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Dissertations / Theses on the topic 'Cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC)'
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Hafner, Anne-Laure. "Étude des progéniteurs adipeux dérivés des cellules souches pluripotentes induites humaines." Thesis, Nice, 2015. http://www.theses.fr/2015NICE4062.
Full textAbstract:
Chez les mammifères, on distingue principalement deux types de tissu adipeux (TA) : le TA blanc permet le stockage de l’énergie alors que le TA brun est spécialisé dans la thermogénèse induisant une dépense énergétique. Aujourd’hui, un troisième type d’adipocyte, nommé beige/ brite, est également reconnu. Ces cellules recrutées au sein du TA blanc, possèdent le même potentiel que les adipocytes bruns. L’identification des voies de signalisation permettant de réguler le développement des adipocytes blancs, beiges et bruns reste encore aujourd’hui à être déterminée. La génération des cellules souches pluripotentes induites (hiPS) a permis d’établir un nouveau modèle d’étude des étapes précoces de l’adipogénèse humaine. Nous avons démontré que la génération des progéniteurs adipeux (PA) blancs et bruns est régulée par la voie de l’acide rétinoïque pendant la différenciation in-vitro des cellules hiPS. La caractérisation moléculaire de ces deux types de PA a révélé l’implication du facteur Pax3 dans l’acquisition du phénotype brun. Au cours de cette étude, nous avons constaté que les PA dérivés de cellules hiPS (hiPSC-PA) présentaient un faible potentiel adipocytaire. Nous avons identifiés les facteurs permettant de différencier avec une forte efficacité les hiPSC-PA comprenant l’EGF, l’acide ascorbique, l’hydrocortisone et l’inhibiteur de la voie du TGFβ, le SB 431542. Lors d’expériences préliminaires, nous avons analysé l’effet de la surexpression du facteur HOXC8 sur la différenciation des PA. L’expression ectopique de ce facteur conduit à des réponses distinctes sur le phénotype et la différenciation des hiPSC-PA et ceux provenant de tissus adultesIn mammals, two types of adipose tissue coexist: the white (WAT) wich is involved in energy storage and the brown (BAT) which is specialized in energy expenditure. Beige adipocytes have recently been described as brown –like adipocytes and represent a third type of adipocytes that are recruited in WAT. The molecular mechanisms involved in the generation of these different types of adipocytes remains unknow in humans, mainly because of the lack of appropriate in vitro cellular models. The human induced Pluripotent Stem (hips) cells are a good model to study the earliest steps of human adipogenesis. We have shown that the generation of white and brown adipocytes progenitors (AP) is regulated by acid retinoic signaling pathway during hips cells differentiation. Functional experiments indicated that the transcription factor Pax3 is a molecular mediator of the brown phenotype. During this study, we could see that AP derived from hips cells display a low adipogenic capacity as compared to progenitors derived from adult adipose tissue. We show in this work that treatment with TGFβ pathway inhibitor SB431542 together with ascorbic acid, hydrocortisone and EGF promoted differentiation of non- genetically modified hiPSCs-BAPs at a high rate. During preliminary results, we have analyzed the role of the transcription factor Hoxc8 on PA differentiation. The surexpression of this factor lead to distinct answers on the phenotype and differentiation between hiPSCs-AP and adult-derived AP
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Hafner, Anne-Laure. "Étude des progéniteurs adipeux dérivés des cellules souches pluripotentes induites humaines." Electronic Thesis or Diss., Nice, 2015. http://www.theses.fr/2015NICE4062.
Full textAbstract:
Chez les mammifères, on distingue principalement deux types de tissu adipeux (TA) : le TA blanc permet le stockage de l’énergie alors que le TA brun est spécialisé dans la thermogénèse induisant une dépense énergétique. Aujourd’hui, un troisième type d’adipocyte, nommé beige/ brite, est également reconnu. Ces cellules recrutées au sein du TA blanc, possèdent le même potentiel que les adipocytes bruns. L’identification des voies de signalisation permettant de réguler le développement des adipocytes blancs, beiges et bruns reste encore aujourd’hui à être déterminée. La génération des cellules souches pluripotentes induites (hiPS) a permis d’établir un nouveau modèle d’étude des étapes précoces de l’adipogénèse humaine. Nous avons démontré que la génération des progéniteurs adipeux (PA) blancs et bruns est régulée par la voie de l’acide rétinoïque pendant la différenciation in-vitro des cellules hiPS. La caractérisation moléculaire de ces deux types de PA a révélé l’implication du facteur Pax3 dans l’acquisition du phénotype brun. Au cours de cette étude, nous avons constaté que les PA dérivés de cellules hiPS (hiPSC-PA) présentaient un faible potentiel adipocytaire. Nous avons identifiés les facteurs permettant de différencier avec une forte efficacité les hiPSC-PA comprenant l’EGF, l’acide ascorbique, l’hydrocortisone et l’inhibiteur de la voie du TGFβ, le SB 431542. Lors d’expériences préliminaires, nous avons analysé l’effet de la surexpression du facteur HOXC8 sur la différenciation des PA. L’expression ectopique de ce facteur conduit à des réponses distinctes sur le phénotype et la différenciation des hiPSC-PA et ceux provenant de tissus adultesIn mammals, two types of adipose tissue coexist: the white (WAT) wich is involved in energy storage and the brown (BAT) which is specialized in energy expenditure. Beige adipocytes have recently been described as brown –like adipocytes and represent a third type of adipocytes that are recruited in WAT. The molecular mechanisms involved in the generation of these different types of adipocytes remains unknow in humans, mainly because of the lack of appropriate in vitro cellular models. The human induced Pluripotent Stem (hips) cells are a good model to study the earliest steps of human adipogenesis. We have shown that the generation of white and brown adipocytes progenitors (AP) is regulated by acid retinoic signaling pathway during hips cells differentiation. Functional experiments indicated that the transcription factor Pax3 is a molecular mediator of the brown phenotype. During this study, we could see that AP derived from hips cells display a low adipogenic capacity as compared to progenitors derived from adult adipose tissue. We show in this work that treatment with TGFβ pathway inhibitor SB431542 together with ascorbic acid, hydrocortisone and EGF promoted differentiation of non- genetically modified hiPSCs-BAPs at a high rate. During preliminary results, we have analyzed the role of the transcription factor Hoxc8 on PA differentiation. The surexpression of this factor lead to distinct answers on the phenotype and differentiation between hiPSCs-AP and adult-derived AP
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Jung, Laura. "Optimisation de protocoles de reprogrammation de cellules somatiques humaines en cellules souches à pluripotence induite (hiPSC)." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ066.
Full textAbstract:
En 2006 et 2007, les équipes de Yamanaka et Thomson réalisent la reprogrammation de cellules somatiques murines et humaines en cellules souches pluripotentes à partir de deux cocktails de gènes : OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) et OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). Les cellules souches à pluripotence induite générées (iPS) partagent les propriétés fondamentales des cellules souches embryonnaires : l’auto-renouvèlement, le maintien de la pluripotence et la capacité de différenciation. Ces cellules laissent entrevoir des applications considérables tant en recherche fondamentale (compréhension des mécanismes de développement et de pathologies, développement de modèles) qu’en recherche appliquée (médecine régénérative, toxicologie prédictive, criblage de médicaments). L’avantage majeur de l’utilisation des iPS réside dans leur origine non embryonnaire. Les contraintes d’ordre éthique sont écartées et une grande diversité de types cellulaires à partir de n’importe quel donneur a priori est disponible pour une reprogrammation. L’établissement d’une banque d’hiPS issus de donneurs sains ou de patients, serait d’une grande utilité pour la communauté scientifique se consacrant à l’étude des mécanismes physiopathologiques ou de développement et une source considérable pour la dérivation à des fins de thérapie cellulaire. Dans le but de mettre en place une telle banque, nous avons développé avec la société Vectalys des rétrovirus de reprogrammation contenant les cassettes polycistroniques ONSL et OSKM. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole de reprogrammation robuste à l’aide des rétrovirus RV-ONSL. Nous avons ensuite mis en évidence la synergie entre les facteurs ONSL et OSKM, la combinaison équimolaire de RV-ONSL et RV-OSKM permettant d’atteindre 2% d’efficacité de reprogrammation. Nous avons également entrepris la reprogrammation propre par transfections d’ARNm polycistroniques ONSL et OKM mettant à profit cette incroyable synergieIn 2006 and 2007, Yamanaka and Thomson teams achieved the reprogramming of mouse and human somatic cells into pluripotent stem cells through the transfection of two cocktails of genes: OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) and OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). The generated cells, called induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) share the same fundamental properties of ESC : self-renewing, pluripotency maintenance and capacity of differentiation into the three germ layers and suggest the same application potential in basic research (developmental and epigenetic biology) as well as in therapy (regenerative medicine, disease modeling for drug development). One of the major advantages of iPSC lies in their non-embryonic origin. Indeed, the use of iPSC resolves the ethical constraints and offers the possibility to work with extensive cell types directly from the patient to treat. Stéphane Viville’s research team aims to develop a hiPSC bank from patient suffering from genetic or other diseases which will be available for the scientific community. We are experienced in human primary fibroblasts reprogramming especially with the use of two polycistronic cassettes: ONSL encoding Thomson’s cocktail and OSKM encoding Yamanaka’s cocktail separated with 2A peptides. Thanks to the combination of RV-ONSL and RV-OSKM retroviral vectors (developed with Vectalys) we are yielding more than 2% of reprogramming efficiency in a highly reproducible way. Indeed, we demonstrated the reprogramming synergy of ONSL and OSKM combination. We are now focusing our effort on non-integrative strategies (ie mRNA) which are more appropriate for clinical usage
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Lahlou, Hanae. "Génération de progéniteurs otiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) : application à la thérapie cellulaire dans l'oreille interne." Thesis, Aix-Marseille, 2017. http://www.theses.fr/2017AIXM0245/document.
Full textAbstract:
La surdité neurosensorielle est définie par une atteinte de l’oreille interne, il résulte principalement d’une perte de cellules ciliées (CC). Chez les mammifères, ce processus est malheureusement irréversible. Le développement de la thérapie cellulaire a fait naître de nouveaux espoirs pour le traitement des surdités neurosensorielles. Les cellules souches d’origine embryonnaire ou adulte seraient capables de se différencier in vitro en progéniteurs otiques et de restaurer partiellement les fonctions auditives in vivo après transplantation. Cependant, les protocoles de différenciation in vitro des CC à partir de cellules souches sont insatisfaisants, et les signaux qui contrôlent ce phénomène restent mal connus. Ainsi, l’objectif de ce travail de thèse était d’étudier in vitro la différenciation des CC à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous nous sommes intéressés à deux voies de signalisation majeures impliquées dans le développement de l’oreille interne in vivo, la voie Notch et la voie Wnt. Dans une première partie, nous avons montré que l’inhibition tardive de la voie Notch favorise la différenciation des hiPSC en CC. Dans une seconde partie, nous avons étudié le rôle de la voie Wnt dans la différenciation des hiPSC en cellules otiques. Nos résultats indiquent que l'inhibition de la voie Wnt durant la première phase d’induction favorise l'expression des marqueurs de la placode otique et initie la spécification des CC.Les travaux présentés dans cette thèse améliorent ainsi les protocoles de différenciation des hiPSC et suggèrent que ce type de cellules serait parfaitement adapté pour traiter les surdités neurosensoriellesNeurosensory hearing loss is associated to inner ear disorders and degeneration of hair cells (HCs). Unfortunately, this process is irreversible in mammals. Currently, no curative treatment allows these cells to regenerate. For this reason, the development of cell therapy arose new hopes for the treatment of neurosensory hearing loss. Stem cells, either of embryonic or adult origin, seem able to differentiate in vitro into otic progenitors and to partially restore auditory functions in vivo. However, current protocols for in vitro differentiation of stem cells into HCs are unsatisfactory, and the signals that control this phenomenon remain poorly understood. Thus, the objective of this thesis was to study in vitro HC differentiation from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). We were particularly interested in two major signaling pathways involved in vivo in inner ear development, the Notch and Wnt signaling pathways.In a first part, we demonstrated that Notch inhibition during late otic differentiation enhances hiPSC differentiation into hair cell-like cells. In a second part, we studied the role of the Wnt signaling pathway during otic induction and HC specification. Our results indicate that Wnt inhibition during early otic induction promotes the expression of otic placode markers and initiate HC specification. The work presented here thus propose improved protocols to obtain HCs from hiPSCs, and suggest that this cell type is perfectly adapted for the treatment of neurosensory hearing loss
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Badja, Cherif. "Optimisation de la différenciation neuronale et musculaire de cellules pluripotentes induites humaines pour la modélisation des maladies rares : exemple du syndrome de DiGeorge." Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM5027/document.
Full textAbstract:
Le syndrome de DiGeorge ou microdélétion 22q11.2, est la délétion chromosomique la plus fréquente chez les êtres humains. Cette délétion est liée à la recombinaison homologue non-allélique au cours de la méiose induisant la perte d’en moyenne 40 gènes. Les études de corrélation génotype/phénotype chez les patients ont révélé des différences phénotypiques entre individus et cela indépendamment de la taille des microdélétions. L’hypothèse de l’implication des mécanismes épigénétiques dans la variabilité phénotypique observée a été soulevée mais reste encore inexplorée. C’est dans ce contexte que nous nous intéressons à l’étude des mécanismes épigénétiques au cours du développement, dans cette pathologie à travers l’utilisation d’un modèle de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSs). En particulier, nous avons ciblé nos travaux sur le rôle de la chaperonne d’histone HIRA dont le gène est localisé dans la région délétée. HIRA est impliquée dans la déposition du variant d’histone H3.3, une histone majeure dans le cerveau. Afin de comprendre l’implication de HIRA dans les manifestations neurologique du syndrome de DiGeorge et en particulier dans la schizophrénie, nous avons développé et optimisé un nouveau protocole pour la différenciation de cellules hiPSCs en progéniteurs neuronaux, neurones corticaux et neurones dopaminergiques. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives pour la modélisation d’un grand nombre de pathologies, et dans le contexte du laboratoire, pour l’exploration des mécanismes épigénétiques associés à la variabilité phénotypique dans différentes maladies génétiquesThe DiGeorge syndrome also known as 22q11.2 microdeletion syndrome, is the most common deletion in humans. This deletion is linked to a non-allelic homologous recombination that occurs during meiosis and involves sequences called LCRs for "Low Copy Repeats". Depending on the LCRs involved, different deletions are observed, inducing the loss of approximately 40 genes. The absence of genotype/phenotype correlation in patients and the phenotypical differences regardless of the size of the microdeletion suggests the involvement of additional parameter. The hypothesis of epigenetic changes associated with the onset or variability of symptoms has been suggested but never investigated. In order to tackle this question, we decided to focus our attention of the role of the HIRA histone chaperone encoded by a gene located in the 22q11.2-deleted region. HIRA is involved in the deposition of the H3.3 histone variant, one of the main histone in the brain. In order to determine whether HIRA is implicated in the neurological manifestations in DiGeorge patients and particularly in schizophrenia, we developed and optimized a new protocol for the direct differentiation of human induced pluripotent stem cell (hiPSCs) into neural progenitors, cortical and dopaminergic neurons. In parallel, we developed a new protocol for hiPSCs differentiation toward the skeletal muscle lineage and the production of multinucleated muscle fibers. Altogether, these results open new perspectives for the modeling of a large number of pathologies, and in the context of our laboratory, the exploration of epigenetic mechanisms associated with phenotypic variability in different genetic diseases
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Paiva, Solenne. "Facteurs environnementaux et épigénétiques impliqués dans la différenciation cardiaque de cellules souches humaines pluripotentes induites MiRroring the Multiple Potentials of MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction Acellular therapeutic approach for heart failure: in vitro production of extracellular vesicles from human cardiovascular progenitors." Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS457.
