Academic literature on the topic 'Cellules souches hématopoïétiques – Conservation'

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont greffées à des patients dont le système immunitaire est affaibli ou déficient, afin de reconstituer leur système hématopoïétique. En raison de leurs nombreux avantages, les CSH provenant du sang de cordon ombilical sont de plus en plus utilisées. Cette hausse de la demande a mené à l’implantation de plusieurs banques publiques, dont celle d’Héma-Québec, opérant selon les lignes directrices d’organismes réglementaires. Malgré la standardisation des protocoles de mise en banque, certains paramètres ne sont pas règlementés, telle la température d’entreposage des sangs de cordon avant leur cryopréservation. À Héma-Québec, le transport et la conservation des prélèvements avant la mise en banque sont faits à température pièce (TP) en respectant un délai maximal de 48 heures entre le moment du prélèvement et celui de la mise en banque. De récents travaux rapportés dans la littérature ont montré que les CSH provenant de sang de cordon conservé à TP pendant une période de 72 heures avant la mise en banque perdaient complètement leur capacité de reconstitution hématopoïétique alors que celle-ci était préservée si la conservation était faite à 4°C. Nous avons donc entrepris la présente étude afin de déterminer l’impact de l’entreposage à 4oC ou TP allant jusqu’à 48 heures sur plusieurs paramètres fonctionnels des CSH de sang de cordon ombilical, soit la viabilité, la capacité à se différencier et le potentiel de reconstitution hématopoïétique à l’aide d’un modèle animal de greffe. Les essais de différenciation ont permis de prédire les résultats des greffes, et ces derniers ont mis en évidence une grande variabilité entre les différents sangs de cordon. À ce stade, l’impact de la température d’entreposage avant la mise en banque sur le potentiel de reconstitution hématopoïétique des CSH n’est pas encore déterminé et des travaux supplémentaires devront être effectués.<br>Umbilical cord blood (UCB) has been proven to be an important alternative source of hematopoietic stem cells (HSCs) mostly for pediatric patients suffering from hematologic disorders. Because of its many advantages over other sources of HSCs, such as ease of collection, less stringent HLA restrictions and lower risks of developing GVHD, the use of UCB has expanded in recent years and led to a growing number of public cord blood banks (CBB) that operate under guidelines established by the regulatory organisms such as Netcord FACT, AABB or FDA. Despite the standardization of CBB procedures, some parameters remain unregulated, such as the pre-processing storage temperature. At Héma-Québec Public CBB, the units are kept at room temperature (RT) before being processed and cryopreserved within 48 hours after collection. Recently, a study using a mouse model of engraftment revealed that a pre-processing storage of 72 hours at room temperature might have deleterious effects on the HSC reconstitution capacity. The aim of our study was to evaluate the impact of pre-processing storage temperature on HSCs, by evaluating their viability, differentiation capacity and in vivo hematopoietic reconstitution in a mouse engraftment model. Results show that hematopoietic reconstitution potential measured in NSG mice differed for each of CBUs tested and that, in contrast to the previously published study, the in vivo reconstitution could be predicted by CFU assays. At this stage, the impact of preprocessing temperature on HSCs has not been confirmed, and to do so will require additional experiments.

