by chemotaxis studies to constantly control the dose applied to breast cancer cell line (MCF7). The choice of the stimulation method plays an important role in our study. Indeed, in order to deliver a constant concentration of stimulus to mammalian cells, non-consuming H2O2 cell culture medium is chosen. Using a fluidic system, the intracellular H2O2 production rate is controlled by varying the external H2O2 concentration. Stimulus delivery and removal is thus performed fast enough (faster than cellular consumption) to study the dynamical cellular responses. During constant stimulation, adaptation dynamics are notified, suggesting that negative feedbacks are involved in the cellular protection against stress. Cell-to-cell variability is observed and can be quantified using identified adaptation parameters. The fluorescent signal is processed and preliminary results of pH modulation dependence by the cellular metabolic state are discussed. The adaptation features are not depicted when the carbon sources are completely removed from external medium. This result underlines the role of glucose in the cellular defensive mechanism. Another important result is that the feedback dynamics is depending by the H2O2 dose applied to cells: stronger stimulation implies stronger response. It is a first limiting factor we identified while quantifying the cell death response to H2O2 stress. The results of cell death dose response are suggesting that the cell fate (survival or death) is also depending by both the control of the stimulus and the cellular metabolic state. In order to identify the metabolic pathways involved in the negative feedback induced by the oxidative stress, key molecules regulating the Phosphate Pentose Pathway (PPP) are modulated. We conclude that the orchestration of molecular network is more complex and PPP is the main but not the only network involved in the cellular defense. In this manuscript an experimental design is presented in order to study the adaptation responses to oxidative stress in real time. Our experiments are confirming the fast adaptation kinetics of NAD(P)H already observed in literature. We identify, for the first time, a second regulation mechanism where the glutathione system is restoring within 30 min during controlled H2O2 stimulation. The glucose metabolism is supporting the regeneration of this antioxidant system and PPP network is thus identified as the main negative feedback in the molecular adaptation here observed

L'apoptose est une mort cellulaire programmée nécessaire à l'homéostasie tissulaireau cours du développement. Les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à échapper àl'apoptose. Restaurer la capacité des cellules tumorales à mourir est une stratégiethérapeutique qui permettrait de lutter contre le cancer. Il est donc important d'identifier denouvelles cibles au sein de la signalisation apoptotique et de tester de nouvelles molécules.La mitochondrie, intégrateur central des signaux de mort cellulaire et actrice de l'exécution de l'apoptose, est une cible de choix pour développer des thérapies anti-tumorales.L'ANT (Adenine Nucleotide Translocase) est la protéine majoritaire de la membrane internemitochondriale. Elle est possède une fonction de transporteur ATP/ADP, en conditionphysiologique, et suite à un stimulus apoptotique, acquiert une activité de pore létal. Ainsi, ilest intéressant d'inhiber la fonction transporteur et d'activer la fonction pore d'ANT pourinduire l'apoptose. Il existe quatre isoformes d'ANT : ANT1, 2, 3 et 4. Nous avons étudié lerôle d'ANT4, récemment identifiée, dans la signalisation apoptotique. Notre étude montre lerôle anti-apoptotique d'ANT4 dans des cellules cancéreuses et l'intérêt d'ANT comme ciblethérapeutique anti-cancéreuse.Une augmentation de l'expression de protéines anti-apoptotiques, l'adaptation auxstress cellulaires et l'activation de voies de survie sont les mécanismes les plus fréquemmentdécrits pour expliquer la chimiorésistance du mélanome. A l'aide de modèles cellulaires, nousavons étudié la capacité de deux nouvelles molécules : Withaférine A (WFA) et Plumbagine(PBG) à stimuler l'apoptose et déterminé les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avonsmontré la capacité de WFA à induire spécifiquement la voie mitochondriale de l'apoptose decellules de mélanome par un mécanisme dépendant de la production d'espèces activées del'oxygène (EAO) qui déclenchent la voie mitochondriale et de la diminution du niveaud'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. En revanche, PBG induit une mortapoptotique et une mort nécrotique des cellules de mélanomes. Dans les deux cas, PBG agitpar l'augmentation des EAO suite au déclenchement d'un stress du reticulum endoplasmique.WFA et PBG sont donc deux molécules pro-oxydantes capables d'induire la mort des cellulesde mélanome en tirant partie de leur vulnérabilité au stress oxydant.Nos travaux ont participé à la mise en évidence d'une cible thérapeutique anticancéreusepotentielle et de deux agents capables d'induire la mort cellulaire dans un contextede chimiorésistance.

Les bactéries lactiques présentent un grand intérêt économique de par leur large utilisation dans l’industrie agroalimentaire. Parmi elles, Streptococcus thermophilus (ST) est d’une importance majeure puisqu’elle est la plus utilisée après Lactococcus lactis, pour la fabrication de produits laitiers fermentés et de fromages. De plus, cette bactérie est le seul streptocoque à bénéficier du statut GRAS (Generally Recognized As Safe). Outre son intérêt en industrie laitière, ST présente des effets bénéfiques sur la santé intestinale de l’Homme. Bien que ces effets soient largement documentés, le statut probiotique de ST reste encore à conforter. C’est pourquoi des études sont actuellement menées afin de sélectionner des souches de ST à fort potentiel probiotique. Parmi les critères importants figurent leur capacité à survivre aux conditions drastiques du tube digestif (TD) et leur capacité à adhérer aux cellules intestinales. Dans cette optique, les objectifs de cette thèse étaient d’étudier, dans un premier temps, la capacité d’adhésion in vitro de la souche ST LMD-9 à différentes lignées cellulaires intestinales d’origine humaine et d’évaluer la survie de cette souche au stress biliaire. Afin de mettre en évidence un rôle potentiel de certaines protéines de surface dans ces deux processus, trois mutants issus de cette souche et inactivés dans les gènes prtS (protéase pariétale), srtA (sortase A) et mucBP (protéine de liaison aux mucines), ont été inclus dans cette étude. Dans un second temps, l’impact de l’adhésion de LMD-9 a été analysé, d’une part sur l’expression de gènes codant certaines mucines dans les cellules eucaryotes, et d’autre part sur l’expression de gènes qui seraient spécifiquement induits durant le processus d’adhésion, ceci en utilisant la technologie R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology). Les résultats obtenus ont permis de montrer que la souche LMD-9 était capable de survivre jusqu’à une concentration de 3 mM en sels biliaires et que les protéines de surface PrtS, SrtA et MucBP seraient impliquées dans la résistance à ce stress. Nos résultats ont également montré que LMD-9 adhérait aux trois différentes lignées cellulaires, suggérant ainsi que la souche pourrait interagir avec les différentes mucines qu’elle peut rencontrer dans le TD. De plus, l’implication de certaines protéines de surface dans l’adhésion de LMD-9 s’est avérée dépendante des caractéristiques de ces lignées, qu’il s’agisse de cellules entérocytaires (Caco-2) ou productrices de mucus (HT29-MTX et HT29-CL.16E). Concernant l’impact de l’adhésion de la souche LMD-9 sur l’expression des gènes MUC2 et MUC5AC, aucun effet sur le taux de transcrits n’a été observé dans nos conditions expérimentales. Par ailleurs, nos résultats ont permis, pour la première fois, d’identifier les gènes spécifiquement induits dans la souche LMD-9 durant l’adhésion aux cellules épithéliales. Nous avons ainsi montré que l’adhésion de la souche LMD-9 ne dépend pas uniquement des protéines de surface, mais d’autres fonctions et voies métaboliques seraient également impliquées. Ce travail de thèse contribue ainsi à apporter de nouvelles connaissances liées (i) au choix du modèle cellulaire dans les études d’adhésion bactérienne in vitro, (ii) à l’aptitude de la souche LMD-9 à survivre au stress biliaire en faisant intervenir certaines protéines de surface et (iii) à la compréhension des mécanismes moléculaires de l’adhésion de LMD-9 aux cellules épithéliales intestinales
Lactic acid bacteria are of great economic interest because of their use in the food industry. Among them, Streptococcus thermophilus (ST) is of major interest since it is the most used after Lactococcus lactis, for the manufacture of fermented dairy products and cheese. In addition, this bacterium is the only streptococcus to benefit from GRAS status (Generally Recognized As Safe). Beside its interest in the dairy industry, ST has beneficial effects on human intestinal health. Although these effects are widely documented, the probiotic status of ST remains to be consolidated. Therefore, studies are currently being conducted in order to select strains of ST with a high probiotic potential. Among criteria that are important to select ST strains include their ability to survive stress the drastic conditions of the digestive tract (DT) and their ability to adhere to intestinal cells. In this context, the aim of this thesis was to investigate firstly the in vitro adhesion capacity of the ST LMD-9 strain to different human intestinal cell lines and to evaluate the survival of this strain to bile salt stress. In order to highlight the potential role of some surface proteins in these two processes, three mutants derived from this strain and inactivated in the genes prtS (parietal protease), srtA (sortase A) and mucBP (Mucin Binding-protein) were also included in this study. Secondly, the impact of LMD-9 adhesion was analyzed, on one hand on the expression of some mucin-encoding genes in eukaryotic cells, and on the other hand on the expression of genes that would be specifically induced during adhesion process using the R-IVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) approach. The results obtained demonstrated the ability of LMD-9 to survive up to the concentration of 3 mM of bile salts and that the PrtS, SrtA and MucBP surface proteins would be involved in the resistance to this stress. Our results also showed that the LMD-9 strain was capable of adhering to three cell lines used suggesting that this strain could interact with different mucins that may encounter in the DT. Moreover, the involvement of some surface proteins in the adhesion of LMD-9 has been found to be dependent on the surface characteristics of these cell lines, whether they are enterocytic (Caco-2) or mucus-secreting cells (HT29-MTX and HT29-CL.16E). Regarding the impact of LMD-9 adhesion on MUC2 and MUC5AC gene expression, no effect has been observed on the transcript level under our experimental conditions. Furthermore, for the first time, our results allowed us to identify genes specifically induced in the LMD-9 strain during adhesion process to epithelial cells. We have thus shown that the LMD-9 adhesion does not depend solely on surface proteins, but other functions and metabolic pathways are also involved. This thesis work contributes thus to new knowledge related to (i) the choice of the cellular model in in vitro bacterial adhesion studies, (ii) the ability of LMD-9 to survive bile salt stress by involving some surface proteins and (iii) understanding the molecular mechanisms of LMD-9 adhesion to epithelial cells