Full textAbstract:
L’objectif de cette thèse a été d’évaluer certains paramètres physiques et épigénétiques impliqués dans la différenciation cardiaque de cellules souches humaines pluripotentes induites. Un premier paramètre physique souvent sous-évalué a été étudié, celui de la rigidité. Classiquement, les cellules souches sont cultivées et adaptées à des rigidités in vitro allant de 1-10 GPa très éloignées des valeurs physiologiques, de l’ordre du kPa. L’impact de support de culture à 3, 12 et 25 kPa a été évalué sur les cellules souches initiales. Les résultats montrent que des rigidités inférieures à 25 kPa ne permettent pas le maintien de la pluripotence au bout de 6 passages. De plus, les colonies cellulaires se développent en 3D et créent leur propre microenvironnement. Un second paramètre étudié concerne les microRNAs appartenant à la famille let-7 dont la fonction exacte au niveau cardiaque reste à définir. Les résultats montrent qu’au cours de la différenciation son expression se caractérise par une augmentation transitoire précoce au moment de la formation du mésoderme, puis s’éteint pour ne ré-augmenter que plus tard lors de la maturation des cardiomyocytes. Des modulations via des mimics ou des inhibiteurs dans différents contextes cellulaires suggèrent qu’initialement let-7 contribue à une future spécification cardiaque, mais que plus tard cette famille devra être réprimée pour générer des progéniteurs cardiaques. À l’opposé, miR-1, spécifique au cœur, contribue toujours à la progression en cardiomyocytes. Ensemble, ces recherches contribuent à la recherche fondamentale sur le développement du cœur humain et à la recherche appliquée en ingénierie tissulaire cardiaqueThe objective of this thesis was to evaluate some physical and epigenetic parameters involved during cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells. Environmentally, an often undervalued physical parameter remains, the stiffness defined by the Young’s modulus. Commonly stem cells are cultured and adapted to in vitro rigidities ranging between 1-10 GPa very far from physiological values, for instance 10-15 kPa for the heart. The impact of soft culture substrates with 3 kPa, 12 kPa and 25 kPa was studied on the initial stem cells. Globally, results indicated that rigidities lower than 25 kPa were not suited for total pluripotency maintenance after 6 passages. Also, cellular colonies started to grow in 3D suggesting that softness drove them to build their own microenvironment. Epigenetically, the exact role of one of the first discovered microRNAs, the let-7 family has not yet been fully elucidated. Throughout differentiation its expression was characterized by an early transient peak at the time of mesoderm formation, after which their expression extinguished to only gradually re-increase later in the course of cardiomyocytes maturation. Modulation experiments involving mimics or inhibitors of the let-7 family on different cellular contexts suggested that initially let-7 acted on future cardiac specification but later, this family had to be repressed in order for cardiac progenitors to emerge. Oppositely, the cardiac specific miR-1 always contributed to their progression into cardiomyocytes. Together these researches contribute to fundamental research on human heart development and to applied research on human engineered cardiac tissues
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Louis, Jeanne. "Syndrοme de Li-Fraumeni : apprοches fοnctiοnnelles visant à appréhender la variabilité génοtypique et phénοtypique." Electronic Thesis or Diss., Normandie, 2025. http://www.theses.fr/2025NORMR002.
Full textAbstract:
Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) prédispose les porteurs de variations pathogènes de TP53 à un large spectre de tumeurs dès l’enfance. La variabilité phénotypique du LFS complique la prise en charge des patients et peut s’expliquer en partie par le type de variations de TP53, mais également par l'influence de facteurs modificateurs génétiques. Afin d’évaluer ces facteurs modificateurs, il est nécessaire de mettre au point des tests fonctionnels adaptés.L’activité des isoformes de p53 suggère qu’elles pourraient agir comme facteurs modificateurs du LFS. C’est pourquoi nous avons mis au point des techniques pour l’analyse des transcrits alternatifs, présentées dans la première partie de ces travaux de thèse. Si nos résultats ont montré que ces techniques n’étaient pas adaptées pour répondre à cette hypothèse, elles nous ont néanmoins permis d’identifier un nouveau transcrit physiologique, non décrit dans la littérature, augmenté chez une patiente porteuse d’une variation située sur le site accepteur d’épissage du dernier exon de TP53. Ce transcrit démontre l’existence d’un épissage alternatif du dernier exon de TP53 avec un exon terminal alternatif situé à plus de 2 kb en aval.Afin d’aider à la classification des variations de TP53, notre laboratoire évalue l’activité transcriptionnelle de p53 dans le contexte génétique du patient. Ce test ne permet donc pas de s’affranchir de l’influence potentielle des facteurs modificateurs génétiques individuels. C’est pourquoi, dans la deuxième partie de ces travaux de thèse, nous avons mis au point un modèle cellulaire de cellules souches pluripotentes induites humaines permettant d’étudier les variations de TP53 insérées par CRISPR-Cas9 dans un fond génétique commun. Ces travaux soulignent l’importance de l’expression de TP53, notamment pour l’étude des variations dont la pénétrance est moindre par rapport aux variations « hot-spot ». Par ailleurs, nous montrons que les variations en phase exercent un impact différentiel sur l’activité fonctionnelle de p53, selon le domaine protéique dans lequel elles se situent. L’avantage de notre modèle réside également sur son hétérozygotie pour PEX4 sur lequel nous avons pu insérer une seconde variation, ici le polymorphisme p.(Pro47Ser) inséré en trans d’une variation pathogène. Nos résultats soulignent l’importance du contexte génétique dans l’analyse des variations de TP53. L’ensemble de ces travaux de thèse mettent en lumière la nécessité d’étudier l’activité transcriptionnelle de p53 dans un contexte physiologique, sans surexpression, dans le but de mieux comprendre ce syndrome et d’optimiser la prise en charge des patients LFSLi-Fraumeni Syndrome (LFS) predisposes carriers of pathogenic TP53 variants to a wide spectrum of cancers throughout life. The phenotypic variability of LFS complicates patient management and can be partly attributed to the type of TP53 variant, as well as the influence of genetic modifier factors. To evaluate these modifier factors, it is essential to develop suitable functional tests.The activity of p53 isoforms suggests that they may act as modifier factors in LFS. Consequently, we developed assays for analyzing alternative transcripts, as presented in the first part of this work. While our results demonstrated that these assays were not well-suited to addressing this specific hypothesis, they nevertheless led us to the discovery of a novel physiological transcript not previously described in the literature. This transcript was found to be increased in a patient carrying a variant located at the splice acceptor site of TP53’s last exon, revealing an alternative splicing event involving TP53’s final exon and an alternative terminal exon located more than 2 kb downstream.To facilitate the classification of TP53 variants, our laboratory evaluates p53’s transcriptional activity in the patient’s specific genetic context. However, this approach does not allow us to fully disentangle the potential influence of individual genetic modifier factors. Therefore, in the second part of this work, we developed a human-induced pluripotent stem cell model to study TP53 variants introduced by CRISPR-Cas9 within a standardized genetic background. Our findings highlight the importance of physiological TP53 expression, particularly for studying variants with lower penetrance compared to "hot-spot" variants. Additionally, we show that in-frame variants exert differential impacts on p53’s functional activity, depending on the protein domain in which they are located. The advantage of our model also lies in its heterozygosity for PEX4, into which we were able to insert a second variant, in this case, the p.(Pro47Ser) polymorphism, inserted in trans with a pathogenic variant. Our results highlight the importance of the genetic context in the analysis of TP53 variants. This thesis work emphasizes the necessity of studying p53 transcriptional activity in a physiological context, without overexpression, with the aim of improving our understanding of this syndrome and optimizing the management of LFS patients
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Lemonnier, Thomas. "Modélisation de maladies neurodégénératives à l’aide de cellules souches pluripotentes induites humaines." Thesis, Paris 5, 2012. http://www.theses.fr/2012PA05T074/document.
Full textAbstract:
La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd’hui l’opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l’accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l’appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l’orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu’il n’existait jusqu’alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d’étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutiqueReprogramming technology of somatic cells in induced pluripotent stem cells (iPS) now offers the opportunity to model neurodegenerative diseases and to study patient’s neurons. We used this technology for generating two models of neurodegenerative diseases: the muccopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) and the ALS2 form of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the MPSIIIB model, we have shown that iPS and neurons of patients had characteristic defects of the disease such as the accumulation of storage vesicles. Alterations of the Golgi apparatus in these cells were also highlighted. Transcriptome analysis of MPSIIIB neural precursors showed transcriptional changes involving particularly genes implicated in cell-extracellular matrix interactions. Thus, in a subsequent study, alterations of migration and orientation of MPSIIIB mutant mouse cells and MPSIIIB patients’ cells have been demonstrated. These alterations may be responsible for the disruption of neurogenesis and neuritogenesis in sick children. In the ALS2 model, we have shown that patients’ neurons had defects including decreased endosomes’ surface and abnormal neurite outgrowth. As there was previously no relevant cellular model reproducing the disease, this model will now allow the study of physiopathological processes involved in the disease. In conclusion, the generation of iPS cells allows to model neurodegenerative diseases and to study associated physiopathological processes on cultured human neurons. These cell models could allow in the near future the screening of molecules of potential therapeutical interest
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Lemonnier, Thomas. "Modélisation de maladies neurodégénératives à l'aide de cellules souches pluripotentes induites humaines." Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00806699.
Full textAbstract:
La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd'hui l'opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l'accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l'appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l'orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu'il n'existait jusqu'alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d'étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutique
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Sleiman, Yvonne. "Modélisation des ryanopathies avec des cardiomyocytes patient-spécific issus de cellules souches pluripotentes induites." Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT049.
Full textAbstract:
Malgré les avancées majeures en recherche, les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de décès dans le monde. Les arythmies cardiaques résultent principalement des canalopathies généralement causées par des mutations dans des gènes codant pour des canaux ioniques. Des mutations du récepteur cardiaque de la ryanodine de type 2 (RyR2) conduisent à des troubles du rythme tels que la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (CPVT) et la mort subite cardiaque dans des conditions de stress. L'association de mutations RyR2 avec la tachycardie ventriculaire polymorphe à couplage court (SC-PMVT) au repos n'est pas claire. De plus, l'implication du RyR2 dans la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) associée à la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) conduisant à des arythmies ventriculaires a également été rapportée. Cependant, les connaissances en physiologie et physiopathologie cardiaques ont été considérablement développées en utilisant des modèles d'expression hétérologues et des modèles de souris transgéniques qui ne récapitulent pas toujours le phénotype observé chez les patients. Par conséquent, les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) offrent de grandes possibilités de travailler avec les cellules appartenant aux patients, d'élucider des mécanismes importants responsables des maladies cardiaques notamment et de tester de nouveaux composés thérapeutiques.L’objectif principal de ma thèse était de modéliser le SC-PMVT en utilisant des cardiomyocytes (CM) dérivés de hiPSC « patient-specific » et la technologie CRISPR / Cas 9 pour aller au-delà du travail réalisé par Cheung, Meli et al., en 2015 avec le nouveau canal mutant RyR2-H29D. Mon travail a contribué à élucider le fait que les canaux mutants RyR2-H29D sont responsables d’une homéostasie calcique anormale, des propriétés contractiles et électriques anormales et un remodelage du complexe macromoléculaire RyR2. Ces anomalies ont été complètement supprimées lors de l'inversion de la mutation RyR2-H29D avec la technologie CRISPR / Cas9. De plus, nous avons constaté que la Flecaïnide et les stabilisateurs du RyR2 S107 sont efficaces pour prévenir la libération anormale de calcium (Ca2+) dans les RyR2-H29D hiPSC-CMs, contrairement au Verapamil et au Propanolol.Mon deuxième sujet de thèse portait sur la modélisation de la CMD associée à la DMD à l'aide de hiPSC-CMs « patient-specific » exploités à partir d'une cohorte de patients. Nos résultats préliminaires suggèrent que 3 mutations indépendantes de la dystrophine induisent une fuite de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (RS) et des propriétés contractiles anormales dans les DMD hiPSC-CMs dans des conditions physiologiques et de stress.Dans l’ensemble, mon travail de thèse a contribué à valider l'utilisation de hiPSC-CMs « patient-specific » pour modéliser des ryanopathies directement induites par des mutations ponctuelles et indirectement par d'autres conditions physiopathologiques. Ce travail de thèse renforce l’intérêt croissant que suscitent les hiPSC-CMs « patient-specific » pour élucider les mécanismes physiopathologiques des ryanopathies et proposer à terme une médecine personnaliséeDespite major advances in the field of research, the cardiovascular diseases remain the leading cause of death worldwide. Cardiac arrhythmias are mainly the results of channelopathies which are normally caused by mutations occurring in genes coding for ion channels. Mutations of the cardiac ryanodine receptor type 2 (RyR2) lead to arrhythmogenic disorders such as the catecholamine polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) and sudden cardiac death under stress conditions. The association of RyR2 mutations with the short-coupled polymorphic ventricular tachycardia (SC-PMVT) at rest is unclear. Moreover, the implication of the RyR2 in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy (DCM) associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD) leading to ventricular arrhythmias was also reported. However, the knowledges in the cardiac physiology and physiopathology have been significantly made using either the heterologous expression or transgenic mouse models which do not always recapitulate the phenotype observed in patients. Therefore, the human induced pluripotent stem cells (hiPSC) offer great opportunities to work with human somatic cells, to elucidate important mechanisms driving cardiac disease and to test novel therapeutic compounds.The main aim of my PhD thesis was to model the SC-PMVT using patient-specific hiPSC-derived cardiomyocytes (CMs) and CRISPR/Cas 9 technologies to go beyond the work achieved by Cheung, Meli et al., in 2015 with the novel RyR2-H29D mutant channels. My work contributed to elucidate that the RyR2-H29D mutant channels exhibit abnormal intracellular calcium (Ca2+) homeostasis, abnormal contractile and electrical properties and RyR2 macromolecular complex remodeling. These abnormalities were fully abolished when reversing the RyR2-H29D mutation with CRISPR/Cas9 technology. Moreover, we found that the Flecainide and RyR2 stabilizer S107 are potent to prevent the abnormal release of Ca2+ in RyR2-H29D hiPSC-CMs while Verapamil and Propanolol do not.My second thesis objective was focused on modeling the DCM associated with Duchenne muscular dystrophy (DMD) using patient-specific hiPSC-CMs exploited from a local cohort of DMD patient. Our preliminary results suggested that 3 independent dystrophin mutations induce sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ leak and abnormal contractile properties in DMD hiPSC-CMs under both physiological and stress conditions.My thesis work contributed to validate the use of patient-specific hiPSC-CMs to model ryanopathies directly induced by single-point mutations and indirectly by other pathophysiological conditions. Overall, my thesis work highlighted the increasing interest in patient-specific hiPSC-CMs to decipher the pathophysiological mechanisms behind ryanopathies and orientate toward personalized medicine
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Faye, Pierre-Antoine. "Cellules souches pluripotentes induites (iPSc) différenciées en motoneurones spinaux : vers des modèles cellulaires de neuropathies périphériques d'origine génétique." Thesis, Limoges, 2015. http://www.theses.fr/2015LIMO0051/document.
Full textAbstract:
Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSc) apparaissent comme une solution très intéressante pour créer et observer le comportement de cellules spécifiques et inaccessibles d'un patient. Notre équipe travaille sur les pathologies génétiques des nerfs périphériques et en particulier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). Un de nos objectifs est le développement de modèles de motoneurones de patients utilisant la stratégie des iPSc afin de mieux comprendre la physiopathologie des neuropathies liées au gène GDAP1. Ce gène a été décrit en 1998 pour être responsable d'une forme axonale de CMT ; il code une protéine de la membrane externe mitochondriale dont la fonction précise reste encore méconnue. Des fibroblastes dermiques (FD) ont été obtenus après une biopsie de peau d'une personne saine (témoin) et d'un patient homozygote porteur de la mutation non-sens p.Gln163* dans le gène GDAP1. Par la suite, les FDs ont été reprogrammés en cellules iPSc en utilisant le cocktail de Yamanaka (plasmides non intégratifs composés d’Oct4, Sox2, Klf4 et l-Myc). Après amplification, tous les contrôles ont été effectués pour conclure que nos iPSc avaient les mêmes propriétés et les mêmes capacités que les cellules souches embryonnaires ainsi qu’un caryotype normal. Enfin, nous avons optimisé le protocole de différenciation avec succès de manière à obtenir à partir des iPSc des rosettes (structures pleines de progéniteurs neuronaux), puis des neurones et finalement des motoneurones pour le contrôle et le patient. Les premières différences entre le contrôle et le patient ont été observées lors de l’obtention de rosettes. Les cellules du patient présentaient de nombreuses gouttelettes lipidiques et la proportion de rosettes obtenue était plus faible. Une fois les motoneurones obtenus, des tests de microscopie confocale et électroniques ont montré des différences du réseau mitochondrial entre le témoin et le patient, ainsi qu’une morphologie des mitochondries se rapprochant de celle observée lors de biopsie de nerf de patient (rondes / accumulées). De manière à réduire la durée de différenciation, une méthode de tri cellulaire a été utilisée la SdFFF. Cette méthode nous a permis de trier différents progéniteurs (neuraux / endothéliaux). La génération de motoneurones à partir de fibroblastes dermiques de patient atteint de CMT axonale via les iPSc était une première étape cruciale pour mieux comprendre le rôle de GDAP1 dans cette pathologie. Ce modèle cellulaire de CMT4A est un premier pas pour réaliser des tests précliniques de médicaments afin d'identifier de futurs candidats pharmacologiquesInduced pluripotent stem cells (iPSc) are a highly interesting tool to create and observe the behavior of specific and unattainable cells from a patient. Our team is interested in genetic peripheral nerves disorders and especially in Charcot-Marie-Tooth disease (CMT). One of our objectives is the development of motor neurons models from patients using the iPSc strategy in order to better understand the pathophysiology of GDAP1-related neuropathies. This gene was found in 1998 to be mutated in an axonal form of CMT and encodes a mitochondrial outer membrane protein, which function remains unclear. We first obtained dermal fibroblasts (DF) from skin biopsies of a healthy person and of a homozygous patient carrying GDAP1 non-sense mutation (p.Gln163*). Then, we reprogrammed DFs into iPSc using non-integrative plasmids (Oct4, Sox2, Klf4 and l-Myc). After amplification, all quality controls were performed to conclude that our iPSc had the same properties and capacities than embryonic stem cells and a normal karyotype. Finally, we optimized protocols to successfully differentiate these iPSc into rosettes (structures full of neural progenitors), then into neurons and finally into motor neurons for control and GDAP1 patients. The first differences between control and patient cells were observed during the rosette formation, where a lot of patient cells were full of lipid droplets, and the rosette proportion was lower than the control cells. Mitochondria morphology was totally different in motor neurons between control and patient, where mitochondria had the same morphology than the mitochondria observed in patient nerve biopsies (round and accumulated). In order to reduce the time of differentiation, a cell sorting method was used (SdFFF). It allowed us to sort different progenitors (neural / endothelial). Generation of motor neurons using axonal CMT-patient-derived iPSc was a first crucial step to better understand the role of GDAP1 in this pathology. This cellular model of CMT4A should ultimately allow us to perform preclinical drug screening in order to identify candidate pharmacological treatments for CMT patients
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Lay, Russo Nadège. "Différenciation des cellules souches embryonnaires murines et des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules dendritiques : cellules d'intérêt pour les tests de toxicologie." Nice, 2012. http://www.theses.fr/2012NICE4077.