La thérapie cellulaire basée sur l’utilisation des lymphocytes T a révolutionné les soins médicaux ces dernières années, cependant il existe encore certaines limites à leur utilisation. Ces limites sont liées à la difficulté de produire un nombre suffisant de cellules, de standardiser le produit et d'éditer le génome des cellules. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) peuvent s'auto-renouveler et se différencier en lymphocytes T pour fournir un produit homogène standardisé d'origine définie en quantité indéfinie. Elles présentent donc un grand potentiel pour pallier aux limitations de la production de lymphocytes T thérapeutiques. Nous décrivons un protocole efficace pour la génération de progéniteurs hématopoïétiques et de lymphocytes T en deux étapes : la génération de progéniteurs hématopoïétiques à partir de corps embryonnaires puis la différenciation dirigée des progéniteurs hématopoïétiques dérivés des hPSCs en progéniteurs de lymphocytes T en présence de la signalisation Notch. Nous avons comparé le transcriptome des progéniteurs hématopoïétiques différenciés à partir de hPSCs avec des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) de sang de cordon. Cette comparaison a révélé que la population cellulaire CD34+CD43+ est le plus proche des CSHs de sang de cordon que les autres populations différenciées. De même, nous avons comparé les progéniteurs T différenciées à partir de hPSCs avec des progéniteurs T issus du thymus. Ceci nous a montré que nous avons réussi à différencier les cellules jusqu'à l'étape DN2 du développement des lymphocytes T dans le thymus. De plus, la transduction de FOXP3 pendant la différenciation a entraîné une différenciation significative des cellules Foxp3+CD3+TCRαβ+CD8+ ou Foxp3+CD3+TCRαβ+CD4+. Collectivement, ces résultats sont d'un grand intérêt pour l'étude de l'hématopoïèse et de la lymphopoïèse. En outre, ces travaux constituent une étape vers l'utilisation des lymphocytes T dérivées de hPSCs en thérapie cellulaire<br>Cell therapy using T cells has revolutionized medical care in the last years but limitations are associated with the difficulty of genome editing, the production of sufficient number of cells and product standardization. Human pluripotent stem cells (hPSCs) can self-renew and differentiate into T cells to provide a standardized homogenous product of defined origin in indefinite quantity, therefore they are of great potential to alleviate limitations of therapeutic T cell production. We describe an efficient protocol for the generation of hematopoietic and T cell progenitors in two steps: generation of hematopoietic progenitor cells from embryoid bodies then directed differentiation of hPSC-derived hematopoietic progenitors into T-cell progenitors in the presence of Notch signaling. We compared the transcriptome of the hematopoietic progenitors differentiated from hPSCs with cord blood HSCs. This revealed that the CD34+CD43+ subset of cells is the closest to cord blood HSCs. Similarly, we compared the T cells differentiated from hPSCs with primary thymus tissue. This revealed that we managed to differentiate cells up to the DN2 step of T cells development in thymus. Moreover, FOXP3 transduction during the differentiation resulted in a significant differentiation of Foxp3+CD3+TCRαβ+CD8+ or Foxp3+CD3+TCRαβ+CD4+ cells. Collectively, these results are of great interest for the study of hematopoiesis and lymphopoiesis. In addition, this work is a step towards the use of human T cells derived from hiPSCs in cell therapy

L’existance de cellules souches leucémiques (CSL) dans la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) prédit que que seule la destruction des CSL conduirait à une guérison. Une proportion importante de patients atteints de LMC développe une résistance aux drogues, environ ~ 30% des cas, Les mécanismes de résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) restent souvent obscures. Les cellules souches leucémiques de la LMC pourraient rester viables et en repos, malgré la présence de facteurs de croissance ou de médicaments qui semblent les protéger de l'apoptose. Nous avons montré dans la première parti de cette étude que certains transporteurs telles ABCG2, hOCT-1 pourraient jouer un rôle avec le micro environnement dans la résistance des lignées LMC en adhésion au stoma médullaire. De plus, dans deuxième parti nous avons montré que le gène TWIST-1 (est un acteur clé de l'embryogenèse) est déréglementé dans les cellules de LMC innée des résistants à l'imatinib, et que la sur-expression de l’oncogène TWIST-1 pourrait représenter un nouveau facteur clé de pronostiques potentiellement utiles pour améliorer la guérison de LMC aux TKI. De plus, nous avons pu également montrer que le gène TP73 est impliqué dans la résistance des CSL de LMC. Ce gène pourrait être un facteur prédictif pour identifier une résistance potentielle des patients de LMC au moment du diagnostic. Nous avons montré également que ce gène est régulé par le micro-environnement. Nous avons montrés une sur-expression des isoformes tronquées dans les lignées LMC avec l’adhésion au stroma. Les résultats suggèrent que les molécules intrinsèques comme TWIST-1, les transporteurs et les isoformes de p73 sont dérégulées dans les CSL par des mécanismes extrinsèques qui interviennent avec le micro environnement leucémique par le mécanisme d’adhésion dans le phénomène de résistance aux traitements. Ce mécanisme spécial de résistance due à la conservation de ces CSL dans l’état immature en adhésion avec son micro environnement<br>The existence of Leukemia stem cells (CSL) in chronic myelogenous leukemia (CML) predicts that only the destruction of CSL lead to a cure. A significant proportion of CML patients develop resistance to drugs, ~ 30% cases, mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) in chronic myeloid leukemia (CML) often remain obscure. Leukemic stem cells of CML could remain viable and quiet, despite the presence of growth factors or drugs that seem to protect them from apoptosis. We have shown in the first part of this study that some carriers such as ABCG2, hOCT could to be play a role with the microenvironment in the resistance among CML adhesion of stoma Bone marrow. Furthermore, in the second part we showed that the gene TWIST-1 (is a key player of the embryogenesis) is deregulated in cells of CML innately resistant to imatinib, and that overexpression of the oncogene TWIST-1 could represent a new prognostic factor key potentially useful for improving the querison CML to TKI. In addition, we also could show that the TP73 gene is involved in the resistance of CSL CML. This gene could be a predictor to identify potential resistance of CML patients at diagnosis. We have also shown that this gene is regulated by the microenvironment. We have shown an overexpression of truncated isoforms in CML cell lines with the accession to the stroma. The results suggest that intrinsic molecules such as TWIST-1 carriers and p73 isoforms are deregulated in CSL by extrinsic mechanisms involved with the leukemia microenvironment by the mechanism for participation in the phenomenon of drug resistance. This mechanism with its microenvironment