OBJECTIFS : Le Bortezomib (Velcade©) est un inhibiteur de protéasome présentement utilisée en chimiothérapie pour soigner les cas de myélomes multiples et de lymphomes. Les tumeurs solides sont souvent résistantes à ce type de traitement. Mon laboratoire d’accueil à récemment déterminé que le traitement de cellules cancéreuses issues de tumeurs solides avec le Bortezomib induit une réponse de stress caractérisée par la phosphorylation du facteur d’initiation à la traduction eIF2α. Cette phosphorylation est médiée par une protéine kinase, nommée Heme Regulated Inhibitor (HRI). La phosphorylation du facteur eIF2α par HRI occasionne la formation de granules de stress (GS); corps cytoplasmiques renfermant les protéines ribosomales, les ARNms, et des molécules de signalisation. La formation des GS est associée à une résistance à la mort cellulaire induite par différents types de stress, tels qu’un choc oxydatif, l’hypoxie ou les radiations. Nous avons ainsi impliqué la formation des GS dans la résistance des cellules cancéreuses au Bortezomib. En effet, nous avons démontré que la suppression des GS en interférant avec l’expression d’HRI sensibilisait les cellules cancéreuses au traitement de Bortezomib. Ce résultat dénote aussi un nouveau rôle potentiel de HRI dans la chimiorésistance. Mon projet consistait donc à tester cette hypothése in vivo en utilisant des cellules cancéreuses déplétées de manière stable en HRI. MÉTHODES : D’abord, en surexprimant de manière transitoire la protéine HRI grâce à un plasmide GFP-HRI, nous avons pu évaluer l’effet de sa surexpression sur la viabilité cellulaire. D’autre part, en créant des lignées stables exprimant des Small hairpin RNA (shRNA) dirigés contre l’ARNm HRI, nous avons pu étudier l’effet de l’absence de cette kinase sur la physiologie cellulaire et ce, en condition normale et en condition de traitement au Bortezomib. RÉSULTATS : La surexpression de la protéine HRI cause l’induction de granules de stress dépendant de la phosphorylation du facteur eIF2α. Ce résultat valide nos résultats de déplétion démontrant un rôle majeur de HRI dans la formation des GS en condition de Bortezomib via la phosphorylation de son substrat eIF2. De façon surprenante, nous avons également constaté une morphologie cellulaire ainsi qu’un taux de croissance différents en condition non traitée, comparativement aux contrôles shRNA non effecteurs. Ceci suggère un rôle nouveau de HRI dans la croissance cellulaire, indépendamment de la phosphorylation d’eIF2a. L’injection sur la membrane chorioallantoique d’un fœtus de poulet (in ovo) de cellules cancéreuses déplétées en HRI occasionne une diminution de développement tumoral. Inversement, on observe la formation d’une masse apparente pour les contrôles non effecteurs et ce, toujours en condition non traitée. Ceci suggère donc un rôle de HRI dans la croissance tumorale. CONCLUSION : La kinase HRI est impliquée dans la résistance des cellules cancéreuses à la mort cellulaire engendrée par le Bortezomib, mais semble également jouer un rôle physiologique dans la croissance tumorale.

La physiopathologie artérielle comprend différentes pathologies telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hyperplasie intimale qui sont caractérisées par un remodelage artériel en réponse à différents stress environnementaux. Mon travail de thèse s'est intéressé à décrire les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu en réponse à un stress artériel dans des modèles murins et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention des dommages artériels. Ainsi, nous nous sommes intéressés au rôle d'une isoforme particulière de la famille des phosphoinositide 3-kinase, la PI3Ky. Cette protéine est largement exprimée dans le compartiment hématopoïétique, où son activité catalytique intervient dans l'inflammation de la paroi artérielle, mais elle est également présente à de plus faible niveau dans les CML et les CE. Associée à son rôle catalytique largement impliqué dans la migration et la libération de facteurs inflammatoires, la PI3Ky a été décrite comme ayant des fonctions non-catalytiques, dite " d'ancrage ", activant des phosphodiestérases (PDE). Ainsi, en utilisant deux modèles murins génétiquement modifiés pour la PI3Ky, l'un délété pour la PI3Ky (PI3KyKO pour knockout) et l'autre exprimant une forme inactive de la PI3Ky (PI3KyKD pour kinase dead) nous avons pu évaluer le rôle des 2 fonctions dans des modèles murins de lésions artérielle. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle non-catalytique de la PI3Ky dans les CML. A partir d'un modèle murin de remodelage artériel induit par un stress hypertenseur nous avons observé que l'hyperplasie médiale des CML est dépendante de la PI3Ky, mais indépendante de son activité catalytique. In vitro à partir de cultures primaires de CML de souris nous avons démontré que la PI3Ky régule l'activité des PDE indépendamment de son activité, limitant les taux intracellulaires d'AMPc qui est un puissant frein de la prolifération des CML. Ces modèles nous ont aussi permis de tester une stratégie thérapeutique originale utilisant un peptide perméant inhibant l'interaction PI3Ky/PDE. Ce peptide est capable de prévenir à la fois la prolifération des CML in vitro mais aussi l'hyperplasie médiale in vivo. Dans un deuxième temps, nous avons étudié comment l'activité PI3Ky inflammatoire, inhibe la cicatrisation endothéliale suite à une lésion endovasculaire. A l'aide de différents modèles in vivo et ex vivo de réendothélialisation chez la souris, nous avons pu observer que suite à une lésion vasculaire l'activité de PI3Ky des lymphocytes T induit la sécrétion d'IFNy, entrainant une production locale de CXCL10 par les CML. Cette chimiokine va directement inhiber la cicatrisation endothéliale, indépendamment du compartiment immun. Ces travaux ont permis d'une part de démontrer que l'inhibition de la PI3Ky représentait une stratégie thérapeutique envisageable dans les complications de l'angioplastie mais ont également permis de montrer les mécanismes d'interactions cellulaires complexes mis en jeu lors d'une agression artérielle. Ils ont notamment permis de démontrer un rôle central de la CML agissant comme un relai entre l'inflammation adventitielle et l'endothélium. L'ensemble de ces données a pu mettre en avant une double fonction de la PI3Ky dans les processus de réponse à un stress inflammatoire ou hémodynamique. D'une part, son rôle pro-inflammatoire contrôlé par son activité catalytique, responsable d'une inhibition de la cicatrisation endothéliale via l'activation des CML. D'autre part, son rôle non-catalytique dans les CML, modulant leur prolifération via la signalisation de l'AMPc. Ces travaux permettent d'envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant d'une part à inhiber son activité en utilisant des inhibiteurs hautement spécifiques pour cette isoforme et d'autre part des peptides capables de bloquer le rôle non catalytique de la PI3Ky
Cardiovascular diseases represent the first cause of death worldwide and a large part of them concerns different arterial disorders as hypertension, atherosclerosis, intimal hyperplasia and aneurism. All of these diseases are characterized by arterial remodeling resulting in a complex collaboration between environment and arterial physiology participants: Blood flow, endothelial cells (EC), smooth muscle cells (SMC) and arterial inflammation. In this context, this thesis project is interested in y-isoform of phosphoinositide 3-kinase (PI3Ky). PI3Ky is largely expressed in hematopoietic compartment where its catalytic activity drives arterial wall inflammation, but it is also lower expressed in cardiovascular system such as SMC and EC. Moreover, in addition to catalytic function implicated in chemoattraction and release of inflammatory mediators, PI3Ky has been described to activate phosphodiesterases (PDE) activity, through a non-catalytic "docking" function. At first, this work studied studied non-catalytic docking function of PI3Ky in SMC. Using hypertension-induced arterial remodeling in mice showed that SMC hyperplasia was dependent of PI3Ky protein expression but independent of its activity. Further, in vitro exploration with primary-SMC from mice aorta highlighted that PI3Ky activates PDE independently of its catalytic function, which promotes SMC proliferation by hydrolysis of an anti-mitotic second messenger: the cyclic-AMP. In the same approach, we tested original therapeutic strategy using a permeant-peptide which inhibits PI3Ky/PDE interaction. This permeant-peptide showed good efficiency to prevent both in vitro SMC proliferation and in vivo arterial SMC hyperplasia. The second part of this work how PI3Ky activity in inflammatory cells modulates endothelial healing following endovascular injury. Using in vivo and ex vivo models of arterial de-endothelialization in mouse, we observed a cellular cross talk in arterial wall between T-cells, SMC and EC. PI3Ky activity in T-cells promotes IFNy secretion following arterial injury which indirectly decreases re-endothelialization through a local secretion of CXCL10 by SMC. Indeed, CXCL10 directly inhibits endothelial healing independently of immune compartment. Our findings provide a new promising target to promote endothelial repair and therefore prevent cardiovascular events following endovascular intervention.Altogether, these works unravel an interesting dual function of PI3Ky in arterial stress response. In one hand, catalytic function of PI3Ky drives inflammatory-induced inhibition of endothelial healing, and in other hand, non-catalytic function controls SMC proliferation via inhibition of cyclic-AMP pathway