Full textAbstract:
Le septième amendement à la directive cosmétique européenne impose un abandon des tests sur les animaux pour mesurer l’effet allergène ou irritant de certains composés utilisés en cosmétique. La réponse aux allergènes dans le modèle animal regroupe cinq aspects différents, mais dans les tests in vitro chaque aspect est étudié séparément. Parmi les tests de toxicité qui sont envisagés in vitre, les cellules dendritiques (cellules présentatrices de l’antigène) apparaissent come les cellules de choix pour étudier un de ces aspects. Cependant aujourd’hui il est difficile d’obtenir une source fiable et robuste de cellules dendritiques permettant de mettre au point un test réglementaire. Le but de mon projet de thèse a été de proposer un modèle alternatif à ces tests sur les animaux. Pour cela nous avons mis en place les conditions permettant de générer des cellules dendritiques à partir de cellules souches. Pour cela nous disposons de deux sources de cellules souches : les cellules souches embryonnaires murines (mES) et les cellules humaines pluripotentes induites (cellules hiPS). Les hiPS sont des cellules reprogrammées en cellules ayant toutes les caractéristiques des cellules embryonnaires sans que celles-ci ne posent de problèmes éthiques. Ces deux types de cellules souches devaient permettre de disposer d’une source inépuisable et abondante de cellules dendritiques, cellules de choix pour les tests de toxicité in vitro. Nous avons mis au point un protocole permettant de générer et purifier une population de cellules dendritiques à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Ces cellules ont été caractérisées par l’expression de marqueurs tels que CD45, CD209, CD86, MHC II, CD14, CD205, CD11c, et par l’étude de marqueurs de surface tels que CD45, CD86. Enfin, nous avons réalisé des tests fonctionnels comme des expériences d’endocytose du dextran-FITC et de réponse de cette population cellulaire à des modèles allergènes de références telles que MCI/MI ou le TNBS. Nous avons ensuite essayé de générer des cellules « dendritiques-like » à partir de cellules iPS humaines en nous basant sur l’expression de marqueurs tels que CD45, CD34, CD1a, CD1c, CD14, CD209, CD207, CD86 et HLA-DR. Plusieurs protocoles ont été envisagés. Toutefois, les cellules « dendritiques-like » obtenues représentent un faible pourcentage des cellules différenciées et le protocole est en cours d’optimisation. De plus en plus de tests utilisent les kératinocytes pour évaluer un autre aspect de la réponse aux allergènes. Nous nous sommes donc intéressés aussi à ces cellules et nous présenterons les premières étapes de différenciation des hiPS qui devraient permettre de générer les kératinocytesThe seventh amendment in the European cosmetic directive imposes an abandonment of the tests on animals to measure the allergenic or irritant effects of some compounds used in cosmetic. The allergenic response in animals ‘models includes five aspects but in the in vitro test each aspect is studied separately. Among the in vitro tests of toxicity which are envisaged, dendritic cells, which are antigen presenting cells, were revealed as cells of choice for study one of these aspects. However today it is difficult to obtain a reliable and strong source of dendritic cells allowing working out a reglementary test. The aim of my thesis project was to propose an alternative model in these tests on animals. For it we set up the conditions allowing generating dendritic cells derived of stern cells. For it we have two sources of stem cells (hiPS) which having all the characteristics of the embryonic stem cells without raise ethical problems. These two types of cells allowed having an inexhaustible and plentiful source of dendritic cells. We set up one protocol allowing generating and purifying a population of dendritic cells from mouse embryonic stem cells. Cells were characterized by gene expression like CD45, CD86. Furthermore we realized as functional test that consists to measure the dextran-FICT endocytosis and the answer of this cellular population to allergenic reference molecules such as MCI/MI or TNBS. We also tried to generate “dendritic-like” cells from human iPS based to expression of specifics markers as CD45, CD34, CD1a, CD14, CD209, CD207, CD86 and HLA-DR. Several protocols were envisaged. However dendritic-like cells obtained represent a low percentage of differentiated cells and the protocol is in the course of optimization. Increasingly tests use keratinocytes cells for evaluate another aspect of allergenic response. So we were interesting also to these cells and we will present first steps differentiation of hiPS that will allow generating keratinocytes
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Hiriart, Emilye. "Modélisation cellulaire des étapes précoces de la valvulogenèse à partir d'un modèle de cellules souches embryonnaires humaines, et étude de l'implication d'Oct4 dans le phénomène de transition endothélio-mésenchymateuse lors de la formation des coussins endocardiques." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLE011.
Full textAbstract:
Les cardiopathies représentent la première cause de mortalité dans le monde, près de 30% des décès chaque année sont imputables à ce type de pathologies ; cette incidence a par ailleurs fortement augmentée au cours du siècle dernier (OMS). Les cardiopathies peuvent être classées en plusieurs sous-groupes de maladies cardio-vasculaires en fonction du tissu affecté par la pathologie. On différencie ainsi les maladies affectant les vaisseaux, le muscle cardiaque, le rythme (tissu pacemaker et de conduction) et les maladies des valves cardiaques. Les valvulopathies cardiaques peuvent être causées par des défauts des valves acquis ou innés et représentent près de 30 à 40% des malformations cardiaques recensées. Le pourcentage de patients atteints de valvulopathies augmente avec l’âge du patient, de plus, les valvulopathies représentent la principale cause de morbidité chez l’adulte, et l’enfant dans les pays développés.Ces défauts peuvent être d’origines génétiques, congénitales, toxicologique, ischémiques avec influence de différents facteurs de risques aussi bien génétiques qu’environnementaux, dans certains cas elles peuvent même être provoquées par des médicaments, le cas du Benfluorex (Mediator®) étant probablement le plus connu. Les défauts affectant les valves peuvent avoir de graves conséquences sur le fonctionnement du cœur. Ainsi, en 2008, aux États-Unis, il a été nécessaire de procéder au remplacement de près de 82000 valves cardiaques chez des patients adultes. Si le remplacement de valves cardiaques reste une avancée majeure pour les patients atteints de valvulopathies, l’utilisation de prothèses et de transplants valvulaires présentent néanmoins des limitations, notamment : une absence de croissance des prothèses, l’apparition de thromboses, ainsi que des rejets en cas de transplantation de valves allo-géniques, prélevées sur des donneurs en morts cérébrale. Ainsi, il est nécessaire d’étudier les mécanismes mis en jeu dès le développement embryonnaire, mécanismes qui pourrait avoir un effet délétère à plus ou moins long terme entrainant l’apparition d’une valvulopathie chez l’enfant, le jeune adulte ou chez la personne âgée. Pour cela l’utilisation d’un modèle cellulaire utilisable in vitro serait une avancée remarquable. Ce modèle permettrait à la fois d’élucider un certain nombre de mécanismes biologiques mis en place au cours du développement ou de la pathologie, mais aussi d’espérer la mise en place d’un protocole permettant l’utilisation clinique de cellules autologues reprogrammées pour la thérapie des tissus atteints de valvulopathies voire même une thérapie incluant une réparation endogèneHeart disease is the leading cause of death worldwide, nearly 30% of deaths each year are attributable to such diseases; this incidence has also greatly increased in the last century (WHO).Heart disease can be classified into several subgroups of cardiovascular disease based on the tissue affected by the pathology. It thus differs diseases affecting vessels, cardiac muscle, rhythm (fabric pacemaker and conduction) and heart valve disease. Heart valve disease can be caused by defects of innate and acquired or valves represent about 30-40% of heart defects identified. The percentage of patients with valvular heart disease patients increases with age of the patient, in addition, valvular heart disease is the leading cause of morbidity in adults and children in developed countries.These defects may be of genetic origin, congenital, toxicological, with ischemic influence of various risk factors both genetic and environmental, in some cases they can even be caused by medications, if the Benfluorex (Mediator®) are probably the most known. The defects in the valves can have serious consequences on the functioning of the heart. In 2008, the United States, it was necessary to proceed with the replacement of nearly 82,000 heart valves in adult patients.If the replacement heart valves remains a major advance for patients with valvular heart disease, the use of prostheses and transplants valves nevertheless have limitations, including: no growth prostheses, the occurrence of thrombosis and releases in cases of allo-transplantation of gene valves taken from brain dead donors. Thus, it is necessary to study the mechanisms involved early embryonic development, mechanisms that could have a deleterious effect more or less long term leading the development of valvular disease in children or young adults in the old person. For this the use of an in vitro cell model used is a remarkable achievement. This model would both elucidate a number of biological mechanisms during development or pathology, but also hope the development of a protocol for the clinical use of autologous cells reprogrammed to the therapy of patients with valvular tissue or even a therapy including an endogenous repair
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Terray, Angélique. "Développement de modèles in vitro de rétinites pigmentaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066614/document.
Full textAbstract:
Les rétinites pigmentaires (RP) sont des pathologies rétiniennes cécitantes d'origine génétique caractérisées par une perte des photorécepteurs. Nous avons ciblé des formes de RP autosomique dominante consécutives à des mutations dans le gène du pigment visuel de la RHODOPSINE, du facteur d'épissage PRPF31 et du facteur de transcription impliqué dans le développement des photorécepteurs NR2E3. Les fibroblastes, issus de biopsies de peau de patients, ont été reprogrammés en cellules iPS par une technique dite non intégrative. Après stabilisation des cellules iPS, nous avons vérifié leur propriété de pluripotence et l'absence d'anomalies caryotypiques.Les cellules iPS porteuses d'une mutation sur le gène RHODOPSINE ont été différenciées dans le lignage des photorécepteurs. Nos résultats montrent que les photorécepteurs porteurs de la mutation P347L du le gène RHODOPSINE récapitulent la dégénérescence observée chez les patients.Nous montrons que les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS porteuses de la mutation Cys294X du gène PRPF31 présentent des problèmes d'adhésion cellulaire due à l'absence de lame basale. Leur activité de phagocytose est alors perturbée, suggérant qu'un dysfonctionnement de l'EPR pourrait être à la base de la RP causée par la mutation Cys294X du gène PRPF31. Les modèles développés nous ont permis de mieux comprendre les processus à la base de la pathogénèse de certaines RP. Ces modèles associés à des protocoles de criblage, pourraient permettre d'évaluer l'efficacité et la toxicité de nouvelles molécules pharmacologiques, mais également être utilisés pour valider des approches de thérapie géniqueRetinitis pigmentosa (RP) is an inherited retinal diseases characterized by a loss of photoreceptors. We focused specific forms of autosomal dominant RP with mutations in the rod visual pigment RHODOPSIN, the ubiquitous splicing factor PRPF31 and the transcription factor involved in the development of photoreceptors NR2E3. Fibroblasts from skin biopsies of patients were reprogrammed into iPS cells by a non-integrative approach. After stabilization of iPS cell lines, we verified their pluripotency property and the absence of karyotype abnormalities. Based on the retinal differentiation protocol, iPS cells carrying a mutation in the RHODOPSIN gene have been differentiated in the photoreceptor lineage. Our results showed that the photoreceptors expressing the mutated form of RHODOPSIN summarizing the process of degeneration observed in RP patients. We show that retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from iPS cells carrying a mutation in the PRPF31 gene lack basal membranes and have cell adhesion disorders. Consequently, their phagocytic activity is disturbed, suggesting that a malfunction of the RPE could be the primary step of the development of RP caused by mutation Cys294X in the PRPF31 gene. The models developed from specific-patient iPS cells have enabled us to better understand the processes underlying the pathogenesis of some RP. These models associated with screening protocols could be used to evaluate the efficacy and toxicity of new pharmacologic compounds but also used to validate new gene therapy approaches
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Ahmed, Engi. "Modélisation de l'épithélium bronchique par les cellules souches pluripotentes induites humaines dans la Bronchopathie Pulmonaire Chronique Obstructive (BPCO)." Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT070.
Full textAbstract:
La BPCO (bronchopathie pulmonaire chronique obstructive) est un problème majeur de santé publique et représentera la 3ème cause de mortalité dans le monde en 2030. L’âge, le tabagisme, ainsi que la pollution atmosphérique via l’exposition aux particules de diesel mais également la pollution domestique – majoritairement représentée par la combustion domestique de biomasse – sont des facteurs de risque bien identifiés d’apparition d’une BPCO. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pouvant interférer avec l’histoire naturelle de la maladie.Les cellules souches pluripotentes, et notamment les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier en tous les types cellulaires de notre corps. Elles offrent une opportunité sans précédent de modéliser le développement humain normal et pathologique de l’appareil respiratoire.Ce projet de recherche a pour objectif de modéliser in vitro les trajectoires de la BPCO, en lien avec une origine développementale (racines pédiatriques) et/ou une susceptibilité au tabac. Afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie de la BPCO et de la susceptibilité au tabac, nous avons constitué deux groupes caricaturaux : i) 4 patients atteints d’une forme sévère de la BPCO, constituant le groupe « hautement susceptibles », ii) 4 patients fumeurs indemnes de BPCO ou tout autre comorbidité liée au tabac « hautement résistants » au tabac.Nous avons utilisés deux modèles de culture cellulaires in vitro : les hiPSCs et la culture de cellules épithéliales primaires bronchiques humaines (HBECs) cultivées en ALI (interface air liquide).Dans un premier temps, nous avons généré des lignées hiPSCs par reprogrammation cellulaire à partir du sang périphérique d’un sujet sain (contrôle), et de trois patients BPCO sévères hautement caractérisés. Dans un second temps, la différenciation dirigée des hiPSCs a permis de récapituler le développement pulmonaire précoce (génération de progéniteurs bronchiques NKX2.1) par la mise au point d’un protocole de différenciation dirigée robuste et reproductible sur plusieurs lignées hiPSCs. La maturation de ces progéniteurs bronchiques en culture 2D ou 3D a permis d’obtenir des structures épithéliales exprimant les marqueurs de cellules basales (KRT5), de cellules Club (CCSP), et ciliées (FOXJ1). Dans un second temps, ces épithélia seront exposés au tabac (CSE- cigarette smoke extract) afin d’induire un phénotype « BPCO-like ». Enfin, la culture des HBECs cultivées en ALI des patients BPCO sévères a été réalisée en condition exposée (CSE) et non exposée. La résistance transépithéliale, la motilité ciliaire, le profil sécrétoire et la diversité ARN ont été collecté.Ce travail a permis de mettre en place les outils nécessaires pour reproduire les trajectoires in vitro de la BPCO et élucider les origines de la pathologie. Les outils de séquençage à haut débit (transcriptomique dans notre étude), permettront de découvrir de nouveaux candidats, représentants de potentielles cibles en vue d’un criblage pharmacologiqueCOPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is a major public health problem and will be the 3rd leading cause of death in the world in 2030. Age, smoking, and air pollution through the exposure to particulate matter but also domestic pollution - mostly represented by domestic biomass combustion - are well-identified risk factors for the development of COPD. To date, there is no cure that can interfere with the natural history of the disease.Pluripotent stem cells, including induced pluripotent human stem cells (hiPSCs), are defined by two fundamental properties: self-renewal and the ability to differentiate into all cell types in our body. They offer an unprecedented opportunity to model the normal and pathological human development of the respiratory system.This research project aimed to model in vitro the trajectories of COPD, related to a developmental origin (pediatric roots) and / or susceptibility to tobacco. In order to elucidate the underlying mechanisms of COPD and tobacco susceptibility, we established two extreme groups: i) 4 patients with a severe form of COPD, the "highly susceptible" group, ii) 4 patients who are free of COPD or other tobacco-related comorbidity despite heavy smoking, called as "highly resistant" to tobacco.We have used two different but complementary in vitro cell culture models: hiPSCs and human bronchial primary epithelial cell cultures (HBECs) grown in ALI condition (Air Liquid Interface).First of all, we generate hiPSCs cell lines by reprogramming cells from peripheral blood of a healthy subject (control), and three highly characterized severe COPD patients. In a second step, the directed differentiation of hiPSCs allowed to recapitulate the early pulmonary development (NKX2.1 generation of bronchial progenitors) by the development of a robust and reproducible directed differentiation protocol of several hiPSCs lines. The maturation of these bronchial progenitors in 2D or 3D culture allows the generation of epithelial structures expressing markers of KRT5 + basal cells , CSSP + Club cells and FOXJ1 + ciliated cells. In a second step, these epithelia will be exposed to tobacco (CSE-cigarette smoke extract) in order to induce a "COPD-like" phenotype. Finally, ALI culture of HBECs of severe COPD patients was performed in unexposed and exposed condition (CSE). Transepithelial resistance, ciliary motility, secretory profile, and RNA diversity were collected.This work allowed to put in place the necessary tools to reproduce the in vitro trajectories of COPD and to clarify the origins of this pathology. The high throughput sequencing tools (transcriptomic in our study), will allow the discovery of new candidates, that represent potential targets for future pharmacological screening
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Rossiaud, Lucille. "Modélisation et compréhension de la glycogénose de type III grâce à l'utilisation de cellules souches pluripotentes induites humaines." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. https://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2024/interne/2024UPASL091.pdf.
