Academic literature on the topic 'Células madre embrionarias'

La historia de las células madre comenzó ya hace dos décadas durante las cuales se ha producido un cambio radical en el horizonte de la medicina. El reconocimiento de la existencia de varios tipos de linajes celulares provenientes del blastocito y de la sangre periférica del adulto, junto con su capacidad de producir nuevos tejidos, inclusive de capas embrionarias diferentes, ha permitido diseñar nuevos tratamientos antes considerados imposibles.

Pocos avances recientes han revolucionado tanto la biología del desarrollo como la reprogramación de células por transferencia nuclear. Desde 1952 a la fecha, se ha acumulado suficiente información teórica así como tecnologías de avanzada, para desmitificar el paradigma de la irreversibilidad de la diferenciación celular. El cigoto totipotente cuando empieza a segmentarse da origen al blastocisto, estado embrionario cuyas células de la masa celular interna son pluripotentes y capaces de originar los linajes celulares de las tres capas germinales. Estas células son las denominadas células madre embrionarias. La diversidad celular en un organismo adulto es consecuencia del control epigené- tico de la expresión génica que restringe progresivamente la pluripotencia y permite que algunas de ellas proliferen continuamente durante la vida del individuo, otras estén en reposo proliferativo y unas pocas alcancen una masa adecuada y dejen de proliferar. Sin embargo en todas estas poblaciones celulares, existen grupos pequeños que son pluripotentes y se denominan células madre adultas. La transferencia de núcleos somáticos a citoplasma de ovocitos o de cigotos demostró que su información genética puede ser reprogramada y regresarla al estado de pluripotencia. Los conocimientos señalados, han permitido emplear esta biotecnología con fines reproductivos y terapéuticos pero cuya aplicación en humanos es cuestionada desde el punto de vista de la bioética. Recientemente se ha logrado fusionar células madre embrionarias con células somáticas adultas, logrando que la célula hibrida resultante vuelva al estado pluripotente. Además se ha descubierto que la pluripotencia es consecuencia de la

Se presentan los resultados obtenidos tras analizar los temas, los géneros, los tipos de células troncales mencionadas y el encuadre en 2.481 textos periodísticos publicados por El País (1.497) y ABC (984) entre los años 1996 y 2006. A comienzos de esta década, aparecen en la prensa española las “células madre” hasta que, en 2006, queda pendiente de autorización la clonación terapéutica, la investigación con embriones congelados y el uso de células troncales embrionarias para la investigación en el Proyecto de Ley de Investigación Biomédica. El trabajo forma parte de un estudio más amplio, en curso, sobre tratamiento periodístico de las “células madre” en los diarios españoles.

<p>Los recientes avances en la implementación de estrategias de reprogramación genética en células somáticas para la producción de células pluripotentes inducidas (iPS), abren la posibilidad de generar células pluripotentes para estudios del desarrollo embrionario y la diferenciación celular, herramientas para detección in vitro de nuevos medicamentos y evaluación de su eficacia y toxicidad, desarrollo de modelos in vitro de enfermedades humanas y uso en terapia celular. Las iPS, son células que muestran características fenotípicas y funcionales similares a las observadas en células madre embrionarias, sin los cuestionamientos éticos y legales de la manipulación de embriones. En articular, la generación de las células pluripotentes inducidas paciente-específicas ha permitido dilucidar los procesos fisiopatológicos de diversas enfermedades genéticas de etiología conocida y desconocida, así como plantean la posibilidad de realizar terapia celular autóloga y terapia génica basada en células para la regeneración tisular dependiendo de las necesidades individuales.</p>

Las células troncales (CT) también llamadas células madre tienen dos características que las distinguen de las demás células de un organismo: son células no especializadas que pueden auto-renovarse mediante la mitosis y en ciertas condiciones fisiológicas o experimentales pueden diferenciarse a células con una función específica como neuronas, hepatocitos, células del cartílago, etc. (McKay, 2000). Se han descrito dos tipos de CT, tanto en los animales como en el ser humano: las CT embrionarias (CTE) y obtenidas de tejido adulto. Ambas tienen características y funciones diferentes.