L'androgenese permet de produire des plantes haploides doublees (hd) apres obtention des plantes haploides et doublement de leur stock chromosomique. L'origine haploide et unicellulaire des microspores en font une cible de choix pour la transformation genetique. Le travail realise a pour objectif l'utilisation de l'androgenese pour l'amelioration des bles par deux voies : la transformation genetique et l'obtention de plantes hd resistantes a la secheresse. Dans une premiere partie, nous avons examine l'effet des facteurs externes conditionnant l'embryogenese et l'obtention de plantes hd aussi bien par culture d'antheres que par culture de microspores isolees chez le ble dur et le ble tendre. Nos travaux ont permis de demontrer les resultats suivants : -le pretraitement au froid a un effet negatif sur la production d'embryons chez les genotypes utilises dans notre experimentation. -le traitement a la colchicine sur embryons in vitro (500 mg/l) pendant 1 ou 3 jours permet d'atteindre des taux de doublement chromosomique eleves, mais diminue fortement la regeneration des embryons formes. -une concentration elevee de maltose (135 g/l) dans le milieu d'induction diminue la production d'embryons a partir de microspores isolees de ble. -en l'absence de pretraitement (thermique ou nutritionnel), une centrifugation sur gradient de ficoll n'a pas d'effet sur l'embryogenese a partir des microspores isolees. -il existe une interaction genotype-ovaires lors de la culture de microspores isolees. En tenant compte des resultats obtenus, nous avons, dans une deuxieme partie, procede a la transformation genetique, par biolistique. Des embryons haploides et des microspores isolees de ble ont ete bombardes, en utilisant comme marqueurs, les genes c1 et b-peru stimulant la biosynthese des anthocyanines. Une expression transitoire a ete mise en evidence au niveau des microspores bombardees apres un ou huit jours de culture. Le bombardement n'a eu aucun effet sur la regeneration des embryons androgenetiques et des plantes chimeriques ont ete obtenues. L'etude de 60 lignees hd obtenues a partir des plantes f1 provenant du croisement entre les deux genotypes pavon et siete cerros, resistantes et sensibles a la secheresse montre l'existence de lignees transgressives, presentant des caracteres agronomiques et physiologiques de resistance au stress hydrique, meilleurs que ceux de leur deux parents.

Une des principales causes d’échec dans le traitement des cancers est le développement de résistances aux drogues par les cellules tumorales. Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont suspectées d’être responsables de ces rechutes, conduisant à la récurrence de la maladie et bien souvent au décès des patients. En clinique, il est donc nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques capables de cibler ces CSC résistantes et aboutir à la guérison des patients. Les CSC sont régulées par un ensemble de signaux aussi bien biologiques que physiques au sein de la niche tumorale. Mon projet a pour objectif de déterminer l’implication du microenvironnement tumoral (voie de signalisation BMP et contraintes mécaniques) dans le maintien et la résistance des cellules souches leucémiques (CSLs) de la leucémie myéloïde chronique (LMC). Pour cela, nous avons combiné tests fonctionnels et moléculaires ainsi que l’analyse de la niche tumorale sur plus de 200 échantillons de patients atteints de LMC. Nous avons ainsi démontré que l’altération de la voie BMP intrinsèque aux cellules immatures de la LMC corrompt et amplifie la réponse à BMP2 et BMP4, présents en quantités anormalement abondantes au sein de la niche tumorale. Ces résultats récemment publiés dans Blood nous ont amenés à évaluer le rôle de la voie BMP dans le maintien des CSLs sous traitement par les ITK. La microscopie à force atomique nous a permis de démontrer que l’expression de BCR-ABL est suffisante pour induire une augmentation de la rigidité des cellules immatures de LMC par rapport à des cellules saines. Enfin, l’utilisation d’un système de confinement cellulaire nous a permis de démontrer que le stress mécanique contrôle la prolifération des cellules leucémiques immatures en régulant l’expression de gènes mécano-sensibles comme Twist-1. Ces résultats pourraient expliquer comment des CSLs tirent profit des contraintes mécaniques issues de leur microenvironnement afin d’acquérir un avantage prolifératif par rapport aux cellules saines. Ultimement, nous espérons que cette approche transdisciplinaire permettra d’identifier les molécules clés de la transduction de signaux mécaniques potentiellement impliqués dans le maintien et la résistance des CSC et ainsi proposer de nouvelles cibles pour contrer ces effets
One of the main causes of treatment failure in cancers is the development of drug resistance by cancer cells. The persistence of cancer stem cells (CSCs) might explain cancer relapses as they could allow reactivation of cancer cells proliferation following therapy, leading to disease persistence and ultimately to patients’ death. Clinically, it is crucial to develop therapeutic strategies able to target resistant CSCs in order to cure the patients. CSCs are controlled by a variety of biochemical and biomechanical signals from the leukemic niche. My project aims to determine the involvement of the tumor microenvironment (BMP signaling pathway and mechanical stress) in the maintenance and resistance of Leukemic Stem Cells (LSCs) in Chronic Myelogenous Leukemia (CML). For this, we combined functional and molecular assays to the analysis of tumor microenvironment on more than 200 CML patients’ samples. We demonstrated that alterations of intracellular BMP signaling pathway in CP-CML primary samples corrupt and amplify the response to exogenous BMP2 and BMP4, which are abnormally abundant in the tumor microenvironment. These results, recently published in Blood led us to evaluate the role of the BMP pathway in LSC maintenance under TKI treatment. Atomic force microscopy allowed us to demonstrate that BCR-ABL expression alone is sufficient to increases the rigidity of immature CML cells compared to healthy ones. Finally, using a unique cell confining system, we were able to demonstrate that mechanical stress controls the proliferation of immature leukemic cells by regulating the expression of mechano-sensitive genes such as Twist-1. These results could explain how LSCs can benefit from a mechanical stress exerted by their microenvironment to acquire a proliferative advantage over normal cells. Ultimately, we hope that this transdisciplinary approach will help to identify key molecules in the transduction of mechanical signals potentially involved in maintenance and resistance of CSCs and thus offer new targets to counter these effects