Full textAbstract:
La glycogénose de type III (GSDIII) est une maladie génétique rare due à un déficit en enzyme débranchante du glycogène (GDE), provoquant une accumulation de glycogène dans le foie, le cœur et les muscles squelettiques. Alors que les atteintes hépatiques dominent durant l'enfance, les atteintes musculaires progressent et deviennent prédominantes à l'âge adulte. L'absence de modèles humains freine la compréhension de cette pathologie et la mise au point de traitements.Dans ce contexte, mon premier objectif était de créer des modèles pathologiques humains in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC). J'ai généré cinq lignées hiPSC pathologiques : quatre lignées dérivées de patients par reprogrammation et une lignée génétiquement modifiée par CRISPR/Cas9. Ces cellules ont ensuite été différenciées en myocytes et en hépatocytes, les deux types cellulaires pertinents pour l'étude de la GSDIII. J'ai confirmé que ces cellules expriment respectivement les marqueurs spécifiques des muscles et du foie, et récapitulent, en condition de privation de glucose, le phénotype d'accumulation de glycogène en comparaison à des cellules saines.Le deuxième objectif visait à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la GSDIII et à identifier de nouveaux biomarqueurs de la pathologie. Je me suis d'abord focalisée sur le muscle, pour lequel j'ai identifié, par séquençage ARN des myocytes dérivés d'hiPSC, des gènes différentiellement exprimés entre cellules saines et pathologiques. Une analyse comparative avec les données d'un séquençage ARN réalisés sur des biopsies de triceps de souris saines et GSDIII a révélé la surexpression d'un gène commun codant pour la Galectine-3, un marqueur de vésicules endommagées. Sa surexpression a été validée dans les myocytes mutés dérivés d'hiPSC, ainsi que dans les triceps de souris GSDIII et dans des biopsies de patients. En parallèle, une approche similaire sur les hépatocytes dérivés d'hiPSC a permis d'identifier de potentiels biomarqueurs du foie, ouvrant la voie à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques hépatiques. Le dernier objectif était d'utiliser ces modèles pathologiques humains in vitro pour tester de nouvelles thérapies. J'ai démontré que le traitement de myocytes mutés par des vecteurs AAV exprimant la GDE humaine complète ou tronquée, préalablement validés dans des modèles in vivo de souris et de rats GSDIII, diminuait l'accumulation de glycogène à des niveaux comparables à ceux de cellules saines. Ces expériences ont confirmé l'intérêt du développement de ces nouveaux modèles in vitro. L'ensemble de ces travaux ont permis l'identification de nouveaux biomarqueurs de la GSDIII, permettant d'améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires dans le muscle et le foie. La création de ces nouveaux modèles in vitro ouvre également de nouvelles perspectives thérapeutiques pour la GSDIII, notamment en facilitant le criblage de médicamentsGlycogen storage disease type III (GSDIII) is a rare genetic disorder caused by glycogen debranching enzyme (GDE) deficiency, leading to an accumulation of glycogen accumulation in the liver, heart and skeletal muscles. While liver damages predominate in childhood, muscle impairments progress and become predominant in adulthood. The lack of human models hinders our understanding of the disease and the development of treatments.In this context, my first objective was to create in vitro human pathological models from induced pluripotent stem cells (hiPSCs). I generated five pathological hiPSC lines: four lines derived from patients by reprogramming and one line genetically modified by CRISPR/Cas9. These cells were then differentiated into myocytes and hepatocytes, the two relevant cell types for the study of GSDIII. I confirmed that these cells express muscle and liver specific markers respectively, and recapitulate the glycogen accumulation phenotype under glucose starvation conditions compared to healthy cells.The second objective was to better understand the pathophysiological mechanisms of GSDIII and to identify new biomarkers of the disease. I first focused on muscle, for which I identified genes differentially expressed between healthy and pathological cells by RNA sequencing of hiPSC-derived myocytes. Comparative analysis with RNA sequencing data from triceps biopsies of healthy and GSDIII mice revealed overexpression of a common gene encoding galectin-3, a marker of damaged vesicles. This overexpression was validated in mutated myocytes derived from hiPSCs, as well as in the triceps of GSDIII mice and in patient biopsies. In parallel, a similar approach on hiPSC-derived hepatocytes identified potential liver biomarkers, paving the way for a better understanding of the mechanisms of liver damage.The final objective was to use these in vitro human pathological models to test new therapies. I demonstrated that treatment of mutated myocytes with AAV vectors expressing complete or truncated human GDE, previously validated on in vivo GSDIII mouse and rat models, reduced glycogen accumulation to levels comparable to those of healthy cells. These experiments confirmed the value of developing these new in vitro models.Taken together, this work has led to the identification of new biomarkers for GSDIII, providing a better understanding of the molecular mechanisms in muscle and liver. The creation of these new in vitro models also opens up new therapeutic prospects for GSDIII, particularly by facilitating drug screening
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Rabesandratana, Oriane. "Les cellules ganglionnaires rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes humaines : de la caractérisation à la transplantation." Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS322.
Full textAbstract:
Parmi les stratégies en développement de nouveaux traitements pour les neuropathies optiques, la thérapie cellulaire par transplantation de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) dérivées de cellules pluripotentes humaines est l’un des axes de recherche les plus prometteurs. Au cours de la réalisation du projet présenté dans ce document, nous avons validé la production optimisée de CGRs, à partir de quatre lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines, par une double sélection selon les conditions de culture in vitro et un protocole de tri magnétique basé sur l’expression de l’antigène de surface CD90/THY1. Nous avons caractérisé les CGRs enrichies par ce double protocole de sélection selon leurs propriétés morphologiques, moléculaires et fonctionnelles. Ces résultats furent validés pour un total de quatre lignées cellulaires iPS, dont une lignée rapportrice fluorescente ubiquitaire, générée par stratégie Crispr-Cas9. La transplantation par injection intravitréenne des CGRs dérivées de cette lignée rapportrice, sur un modèle murin ayant subi un écrasement du nerf optique, a permis d’observer une intégration partielle des cellules survivantes dans la rétine hôte permettant d’établir la preuve de concept quant à la possibilité de réaliser ce type de transplantation. Ce travail devra être poursuivi afin d’étudier la capacité de ces cellules à établir des contacts fonctionnels avec les partenaires rétiniens et cérébrauxAmong the different treatments for optic neuropathies, cell therapy using transplantation of retinal ganglion cells (RGCs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) is one of the most promising strategy. In this project, we validated the optimized production of RGCs from retinal organoids derived from four different hiPSC lines. Our methodology included a double selection process, comprising the culture of retinal dissociated cell in adherent conditions and a magnetic sorting protocol, based on the expression of surface antigen CD90/THY1. We identified enriched RGCs resulting from this double protocol, according morphological, molecular and functional properties. These results were validated for all four hiPSC lines, including a ubiquitous fluorescent reporter cell line, using Crispr/Cas9 strategy. Intravitreal injection of reporter hiPSC line-derived RGCs into an optic nerve crush mouse model led to a partial integration of surviving cells into the host retina establishing the possibility to performed RGC transplantation. This work will be continued in order to explore the capacity of hiPSC-derived RGCs to reconnect with both retinal partners and with the different targets in the brain
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Denis, Jérôme Alexandre. "Applications médicales et pharmaceutiques des cellules souches pluripotentes : vers un changement de paradigme ?" Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00637075.
Full textAbstract:
Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.
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Dianat, Noushin. "Cellules souches pluripotentes humaines et modélisation de maladies hépatiques : l'hypercholestérolémie familiale et les cholangiopathies." Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA114810.
Full textAbstract:
La thérapie cellulaire pourrait représenter une alternative à la transplantation hépatique dans certaines pathologies comme les maladies métaboliques sévères. Toutefois, la pénurie de donneurs d’organes implique la nécessité de trouver de nouvelles sources de cellules hépatiques comme les cellules souches pluripotentes qui peuvent être amplifiées extensivement et différenciées en tout type cellulaire. Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) générées à partir des cellules somatiques de patients puis différenciées en hépatocytes représentent une source potentielle d’hépatocytes. Ces cellules permettent en outre d’envisager la transplantation d’hépatocytes autologues génétiquement modifiés comme alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies génétiques du foie. L’hypercholestérolémie familiale (HF) est une maladie autosomale dominante due à des mutations dans le gène codant le Récepteur aux Low Density Lipoproteins (RLDL) qui est à l’origine d’un taux élevé de cholestérol sanguin de patients HF. Les patients homozygotes doivent épurer leur sérum par LDL-aphérèse en moyenne deux fois par mois dès le plus jeune âge pour éviter les infarctus mortels survenant dès l’enfance. Les hépatocytes différenciées à partir des iPSC de patients et leur correction in vitro, permettent d'évaluer la faisabilité de la transplantation d'hépatocytes autologues génétiquement modifiés pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale.Au cours du développement du foie, des hépatocytes et des cholangiocytes, les deux types de cellules épithéliales hépatiques, dérivent de progéniteurs hépatiques bipotents (les hépatoblastes). Bien que les cholangiocytes formant les canaux biliaires intrahépatiques ne représentent qu'une petite fraction de la population cellulaire totale du foie (3%), ces cellules régulent activement la composition de la bile par réabsorption des acides biliaires, un processus qui est important dans des maladies choléstatiques du foie. Dans la première partie de cette étude nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches pluripotentes (hESC et hiPSC) en cholangiocytes fonctionnels. Ces cellules serviront à la modélisation des maladies génétiques touchant les cholangiocytes formant des canaux biliaires. Dans la deuxième partie, nous avons généré des iPSC spécifiques de patients HF (HF-iPSC), différenciées en hépatocytes et corrigé le défaut phénotypique par transfert lentiviral de l’ADNc codant le LDLR dans les HF-iPSCCell therapy can be an alternative to liver transplantation in some cases such as severe metabolic diseases. However, the shortage of organ donors implies the need to find new sources of liver cells such as hepatocytes derived from pluripotent stem cells that can be amplified and differentiated extensively into any cell type. Human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells of patients and then differentiated into hepatocytes represent a potential source of transplantable hepatocytes. These cells now make it possible to consider the transplantation of genetically modified autologous hepatocytes as an alternative to liver transplantation for the treatment of genetic diseases of the liver.Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the gene encoding the receptor for Low Density Lipoproteins (LDLR), which is the cause of high blood cholesterol in these patients. Homozygous patients should purify their serum LDL-apheresis on average twice a month starting at a young age to avoid fatal myocardial infarction occurring in childhood.Human hepatocytes differentiated from patient’s induced pluripotent stem cells (iPSCs) allow assessing the feasibility to transplant genetically modified autologous hepatocytes as treatment of familial hypercholesterolemia.During the liver development, hepatocytes and cholangiocytes, the two types of hepatic epithelial cells, derive from bipotent hepatic progenitors (hepatoblasts). Although cholangiocytes, forming intrahepatic bile ducts, represent a small fraction of the total liver cell population (3%), they actively regulate bile composition by secretion and reabsorption of bile acids, a process that is important in cholestatic liver diseases. In the first part of this study we developed an approach to differentiate pluripotent stem cells (hESC and hiPSC) into functional cholangiocytes. These cells could be used for the modeling of genetic biliary diseases. In the second part, we generated FH patient specific iPSCs (HF-iPSC), differentiated them into hepatocytes and tried to correct the disease phenotype by lentiviral introduction of LDLR cDNA cassette in HF-iPSC
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Roudaut, Méryl. "Les cellules souches pluripotentes induites humaines : un modèle innovant pour la découverte d’une nouvelle fonction de PCSK9 et la mise en place d’organoïdes de foie." Thesis, Nantes, 2020. http://www.theses.fr/2020NANT1023.
Full textAbstract:
Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) offrent une alternative particulièrement attractive pour l ‘étude de nouvelles fonctions liées à des pathologies ainsi que la mise en place de modèles d’études innovants. C’est dans ce contexte que nous étudions un acteur clé de la régulation du métabolisme du cholestérol par les hépatocytes, PCSK9. Lors de la différenciation des hiPSC en hépatocytes, nous avons mis en évidence un rôle inattendu de PCSK9 dans les cellules indifférenciées. Grâce à l’utilisation d’outils de surexpression, d’invalidation de gène par une approche CRISPR/Cas9 ou d’hiPSC d’un patient portant des mutations pertes de fonction de PCSK9, nous avons pu mettre en évidence une action régulatrice de PCSK9 sur la voie TGFß. Cet effet serait médié par une action de PCSK9 sur la protéine DACT2, un régulateur négatif de la sous-unité R1 du récepteur au TGFßR. Les effets de PCSK9 sur DACT2 entrainent une modification de la phosphorylation de SMAD2 et subséquemment la prolifération des hiPSC. En parallèle, afin d’améliorer les fonctions hépatiques des hiPSC différenciées, nous avons mis en place une nouvelle procédure permettant d’obtenir de façon simple des organoïdes hépatiques. Pour cela les hiPSC sont mises en culture dans un hydroscaffold modifié, BIOMIMESYS®, produit par HCS Pharma dans un format 96-puits pour adapter le modèle au criblage moléculaire. Notre procédure récapitulant les étapes clés du développement hépatiques nous a permis d’obtenir des organoïdes hépatiques comprenant en plus des hépatocytes, des cellules biliaires, étoilées et endothéliales. Leur caractérisation fonctionnelle nous a permis de mettre en évidence des activités de cytochrome supérieur au modèle en 2D, ainsi qu’une excellente réponse pharmacologique suite à leur capacité à accumuler les lipides lors d'un traitement à l'amiodarone ou à l’éthanol ainsi qu’à absorber les LDL-bodipy après traitement aux statines. Notre modèle pouvant être personnalisé et automatisable, offre de nouvelles perspectives pour le criblage moléculaire à haut débitHuman induced pluripotent stem cell (hiPSC) offer an attractive alternative to study novel functions linked to diseases and to setup innovative models. In this context, we studied a key player of the hepatic cholesterol metabolism regulation, PCSK9. Upon hiPSC differentiation into hepatocyte-like cells, we found an unexpected role of PCSK9 in undifferentiated cells. Using tools such as overexpression, CRISPR/Cas9-mediated gene invalidation, and hiPSC derived from a patient carrying PCSK9 loss of functions mutations, we found a regulatory effect of PCSK9 on the TGFß pathway. This effect is mediated by DACT2, a negative regulator of the TGFßR subunit R1. Through DACT2 modulation by PCSK9, the SMAD2 phosphorylation is impacted, thus hiPSC proliferation. In parallel, to enhance hepatic cells functions generated from hiPSC, we setup a new simplified procedure to obtain liver organoïdes. hiPSC are cultured in a modified hydroscaffold, BIOMIMESYS®, produced by HCS Pharma in a 96-well format suitable for molecular screening. Our procedure, recapitulating key steps of liver development, allowed us to generate liver organoids including not only hepatocytes but also, biliary-, stellate- and endothelial-cells. Functional characterizations showed enhanced cytochrome activities compared to HLC and excellent pharmacological responses with lipid accumulation upon amiodarone or ethanol treatments and LDL-bodipy uptake upon statin treatments. As our model can be personalized and automatized, if offers a new perspective for high content molecular screening
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Frank, Elie. "Modélisation du Syndrome d'Alström à partir de cellules souches pluripotentes humaines pour l'identification de cibles moléculaires d'intérêt thérapeutique." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASQ041.