Fundamenta con argumentos ético filosóficos la posibilidad del uso de células madres embrionarias provenientes de embriones tempranos, bajo estrictos controles éticos, científicos y sociales, realizados por comités formados por hombres de ciencia, filósofos, bioéticos, y, eventualmente, representantes de las organizaciones sociales, como grupos de defensa de pacientes, sindicatos y representantes de todas las confesiones religiosas.
Tesis

La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos.
Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.
Tesis

Polycomb repressive complex 2 (PRC2) is a key epigenetic regulator of gene expression. It acts through its histone-modifying activity, as it is responsible of di- and trimethylating the tail of histone H3 on lysine 27 (H3K27me2/me3), a mark associated with gene repression. PRC2 activity is highly modulated by a number of sub-stoichiometric factors that allow its recruitment to specific target genes through the interaction with RNA, DNA and histone marks; as well as modulation of its enzymatic activity. EPOP is a recently-identified PRC2-associated factor in mouse embryonic stem cells (mESCs), which is necessary to maintain a low level of expression of PRC2 targets, although the result of this regulation is not yet understood. In this thesis, to further our understanding of the relevance of this EPOP-mediated gene regulation, we investigate the role of EPOP in the context of mESCs differentiation both in vitro and in vivo.
El complejo represivo Polycomb 2 (PRC2 por sus siglas en inglés) es un regulador epigenético clave de la expresión génica. Actúa a través de su actividad modificadora de histonas, ya que es responsable de di- y tri-metilar la cola de la histona H3 en la lisina 27 (H3K27me2/me3). La presencia de esta marca se asocia con la represión génica. La actividad de PRC2 está altamente modulada por una serie de factores sub-estequiométricos que determinan su reclutamiento a genes específicos a través de la interacción con ARN, ADN e marcas de histonas. Asimismo, pueden modular su actividad enzimática. EPOP es un factor asociado a PRC2 que ha sido recientemente identificado en mESCs (del inglés mouse embryonic stem cells). EPOP es necesario para mantener un bajo nivel de expresión de los genes diana de PRC2, aunque su mecanismo de regulación todavía no ha sido completamente descrito. Con el objetivo de esta tesis es ampliar nuestro conocimiento sobre la regulación génica mediada por EPOP y sus consecuencias, esta tesis investiga el papel de EPOP durante la diferenciación de mESCs, tanto in vitro como in vivo