Raisonnement: Les mécanismes post-transcriptionnels occupent une place importante au sein de la régulation de l’expression génique. L’expression génique est cruciale au bon développement de la cellule, mais également à sa survie. L’altération des mécanismes post-transcriptionnels fait maintenant l'objet de nombreuses études sur la cause ou la conséquence de différentes pathologies humaines telles que le cancer. Récemment, les Granules de Stress (GS) ont été trouvées à agir comme un nouveau mécanisme post-transcriptionnel, qui permet à la cellule de survivre en conditions de stress. Résultats: Notre étude démontre pour la première fois, la formation de GS dans les cellules cancéreuses traitées avec un agent chimiothérapeutique. De cela, nous avons élucidé un sentier spécifique de formation des GS en réponse au Bortézomib (Bz). Nous avons montré que cet inhibiteur de protéasome réduit l’initiation de la traduction via la phosphorylation du facteur de l’initiation de la traduction (eIF2). Cette phosphorylation d’eIF2 se produit via l’activation de la kinase de stress HRI (Heme-Regulated kinase). La suppression de la voie de phosphorylation d’eIF2-GS via la déplétion de HRI favorise une mort cellulaire accrue chez les cellules cancéreuses traitées au Bz. Ces données révèlent donc un rôle important pour HRI dans la résistance des cellules cancéreuses face au Bz, en partie par l’entremise de sa capacité à réguler la formation de GS. Pour faire suite à cette étude, nous décrivons que le facteur anti-apoptotique p21 est séquestré à l’intérieur des GS qui sont induites par le Bz. L’emprisonnement de l’ARNm p21, hautement instable, à l’intérieur des GS permet à cet ARNm d’être protégé, stabilisé et donc accumulé. Nous démontrons que la protéine de liaison à l’ARN, CUGBP1, est responsable de la localisation de l’ARNm p21 à l’intérieur des GS en réponse au Bz. Après un traitement prolongé de Bz, les GS sont désassemblées et ainsi relâchent une grande quantité d’ARNm p21 qui devient alors disponible pour être traduite. Cette traduction massive de p21 apporte alors un élan anti-apoptotique à la cellule cancéreuse ce qui lui permet de survivre au traitement chimiothérapeutique de Bz. Conclusions et perspectives: En somme, ces études décrivent une nouvelle voie spécifique de survie cellulaire qui implique un rôle potentiel pour les GS dans le cancer et qui pourrait être ciblée en thérapie. En perspective, des tumeurs xénogreffes chez la souris seront utilisées pour tester si (i) la suppression des GS via l’inactivation de HRI, et (ii) l’inactivation de la voie CUGBP1-p21, qui est régulée par les GS, sensibiliseraient les tumeurs au Bz, validant ainsi notre modèle in vivo. Ces études apporteraient des preuves de concept pour le développement de nouvelles stratégies ciblant les voies associées au GS et qui pourraient être utilisées en thérapie combinatoire pour diminuer le risque de résistance face au traitement de Bz.
Rationale: Post-transcriptional mechanisms play an important role in the regulation of gene expression. Gene expression is crucial for the proper development of the cell but also for its survival. The alteration of post-transcriptional mechanisms is now the subject of numerous studies on the cause, or on the consequence, of various human diseases such as cancer. Recently, Stress Granules (SG) have been found to act as a new post-transcriptional mechanism, which allows the cell to survive in stress conditions. Results: Our study demonstrates for the first time, the formation of SGs in cancerous cells, in response to a chemotherapeutic agent. From this we have elucidated a specific pathway of SG formation in response to Bortezomib (Bz). We demonstrate herein that this proteasome inhibitor reduces translation initiation via the phosphorylation of the initiation factor (eIF2). This phosphorylation of eIF2 is controlled through the activation of the heme-regulated kinase (HRI). The alteration of the pathway phospho-eIf2-SG, through depletion of HRI, causes massive cellular death in Bz treated cancerous cells. These data thus reveal a crucial role for HRI in the resistance of cancerous cells against Bz, in part via its capacity to regulate SG formation. Furthermore, we describe the anti-apoptotic factor p21 to be trapped inside Bz-SGs. This sheltering of the highly unstable p21 mRNA allows this one to be protected from degradation, which can be stabilized and accumulated. We also demonstrate, herein, that the RNA-binding protein CUGBP1 acts as a factor responsible for the localization of the p21 mRNA inside Bz-SGs. After prolonged treatment of Bz, SGs disassemble and release a high dose of p21 mRNA that becomes available for translation. This massive translation of anti-apoptotic p21 gives a boost to the cell that allows it to survive the stress. Perspectives and Conclusion: In sum, our studies describe a new specific pathway of cell survival that implies a potential role for SGs in cancer, which could be targeted in therapy. In perspective, xenograft tumors in mice will be used to test if (i) the inhibition of SG formation via the inactivation of HRI, and (ii) the inactivation of the CUGBP1-p21 pathway that is regulated by SGs, can both sensitize tumors to Bz treatment thus validating our model in vivo. These studies will provide us with a proof of principle for the development of new strategies targeting SG-associated pathways. Combinatorial therapies implicating the termination of such pathways could be developped in order to reduce the risk of recurrence against Bz.

La cellule vivante est en permanence exposée à divers types de stress pouvant endommager ses composants. Quand les dommages induits sont détectés, des mécanismes de défense sont activés pour les maîtriser tout en gérant au mieux les ressources énergétiques disponibles et nécessaires au bon fonctionnement cellulaire. Si le stress est trop sévère et que le système ne peut se défendre, la mort sera inévitable. La réponse cellulaire au stress est orchestrée par des réseaux de signalisation intracellulaires qui présentent une complexité extraordinaire. Les espèces moléculaires constituant ces réseaux assurent des tâches diverses à travers des réactions biochimiques, formant des machineries de processus biologiques synchronisées. Notre approche dans cette thèse pour l’étude de ces réseaux consiste à les modéliser mathématiquement pour reproduire un phénomène observé et repérer ses acteurs clés, analyser leurs réactions en réponse à différents signaux, et éventuellement réaliser des prédictions assez précises et expérimentalement vérifiables qui peuvent se montrer d’une extrême utilité pour les applications thérapeutiques. Dans nos travaux, nous nous focalisons sur le stress thermique et sur la réponse cellulaire qui en résulte en termes de dynamique des espèces moléculaires impliquées, mais également de destin cellulaire (mort ou survie) à l’issue de l’exposition, nous abordons cette problématique par des modèles dynamiques décrivant la cinétique biochimique des variables du système en conséquence d’une variation de la température. Dans un premier temps, nous démontrons à travers des simulations, suivies par une validation expérimentale, que la forme temporelle du stress thermique impacte considérablement la survie cellulaire. Ce premier résultat met en évidence un mécanisme de saturation des espèces réparatrices en conséquence d’une exposition à des températures élevées. Dans un second temps, nous étudions la potentielle corrélation entre une variabilité introduite sur les niveaux de deux protéines du réseau de réponse au choc thermique et le phénomène de mort fractionnelle. Selon les prédictions de notre modèle, la variabilité des protéines chaperons (espèces réparatrices) mesurée expérimentalement ne suffit pas à elle seule à expliquer la mort fractionnelle, qui doit impliquer d’autres sources de variabilité. Enfin, une analyse des courbes iso-effet générées à l’aide d’un modèle générique de la réponse cellulaire aux stress transitoires nous montre l’existence de quatre régimes de sensibilité en fonction des paramètres durée-intensité du stress ainsi que des paramètres du réseau et de ses échelles de temps. Nos travaux soulignent le potentiel et l’utilité des modèles de réseaux dynamiques dans la caractérisation des courbes dose-effet
The living cell is constantly exposed to various types of stress that can damage its components. When the induced damages are detected, defense mechanisms are activated to repair them while optimally managing the energy resources available and necessary for cell function. If the stress is too severe and the system can not defend itself, death will be inevitable. The cellular response to stress is orchestrated by intracellular signaling networks that are extraordinarily complex. The molecular species constituting these networks perform various tasks through biochemical reactions, forming synchronized biological process machineries. Our approach in this thesis for the study of these networks is to model them mathematically to reproduce an observed phenomenon and identify its key players, analyze their reactions in response to different signals, and possibly make precise enough and experimentally verifiable predictions that can be of an extreme utility for therapeutic applications. In our studies, we focus on thermal stress and on the resulting cellular response in terms of the dynamics of the molecular species involved, but also of cell fate (death or survival) at the end of the exposure, we adress those questions by dynamic models describing the biochemical kinetics of system variables as a consequence of temperature variation. In a first step, we demonstrate through simulations, followed by experimental validation, that the temporal form of heat stress significantly impacts cell survival. This first result highlights a mechanism of saturation of the repair species as a consequence of exposure to high temperatures. In a second step, we study the potential correlation between a variability introduced on the levels of two proteins in the heat shock response network and the phenomenon of fractional killing. According to our model predictions, experimentally measured chaperone proteins (repair species) variability alone is not sufficient to explain fractional killing, which must involve other sources of variability. Finally, an analysis of the isoeffect curves generated by a generic model of the cellular response to transient stress shows the existence of four sensitivity regimes depending on the duration-intensity parameters of the stress as well as on the parameters of the response network and its time scales. Our work highlights the potential and utility of dynamic network models in the characterization of dose-response curves