Full textAbstract:
Le syndrome d'Alström (SA) est une maladie monogénique récessive multi-systémique, caractérisée notamment par une perte de l'audition et de la vue, une obésité, un diabète de type 2, une cardiomyopathie et une insuffisance hépatique et rénale progressive. Les symptômes affectant la vision se développent dès les premières semaines après la naissance et mènent progressivement à une perte totale de la vue. À l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de soigner cette maladie et seules des solutions permettant de réduire les effets des symptômes peuvent être proposées.L'objet de la thèse est de mettre au point un modèle cellulaire du SA dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires entrainant la maladie et d'identifier des cibles thérapeutiques.Nous avons obtenu différents clones présentant des mutations pathologiques ou de novo à l'aide de systèmes d'édition génomique associés à CRISPR/Cas9. Nous avons caractérisé ces clones modèles en cherchant à identifier des marqueurs phénotypiques particuliers au sein des CSPih. Les mutations engendrées ne provoquent pas de changement des propriétés de ces cellules.Dans un second temps, toujours dans le but d'identifier un phénotype pathologique, nous avons différencié les lignées de CSPih modèles en cellules de l'EPR. Là encore, nous n'avons pas identifié de marqueur phénotypique spécifique. Enfin, nous avons différencié les lignées de CSPih modèles en organoïdes neuro-rétiniens afin d'étudier le développement des cellules rétiniennes au sein de ces structures avec une attention particulière apportée aux photorécepteurs. Nous avons ainsi pu constater une absence ou une réduction d'expression des opsines caractéristiques des cônes et des bâtonnets dans les organoïdes issus de CSPih mutées dans ALMS1. De plus, ces organoïdes présentent une mortalité cellulaire accrue par rapport aux organoïdes issus des lignées de CSPih saines. Ces éléments laissent penser que les photorécepteurs dégénèrent durant leur différenciation au sein des organoïdes. Les mécanismes par lesquels les mutations dans ALMS1 entrainent cette dégénérescence ne sont pas élucidés à l'heure actuelle.Les modèles cellulaires du SA présentés dans cette thèse reproduisent donc un phénotype pathologique et seront des outils précieux pour la compréhension des mécanismes responsables des symptômes visuels de la maladie et pavent la voie à des stratégies de criblage visant à identifier de nouvelles cibles thérapeutiquesAlström syndrome (AS) is a monogenic recessive multi-systemic disease characterized by hearing and vision loss, obesity, type 2 diabetes, cardiomyopathy and progressive liver and kidney failure. Symptoms affecting vision develop in the first few weeks after birth and gradually lead to total loss of sight. At present, there is no cure for this disease, and only solutions that reduce the effects of the symptoms can be proposed.The aim of this thesis is to develop a cellular model of AS with a view to understanding the molecular mechanisms driving the disease and identifying therapeutic targets.We obtained different clones with pathological or de novo mutations using genome-editing systems associated with CRISPR/Cas9. We characterized these model clones by seeking to identify specific phenotypic markers within the hiPSCs. The mutations generated did not change the properties of these cells.In a second step, still with the aim of identifying a pathological phenotype, we differentiated the model iPSC lines into RPE cells.Again, no specific phenotypic marker was identified. Finally, we differentiated our model hiPSC lines into neuroretinal organoids to study retinal cells development within these structures with a particular focus on photoreceptors. We were able to observe the absence or reduced expression of opsins characteristic of cones and rods in organoids derived from ALMS1-mutant hiPSCs. In addition, these organoids showed increased cell death compared with organoids derived from healthy hiPSC lines. This suggests that photoreceptors degenerate during differentiation within organoids. The mechanisms by which mutations in ALMS1 lead to this degeneration remain unclear.The cellular models of AS presented in this thesis therefore reproduce a pathological phenotype and will be invaluable tools for understanding the mechanisms responsible for the visual symptoms of the disease, and pave the way for screening strategies aimed at identifying new therapeutic targets
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Bourguignon, Chloé. "Modélisation de l’effet de la pollution atmosphérique sur l’épithélium bronchique : les cellules souches pluripotentes induites humaines, une nouvelle voie d’étude de l’exposome ?" Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT018.
Full textAbstract:
La pollution atmosphérique est responsable d’environ 7 millions de décès prématurés par an au niveau mondial. Les particules fines (PM2.5) en particulier, jouent un rôle majeur dans le développement de pathologies respiratoires chroniques telles que la bronchopneumopathie obstructive chronique et l’asthme. Plusieurs études ont récemment mis en évidence que ces maladies pouvaient prendre racine dès l’enfance, au cours du développement pulmonaire. Il existe cependant peu de modèles précliniques permettant d’étudier ces étapes précoces et critiques en santé respiratoire. Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont capables de se différencier vers tous les types cellulaires de l’organisme. Elles offrent ainsi une formidable opportunité de modéliser in vitro le développement pulmonaire et plus particulièrement celui de l’épithélium bronchique, dans le cadre de ces pathologies respiratoires chroniques.Grâce à un protocole de différenciation de hiPSC vers un épithélium bronchique fonctionnel, nous pouvons mimer les étapes clés de la morphogenèse bronchique in vitro en reproduisant les stades d’endoderme définitif, d’intestin primitif antérieur, de progéniteurs bronchiques jusqu’au stade d’épithélium bronchique composé de cellules multiciliées, à mucus, basales, club et neuroendocrines. En exposant à différents stades du protocole cet épithélium à des particules fines de pollution atmosphérique, nous avons pu mettre en évidence une cytotoxicité provoquée par de fortes doses de PM2.5, une induction de mécanismes de stress oxydant et d’inflammation, ainsi qu’un impact sur le processus de différenciation : diminution des marqueurs d’intestin primitif antérieur et de progéniteurs bronchiques aux étapes précoces ; modifications de la proportion des marqueurs de cellules terminales aux étapes tardives.Les résultats de ce travail ouvrent de nouvelles perspectives dans l’étude de l’impact de la pollution atmosphérique sur le développement pulmonaire. En enrichissant ce modèle d’autres compartiments cellulaires du poumon, en développant de nouveaux systèmes d’exposition et en variant le fond génétique des hiPSC, les propriétés d’auto-renouvellement virtuellement illimité de ces cellules souches pourraient permettre une évaluation à grande échelle de l’impact de nombreux facteurs environnementaux, au cours du développementABSTRACTAir pollution is one of the largest environmental cause of disease and every year, 7 millions of premature deaths are attributable to air pollution worldwide. Ambient fine particulate matter plays a major role in the development of chronic respiratory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or asthma. Recently, several studies have highlighted pediatric roots in the trajectories of these diseases. However, only few preclinical models are available to study these early developmental stages yet critical in respiratory health. Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are able to differentiate into all cell types of human body. Thus, they offer a great opportunity to recapitulate lung development in vitro, especially bronchial airway development.Thanks to our differentiation protocol of hiPSC into functional airway epithelium, we can mimic in vitro key bronchial development steps: definitive endoderm, anterior foregut endoderm, lung progenitors towards functional epithelial cells such as ciliated cells, goblet cells, basal cells, club cells and neuroendocrine cells. PM2.5 exposure performed at different steps of the protocol showed high doses related cytotoxicity, oxidative stress and inflammatory responses. An effect on differentiation process was also observed with a decrease of anterior foregut endoderm and lung progenitors markers along with a modification in differentiated cells proportion.These results open new possibilities to study air pollution impact on lung development. Thanks to hiPSC self-renewal property, high scale exposure studies of environmental factors impact on lung development could emerge by adding new cell types to this model, developing new exposure systems and modifying genetic background of hiPSC
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Mery-Bories, Julie. "Utilisation des cellules souches pluripotentes humaines pour avancer dans la compréhension des atteintes neuromusculaires associées à la Dystrophie Myotonique de type 1 Building neuromuscular junctions invitro." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. https://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2021/interne/2021UPASL012.pdf.
Full textAbstract:
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire rare, principalement caractérisée par une myotonie, une faiblesse et une atrophie musculaire. La DM1 est une maladie autosomique dominante causée par une expansion anormale de triplets CTG, corrélée à la gravité de la maladie, située dans la région 3' non codante du gène DMPK. Cette mutation engendre un gain de fonction toxique des ARNm mutants qui s'agrègent dans le noyau en séquestrant des protéines de liaisons à l'ARN comme la famille des protéines MBNL. Plusieurs études ont suggéré une implication des motoneurones et de la jonction neuromusculaire dans les défauts musculaires observés chez les patients DM1. Cependant, les mécanismes à l'origine de ces atteintes sont encore peu compris. Le but de ce projet était de mettre en lumière les conséquences directes et indirectes de la mutation DMPK et de la séquestration des protéines MBNL dans le compartiment pré-synaptique et de déterminer la contribution pathologique des motoneurones dans la physiopathologie de la DM1. Grâce à un récent développement publié par l'équipe permettant de différencier efficacement des motoneurones à partir de cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSC), nos résultats démontrent que les motoneurones dérivés de hiPSC DM1 présentent un défaut d'arborisation neuritique, retrouvé lors de la déplétion des protéines MBNL dans ce même type cellulaire. Pour évaluer les conséquences fonctionnelles de ce défaut, nous avons développé un modèle humain de co-culture de motoneurones dérivés de hiPSC associés à des cellules musculaires primaires humaines sur un support micropatterné. Nos résultats démontrent que la mutation DM1, présente uniquement dans le compartiment pré-synaptique, mène à des défauts fonctionnels post-synaptiques. De façon intéressante, des résultats identiques sont obtenus après l'extinction des protéines MBNL dans le compartiment pré-synaptique. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié un panel de gènes dérégulés impliqués dans la plasticité synaptique pouvant potentiellement affecter la fonctionnalité ou l'intégrité de la jonction neuromusculaire. Ces résultats soulèvent l'importance de nouvelles contributions dans la pathogénicité de la DM1Myotonic Dystrophy type I (DM1) is a rare neuromuscular disease that is mainly characterized by myotonia, progressive muscle weakness and wasting. DM1 is an autosomal dominant disorder caused by an expanded CTG repeat in the 3' UTR of DMPK gene. This abnormal expansion leads to a toxic gain-of-function of the mutated mRNAs which aggregate within the nucleus in association with different RNA binding proteins such as the MBNL family proteins. Several studies suggest the involvement of motoneurons and the neuromuscular junction in the muscular defects observed in DM1 patients. However, the mechanisms by which this intercellular system might be affected in DM1 is still poorly understood. The aim of this project was to decipher the direct and indirect consequences of the DMPK mutation and the impact of MBNL sequestration in the pre-synaptic compartment and determine the pathological contribution of motorneurons in DM1 physiopathology. Thanks to the recent development by the team of a protocol allowing the efficient conversion of human pluripotent stem cells (hiPSCs), our results demonstrated that DM1 hiPSC-derived motoneurons exhibit a defective neuritic arborization that can be mimicked by the depletion of MBNL proteins. To further evaluate the functional consequences of these findings, we developed a humanized cellular model based on the coculture of hiPSC-derived motoneurons and micropatterned human primary skeletal muscle cells. Our results demonstrated that expression of DM1 mutation only in the pre-synaptic compartment led to functional defects at the post-synaptic level. Interestingly, similar results were obtained with the specific depletion of MBNL proteins in the pre-synaptic compartment.Thanks to a transcriptomic approach, we identified a panel of deregulated genes involved in synaptic plasticity which may affect function or stability of the neuromuscular junction. Altogether, these findings hold several new implications for DM pathogenesis
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Bizy, Alexandra. "Sélection des myocytes atriaux et ventriculaires dérivés des cellules souches pluripotentes humaines induites basée sur l’expression des isoformes de chaînes légères de myosine." Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066590.
Full textAbstract:
Current cardiac differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) lead to mixed populations of atrial-, ventricular-, and nodal-like cardiac myocytes (CMs), which limits their use for cardiac research. To overcome this limitation, we have developed an iPSC-CM marking system using recombinant adenoviral reporter constructs with atrial- or ventricular-specific myosin light chain-2 promoters, MLC-2a and MLC-2v. FACS-purified MLC-2a and MLC-2v CMs recapitulate well-known structural and functional differences between human atrial and ventricular CMs. However, if MLC-2v constitutes a robust marker to purify ventricular CMs, promoting maturation of hiPSC-CMs would increase the specificity of the MLC-2a promoter for atrial cells. Another hurdle to overcome when working with hiPSC-CMs is their immature phenotype. Previous studies have demonstrated the importance of the extracellular matrix in the maturation of the cells. Thus, we have tested the influence of different matrices on hiPSC-CMs and we have identified 2- and 3-dimensional extracellular matrices that enhance maturation of the CMs towards an adult-like phenotype. Purification and maturation of hiPSC-CMs constitute important advances in the field and offer interesting perspectives for fundamental and clinical researchLes protocoles de différentiation des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines en cardiomyocytes (CMs) aboutissent à la présence concomitante de cellules atriales, ventriculaires et nodales, ce qui limite leur utilisation. Pour surmonter cette limitation, nous avons construit des adénovirus avec le gène de la GFP sous le contrôle des promoteurs des chaînes légères de myosine atriale et ventriculaire MLC-2a et MLC-2v. Nous montrons que ce système de marquage à la GFP associé à la technique de cytometry en flux est efficace pour la purification de CMs présentant les caractéristiques structurales et fonctionnelles de cellules atriales et ventriculaires humaines. Cependant, si MLC-2v est un marqueur robuste pour purifier les cellules ventriculaires, promouvoir la maturation des CMs dérivés des CSPi renforcerait la spécificité du promoteur MLC-2a pour les cellules atriales. Une autre barrière à l’utilisation des CMs différenciés est leur phénotype immature. Plusieurs études ont démontré l’importance de la matrice extracellulaire dans la maturation des cellules. Nous avons donc testé l’influence de différents types de matrices sur la maturation des CMs dérivés CSPi et avons identifié des matrices extracellulaires en 2 et 3 dimensions favorisant le développement des CMs vers un phénotype adulte. Purification et maturation des CMs dérivés des CPSi constituent des avancées importantes pour leur utilisation en recherche fondamentale et clinique
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Raïs, Célia. "Analyse histologique et fonctionnelle du développement de précurseurs neuraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines greffés dans le cortex de la souris." Thesis, Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=http://theses-intra.upmc.fr/modules/resources/download/theses/2019SORUS333.pdf.
Full textAbstract:
Les anomalies du neurodéveloppement sous-tendent entre autres les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou l’autisme. L'hétérogénéité génétique de l'être humain rend cependant complexe l'établissement d'un lien entre un génome donné et les programmes de développement qui peuvent mener à une maladie. Pour répondre à ce problème, les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont un outil ethique et efficace. Elles sont capables de se développer et de se différencier en neurones fonctionnels, en utilisant un mécanisme similaire au développement in vivo. J’ai étudié un modèle permettant de suivre l’intégration et la migration de précurseurs neuraux issus d’iPSC humaines dans le cortex de souris. En marquant les cellules greffées par immunofluorescence, j’ai pu montrer qu’elles se différencient principalement en neurones des couches supérieures du cortex. J’ai étudié les relations entre l’hôte et la greffe, et montre que les cellules de la souris participent au développement de la greffe, en apportant une vascularisation, et en myélinisant les neurones humains en développement. Enfin, j’ai suivi le développement fonctionnel des neurones humains en utilisant une lignée exprimant un indicateur calcique, le GCaMP6f, et en observant chroniquement les souris injectées au microscope 2-photons. Cette activité évolue au cours du temps, et reflète un cerveau prénatal humain. Ce modèle offre des possibilités nouvelles de modélisation in vivo du developpement cortical humain, notamment dans l’étude de l’impact d’altérations génétiques dans le cadre de maladies psychiatriquesNeurodevelopmental abnormalities underlie psychiatric diseases such as schizophrenia or autism, among others. However, the genetic heterogeneity of human beings makes it difficult to establish a link between a given genome and development programs that can lead to a disease. To address this problem, induced pluripotent stem cells (iPSCs) are an ethical and effective tool. They are able to develop and differentiate into functional neurons, using a mechanism similar to in vivo development. I studied a model enabling the integration and migration of neural precursors from human iPSCs into the mouse cortex. By labelling the cells grafted by immunofluorescence, I was able to show that they differentiate mainly into upper layer cortical neurons. I have studied the relationship between host and grafted cells , and show that mouse cells participate in the development of the graft, providing vascularization, and myelinating developing human neurons. Finally, I followed the functional development of human neurons using a cell line expressing a calcium indicator, GCaMP6f, and chronically observing injected mice under a 2-photon microscope. This activity changes over time, and reflects a prenatal human brain. This model offers new possibilities for in vivo modelling of human cortical development, particularly in the study of the impact of genetic alterations in the context of psychiatric diseases
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Merien, Antoine. "Étude de la fonction des protéines MBNL au cours du développement à l’aide de cellules souches humaines induites à la pluripotence." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. https://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2021/interne/2021UPASQ015.pdf.