La protéine TRRAP est une sous-unité de la plupart des complexes histones acétyltransférases (HATs). Le rôle principal de l’acétylation des histones est la régulation de la transcription, cependant des études récentes proposent son implication dans d’autres processus cellulaires utilisant l’ADN comme substrat. Le principal but de notre étude était d’identifier le rôle de TRRAP dans la réparation de l’ADN. Nous avons démontré que TRRAP est impliquée dans les deux types majeurs de réparation des cassures double brin, la recombinaison homologue et la recombinaison non homologue des extrémités. Le rôle de TRRAP dans la réparation peut être soit dépendante des HATs et permettant la relaxation de la chromatine afin de faciliter l’accès des protéines de réparation, soit indépendante des HATs, en tant que membre du complexe MRN. En deuxième partie de la thèse, nous avons identifié deux nouvelles fonctions de TRRAP: la première étant de contrôler la cascade de signalisation Wnt, à travers l’ubiquitination de β-Catenin. La deuxième se résume par la régulation de l’autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques. Ensemble, ces résultats soulignent le rôle multifonctionnel de TRRAP dans la régulation et la coordination de plusieurs processus cellulaires<br>TRRAP protein is a common component of several histone acetyltransferase (HAT) complexes. TRRAP and histone acetylation have been mainly studied in the context of gene transcription, however they have been recently implicated in other chromatin based processes. The main goal of our study was to investigate the role of TRRAP and histone acetylation in DNA repair. We demonstrated that TRRAP is implicated in two major types of double strand breaks repair, homologous recombination and non homologous end joining. The role of TRRAP in repair is either HAT-dependent leading to chromatin relaxation thus allowing the access of DNA repair proteins to the sites of breaks, or HAT-independent as a member of the MRN complex. In the second part of the thesis, we have identified two novel functions of TRRAP: First, we demonstrated that TRRAP is implicated in the Wnt signalling pathway, through ubiquitination of β-catenin on the chromatin. Second, TRRAP was shown to regulate the selfrenewal of hematopoietic stem cells through its transcription cofactor activity. Together, our results highlight the mutifunctional role of TRRAP and histone acetylation in the regulation and coordination of chromatin based processes

Le stroma médullaire participe à la régulation du devenir des cellules souches hématopoïétiques (CSH): la survie, l'autorenouvellement et l'engagement. Cette régulation est relayée par des protéines d'interaction cellulaire. Afin de caractériser ces protéines, nous avons développé une technique originale de piégeage de gènes qui codent pour des protéines transmembranaires ou sécrétées. Elle a été appliquée à la lignée stromale MS-5, capable de mimer les fonctions du stroma médullaire. Cette approche a permis d'identifier des gènes candidats: thrombospondine-l, entactine, neuropiline-l (Np-l). Ce travail a été particulièrement axé sur la Np-let ses ligands. La Np-1 est un récepteur qui participe au guidage axonal au cours de l'embryogenèse. Nous avons montré que la Np-l est exprimée à la surface des cellules du stroma médullaire et qu'elle est capable de lier deux ligands, la sémaphorine III et le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). L'addition de VEGF sur les cellules stromales qui expriment la Np-l induit la synthèse de thrombopoïétine et de Flt3-Ligand, cytokines impliquées dans les étapes précoces de l'hématopoïèse. La Np-l pourrait ainsi relayer des actions entre cellules stromales et CSH. En recherchant la présence de ligands de la Np-1 dans les cellules hématopoïétiques, nous avons montré in vivo que les érythroblastes humains sont les seules cellules qui expriment à la fois le VEGF et un autre facteur angiogénique, le P1GF (Placenta Growth Factor). La sécrétion de ces deux protéines augmente au cours de la différenciation érythrocytaire. Les cellules endothéliales et les macrophages sont des cibles potentielles du VEGF et du PlGF érythrocytaires puisqu'ils expriment des récepteurs pour ces facteurs et sont au contact des érythroblastes dans la moelle. Le surnageant des érythroblastes est en effet capable de faire migrer les monocytes (précurseurs des macrophages) et les cellules endothéliales et d'induire une perméabilité vasculaire. Ces effets sont relayés par le VEGF et le PIGF. Ces deux facteurs sécrétés par les érythroblastes pourraient donc jouer un rôle: (i) dans la formation de l'îlot érythroblastique (unité de maturation des érythroblastes dans la moelle) par migration du macrophage vers les érythroblastes, (ii) dans les interactions entre cellules endothéliales et érythroblastes impliquées en particulier dans le passage des cellules érythroides vers la circulation. Le concept d'interaction entre processus hématopoïétiques et angiogénèse ouvre un champ de réflexion à la fois dans chacun de ces deux domaines mais également dans celui des hémopathies malignes.