Comme décrit dans la partie But du Travail, les tumeurs gliales sont particulièrement agressives d’un point de vue clinique. Le glioblastome, qui correspond au grade de malignité le plus élevé des gliomes, est associé à un pronostic très sombre car aucun patient atteint de ce cancer n’a pu être guéri à ce jour. Ces tumeurs envahissent de manière diffuse (par essaimage de cellules tumorales isolées) le parenchyme cérébral, ce qui empêche une résection chirurgicale complète de la tumeur. De plus, les cellules tumorales gliales d’origine astrocytaire sont souvent résistantes à l’apoptose et donc aux thérapies adjuvantes telles que la chimiothérapie et la radiothérapie. La galectine-1 est une petite protéine intervenant directement dans les processus migratoires des cellules gliales tumorales. Nous avons donc poursuivi la caractérisation des rôles biologiques que pourrait exercer la galectine-1 au sein des gliomes.

Nous avons tout d’abord montré que la galectine-1 est impliquée dans la chimiorésistance des gliomes. En effet, nous avons démontré que la diminution du taux d’expression de la galectine-1, au moyen d’un siRNA au sein d’un modèle de gliome expérimental, permet d’augmenter le bénéfice thérapeutique du témozolomide in vivo sans toutefois induire d’apoptose, d’autophagie ou de perméabilisation de la membrane des lysosomes. Nous avons également montré que la diminution du taux d’expression de la galectine-1 au sein de ce modèle de gliome expérimental affecte les processus d’angiogenèse in vivo et de « vasculogenic mimicry » in vitro. Nous avons identifié la protéine ORP150 comme l’une des principales cibles de l’effet pro-angiogénique de la galectine-1, sachant que la protéine ORP150 contrôle la maturation du facteur VEGF. Nous avons ensuite montré que le rôle de la galectine-1 dans la chimiorésistance des gliomes et dans l’angiogenèse est directement lié à l’implication de la galectine-1 dans le processus de réponse au stress du réticulum endoplasmique. Via ce processus, la galectine-1 modulerait l’expression d’un certain nombre de gènes tels que ATF3, DUSP5 et HERP, qui sont impliqués dans la chimiorésistance et des gènes tels que ORP150 et MDG1 qui sont impliqués dans l’angiogenèse.

Enfin, nous avons également montré que la galectine-1 régule l’expression du gène BEX2 et que celui-ci joue un rôle important dans la biologie des gliomes, notamment dans les processus d’angiogenèse et de migration cellulaire.

En conclusion, notre travail suggère que l’étiquette « biomarqueur » pourrait être attribuée à la galectine-1 pour qualifier l’agressivité biologique des gliomes malins et que la galectine-1 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans le combat contre les gliomes malins en général, et le glioblastome en particulier.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les composés hydrophobes sont connus comme des sources de carbone qui peuvent être utilisées par les levures comme Yarrowia lipolytica pour de multiples applications. Ces composés causent parfois des perturbations aux levures mais sont aussi rapportés comme conférant aux cellules une certaine résistance contre les stress environnementaux. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié le rôle de l'oléate de méthyle comme source de carbone sur la résistance de la levure Y. lipolytica en réponse au choc d'un composé amphiphile, la -dodécalactone, et au stress thermique. Les résultats obtenus montrent que les cellules ayant poussé sur oléate sont beaucoup plus résistantes au choc lactone ainsi qu'au stress thermique que les cellules ayant poussé sur glucose. L'action de la lactone se trouve au niveau de la membrane où elle cause une fluidification membranaire et une déplétion de stérols qui sont considérés comme la cause de la mort cellulaire. Ce travail met en évidence le rôle des corps lipidiques dans la réponse cellulaire qui se manifeste de différentes manières en réponse à ces stress. Une accumulation des corps lipidiques est importante pour la résistance de la cellule aux stress. Les cellules ayant poussé sur glucose transforment leur stérol libre en esters de stéryle pour former les corps lipidiques en réponse au choc lactone, ce qui augmente leur sensibilité. Tandis que les cellules ayant poussé sur oléate qui ont accumulé des corps lipidiques pendant leur croissance ont tendance à convertir leurs esters de stéryle en stérol libre pour compenser la déplétion de stérol membranaire causée par la lactone ce qui diminue leur sensibilité. L'homéostasie de l'ergostérol, liée à la présence de corps lipidiques, semble donc jouer un rôle clé dans la résistance cellulaire à ces stress. Ce travail relève aussi que la présence de lipides modifie le processus de mort cellulaire programmée de Y. lipolytica en réponse à un stress thermique.

La prolifération bactérienne requiert la coordination entre les grands processus du cycle cellulaire qui sont la réplication et la ségrégation de l’ADN, l’élongation et la division cellulaire. Durant leur vie, les bactéries sont exposées à différents stress endogènes ou exogènes (antibiotiques, pH, manque de nutriments…) qui peuvent perturber le cycle cellulaire. Ces conditions défavorables activent alors une réponse cellulaire qui vise à améliorer la survie aux stress. Chez E. coli, la formation de cassures sur le chromosome induit la réponse SOS qui inhibe la division des cellules. Dans ce contexte, la bactérie continue à s’allonger ce qui aboutit à la formation d’une cellule filamenteuse. La filamentation a longtemps été considérée comme un symptôme de mort cellulaire, mais des études récentes suggèrent qu’il s’agirait plutôt d’un changement de morphologie transitoire qui améliorerait la survie en conditions défavorables. L’objectif principal de cette thèse est de caractériser le processus de filamentation et surtout le redémarrage de la division du filament, permettant un retour à une croissance normale de la bactérie. J’ai pour cela mis en place une approche combinant la microscopie en cellules vivantes en chambre microfluidique, la cytométrie en flux, la microbiologie traditionnelle et la génétique bactérienne. L’association de ces techniques constitue une approche globale permettant de caractériser l’effet d’un stress sur la viabilité, la morphologie et le contenu en ADN des bactéries, et ce de la cellule unique à l’échelle de la population. Cette approche a permis de décrire comment les cellules filamenteuses se divisent rapidement en cellules viables et de comprendre comment cet état de différenciation cellulaire transitoire et réversible constitue une stratégie efficace de survie aux stress. Par ailleurs, l’expertise développée au cours de ces travaux m’a permis d’être impliqué dans l ‘étude du transfert de gène de résistance à la tétracycline par conjugaison bactérienne. Ces mêmes expertisent ont aussi permis la caractérisation de l’effet de biocides induisant la réponse aux stress de l’enveloppe et la visualisation de l’effet de la production chez E. coli de deux toxines prédites pour être impliquées dans un système d’inhibition de croissance contact-dépendant chez A. baumannii
Bacterial growth requires coordination between the main cell cycle processes that are DNA replication and segregation, elongation and cell division. During their life, bacteria are exposed to different endogenous or exogenous stresses (antibiotics, pH, nutrients starvation…) that can disturb the bacteria cell cycle. Those hostile life conditions trigger a cellular response aiming at improving survival in stress conditions. In E. coli, DNA breaks induce the SOS response that inhibits cell division while the bacteria continue to elongate, resulting in the formation of a filamentous cell. Filamentation has long been considered as a symptom of cell death, however recent studies suggest that this phenotype could instead be a transient morphology change improving the survival in hostile environments. The main objective of this thesis is to characterize the filamentation process, especially the restart of the filament division allowing to resume normal bacterial growth. To do so, I developped an approach combining live-cell microscopy in microfluidic chamber, flow cytometry, traditional microbiology technics and bacterial genetics. Association of those techniques constitutes a global approach allowing characterization of the stress effect on bacterial viability, morphology and DNA content, from the single cell to the population level. This experimental framework allowed to describe how filamentous cells quickly divide into viable cells, thus understanding how this transient and reversible cellular differentiation state constitute an efficient stress-survival strategy. Furthermore, the expertise I developed during this ph.D. project allowed me to be involved into the study of drug-resistance acquisition by gene transfer through bacterial DNA conjugation. Besides, I contributed to the characterization of the effects of biocides inducing envelop stress response and to the characterize the impact on E. coli of the production of Acinetobacter baumannii toxins predicted to be involved in contact-dependant growth inhibition