Full textAbstract:
L'épissage alternatif est apparu comme un mécanisme fondamental non seulement pour la diversification des isoformes des protéines mais aussi pour la régulation spatio-temporelle du développement. Par conséquent, une meilleure compréhension de la manière dont ce mécanisme est régulé permettrait non seulement d'élucider les principes biologiques fondamentaux, mais aussi de déchiffrer les mécanismes pathologiques impliqués dans les maladies dans lesquelles ces processus moléculaires sont dérégulés. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé des cellules souches pluripotentes humaines pour déchiffrer, au cours de la myogenèse humaine, le rôle des protéines MBNL, une famille de régulateurs d'épissage spécifiques aux tissus dont la perte de fonction est associée à la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), une maladie neuromusculaire héréditaire. Grâce à la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des cellules souches pluripotentes d'origine humaine (hiPSC) déplétées en protéines MBNL et évalué les conséquences moléculaires et fonctionnelles de cette perte sur la génération de cellules musculaires squelettiques. Nos résultats ont indiqué que les protéines MBNL sont spécifiquement requises pour la maturation myogénique tardive mais pas pour l'engagement myogénique précoce. Par une analyse transcriptomique, nous avons pu mettre en évidence les voies moléculaires régulées par ces protéines durant la myogenèse, ainsi que les phénomènes de compensation entre les paralogues MBNL. Cette étude nous a également permis d’identifier un nouveau défaut d’épissage alternatif dans la DM1, régulé par les protéines MBNL, et qui aboutit à des anomalies structurelles du compartiment post-synaptique musculaire. Ensemble, nos résultats révèlent à la fois la temporalité de l’action des protéines MBNL dans la myogenèse humaine et permettent également d’identifier de nouvelles voies moléculaires régulées par ces protéines et pouvant être impliquées dans le développement de la DM1. A plus long terme, les outils développés dans cette étude devraient également faciliter l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques capables de faire face à la perte de fonction de ces protéinesAlternative splicing has emerged as a fundamental mechanism not only for the diversification of protein isoforms but also for the spatiotemporal control of development. Therefore, a better understanding of how this mechanism is regulated has the potential not only to elucidate fundamental biological principles, but also to decipher pathological mechanisms involved in diseases where normal splicing networks are mis-regulated. As part of this thesis, we took advantage of human pluripotent stem cells to decipher during human myogenesis the role of MBNL proteins, a family of tissue-specific splicing regulators whose loss of function is associated with Myotonic Dystrophy type 1 (DM1), an inherited neuromuscular disease. Thanks to the CRISPR/Cas9 technology, we generated human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) depleted in MBNL proteins and evaluated the molecular and functional consequences of this loss on the generation of skeletal muscle cells. Our results indicated that MBNL proteins are specifically required for the late myogenic maturation but not for early myogenic commitment. By a transcriptomic analysis, we were able to highlight the molecular pathways regulated by these proteins during myogenesis, as well as the compensatory effects between MBNL paralogs. This study also allowed us to identify a new alternative splicing defect in DM1, regulated by MBNL proteins, which leads to structural abnormalities of the muscular post-synaptic compartment. Together, our results reveal the temporal requirement of MBNL proteins in human myogenesis and allow the identification of new molecular pathways regulated by these proteins that could be involved in the development of DM1. In the longer term, the tools developed in this study should also facilitate the identification of new therapeutic strategies capable to cope with the loss of function of these proteins
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Martineau, Sabrina. "Etude des mécanismes moléculaires de l'épidermolyse bulleuse simple à partir de cellules souches humaines induites à la pluripotence." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASQ020.
Full textAbstract:
L'Epidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie cutanée principalement causée par des mutations dominantes dans les gènes codant les kératines 5 (KRT5) ou 14 (KRT14). Elle se caractérise notamment par la présence de cloques causées par un décollement de l'épiderme et une inflammation cutanée. D'un point de vue génétique, les mutations vont altérer l'assemblage du réseau de filaments intermédiaires de kératines dans les kératinocytes basaux de l'épiderme et entrainer une cytolyse cellulaire d'où la formation de cloques intra épidermiques. Il n'existe actuellement aucune approche thérapeutique efficace. La compréhension de la maladie et le développement de thérapies, ont été entravées par le manque de modèles cellulaires humains et murins relevant.Ainsi, l'objectif général de ma thèse a consisté à exploiter les propriétés des cellules souches induites à la pluripotence (hiPSc) pour modéliser l'EBS. Dans ce but, nous avons généré des kératinocytes à partir d'hiPSc provenant de patients EBS porteurs de mutations dans le gène KRT5 (Ker-EBS), et de patients sains (Ker-WT). La comparaison des Ker-EBS et Ker-WT nous a permis de montrer que les Ker-EBS récapitulent les principaux phénotypes associés à l'EBS à savoir une diminution de la prolifération cellulaire, une augmentation de la migration cellulaire, une altération des voies de signalisation (ERK et JNK), ainsi que des agrégats de filaments intermédiaires de kératines dans le cytoplasme, tel qu'observé dans kératinocytes primaires de l'EBS. Ces résultats démontrent que notre modèle cellulaire dérivés d'hiPSc est relevant pour l'étude de l'EBS.Afin d'identifier de nouveaux mécanismes moléculaires, une analyse trancriptomique comparant les Ker-EBS aux Ker-WT, a mis en évidence 138 gènes dérégulés, révélant un enrichissement dans les processus liés à la matrice extracellulaire, au packaging de l'ADN et à la réponse inflammatoire. La composante inflammatoire dans l'EBS n'ayant été que peu décrite, la suite de mes travaux a consisté à étudier le phénotype cytokinique pro-inflammatoire. Ainsi, nous avons pu démontrer, une augmentation de l'expression de l'IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL5 dans les Ker-EBS, au niveau ARN en condition basale ou stimulée à l'IFNγ pour mimer un contexte pro- inflammatoire. Seules les chemokines CXCL10 et CXCL11 sont secrétées à forte concentration dans le surnagent de culture des Ker-EBS stimulés ou non, démontrant l'implication de ces cytokines dans l'EBS. En parallèle, afin de s'affranchir des biais notamment dus au fond génétique, au sexe, à l'âge des patients et à l'épigénétique, nous avons généré une lignée de Ker-EBS isogénique (Ker-EBS corrigée) par la technique CRISPR-Cas9. Nous avons ainsi pu démontrer que la lignée de Ker-EBS corrigée montrait une restauration du niveau d'expression des cytokines pro-inflammatoires citées précédemment, à un niveau proche des Ker-WT, confirmant un lien direct entre les mutations du gène KRT5 et la signature pro-inflammatoire. Pour conclure, notre nouveau modèle cellulaire nous a permis de reproduire les phénotypes pathologiques connus dans la littérature et de mettre en évidence une dérégulation de l'expression des cytokines pro-inflammatoire dans l'EBS, notamment CXCL10 et CXCL11. Enfin, l'ensemble de ces résultats font de ce modèle un outil pertinent pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires associés à la pathologie, notamment la composante inflammatoire, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiquesEpidermolysis bullosa simplex (EBS) is a skin disorder caused mainly by dominant mutations in genes coding for keratin 5 (KRT5) or 14 (KRT14) genes. It is characterized by the presence of blisters caused by epidermal detachment, and by other complications such as cutaneous inflammation. From a genetic point of view, the mutations will alter the assembly of the keratin intermediate filament network in basal keratinocytes of the epidermis, leading to cell cytolysis and the formation of intra-epidermal blisters. Currently no effective therapeutic approach it is available. Understanding of the disease and the development of therapies have been hampered by the lack and limitations of relevant human cell and mouse models.So, the general aim of my thesis was to exploit the properties of human induced pluripotent stem cells (hiPSc) to modelling EBS. For this purpose, we generate hiPSc-derived keratinocytes from EBS patients carrying KRT5 mutations (Ker-EBS), and from healthy patients (Ker-WT). Comparison of Ker-EBS and Ker-WT enabled to show that Ker-EBS recapitulates the main phenotypes associated with EBS, namely decreased cell proliferation, increased cell migration, altered signalling pathways (ERK and JNK), as well as aggregates of intermediate keratin filaments in the cytoplasm, as observed in primary EBS keratinocytes. These results demonstrate that our hiPSc-derived cell model is relevant for study EBS.In order to identify new molecular mechanisms, a trancriptomic analysis comparing Ker-EBS with Ker-WT revealed 138 deregulated genes, revealing an enrichment in processes linked to the extracellular matrix, DNA packaging and the inflammatory response. As the inflammatory component in EBS has been poorly described, my next step was to study the pro-inflammatory cytokine phenotype. Thus, we were able to demonstrate increased expression of IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL5 in Ker-EBS, at RNA level under basal or IFNy-stimulated conditions to mimic a pro-inflammatory context. Only the chemokines CXCL10 and CXCL11 are secreted at high concentrations in the culture supernatants of stimulated and unstimulated Ker-EBS, demonstrating the involvement of these cytokines in EBS.In parallel, in order to avoid biases due to genetic background, gender, patient age and epigenetics, we generated an isogenic Ker-EBS line (corrected Ker-EBS) using the CRISPR-Cas9 technique. We were thus able to demonstrate that the corrected Ker-EBS line showed a restoration of the expression level of the pro-inflammatory cytokines mentioned above, to a level close to that of Ker-WT, confirming a direct link between mutations in the KRT5 gene and the pro-inflammatory signature.In conclusion, our new cellular model enabled us to reproduce the pathological phenotypes known in the literature, and to demonstrate deregulation of pro-inflammatory cytokine expression in EBS, notably CXCL10 and CXCL11. Taken together, these results make this model a relevant tool to allow a better understanding of the molecular mechanisms associated with the pathology, particularly the inflammatory component, paving the way for new therapeutic approaches
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Roux, Clémence. "Activité immunosuppressive des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines : induction de lymphocytes T régulateurs in vitro et in vivo et expression de PD-L1." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018AZUR4226.
Full textAbstract:
La grande originalité de mon projet réside dans la génération de cellules stromales mésenchymateuses (MSCs) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Je rappellerai les propriétés phénotypiques, de multipotence et immunosuppressives des MSCs et m’attarderai sur leurs différents mécanismes immunomodulateurs. Cependant, leur nombre limité et leur isolation difficile limitent leur utilisation thérapeutique nécessitant une autre source de cellules.Mon travail a donc été de générer et de caractériser des MSCs issues d’iPS (huiPS-MSCs). L'avantage des huiPS-MSCs réside dans leur plus grande disponibilité et la possibilité d'en avoir à volonté. Encore faut-il valider l’intérêt thérapeutique potentiel de ces huiPS-MSCs. Premièrement, mes résultats in vitro montrent que les huiPS-MSCs présentent une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T (LT) activés conduisant à une induction de LT régulateurs FoxP3+ fonctionnels. Deuxièmement, dans une approche plus axée sur la thérapie, j’ai analysé in vivo l’activité́ immunosuppressive des huiPS-MSCs dans un modèle de réaction xénogénique de greffon contre l'hôte (souris immunodéficientes NSG injectées avec des LT humains). Je montre clairement, après traitement avec les huiPS-MSCs, une réduction de la proportion de LT humains producteurs de cytokines inflammatoires (IFNγ et TNFα) typiques de la pathologie et l’apparition concomitante de LT présentant un phénotype régulateur (production d’IL10 et expression de FoxP3). La fin de mon travail a été de caractériser moléculairement la régulation de l’expression de PD-L1, une molécule immuno-régulatrice puissante, entre les MSCs issues de la moelle osseuse (BM-MSCs) de donneurs sains et nos huiPS- MSCs. Les huiPS-MSCs ont une expression constitutive de PD-L1, qui est absente sur les BM-MSCs. J’ai analysé les microARNs susceptibles de limiter l’expression de PD-L1, j’ai pu en identifier plusieurs. En mesurant leur expression dans les différentes MSCs à notre disposition, je montre que cette expression est inverse par rapport à celle de PD-L1. J’ai ainsi pu démontrer l’activité immunosuppressive de nos huiPS-MSCs in vitro et in vivo avec une perspective d’induction de tolérance immune, et caractériser la régulation de l’expression de PD-L1, molécule immunosuppressive exprimée par les huiPS-MSCsThe mesenchymal stromal cells (MSCs) present many features that render attractive as therapeutic cells. Their phenotype, multipotency and immunosuppressive properties are well described. Nevertheless, major restriction for their clinical use is due to the limited in vitro expansion and low quantity of cells that can be collected from adult tissues. The originality of my project consisted in the generation of mesenchymal stromal cells (MSCs) from human induced pluripotent stem cells (iPS). These huiPS-MSCs could fulfill some of the specification required to improve MSCs use in therapeutic approaches: welldefined and unlimited number of cells with reproducible functional characteristics. In a first approach, I characterized the huiPS-MSCs generated in the laboratory. My results highlight the immunosuppressive activity in vitro of the huiPS-MSCs on T-cell stimulation that induces a switch in T-cell cytokine polarization toward the generation of Treg cells. Secondly, in a more therapy-oriented approach, I analyzed in vivo immunosuppressive activity of huiPS-MSCs in a xenogeneic graft versus host model (NSG immunodeficient mice injected with human T lymphocytes). My data showed significantly reduced percentages of human-differentiated T cells producing Th1 inflammatory cytokines (IFNγ and TNFα). By contrast, T cells producing IL-10 and FoxP3+ Treg cells, absent in nontreated animals, were detected in huiPS-MSCs treated mice, confirming the in vitro results of a tolerizing process. The end of my work was to characterize the molecular regulation of the expression of PDL1, an immunoregulatory molecule expressed by the MSCs. Comparing bone marrow MSCs (BM-MSCs) from healthy donors and our huiPS-MSCs, I showed that the huiPSMSCs have a constitutive expression of PD-L1, which is absent on BM-MSCs. Analysing microRNAs that could limit the expression of PD-L1, I could identify several microRNAs which expression is inverse to the expression of PD-L1. For the first time, my results highlight the immunosuppressive activity of huiPS-MSCs on human T-cell stimulation with a concomitant generation of human Treg cells in vivo and characterize the regulation of PD-L1 expression, an immunosuppressive molecule expressed by the MSCs. They may favor the development of new tools and strategies based on the use of huiPS cells and their derivatives for the induction of immune tolerance
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Roux, Clémence. "Activité immunosuppressive des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines : induction de lymphocytes T régulateurs in vitro et in vivo et expression de PD-L1." Thesis, Université Côte d'Azur (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018AZUR4226/document.