La mégacaryopoïèse représente le processus de différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en mégacaryocytes (MK). Ce processus précède la thrombopoïèse qui aboutira à la formation des plaquettes sanguines. Ces processus complexes ont lieu 1) au sein de la structure tridimensionnelle (3D) de la moelle osseuse, 2) dans les vaisseaux sinusoïdes de la moelle et 3) dans la circulation sanguine. Le but général de ce travail a été de comprendre le mécanisme de chaque étape. Le premier objectif a été d’étudier les effets d’une structure poreuse 3D mimant celle de la moelle osseuse, sur la différenciation mégacaryocytaire et la production plaquettaire in vitro. Cette étude a permis de démontrer que la synergie entre l’organisation spatiale et les signaux du microenvironnement améliore la production en MK et en plaquettes. Par la suite, nous avons souhaité caractériser in vitro et in vivo les plaquettes produites en conditions de flux. Nous avons notamment mis en évidence la capacité des plaquettes produites in vitro dans un système de microfluidique, à s’incorporer et à participer à la formation d’un thrombus in vitro et in vivo contrairement aux plaquettes obtenues en statique. Ces travaux prouvent donc l’intérêt d’une part, de mimer le microenvironnement de la moelle osseuse et d’autre part, de reproduire les forces de cisaillement du sang afin d’améliorer et d’augmenter la production de plaquettes in vitro pour de futures applications en thérapeutique<br>Megakaryopoiesis is a process allowing hematopoietic stem cell (HSC) to proliferate and differentiate into megakaryocytes (MK). It is followed by thrombopoiesis allowing blood platelet production. These processes occur 1) in the bone marrow three-dimensional (3D) structure, 2) in the bone marrow sinusoid vessels and 3) in the blood flow. Our general aim was to decipher the mechanism associated to each process. The first objective was to study the effects of porous 3D structure on MK differentiation and platelet production. This study demonstrated that the synergy between spatial organization and biological cues improved MK and platelet production. We also characterized platelets produced from mature MK in flow conditions, with respect to their in vitro and in vivo properties. We highlighted the capacity of flow-derived platelets to incorporate in a thrombus in vitro and in vivo, compared to static-derived platelets. These works represent some new developments for mimicking the bone marrow structure and to reproduce blood shear forces in order to improve and increase in vitro platelet production for therapeutic use

Le gène c-Fos est le prototype des gènes formant la réponse nucléaire précoce de la cellule, lors de l'entrée en cycle prolifératif. La protéine c-Fos possède des propriétés transformantes, et son expression est contrôlée de manière extrêmement stricte au cours du cycle cellulaire. Les études sur les mécanismes responsables de ce contrôle ont été principalement menées dans des systèmes cellulaires modèles, en particulier dans les fibroblastes 3T3. Elles mettent en évidence le rôle primordial joué par le SRE (Serum Response Element) dans le contrôle de la transcription. Nos résultats permettent d'établir que, dans des modèles cellulaires issus du système hématopoïétique, la transcription du gène Fos est régulée d'une manière tout à fait similaire : le processus de la différenciation, non terminale, n'affecte pas directement les mécanismes régissant la transcription du gène c-Fos. La différenciation terminale s'accompagne souvent d'un arrêt de la prolifération cellulaire, et simultanément, on observe une diminution de l'activité du promoteur c-Fos. L'étude d'un système bien connu de différenciation terminale, la différenciation myoblastique, nous a permis de montrer que la protéine MyoD, élément-clé du processus, est capable de réprimer la transcription du gène c-Fos.