Polycomb proteins are important epigenetic regulators involved in the maintenance of stemness and differentiation. In this thesis, I focused on the role of some Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) components. On the one hand, I studied the role of Cbx8 PRC1 component protein in the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs). On the other hand, I analyzed the role of PRC1 components in a hematological disease-­related context which implies a defect in differentiation, the myelodysplastic syndrome (MDS). Specifically, I focused on RING1A PRC1-­component function in this disease. Our previous data showed that upon addition of retinoic acid (RA) during 3 days to E14 mouse ESC cell line, by which cells were prompted into the neuronal lineage, Cbx8 was upregulated both at mRNA and protein level. We performed a genome-­wide chromatin immunoprecipitation of endogenous Cbx8 coupled to direct massive parallel sequencing (ChIP-­seq) to assess the binding sites of Cbx8 genome-­ wide using IgG and Cbx8 ChIP in untreated mESC as negative controls. Our analysis identified 171 high confidence peaks. To our surprise, by crossing our data with previously published microarray analysis, we showed that several differentiation genes transiently recruit Cbx8 during their early activation. Depletion of Cbx8 by 2 different shRNA partially impaired the transcriptional activation of these genes as well as diminish Cbx8 recruitment to its target genes. Both interaction analysis, as well as chromatin immunoprecipitation experiments supported the idea that activating Cbx8 acts in the context of an intact PRC1 complex. Prolonged gene activation resulted in eviction of PRC1 despite persisting H3K27me3 and H2A ubiquitination. The composition of PRC1 is highly modular and changes when embryonic stem cells commit to differentiation. We further demonstrated that the exchange of Cbx7 for Cbx8 is required for the effective activation of differentiation genes. Taken together, our results establish a function for a Cbx8-­containing complex in facilitating the transition from a Polycomb-­ repressed chromatin state to an active state. In order to characterize the function of PRC1 in the pathogenesis of MDS we used publicly available expression datasets of PRC1 components from MDS patients and during normal myeloid differentiation to identify and quantify the level of relevant PRC1 complexes. From this data mining we selected four PRC1 components (CBX6, BMI1, RING1A and CBX7) and two PRC2 components (EZH2 and ASXL1) for further analysis. To study these PRC components we wished to use cell lines that are MDS-­related. For this reason, we extensively characterized 5 MDS/AML derived cell lines by conventional cytogenetics, single nucleotide polymorphism arrays, mutational panel of 83 MDS/AML relevant genes and immunoprofile. After this study, we selected SKK-­1 cell line as the most suitable model to study the function of the selected PRC1 components. Based on the finding that RING1A is highly expressed in hematopoietic stem cells and further overexpressed in patients with high risk MDS, we have analyzed the role of RING1A in cells. We found that RING1A inhibits differentiation in MDS-­derived AML cells and in primary human hematopoietic stem cells (HSCs). We further provide first evidence that pharmacological inhibition of RING1A could be therapeutic strategy by showing that the treatment of HSCs favors differentiation.
Les proteïnes Polycomb són importants reguladors epigenètics implicats en el manteniment de la pluripotència i la diferenciació. En aquesta tesi, m'he centrat en el paper d'alguns components del Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). D'una banda, he estudiat el paper de la proteïna Cbx8, component del PRC1, en la diferenciació de les cèl·lules mare embrionàries de ratolí (mESCs). D'altra banda, he analitzat el paper dels components del PRC1 en un una malaltia hematològica que implica un defecte en la diferenciació, la síndrome mielodisplàstica (SMD). En concret, m'he centrat en la funció de RING1A, component del PRC1, en aquesta malaltia. Les nostres dades anteriors van mostrar que després de l'addició d'àcid retinoic (RA) durant 3 dies a la línia cel·lular de mESCs Cbx8 es sobreexpressava, tant a nivell d'ARNm com de proteïnes. Vam realitzar una immunoprecipitació de cromatina del Cbx8 endogen a nivell de tot el genoma seguit de seqüenciació massiva (ChIP-­seq) per avaluar els punts d'unió de Cbx8 en tot el genoma utilitzant els ChIPs IgG i Cbx8 de mESC sense tractar com a controls negatius. La nostra anàlisi va identificar 171 pics d'alta confiança. Sorprenentment, en creuar les nostres dades amb l'anàlisi de microarrays publicat prèviament, es va demostrar que diversos gens de diferenciació transitòriament recluten Cbx8 durant la seva activació primerenca. El knockdown de Cbx8 per 2 shRNA diferents va afectar parcialment l'activació transcripcional d'aquests gens, així com va disminuir el reclutament de Cbx8 als seus gens diana. Tant l’anàlisi d'interacció per espectrometria de masses com els experiments de immunoprecipitació de la cromatina van donar suport a la idea que l'activació de Cbx8 actua en el context d'un complex PRC1 intacte. L’activació gènica prolongada va resultar en l’expulsió de PRC1 amb un H3K27me3 i H2AK119ub persistents. La composició del PRC1 és altament modular i canvia quan les cèl·lules mare embrionàries es diferencien. A més, vam demostrar que es requereix l'intercanvi de Cbx7 per Cbx8 per a l'activació efectiva dels gens de diferenciació. En conjunt, els nostres resultats estableixen una funció per a un complex que conté Cbx8 a l'hora de facilitar la transició d'un estat de cromatina reprimida per Polycomb a un estat actiu. Per tal de caracteritzar la funció de PRC1 en la patogènesi de SMD vam utilitzar dades d’expressió públicament disponibles de pacients amb SMD i durant la diferenciació mieloide normal per tal d’identificar i quantificar el nivell dels components de PRC1. A partir d'aquesta anàlisi es van seleccionar quatre components del PRC1 ( CBX6, BMI1, RING1A i CBX7) i dos components del PRC2 (EZH2 i ASXL1) per al seu posterior estudi. Vam decidir treballar amb línies cel·lulars relacionades amb MDS per tal d’estudiar aquests components PRC. Per aquesta raó, hem caracteritzat àmpliament 5 línies cel·lulars de leucèmia mieloide aguda (LMA) derivades de síndromes mielodisplàstiques (SMD) per citogenètica convencional, single nucleotide polymorphism arrays, un panell mutacional de 83 gens relacionats amb SMD /LMA i immunofenotip. Després d'aquest estudi, vam seleccionar la línia cel·lular SKK-­1 com el model més adequat per estudiar la funció dels components PRC1 seleccionats. Basant-­ nos en la troballa que RING1A està altament expressat en cèl·lules mare hematopoètiques i a més es sobreexpressa en pacients de SMD amb alt risc, hem analitzat la funció de RING1A. Vam trobar que RING1A inhibeix la diferenciació de la línia cel·lular de SMD/LMA i en cèl·lules mare hematopoètiques primàries. Proporcionem a més la primera evidència que la inhibició farmacològica de RING1A podria ser una estratègia terapèutica ja que el tractament en cèl·lules mare hematopoètiques afavoreix la diferenciació.

Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst and have the capacity for unlimited proliferation while retaining their potential to differentiate into a wide variety of cell types when cultured in vitro. These properties have made of human embryonic stem cells (hESC) an excellent model on which to study the conditions required for differentiation into specific cell lineages, and consequently the possibility of transplanting specific cell types into damaged tissues. The continued turn over of ESC while maintaining an undifferentiated state is dependent on unusual cell cycle properties. These unusual proliferative properties are responsible for the generation of tumours when these cells are injected into adult animals. Thus, the study of the unusual proliferative properties of hESC needs to be addressed if their potential is to be realized. To date, most studies of the cell cycle in hESC have been descriptive, lacking functional studies that reveal the mechanisms of how the cell cycle maintains pluripotency and self- renewal of hESC. In this thesis we sought to understand the mechanisms of cell cycle control of hESC. We asked the question if a single cell cycle gene could regulate the self-renewal or pluripotency properties of hESC using a gain and loss of gene function strategy. We have identified that the protein expression of the p27Kip1 cell cycle inhibitor was low in human pluripotent cells, but its expression increased during differentiation together with changes in the cell cycle structure of pluripotent cells. By adopting a gain and loss of function strategy we increased or reduced its expression in undifferentiating conditions to define its functional role in self-renewal and pluripotency of Hesc, using undifferentiation conditions, overexpression of p27Kip1 in hESC lead to a G1 phase arrest with an enlarged and flattened hESC morphology and consequently loss of self-renewal ability. Loss of p27Kip1 caused an increase of self-renewal while maintaining an undifferentiated phenotype. Moreover, we have shown that a change in the balance of p27Kip1 levels in undifferentiated hESC affects expression of the mesoderm markers: BRACHYURY and TWIST. We have found that expression changes of TWIST are associated with the presence of p27Kip1 protein in the TWIST1 gene promoter. The results presented in this thesis have interesting implications in stem cell biology. Firstly, these results define that the maintenance of p27Kip1 protein levels at a certain level is essential for self-renewal and pluripotency of hESC. Secondly, p27Kip1 is involved in the regulation of TWIST which is upregulated in several types of tumours and induces an epithelial-mesenchymal transition to facilitate tumor metastasis.
Las células madre embrionarias humanas (conocidas como hESC por sus siglas en inglés de human embryonic stem cells) son derivadas de la masa celular interna de los blastocistos y poseen la capacidad para auto-renovarse ilimitadamente, reteniendo su potencial para diferenciarse hace una amplia variedad de tipos celulares (pluripotencia), cuando son cultivadas in vitro. Estas propiedades permiten el estudio de las condiciones requeridas para la diferenciación hacia linajes específicos y la posibilidad de trasplantar tipos celulares específicos en tejidos dañados. El continuo recambio de las hESC al mismo tiempo que mantienen un estado de indiferenciación es dependiente de sus inusuales propiedades proliferativas. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio de los mecanismos de control del ciclo celular de las hESC. Nos preguntamos si una única proteína del ciclo celular podría regular las propiedades de auto-renovación o pluripotencia de las hESC. En esta tesis doctoral identificamos que la expresión proteica del inhibidor del ciclo celular p27Kip1 era baja en diversas líneas celulares humanas pluripotentes pero aumentó durante la diferenciación, al mismo tiempo que la estructura del ciclo celular cambió. Mediante una estrategia de ganancia y pérdida de función, aumentamos o reducimos la expresión de p27Kip1 a fin de definir su función en la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC. En condiciones de indiferenciación, la sobreexpresión de p27Kip1 en las hESC resultó en un arresto del ciclo celular en fase G1 y un cambio hacia una morfología más grande y aplanada, y consiguiente pérdida de la propiedad de auto-renovación. La pérdida de p27Kip1 causó un aumento de la auto-renovación manteniendo un fenotipo indiferenciado. También, hemos demostrado que un cambio en la expresión de p27Kip1 en hESC indiferenciadas afecta la expresión de los reguladores de mesodermo: BRACHYURY y TWIST. Además, hemos descubierto que los cambios en la expresión de TWIST están asociados con la presencia de la proteína p27Kip1 en el promotor de TWIST1. Estos resultados definen que los niveles de expresión de p27Kip1 son críticos para la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC y sugieren una función para p27Kip1 en el control de la transición de epitelio a mesénquima.