Full textAbstract:
La grande originalité de mon projet réside dans la génération de cellules stromales mésenchymateuses (MSCs) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Je rappellerai les propriétés phénotypiques, de multipotence et immunosuppressives des MSCs et m’attarderai sur leurs différents mécanismes immunomodulateurs. Cependant, leur nombre limité et leur isolation difficile limitent leur utilisation thérapeutique nécessitant une autre source de cellules.Mon travail a donc été de générer et de caractériser des MSCs issues d’iPS (huiPS-MSCs). L'avantage des huiPS-MSCs réside dans leur plus grande disponibilité et la possibilité d'en avoir à volonté. Encore faut-il valider l’intérêt thérapeutique potentiel de ces huiPS-MSCs. Premièrement, mes résultats in vitro montrent que les huiPS-MSCs présentent une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T (LT) activés conduisant à une induction de LT régulateurs FoxP3+ fonctionnels. Deuxièmement, dans une approche plus axée sur la thérapie, j’ai analysé in vivo l’activité́ immunosuppressive des huiPS-MSCs dans un modèle de réaction xénogénique de greffon contre l'hôte (souris immunodéficientes NSG injectées avec des LT humains). Je montre clairement, après traitement avec les huiPS-MSCs, une réduction de la proportion de LT humains producteurs de cytokines inflammatoires (IFNγ et TNFα) typiques de la pathologie et l’apparition concomitante de LT présentant un phénotype régulateur (production d’IL10 et expression de FoxP3). La fin de mon travail a été de caractériser moléculairement la régulation de l’expression de PD-L1, une molécule immuno-régulatrice puissante, entre les MSCs issues de la moelle osseuse (BM-MSCs) de donneurs sains et nos huiPS- MSCs. Les huiPS-MSCs ont une expression constitutive de PD-L1, qui est absente sur les BM-MSCs. J’ai analysé les microARNs susceptibles de limiter l’expression de PD-L1, j’ai pu en identifier plusieurs. En mesurant leur expression dans les différentes MSCs à notre disposition, je montre que cette expression est inverse par rapport à celle de PD-L1. J’ai ainsi pu démontrer l’activité immunosuppressive de nos huiPS-MSCs in vitro et in vivo avec une perspective d’induction de tolérance immune, et caractériser la régulation de l’expression de PD-L1, molécule immunosuppressive exprimée par les huiPS-MSCsThe mesenchymal stromal cells (MSCs) present many features that render attractive as therapeutic cells. Their phenotype, multipotency and immunosuppressive properties are well described. Nevertheless, major restriction for their clinical use is due to the limited in vitro expansion and low quantity of cells that can be collected from adult tissues. The originality of my project consisted in the generation of mesenchymal stromal cells (MSCs) from human induced pluripotent stem cells (iPS). These huiPS-MSCs could fulfill some of the specification required to improve MSCs use in therapeutic approaches: welldefined and unlimited number of cells with reproducible functional characteristics. In a first approach, I characterized the huiPS-MSCs generated in the laboratory. My results highlight the immunosuppressive activity in vitro of the huiPS-MSCs on T-cell stimulation that induces a switch in T-cell cytokine polarization toward the generation of Treg cells. Secondly, in a more therapy-oriented approach, I analyzed in vivo immunosuppressive activity of huiPS-MSCs in a xenogeneic graft versus host model (NSG immunodeficient mice injected with human T lymphocytes). My data showed significantly reduced percentages of human-differentiated T cells producing Th1 inflammatory cytokines (IFNγ and TNFα). By contrast, T cells producing IL-10 and FoxP3+ Treg cells, absent in nontreated animals, were detected in huiPS-MSCs treated mice, confirming the in vitro results of a tolerizing process. The end of my work was to characterize the molecular regulation of the expression of PDL1, an immunoregulatory molecule expressed by the MSCs. Comparing bone marrow MSCs (BM-MSCs) from healthy donors and our huiPS-MSCs, I showed that the huiPSMSCs have a constitutive expression of PD-L1, which is absent on BM-MSCs. Analysing microRNAs that could limit the expression of PD-L1, I could identify several microRNAs which expression is inverse to the expression of PD-L1. For the first time, my results highlight the immunosuppressive activity of huiPS-MSCs on human T-cell stimulation with a concomitant generation of human Treg cells in vivo and characterize the regulation of PD-L1 expression, an immunosuppressive molecule expressed by the MSCs. They may favor the development of new tools and strategies based on the use of huiPS cells and their derivatives for the induction of immune tolerance
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Khedher, Ahmed. "Utilisation de technologies d'édition du génome afin de générer des cardiomyocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites CtIP Fusion to Cas9 Enhances Transgene Integration by Homology-Dependent Repair." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL002.
Full textAbstract:
Les cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC-CMs) représentent des modèles in vitro prometteurs pour plusieurs applications scientifiques et thérapeutiques allant de la modélisation de pathologies à la découverte de médicaments et de la toxicologie prédictive à la médecine régénérative. Malgré les nombreux progrès dans ce domaine, les protocoles de différenciation actuels ne permettent pas d’atteindre le stade de maturité que l’on retrouve chez le myocarde adulte de l’Homme. En effet, certaines caractéristiques majeures des hiPSC-CMs demeurent similaires à celles de cardiomyocytes fœtaux telles que l’expression de plusieurs gènes cardiaques, l’électrophysiologie ou leur fonction contractile. En effet, des analyses transcriptomiques réalisés au sein de notre laboratoire à Sanofi ont révélé que les gènes KCNJ2 et CASQ2, impliqués respectivement dans l’électrophysiologie et la gestion du calcium, étaient sous-exprimés dans les hiPSC-CMs en comparaison aux cardiomyocytes adultes. Cette thèse avait pour objectif d’améliorer la maturation des hiPSC-CMs en utilisant des technologies d’édition du génome. Ainsi, nous avons généré des lignées stables de hiPSC-CMs qui expriment de manière inductible KCNJ2 ou CASQ2 ou les deux gènes simultanément puis nous avons examiné leurs phénotypes fonctionnels et électrophysiologiques par le biais de méthodes d’analyses complémentaires. A la suite à l’induction de l’expression de KCNJ2 et CASQ2 par la doxycycline, les hiPSC-CMs montraient des bénéfices phénotypiques tels que la diminution drastique de la fréquence des battements spontanés, une hyperpolarisation du potentiel de repos membranaire, la diminution de la durée du potentiel d’action et l’amélioration du flux de calcium transitoire. En plus de ces bénéfices attendus, l’expression concomitante de ces deux gènes a amélioré la pente de la pointe du potentiel de champ extracellulaire associée au courant sodique ainsi que la gestion du calcium. Nous avons ensuite évalué le bénéfice de l’expression de ces transgènes sur la toxicologie prédictive en testant des molécules agonistes ou antagonistes de canaux ioniques utilisées classiquement dans le cadre des essais précliniques de toxicité cardiaque. Nous avons notamment observé plus d’arythmies induites par l’E4031 avec les hiPSC-CMs exprimant conjointement KCNJ2 et CASQ2 par rapport aux cardiomyocytes contrôles. Ainsi, les hiPSC-CMs exprimant simultanément KCNJ2 et CASQ2 présentent un phénotype plus mature que les hiPSC-CMs natifs et de tels cardiomyocytes édités génétiquement peuvent être utiles pour l’évaluation de la toxicité cardiaque de nouveaux médicaments candidatsHuman induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a very promising model for several scientific and therapeutic applications ranging from disease modeling to drug discovery, and from predictive toxicology to regenerative medicine. Despite numerous efforts, current protocols do not yet lead to a maturation phenotype equivalent to adult human myocardium. Indeed, key features of hiPSC-CMs remaining closer to fetal stages of development, such as gene expression, electrophysiology and function. Transcriptome analysis performed at Sanofi have confirmed these findings at the genome-wide level. Indeed, KCNJ2 and CASQ2 which are implicated in the two major physiological characteristics of cardiac cells, their electrophysiological behavior and calcium handling, respectively, were expressed at very low levels in hiPSC-CMs in comparison with adult cardiomyocytes. This thesis aimed to improve the maturation of hiPSC-CMs by using genome editing technologies. We generated stable hiPSC-CMs with inducible expression of KCNJ2, or CASQ2 or both genes (KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs) and studied their functional and electrophysiological phenotype by several complementary methods. Upon doxycycline induction of KCNJ2 and CASQ2, KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs displayed phenotypic benefits expected from previous studies of each maturation gene, including a drastic reduction of spontaneous beating, hyperpolarized resting membrane potential, shortened action potential duration and enhanced calcium transients. In addition, co-expression of the two genes enhanced Na+ spike slope of extracellular field potential and Ca2+ handling. We tested four reference drugs and observed signatures of known cardiac effects in KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs, including arrhythmias induced by QT prolonging drug (E-4031), which were more easily detected than in control hiPSC-CMs. Therefore, KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs exhibited a more mature phenotype than hiPSC-CMs and such genetically engineered hiPSC-CMs could be useful for testing cardiac toxicity of novel candidate drugs
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Geryk, Michelle. "Cardiac Structural and Functional Consequences of the Desmin p.R406W Mutation." Electronic Thesis or Diss., Nantes Université, 2024. http://www.theses.fr/2024NANU1002.
Full textAbstract:
La myopathie liée à la desmine, ou desminopathie, est une maladie génétique rare causée par des mutations dans le filament intermédiaire de la desmine. La desmine relie plusieurs composants de la cellule, notamment l'appareil contractile, et positionne les organites à l'intérieur des cellules, y compris le noyau et les mitochondries. La desminopathie est le plus souvent associée à une myopathie squelettique et/ou cardiaque et à la formation d'agrégats intracellulaires. Plus de 70 mutations ont été signalées le long du gène de la desmine qui code pour les 470 acides aminés des filaments de desmine. Bien que de nombreuses études se soient concentrées sur ces mutations au fil des ans, le mécanisme précis de la relation structure-fonction de la desmine dans les cardiomyocytes n'a pas encore été élucidé. Le test génétique d'une patiente présentant des antécédents cardiaques complexes, notamment une mort subite cardiaque, une dépression persistante du segment ST sur l'ECG et des orages rythmiques, a révélé une mutation de la desmine en position p.R406W. Le défi de cette étude était d'utiliser les cellules souches pluripotentes induites de la patiente et des lignées cellulaires isogéniques pour comprendre la relation génotype-phénotype. En outre, un modèle tridimensionnel de tissu cardiaque a été réalisé. Les conséquences électriques de cette mutation ont été analysées à l'aide de la technique du patch-clamp, révélant une repolarisation anormale. Simultanément, nous avons réalisé des études protéomiques et transcriptomiques pour étudier les mécanismes complexes en jeu, qui ont révélé des défauts mitochondriaux et de conduction. Par la suite, la microscopie électronique a révélé des changements structurels dans les cellules. En conclusion, ce travail a combiné des approches fonctionnelles et moléculaires pour faciliter notre compréhension de la desminopathieDesmin related myopathy, or desminopathy, is a rare genetic disorder caused by mutations in the intermediate filament desmin. Desmin interconnects several components of the cell including the contractile apparatus and positions organelles within cells, including the nucleus and mitochondria. Desminopathy is most often associated with skeletal and/or cardiac myopathy and is commonly associated with intracellular aggregate formation. Over 70 mutations have been reported along the desmin gene that codes for the filaments 470 amino acids. Although many studies have focused on these mutations over the years, the precise mechanism of the structure-function relationship of desmin within cardiomyocytes has yet to be elucidated. Genetic testing of a patient presenting with a complex cardiac history, including sudden cardiac death, a persistent depression of the ST-segment on the ECG and arrhythmic storms revealed a desmin mutation at position p.R406W. The challenge of this study was to use the patient's induced pluripotent stem cells and isogenic cell lines to understand the genotype-phenotype relationship at hand. Furthermore, a 3-dimensional model of engineered heart tissue was applied. The underlying electrical consequences of this mutation were analyzed using the patch-clamp technique, revealing abnormal repolarization. Simultaneously, we performed proteomic and transcriptomic studies to investigate the complex mechanisms at play, which revealed mitochondrial and conduction defects. Subsequently, electron microscopy revealed structural changes within cells. In conclusion, this work combined functional and molecular approaches to facilitate our understanding of desminopathy
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Giethlen, Colette. "Etude de la régulation transcriptionnelle de la différenciation des cellules entéroendocrines dans un modèle d'organoïde intestinal humain." Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ002.
Full textAbstract:
Les cellules entéroendocrines sécrétrices d’hormones représentent 1% de l’épithélium intestinal mais sont des régulateurs essentiels du métabolisme énergétique et l’altération de leur différenciation provoque de graves pathologies métaboliques. Leur différenciation est régie par une cascade de régulations transcriptionnelles qui est encore peu décrite, particulièrement chez l’homme. L’objectif de ce projet de thèse était d’évaluer l’implication de plusieurs facteurs de transcription préalablement identifiés chez la souris (NGN3, RFX6, ARX, PAX4) dans la différenciation entéroendocrine humaine. Pour ce faire, ces gènes ont été inactivés par la technique CRISPR/Cas9 dans des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs), qui ont ensuite été différenciées in vitro en organoïdes intestinaux (HIOs). Les analyses des HIOs déficients pour NGN3 ne permettent pas de conclure quant à un rôle dans la différenciation entéroendocrine mais indiquent une altération de la régionalisation du tissu formé chez les mutants. RFX6 semble important pour la différenciation et/ou la fonction des cellules entéroendocrines, bien que sa fonction précise n’ait pas pu être déterminéeHormone-producing enteroendocrine cells represent 1% of the intestinal epithelium but are key regulators of the energetic metabolism and alteration of their differentiation is associated with severe metabolic disorders. Enteroendocrine differentiation is governed by a transcriptional regulatory cascade that is poorly described, especially in humans. This thesis project aimed to evaluate the implication of several transcription factors, previously identified in mice (NGN3, RFX6, ARX, PAX4), in human enteroendocrine differentiation. To do so, these genes were disrupted with the CRISPR/Cas9 system in human inducible pluripotent stem cells (hiPSCs), which were then differentiated in intestinal organoids (HIOs). Preliminary analysis of NGN3-deficient HIOs did not allow a firm conclusion regarding NGN3 implication in enteroendocrine differentiation but showed a tissue regionalization alteration. RFX6 seems important for the differentiation/function of enteroendocrine cells, although its precise function is still to be determined
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Mianné, Joffrey. "Thérapie génique par CRISPR/Cas9 pour corriger des épithéliums bronchiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) de patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (DCP) : une preuve de concept." Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT045.
Full textAbstract:
La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une maladie génétique rare et hétérogène affectant la structure et la fonction des cils motiles. Dans l'épithélium des voies respiratoires, l’altération du mouvement ciliaire entraîne des infections chroniques responsables du déclin progressif et définitif des fonctions pulmonaires. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la DCP. Par ailleurs, la recherche de nouvelles thérapies reste limitée par le manque de modèles fiables.Dans ce contexte, les deux objectifs de cette thèse sont : 1) de développer un nouveau modèle in vitro de la DCP basé sur la différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en épithélium des voies respiratoires multiciliées, et 2) d'utiliser ce modèle pour étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9.Dans ce but, nous avons dérivé deux lignées de CSPi, une d'un individu sain et une seconde d'une patiente atteinte de la DCP contenant des mutations hétérozygotes composites dans le gène CCDC40. En utilisant la lignée « saine » et la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des contrôles isogéniques knock-out pour trois gènes impliqués dans la DCP incluant CCDC40, DNAH5 et MCIDAS. Parallèlement, la lignée de CSPi dérivée de la patiente a été corrigée à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 et de l'approche de réparation dirigée par homologie. En appliquant à ces lignées cellulaires notre protocole de différenciation préalablement optimisé, nous générons efficacement un épithélium multicilié fonctionnel des voies aériennes récapitulant les phénotypes ciliaires en fonction du génotype. En outre, ce nouveau modèle nous a permis d'étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer le cadre de lecture et de rétablir le phénotype ciliaire dans la lignée DCP.En conclusion, le nouveau modèle développé dans ce travail pourrait représenter un outil majeur pour la modélisation de la DCP in vitro. Ce modèle sera particulièrement intéressant pour étudier directement sur le tissu humain concerné la faisabilité et l'efficacité de thérapies innovantes. Notre pipeline pourrait donc permettre d’accélérer la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la DCP ainsi que d'autres pathologies pulmonairesPrimary Ciliary dyskinesia (PCD) is a rare and heterogeneous genetic disorder affecting the structure and function of motile cilia. In the airway epithelium, impaired ciliary motion results in chronic airway infections responsible for progressive and definitive decline of lung functions. There is currently no effective treatment for PCD, and research is limited by the lack of convenient models to study this disease and investigate innovative therapies.In this context, the main goals of this thesis are: 1) to develop a new in vitro PCD model based on the directed differentiation of patient-derived or genetically-engineered induced pluripotent stem cells (iPSC) into multiciliated airway epithelium, and 2) to use this model to investigate the potential of an innovative CRISPR/Cas9 gene therapy approach.To this aim, we have derived two iPSC lines, one from an healthy individual and a second from a PCD patient harbouring compound heterozygous mutations in the CCDC40 gene. Using the “healthy” iPSC line and the CRISPR/Cas9 technology we have generated isogenic knock-out controls for three PCD genes including CCDC40, DNAH5 and MCIDAS. In parallel, using the CRISPR/Cas9 technology and the homology directed repair approach, we have corrected the patient-derived iPSC line. By applying our optimized differentiation protocol to these cell lines, we are efficiently generating functional multiciliated airway epithelium recapitulating the ciliary phenotypes in function of the genotype. Furthermore, this new model has allowed us to investigate the potential of a CRISPR/Cas9-mediated reframing gene therapy approach to rescue ciliary phenotype in the patient line.In conclusion, the new model developed in this work could represent a major tool for in vitro PCD modelling. This model will be of particular interest for investigating the feasibility and efficacy of personalized therapies directly on the relevant human tissue. Our pipeline could therefore accelerate the development and translation of new therapeutics for PCD and other lung diseases
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Annab, Karima. "Etude de l’expression génique de différents syndromes progéroïdes en utilisant le modèle des cellules souches à pluripotence induite." Thesis, Aix-Marseille, 2019. http://www.theses.fr/2019AIXM0101.