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ombilical ne s'est pas révélée être favorable pour la reprise des neutrophiles et des plaquettes. L'expansion des cellules hématopoïétiques (CD34+) et leur différenciation en mégacaryocytes (MKs) ont été optimisées dans notre laboratoire. Par contre, l'expansion des MKs avec des cocktails de cytokines atteint rapidement un plateau. Pour pallier ce problème, de nouvelles stratégies doivent être étudiées pour augmenter l'expansion des cellules CD34+ et MKs ex vivo. L'objectif principal de ce projet était de maximiser l'expansion des progéniteurs myéloïdes et MKs en amplifiant les cellules CD34+ en présence de cellules et/ou protéines normalement présentes dans la moelle osseuse (MO) et pour éventuellement améliorer la reprise hématopoïétique à court terme après transplantation. Plusieurs stratégies ont été proposées pour ce projet de doctorat afin de favoriser les expansions des progéniteurs myéloïdes et MKs en présence des cocktails de cytokine : de développer un environnement endostéale en introduisant la co-culture avec les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) de la MO, d'évaluer aussi différentes protéines de la matrice extracellulaire (MEC) afin de stimuler la croissance ex vivo, et de développer un bioréacteur qui recrée partiellement un microenvironnement similaire à la MO in vitro. Les résultats ont démontré que l'expansion des progéniteurs hématopoïétiques (PHs) était généralement meilleure dans les conditions qui ne nécessitent pas de contact avec des CSMs irradiées. Cette étude démontre pour la première fois que les CSMs se différencient en pseudo-ostéoblastes après irradiation (14 Gray) ce qui affecte la sécrétion de la neurotrophine-3 et de 1' insuline growth factor binding protein-2, afin de promouvoir l'expansion des PHs. Deuxièmement, nos résultats avec les protéines de la MEC ont démontré que l'utilisation du mélange protéique 4MECp (collagène type I et IV, laminine, fibronectine) permet aussi augmenter l'expansion des PHs. Finalement, nous avons conçu et validé un système de co-culture avec circulation en trois dimensions qui a favorisé l'expansion des PHs. En conclusion, cette étude de doctorat démontre que recréer partiellement la MO in vitro peut améliorer l'expansion des PH myéloides et mégacaryocytaires à partir de cellules CD34+. Cette étude confirme aussi l'importance qu'ont les CSMs, ostéoblastes et protéines MEC sur la différenciation et la prolifération des PHs.

L’hémine humaine, connue commercialement sous l’appellation Normosang® ou Panhematin® est un produit utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des attaques aigües de porphyrie, maladie génétique affectant la biosynthèse de l’hème. Récemment, le traitement d’une patiente atteinte d’anémie hémolytique auto-immune sévère et de réticulocytopénie a été pris en charge par un médecin hématologue d’Héma-Québec. Le traitement de cette patiente au Normosang® a entre autres contribué à l’augmentation de son nombre d’érythrocytes et a contribué au rétablissement de son état de santé. Nous avons ainsi entrepris ce projet dans le but d’évaluer les effets de l’hémine sur l’expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon dans un milieu de culture favorisant la différenciation érythroïde. Le suivi de l’expansion montre que l’hémine semble avoir un effet positif sur la croissance des cellules lors de leur différenciation érythroïde. Les résultats montrent que l’hémine semble aussi avoir un effet sur les précurseurs érythroïdes engagés dans ’érythropoïèse. L’analyse de la différenciation montre que l’hémine semble stimuler la différenciation érythroïde, ainsi que l’énucléation. L’approfondissement de ces connaissances pourrait ultimement permettre d’élargir le spectre d’application clinique du Normosang®.<br>Human hemin, commercialized as Normosang® or Panhematin®, is a therapeutic agent approved for the treatment of acute attacks of porphyria, a genetic disease causing a malfunction of the heme biosynthesis pathway. Recently, the treatment of a patient with severe autoimmune hemolytic anemia and reticulocytopenia was managed by a hematologist from Héma-Québec. The treatment of this patient with Normosang® has, among other things, contributed to the increasing erythrocyte levels and contributed to the complete recovery of this patient. The aim of this project was to evaluate the effects of hemin on the expansion and differentiation of hematopoietic cord blood stem cells in a culture media favoring erythroid differentiation. Results show that hemin has a positive effect on cell growth during their erythroid differentiation. The results show that hemin also appears to have an effect on erythroid precursors. Differentiation analysis points to a possible role for hemin in the stimulation of erythroid differentiation as well as enucleation. More knowledge on the subject could ultimately support a larger spectrum of clinical applications.