Le mélanome métastatique est une forme agressive de cancer évoluant rapidement du fait de résistances aux anticancéreux. Cette thèse étudie l’hypothèse que des molécules purifiées de plantes ou microalgues marines peuvent améliorer l’efficacité de médicaments anti-mélanome en sensibilisant les cellules cancéreuses à la chimiothérapie. Après une revue des études consacrées à la chimiosensibilisation par des molécules naturelles, nous avons sélectionné des plantes du Brésil et de Nouvelle-Calédonie (Bixa orellana et Gardenia oudiepe) ainsi que des microalgues marines (Rhodomonas salina et Tisochrysis lutea) pour purifier des flavonoïdes et des caroténoïdes originaux et évaluer leur potentiel de chimiosensibilisation dans un modèle cellulaire de mélanome traité par la dacarbazine et le vemurafenib. Nos travaux sur les graines de B. orellana ont permis de détailler leur composition phytochimique, d’identifier deux nouveaux apocaroténoïdes et de démontrer le potentiel chimiosensibilisant de la Z-bixine par génération de ROS. Nous montrons également que la 5,7-dihydroxy-3,6,4'-triméthoxyflavone purifiée de G. oudiepe sensibilise les cellules de mélanome à la dacarbazine en perturbant le cytosquelette. Après avoir redéfini le profil pigmentaire de R. salina et T. lutea, nous avons développé un procédé de purification de la fucoxanthine par CPC et démontré son potentiel chimiosensibilisant ainsi que celui de l’alloxanthine. Ces résultats valident in vitro le concept de sensibilisation à la chimiothérapie par des caroténoïdes et flavonoïdes cytostatiques et contribuent à la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette chimiosensibilisation
Metastatic melanoma is an aggressive form of cancer that progresses rapidly due to resistance to anti-cancer drugs. This thesis studies the hypothesis that molecules purified from plants or marine microalgae can improve the efficacy of anti-melanoma drugs by sensitizing cancer cells to chemotherapy. After a review of studies devoted to chemosensitization by natural molecules, we selected plants from Brazil and New Caledonia (Bixa orellana and Gardenia oudiepe) as well as marine microalgae (Rhodomonas salina and Tisochrysis lutea) to purify original flavonoids and carotenoids and evaluate their chemosensitization potential in a melanoma cell model treated with dacarbazine and vemurafenib. Our work on B. orellana seeds allowed us to detail their phytochemical composition, to identify two novel apocarotenoids and to demonstrate the chemosensitizing potential of Z-bixin by ROS generation. We also show that 5,7-dihydroxy-3,6,4'-trimethoxyflavone, purified from G. oudiepe, sensitizes melanoma cells to dacarbazine by inducing cytoskeleton disruption. After redefining the pigment profile of R. salina and T. lutea, we developed a process for the purification of fucoxanthin by CPC and demonstrated its chemosensitizing potential as well as that of alloxanthin. These results validate in vitro the concept of sensitization to chemotherapy by cytostatic carotenoids and flavonoids and contribute to the understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in this chemosensitization

Un tiers des patients déprimés inclus dans les essais cliniques ne répondent pas à un traitement antidépresseur. La dérégulation de l’axe HPA et la réduction de la neurogènese hippocampique sont les principaux facteurs de la résistance aux antidépresseurs. L’objectif de ce travail est de développer un modèle de résistance à l’antidépresseur lié à l’axe HPA et d’utiliser ce modèle pour comprendre les mécanismes sous-jacents. Nos résultats suggèrent qu'une mauvaise régulation de rétrocontrôle négatif de l'axe HPA au début du protocole peut être un facteur prédictif de l'échec du traitement antidépresseur dans la dépression. Notre protocole montre que l’échec de la fluoxétine à induire des effets antidépresseurs a été associé à une mauvaise aptitude des composés à stimuler la prolifération des cellules dans le gyrus denté de l'hippocampe. D'autres études sont nécessaires pour étudier la relation de causalité entre ces phénomènes
One-third of depressed patients included in clinical trials do not respond to antidepressant treatment. Dysregulation of the HPA axis and reduced hippocampal neurogenesis are the main factors of resistance to antidepressants. The objective of this work is to develop a model of resistance to antidepressant related to the HPA axis and to use this model to understand the underlying mechanisms. Our results suggest that dysregulation of negative feedback of the HPA axis at the beginning of the protocol can be a predictor of antidepressant treatment failure in depression. Our protocol shows that the failure of fluoxetine to induce antidepressant effects was associated with poor ability of compounds to stimulate cell proliferation in the dentate gyrus of the hippocampus. Further studies are needed to investigate the causal relationship between these phenomena

Le travail présenté dans ce mémoire est une contribution à l’étude prospective des effetsprovoqués par des éléments traces métalliques (Zn, Cd et Pb) sur des suspensions cellulaires detomate (Solanum lycopersicum, L.). L’objectif principal de l’investigation est de démontrerl’implication de la paroi dans la réaction de défense des cellules contre le stress métallique à l’instarde celles qu’elles sont capables de développer contre les agressions biotiques.Le premier chapitre a consisté à caractériser des paramètres quantitatifs (croissance, hydratation) etqualitatifs (viabilité, réactivité enzymatique) pour mettre en évidence les effets généralement nocifscausés par l’introduction des éléments traces métalliques (ETM) dans les milieux de culture aumoment de la phase exponentielle de croissance. Outre la diminution de la croissance (arrêt et mortcellulaire), l’état physiologique des cellules, apprécié par leur perte de turgescence, témoigne de lacapacité de tolérance des cellules de tomate vis-à-vis du Zn, par rapport aux deux autres ETM.Le second chapitre a permis de montrer que les cellules de tomate se sont défendues contreles agressions métalliques en augmentant leur biomasse pariétale, notamment en présence de zinc.En outre, la paroi apparaît dans tous les cas comme le principal compartiment de séquestration desETM en excès. La comparaison entre les trois espèces métalliques montre que les parois des cellulesde tomate retiennent mieux le cadmium que le zinc et le plomb.Le troisième chapitre, consacré à l’étude de la composition osidique des parois dans unchamp expérimental réduit aux plus faibles doses de zinc, a fourni des données inédites,notamment à propos des pectines extraites ou non par les procédés employés (CDTA, EPGase). Lesrésultats (quantités et caractéristiques des extraits pectiques) ont été discutés en fonction destraitements subis par les cellules mais également avec le souci de trouver des explications à larétention du zinc dans la paroi et un schéma de structure hypothétique de la paroi a été proposé.En définitive, ce travail répond à la question posée initialement et apparaît comme unepréparation à caractère académique d’un projet environnemental d’utilisation des végétaux pour laphytoremédiation
The aim of this work was to evaluate the effects of heavy metals (Zn, Cd, Pb) on tomato(Solanum lycopersicum, L.) suspension-cultured cells. The main objective was to demonstrate thattomato cells subjected to metal stress react by modifying their cell walls as they can do in responseof a pathogen attack.In the first chapter, cell parameters were characterized with both quantitative(growth, water content) and qualitative (viability, enzymatic activities) aspects to highlightdeleterious effects of heavy metal (HM) when added in the culture medium during exponential cellgrowth. In addition to growth reducing (growth break, turgor pressure loss and cell death), tomatocells have showed higher tolerance capacity to Zn compared to Cd and Pb.The second chapter demonstrated that tomato cells were able to protect themselvesagainst HM stress by increasing their cell wall biomass and also the HM amount retained by cellwall polymers. Cell walls appeared to assume important roles in HM accumulation (Cd>Zn>Pb)and could therefore limit their influx into the cells. Our results also suggested that HM fixation bycell walls was not only due to an increase in cell wall biomass but also to an improvement of itsbinding capacity.The last chapter, devoted to study the osidic composition of tomato primary cell walls forthe lowest Zn doses, has provided original data particularly about pectins. Results have beendiscussed in order to understand the binding capacity of cell walls in function of Zn treatments.Then, an hypothetical structure of tomato cell wall of cultured cells has been proposed.Finally, this work has answered to the initial question and has constituted a preparativestudy for next phytoremediation projects