Full textAbstract:
Les syndromes progéroïdes regroupent un ensemble de pathologies caractérisées par un vieillissement précoce et accéléré. Le syndrome le plus connu et étudié est la progéria de Hutchinson-Gilford dont l'incidence est de 1 cas sur 8 millions ce qui en fait une maladie très rare. Nous avons étudié trois symptômes progéroïdes dont le syndrome HGPS, un syndrome HGPS-like ainsi qu'un syndrome APS. Ces pathologies ont de nombreux symptômes en commun dont une ostéolyse, une lipodystrophie, ainsi qu'une atteinte cardiovasculaire. Ces trois syndromes sont provoqués par différentes mutations du gène LMNA qui code pour les Lamines A et C. Nous avons utilisé le modèle des iPSCs afin d'étudier in vitro la physiopathologie de ces trois syndromes en les comparant à des cellules contrôles. Les cellules dérivées de la voie mésenchymateuse étant majoritairement altérées dans ces pathologies, nous avons créé des modèles in vitro d'étude de la différentiation en MSCs. De plus, ces patients présentant des altérations arterio-veineuses, nous avons analysé la différenciation en VSMCs. Le phénotype des ces cellules a été analysé et les profils transcriptomiques comparés pour les différentes lignées. Des gènes communs, impliqués dans le stress oxydatif et dans des systèmes de réparation géniques ont été retrouvés comme étant altérés. De plus, nous avons mis en évidence des altérations de voies de signalisation indispensables à la survie et à la prolifération cellulaire en comparant les cellules progéroïdes aux contrôles. Certaines de ces voies biologiques ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des symptômes observés chez ces patientsProgeroid syndromes are a group of pathologies characterized by accelerated and early aging. One of the most studied of these diseases is HGPS, with an estimated incidence of 1 in 8 millions birth making it an extremely rare disease. We focused our attention on three different progeroid syndromes including classic HGPS, a HGPS-like and an atypical progeroid syndrome. These pathologies share many symptoms, including osteolysis, lipodystrophy, and cardiovascular alterations. These 3 syndromes are caused by 3 different mutations in the LMNA gene that encodes A- and C-type lamins, inducing production of a truncated Lamin A in HGPS and HGPS-like and production of a mutated Lamin with a p.T528M substitution in APS. We produced hiPSCs to create a model of these different diseases and investigate in vitro the physiopathology of these syndromes by comparing them to control cells. Cells derived from mesenchymal stem cells being the most impaired type of tissue, we established in vitro models in order to study the differentiation of hiPSCs into MSCs. In addition given the massive cardiovascular defects in these patients, we also investigated differentiation toward the VSMCs. Cell phenotypes were carefully characterized and we compared the transcripttomic profile of the different cell types. We identified dysregulation in genes involved in oxidative stress response and in DNA repair in progeroid cells. In addition, pathways essential for cell survival and proliferation are also modified when comparing progeroid and controls cells. Altogether, these results might explain some of the symptoms observed in progeroid patients but also reveal pathways involved in ageing
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Pasquier, Nicolas. "Integrin-mediated regulation of apicobasal polarity, cell states and cancer progression." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL048.
Full textAbstract:
Les intégrines sont des protéines régulant l'adhésion, la migration et l'architecture cellulaires, jouant un rôle tant dans le développement des tissus sains que dans la progression cancéreuse. Bien que les intégrines aient été largement étudiées dans divers modèles biologiques, la manière dont leur disponibilité agit sur la polarité apicobasale, la migration et la capacitation cellulaires n'est pas entièrement connue à ce jour.Ici, nous étudions le rôle des intégrines, et principalement de l'intégrine-β1, sur l'établissement de la polarité apicobasale ainsi que sur la migration cellulaire dans des modèles cancéreux. Nous décryptons également leur action sur l'établissement de l'identité cellulaire en étudiant leur rôle dans la capacitation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs).Les résultats de cette thèse permettent d'identifier une nouvelle une boucle de recyclage de l'intégrine-β1, dépendante de SorLA, HER2 et HER3, permettant aux cellules de cancer du côlon de percevoir la matrice et d'orienter leur polarité apicobasale. Nous approfondissons également la compréhension de la migration de cellules cancéreuses sur la matrice extra-cellulaire en identifiant deux compositions matricielles (collagène + laminine et laminine + ténascine C) permettant aux cellules cancéreuses d'ostéosarcome et aux fibroblastes de migrer indépendamment de la rigidité du substrat grâce à une augmentation du nombre de points d'ancrage moléculaires impliquant l'intégrine-β1. Nous investiguons également le rôle de l'intégrine-β1 dans le processus de capacitation des cellules souches et montrons que l'inhibition de l'intégrine-β1 maintient un phénotype similaire à l'état naïf chez les hiPSCs.Ensemble, ces données soulignent l'importance des intégrines, et principalement de l'intégrine-β1, dans de nombreux processus cellulaires parmi les modèles, expliquant ainsi son importance dans l'adhésion cellulaire, l'architecture des cellules cancéreuses ainsi que dans l'établissement de l'identité cellulaireIntegrins regulate cell adhesion, migration and architecture which play a role both in development of healthy tissues and disease. While integrins have been widely studied amongst models, the way their availability acts on polarity, spreading and cell capacitation is not fully understood.Here we investigate the role of integrins, and mainly integrin-β1, on polarity establishment as well as cell spreading in cancer models. We also decipher their action on cell states by studying their role in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) capacitation.This thesis reveals a newly described SorLA, HER2 and HER3-dependent Integrin-β1 recycling loop, allowing colon cancer cells to sense the matrix and orient their polarity accordingly. We also go deeper in cancer cell spreading on matrix, by identifying two matrix compositions (collagen + laminin and laminin + tenascin C) allowing osteosarcoma cancer cells and fibroblasts to spread in a stiffness-independent fashion through an increased amount of integrin-β1-positive molecular clutches. We also investigate the role of Integrin-β1 on the capacitation process of stem cells and show that inhibition of integrin-β1 maintains a naïve-like phenotype in hiPSCs.Taken together, these data highlight the importance of integrins, and mainly integrin-β1, in many cell processes amongst models, thus explaining its key role in cell adhesion, cancer cell architecture and cell state establishment
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Corbineau, Sébastien. "Génération de progéniteurs hépatiques dérivés de cellules souches : application à l’hypercholestérolémie familiale." Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA114821/document.
Full textAbstract:
La transplantation d’hépatocytes représente une alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies métaboliques dont l’hypercholestérolémie familiale. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines représentent de nouvelles sources de cellules hépatiques. Nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches humaines en cellules hépatiques et généré ainsi des cellules dérivées de cellules iPS de patients atteints d’hypercholestérolémie familialeHepatocyte transplantation represents an alternative to liver for the treatment of metabolic diseases including familial hypercholesterolaemia. Embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS) represent new sources of hepatic cells. We have developed an approach to differentiate human stem cells into hepatic cells and thus we have generated hepatic cells derived from iPS of familial hypercholesterolaemia patients
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M'Callum, Marie-Agnès. "Hépatocytes matures dérivés de cellules souches in vitro : améliorer la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en copiant l’organogénèse hépatique." Thèse, 2018. http://hdl.handle.net/1866/21608.
Full text
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Long, Valérie. "Mécanismes électrophysiologiques responsables de l'augmentation de la fréquence cardiaque induite par les œstrogènes lors de la grossesse." Thesis, 2019. http://hdl.handle.net/1866/23996.
Full textAbstract:
Une accélération de la fréquence cardiaque (FC) au repos est observée chez les femmes enceintes. Au dernier trimestre, la FC accélère en moyenne de 15%, ce qui représente un facteur de risque dans le développement d’arythmies de novo ou dans l’exacerbation d’arythmies cardiaques préexistantes. Ceci est dangereux pour la mère ainsi que pour le fœtus. Cependant, les mécanismes responsables de ce changement cardiovasculaire restent peu connus.
Notre laboratoire a récemment démontré que la grossesse était associée à une augmentation de la densité du courant pacemaker (If) et du courant calcique de type L (ICaL), ainsi qu’à des changements de l’homéostasie calcique dans les cellules de nœud sinusal (NS) de souris. Sachant que les concentrations plasmatiques en œstrogènes sont significativement augmentées pendant la grossesse et que ces hormones sexuelles féminines ont la capacité de modifier les propriétés électrophysiologiques du cœur, l’hypothèse de ce projet de recherche est que les œstrogènes jouent un rôle important dans l’augmentation de la FC associée à la grossesse et régulent les propriétés électrophysiologiques du NS. Les objectifs de ce projet de recherche sont de déterminer le rôle du 17β-œstradiol (E2) dans l’augmentation de la FC, d’examiner si ces effets sont régulés par les récepteurs aux œstrogènes alpha (ERα) et/ou bêta (ERβ) ainsi que d’évaluer les différents mécanismes de régulation de l’E2 sur l’électrophysiologie du NS.
Des souris femelles adultes non-gestantes (2-4 mois) déficientes en ERα (ERKOα) ou en ERβ (ERKOβ) ont reçu un traitement chronique à l’E2 (30 μg deux fois par jour pendant quatre jours) simulant les concentrations plasmatiques en E2 retrouvées en fin de grossesse (23,3 ± 5,0 nM) chez la souris. L’analyse des électrocardiogrammes de surface montrent que la FC des souris ERKOβ (ERKOβ : 511 ± 15 bpm; ERKOβ +E2 : 580 ± 10 bpm, n = 10, p < 0,001) est significativement accélérée suivant le traitement à l’E2. Toutefois, la FC demeure inchangée chez les souris ERKOα (ERKOα : 520 ± 16 bpm; ERKOα +E2 : 530 ± 21 bpm, n = 7, p = 0,114). La méthode du patch-clamp en mode courant-imposé a permis de démontrer une accélération de l’automaticité des cellules du NS des souris ERKOβ suivant le traitement à l’E2, se traduisant par une augmentation de la fréquence des potentiels d’action spontanés (ERKOβ : 284 ± 24 bpm, n = 8; ERKOβ +E2 : 354 ± 23 bpm, n = 15, p = 0,0395) et par une pente de dépolarisation diastolique plus rapide (ERKOβ : 82 ± 12 mV/s, n = 8; ERKOβ +E2 : 140 ± 14 mV/s, n = 15, p < 0,003). En lien avec ces résultats, le patch-clamp en mode voltage-imposé a permis de démontrer que la densité de If est augmentée suivant un traitement à l’E2 (à -90 mV : ERKOβ : -6,6 ± 0,7 pA/pF, n = 12-15; ERKOβ +E2 : -11 ± 1 pA/pF, n = 9-11, p < 0,05). Cependant, If est similaire chez les souris ERKOα traitées ou non à l’E2. De plus, des cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites de type nodal (N-hiPSC-CM) ont une accélération de la fréquence des potentiels d’action (CTL : 69 ± 5 bpm, n = 12; +E2 : 99 ± 6 bpm, n = 14, p < 0,001) ainsi qu’une augmentation de la densité de If (à -90 mV : CTL : -0,95 ± 0,14 pA/pF, n = 7-10; +E2 : -1,62 ± 0,17 pA/pF, n = 13-14, p < 0,05) suivant le traitement à l’E2. L’administration d’E2 ne modifie pas la fréquence des transitoires calciques des cellules de NS des souris ERKOα (139 ± 15, n = 13-14; +E2 : 142 ± 14, n = 15-16, p = ns) et ERKOβ (142 ± 11, n = 14-15; +E2 : 147 ± 13, n = 15-16, p = ns). En lien avec ces résultats, le courant ICaL des N-hiPSC-CM est inchangé suivant le traitement d’E2 (à 0 mV : CTL : -14,0 ± 1,3 pA/pF, n = 12-13; +E2 : -14,5 ± 1,4 pA/pF, n = 22, p = ns).
En conclusion, l’accélération de l’automaticité cardiaque associée à la grossesse est, entre autres, expliquée par une augmentation de la densité de If, régulée par la voie de signalisation E2-ERα. Cependant, les changements de l’homéostasie calcique observés pendant la grossesse sont indépendants des niveaux élevés en œstrogènes. Les résultats obtenus sur les N-hiPSC-CM concordent avec ce qui est observé dans les cellules de NS de souris, ce qui démontre l’applicabilité humaine des résultats. Notre étude contribue à élucider l’influence de la grossesse et le rôle des hormones sexuelles féminines sur la fonction du NS et l’automaticité cardiaque. Ultimement, notre travail pourrait aider à développer une meilleure gestion des arythmies associées aux fluctuations hormonales féminines et/ou à la grossesse.An increased heart rate (HR) is observed in pregnant women. In fact, in the last trimester, in average, the HR increases by 15%, which is a known risk factor to developing cardiac arrhythmias or exacerbating pre-existing arrhythmias. This can lead to major consequences for both the mother and fetus. However, the mechanisms underlying this increased HR remain largely unexplored. Our laboratory recently demonstrate that pregnancy is associated with an increased density of the pacemaker current (If) and the L-type calcium current (ICaL) as well as changes in calcium homeostasis of mouse sinoatrial node (SAN) cells. Knowing that estrogens are increased during pregnancy and that these sex hormones can modify cardiac electrophysiological properties, we hypothesized that estrogens play a key role in the pregnancy-induced increased HR and regulate the SAN electrophysiological properties. Our research project aims to determine the role of 17β-estradiol (E2) on the pregnancy-induced increased HR, to determine if these effects are regulated through estrogen receptor alpha (ERα) and/or beta (ERβ) and to study the E2 underlying mechanisms on SAN electrophysiology. Non-pregnant female mice (2-4 months) lacking ERα (ERKOα) or ERβ (ERKOβ) received a chronic E2 treatment (30 μg twice daily for four days) mimicking E2 concentrations found in late pregnancy (23.3 ± 5.0 nM). Surface electrocardiogram analysis showed a significant increased HR in ERKOβ mice (ERKOβ: 511 ± 15 bpm; ERKOβ +E2: 580 ± 10 bpm; n = 10; p<0.001) following E2 administration. However, the HR remains unchanged in ERKOα mice (ERKOα: 520 ± 16 bpm; ERKOα +E2: 530 ± 21 bpm, n = 7, p = 0.114). Following E2 treatment, current-clamp method demonstrates an increase SAN cells automaticity in ERKOβ mice, resulting in an increase in the spontaneous action potential frequency (ERKOβ : 284 ± 24 bpm, n = 8; ERKOβ +E2 : 354 ± 23 bpm, n = 15, p = 0.0395), associated with a steeper diastolic depolarization slope (ERKOβ : 82 ± 12 mV/s, n = 8; ERKOβ +E2 : 140 ± 14 mV/s, n = 15, p < 0.003), a major determinant of cardiac automaticity. In line with these results, voltage-clamp data showed an increased If density in SAN cells of ERKOβ mice treated with E2 (at -90 mV: ERKOβ: -6.6 ± 0.7 pA/pF, n = 12-15; ERKOβ +E2: -11.0 ± 1.3 pA/pF, n = 9-11, p < 0.05). Nevertheless, If density was similar in E2-treated ERKOα mice. E2-treated nodal-like human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (N-hiPSC-CM) also showed an increased spontaneous action potential frequency (CTL : 69 ± 5 bpm, n = 12; +E2 : 99 ± 6 bpm, n = 14, p < 0.001) and If density (at -90 mV: CTL: -0.95 ± 0.14 pA/pF, n = 7-10; +E2: -1.62 ± 0.17 pA/pF, n = 13-14, p < 0.05). Following E2 administration, the rate of calcium transient was similar in SAN cells from ERKOα (139 ± 15, n = 13-14; +E2 : 142 ± 14, n = 15-16, p = ns) and ERKOβ (142 ± 11, n = 14-15; +E2 : 147 ± 13, n = 15-16, p = ns) mice. In line with these results, no modification was seen on ICaL density in E2-treated N-hiPSC-CM (at 0 mV: CTL: -14.0 ± 1.3 pA/pF, n = 12-13; +E2: -14.5 ± 1.4 pA/pF, n = 22, p = ns). In conclusion, the increased cardiac automaticity observed during pregnancy is, in part, explained by an increased If density. This mechanism is mediated by the E2-ERα pathway. In the other hand, calcium homeostasis changes detected during pregnancy appear to be mediated by an E2-independent mechanism. Finally, results obtained on N-hiPSC-CM are consistent with our observations on mouse SAN cells, demonstrating the human applicability of our results. This study provides novel insight on the effects of female sex hormones on the SAN functions. Ultimately, this information can lead to improved management of arrhythmias associated with female hormone fluctuations and/or pregnancy-induced arrhythmias.