Parmi les acteurs moléculaires de la détoxication, les P-glycoprotéines (P-gp) constituent une première barrière refoulant des composés variés hors de la cellule. Ces protéines ont été initialement identifiées dans des tumeurs néoplasiques (phénotype MDR, Multi Drug Resistance). Ce concept a par la suite été étendu à la notion de phénotype MXR (Multi Xenobiotic Resistance), ensemble de mécanismes de défense des organismes contre les xénobiotiques. Dans les années 90, des travaux ont suggéré l'existence d'un dialogue entre l'activité MXR et la régulation du volume cellulaire. Le but de ce travail est de mettre en évidence les interactions entre les canaux chlorures osmorégulés et les mécanismes de détoxication MDR/MXR. Notre stratégie consiste à comparer les mécanismes MXR er MDR en terme d'activité enzymatique, de régulation, de viabilité/survie cellulaire et de modulation des courants osmorégulés, dans des cellules MCF-7, exprimant ou non la P-gp et des cellules de moule bleue
Among the molecular actors of cellular detoxification, P-glycoproteins (P-gp) represent a first line of defense against various toxic compounds. These proteins were first identified in neoplastic tumors (MDR phenotype, Multi Drug Resistance). This concept was the enlarged to MXR phenotype (Multi Xenobiotic Resistance), a set of defense mechanisms against toxins in aquatic organisms. In 90's, studies proposed that MXR was coupled to volume regulation. The aim of the study was to highlight cross regulations between osmoregulated chloride channels and MXR-MDR mechanisms in terms of enzymatic activity, regulation, cell viability and modulation of osmoregulated chloride currents, in MCF-7 cell line, expressing or not P-gp, and in primary-cultured cells of the blue mussel

Le mélanome est le cancer cutané le plus meurtrier. Il est issu de la transformation maligne des mélanocytes et se dissémine rapidement dans l'organisme sous forme de métastases. A ce stade, ce cancer est réfractaire à pratiquement toutes les thérapies. Ainsi, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc incontournable pour la mise en place de biothérapies spécifiques dans le mélanome. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au facteur de transcription E2F1 qui joue un rôle prépondérant dans le cycle cellulaire. Plus récemment, il lui a été identifié divers rôles dans les fonctions cellulaires. Ainsi, nous avons cherché à caractériser son implication dans le mélanome. Nous avons observé que E2F1 est faiblement exprimé dans les cellules saines de la peau. En revanche, elle est fortement exprimée dans le mélanome, et est corrélée à un mauvais pronostic clinique. Ainsi, nous avons montré que son inhibition réduisait la viabilité de cellules de mélanomes in vitro et in vivo dû à un arrêt du cycle cellulaire de la sénescence et d'une apoptose. Ces processus semblent être dépendants de la voie p53. Ce travail a permis de caractériser E2F1 comme une potentielle cible thérapeutique dans le mélanome non muté p53. En parallèle, nous avons initié une collaboration avec le Dr Slama-Schwok dont l'étude portait sur un composé appelé NS1, un inhibiteur de la NO-Synthase. Ce composé présente une activité anti-mélanome in vitro. En effet, il induit un stress du réticulum endoplasmique lui même conduisant à une autophagie partielle et une mort des cellules par apoptose. Ce projet ouvre de nouvelles perspectives pour le traitement du mélanome métastatique
Melanoma is the most deadly form of skin cancer. It originates from malignant transformation of melanocytes and quickly disseminates as metastasis through the body. At this stage, this cancer is refractory to almost all therapies. Thus, new therapeutic target identification is needed for setting up specific biotherapies against melanoma. In this context, we focused on E2F1 transcription factor which plays a critical role in cell cycle. Recently, it was also implicated in several cell functions. So we aimed at characterizing its implication in melanoma. We observed that E2F1 is weakly expressed in normal skin cells. On the contrary, it is strongly expressed in melanoma and its expression correlates with a bad clinical prognosis. We also showed that E2F1 inhibition decreased melanoma cell viability in vitro and in vivo, as a result of cell cycle arrest, senescence and apoptosis. These processes seem to depend on p53 pathway. With this work we characterized E2F1 as a potential therapeutic target in non-mutated p53 melanoma. In parallel, we initiated a collaboration with Dr Slama-Schwok for studying NS1 compound, a NO-synthase inhibitor. This compound presents an in vitro anti-melanoma activity. Indeed, it induces endoplasmic reticulum stress, which leads to partial autophagy and cell death by apoptosis. This work opens new perspectives for metastatic melanoma treatment

Dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), un taux élevé d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est connu pour favoriser la prolifération de blastes, alors qu’un niveau faible promeut la quiescence des cellules souches leucémiques. La faible oxygénation, ou hypoxie, de la niche médullaire pourrait contribuer à la chimiorésistance des LAM en diminuant le stress oxydatif. Les facteurs induits par l’hypoxie (HIF) sont impliqués dans le contrôle du métabolisme et des enzymes antioxydantes. Leur inhibition conduit à un stress et à la mort des cellules de LAM. Mon objectif était d’étudier un lien entre l’hypoxie, le métabolisme oxydatif et la chimiorésistance dans un modèle in vitro de culture de cellules de LAM. L’acquisition d’un profil hypoxique par les cellules souches hématopoïétiques (CSH), cultivées avec des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) médullaires, a été montré. Nous avons postulé que les cellules leucémiques pouvaient également l’acquérir en coculture avec des CSM humaines. Pour le démontrer, nous avons cultivé des cellules de LAM primaires ou de la lignée MV4-11 sur des CSM humaines primaires ou de la lignée HS-27a. A l’instar des CSH, nous avons identifié trois populations leucémiques en fonction de leur capacité d’adhésion sur les CSM : en suspension, adhérentes aux CSM et nichées dans les CSM. Les cellules nichées, les plus adhérentes, ont une plus forte expression du CXCR4 que les autres. Elles sont aussi plus résistantes de 2 à 7 fois à la cytarabine. Cependant, aucune modification du phénotype souche et des capacités clonogéniques, de repopulation ou de xénogreffe, n’a pu être associée aux cellules nichées comparées aux deux autres populations. En revanche, les cellules nichées présentent un profil hypoxique, une plus faible prolifération avec une augmentation de la phase G0, et de plus faibles niveaux de ROS en lien avec une masse mitochondriale diminuée. Ceci suggère donc un lien entre la chimiorésistance et l’hypoxie ou le métabolisme, plutôt qu’avec une capacité souche. Nous avons aussi montré que l’acriflavine, un inhibiteur non spécifique des HIF, pouvait avoir un effet synergique avec la cytarabine sur les cellules nichées chimiorésistantes. Nos résultats montrent que le surnageant ou le simple contact avec les CSM ne suffisent pas à induire le changement métabolique et la résistance à la cytarabine. Nous pensons que l’hypoxie dans la niche peut moduler le métabolisme oxydatif et donc la chimiorésistance par des mécanismes directs et/ou indirects via l’expression de CXCR4, montré récemment comme impliqué dans la régulation du stress oxydatif des CSH
In acute myeloid leukemia, a high level of ROS is known to favor blasts proliferation, whereas a low level promotes stem cells quiescence. The low oxygenation, or hypoxia, of the bone marrow niche could contribute to chemoresistance of AML cells by reducing the oxidative stress. Hypoxia-inducible factors (HIF) are involved in the control of the cell metabolism and antioxidant enzymes. HIFs inhibition leads to AML cells stress and death. The purpose of this work was to study a link between hypoxia, oxidative metabolism and chemoresistance in an in vitro model of leukemic cell culture. The acquisition of a hypoxic profile by hematopoietic stem cells (HSC) cultured with medullary mesenchymal stromal cells (MSC), has been shown. We hypothesized that AML cells may also acquire such profile in a coculture with human MSCs. To demonstrate that, we cultivated primary AML cells or the MV4-11 cell line on primary human MSCs or the HS-27a cell line. Like HSCs, we identified three leukemic populations according to their adhesion capacity to MSCs: in suspension, adherent to MSCs and embedded in MSCs. Embedded cells, the most adherent, have stronger CXCR4 expression compared to the others. They are also 2- to 7-fold more resistance to cytarabine. However, no change in the stem cell phenotype profile and in the clonogenic, repopulation or xenograft capacities, could be associated with the embedded cells compared to other populations. In contrast, embedded cells present a hypoxic profile, a weak proliferation with increased G0 phase, and lower ROS level that may rely on lower mitochondrial mass. This suggests that chemoresistance mainly relies on hypoxia or cell metabolism rather than a higher stem cell capacity. Furthermore, we have shown that acriflavine, a non-specific HIF inhibitor, could synergize with the cytarabine to eliminate embedded chemoresistant cells. Our results show that the MSC supernatant or a simple contact are not sufficient to induce metabolic change and resistance to cytarabine. We assume that hypoxia in the niche may modulate the oxidative metabolism and the chemoresistance by direct mechanisms and/or indirect ones through CXCR4 expression, a chemokine receptor shown to be involved in the regulation of the oxidative stress in HSC

Parmi les tumeurs cérébrales primaires, les gliomes sont les tumeurs les plus fréquemment rencontrées. Les glioblastomes (GBM) représentent 60 à 70% de ces tumeurs et malgré de récents progrès dans leur traitement, leur pronostic reste sombre. Les gliomes malins sont caractérisés par une prolifération cellulaire importante, un taux élevé de néo-angiogenèse et une migration diffuse des cellules tumorales gliales dans le parenchyme cérébral, ce qui rend impossible une résection chirurgicale complète. De plus, les cellules gliales tumorales migrantes opposent une résistance particulière aux traitements chimiothérapiques de type pro-apoptotique, causant une récidive quasi inévitable de ce type de tumeur. La compréhension des aspects moléculaires à la base de la prolifération, de la migration et de la chimiorésitance des cellules gliales tumorales est donc essentielle pour élaborer des approches ciblées capables d’entraver ces processus. La littérature mentionne plusieurs stratégies qui permettraient, en théorie, de court-circuiter la résistance à l’apoptose des cellules tumorales gliales migrantes. Il s’agirait entre autres :

- de réduire le taux d’activation des voies de signalisation contrôlées par PI3K /Akt /mTOR et NFkappaB, qui diminuerait le taux de croissance des gliomes malins, ainsi que le taux de migration des cellules tumorales isolées dans le parenchyme cérébral;

- de réduire le taux de migration des cellules tumorales gliales afin de restaurer un certain degré de sensibilité à des agents chimiothérapiques pro-apoptotiques;

- d’endiguer l’export des agents chimiothérapiques par les pompes à efflux surexprimées dans les gliomes

- d'induire d’autres processus de mort cellulaire que l’apoptose, car les cellules tumorales gliales migrantes sont plus sensibles à d’autres formes de mort cellulaire.

Ces besoins de nouvelles stratégies thérapeutiques ont motivé ce travail qui se focalisera sur le potentiel antitumoral des ligands du R-sigma1 dans les glioblastomes. Ainsi, nous montrerons que les ligands des Rs-sigma sont capables de produire certains des effets visés dans les stratégies ci-dessus, dont la réduction de la prolifération et de la migration des cellules cancéreuses avec une certaine potentialisation des chimiothérapies. Ces propriétés ouvrent de nouvelles perspectives en thérapie anticancéreuse pour cette famille de ligands, dont plusieurs membres sont déjà utilisés depuis de nombreuses années comme antipsychotique.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans les pays occidentaux et représentent une complication majeure du syndrome métabolique. Il est maintenant largement admis que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et que l’inflammation joue un rôle pathogénique majeur dans l’initiation et la progression de la maladie athéromateuse. Il a été démontré qu’une augmentation des niveaux sériques de la protéine c-réactive (CRP), une protéine de la phase aigüe et un important constituant de la réponse immunitaire de type inné, est associée à un risque cardiovasculaire accru. Ainsi, il a été documenté qu’une augmentation de CRP, tant chez les sujets sains que chez les sujets diabétiques, était associée à une augmentation du risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. De multiples évidences suggèrent que la CRP puisse non seulement constituer un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires mais aussi représenter un facteur pro-athérogénique direct. La dysfonction endothéliale représente un des stades les plus précoces du processus athérosclérotique et un rôle de la CRP dans la pathogenèse de la dysfonction endothéliale est postulé. Outre son origine systémique, la CRP est produite dans la lésion athérosclérotique et par diverses cellules vasculaires, dont les cellules endothéliales. Afin d’élucider le rôle de la CRP vasculaire dans l’altération de la fonction endothéliale associée au syndrome métabolique, nous avons étudié la régulation de l’expression endothéliale de la CRP par les acides gras libres (AGL) et le rôle de la CRP endothéliale dans l’inhibition de la synthèse d’oxyde nitrique (NO) par les AGL. Nos résultats démontrent que :1) l’acide palmitique (PA) induit l’expression génique de CRP au niveau de cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) en culture et, augmente, de manière dose-dépendante, l’expression protéique de la CRP; 2) La pré-incubation des HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la i) protéine kinase C (PKC), ii) du facteur nucléaire-kappa B, iii) des Janus kinases et des protéines de transduction et de régulation de la transcription et iv) des protéines kinases activées par les mitogènes prévient l’effet stimulant du PA sur l’expression protéique et génique de la CRP; 3) Le traitement des HAECs par le PA induit une augmentation de la production des espèces réactives oxygénées, un effet prévenu par les inhibiteurs de la PKC et par l’AICAR(5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), un activateur de la protéine kinase activée par l’AMP; 4) L’incubation des HAECs en présence de PA résulte enfin en une diminution de la production basale endothéliale de NO, un effet abrogé par la préincubation de ces cellules avec un anticorps anti-CRP. Dans l’ensemble, ces données démontrent un effet stimulant du PA sur l’expression de la CRP endothéliale via l’activation de kinases et de facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif. Ils suggèrent en outre un rôle de la CRP dans la dysfonction endothéliale induite par les AGL.
Atherosclerotic cardiovascular disease is the leading cause of death in western countries and the major complication of metabolic syndrome. It is now widely accepted that atherosclerosis is a chronic inflammatory disease and that inflammation plays a major pathogenic role in the initiation and progression of atherosclerotic disease. It has been demonstrated that increased serum levels of C-reactive protein (CRP), a protein of the acute phase and a major constituent of the innate immune response, is associated with increased cardiovascular risk and that, in both healthy subjects and diabetic patients, high CRP enhances the risk of cardiovascular morbidity and mortality. Several evidences suggest that CRP may not only be a cardiovascular risk marker but may also represent a direct pro-atherogenic factor. Endothelial dysfunction is a characteristic feature of early-state atherosclerosis and a role of CRP in the pathogenesis of endothelial dysfunction has been proposed. In addition to its systemic origin, CRP is produced in atherosclerotic lesions and by various vascular cells, including endothelial cells. To elucidate the role of CRP in endothelial dysfunction associated with the metabolic syndrome, we studied the regulation of endothelial CRP expression by free fatty acids (FFA) and the role of endothelial CRP as mediator of the inhibitory effect of FFA on nitric oxide (NO) production. Our results demonstrated that: 1) Palmitic acid (PA) induced CRP gene expression in cultured human arterial endothelial cells (HAECs) and increased CRP protein expression in a dose-dependent manner; 2) Pretreatment of HAECs with antioxidants and inhibitors of i) protein kinase C (PKC), ii) nuclear factor-kappa B, iii) Janus kinase and signal transducer and activator of transcription and iv) mitogen-activated protein kinases prevented the stimulatory effect of PA on CRP protein and gene expression; 3) Treatment of HAECs by PA led to an increased production of reactive oxygen species, an effect prevented by PKC inhibitors and by AICAR (5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), an AMP- activated protein kinase activator; 4) Decreased production of NO was finally observed in PA-treated HAECs, an effect prevented by preincubating endothelial cells with an anti-CRP. Overall, these data indicate a stimulatory effect of PA on endothelial CRP expression through the activation of oxidative stress-sensitive kinases and transcription factors. They further suggest a role of CRP in FFA-induced endothelial dysfunction.