A pesar de la abundancia de estudios realizados sobre el papel de las células acinares en las patologías exocrinas del páncreas (i.e. pancreatitis y cáncer), el estudio de las modificaciones producidas durante la diferenciación acinar en dichas patologías, se ha visto limitado por la escasez de modelos celulares no tumorales. Resultados previos de nuestro laboratorio, muestran que las células mES (células madre embrionarias de ratón )- pluripotentes y con la capacidad para generar tipos celulares especializados- pueden desarrollar un fenotipo acinar in vitro. Los objetivos de esta tesis han sido aumentar el contenido de enzimas digestivos así como las propiedades funcionales de las células generadas. Para ello se sobreexpresaron de forma estable p48, RBPJL y Mist1en células madre por transducción lentiviral de estos genes. Obtuvimos, gracias a una estrategia de infección en múltiples etapas, líneas celulares transgénicas mES que expresaban de forma constitutiva RBPJL y/o Mist1. La superimposición de la expresión de p48 por infección lentiviral en células en proceso de diferenciación dio lugar a una fuerte expresión de enzimas digestivos, con un patrón de regulación similar al que acontece in vivo durante el desarrollo pancreático. En esta inducción, tanto p48 como RPBJL son indispensables. Por otro lado, hemos mostrado un aumento elevado en la producción de varios componentes de la maquinaria secretota dependiente de Mist1. Además, hay que hacer notar ,que las células p48/RBPJL/Mist1 exhiben una regulada-secreción en respuesta a los secretagogos acinares y una mejor actividad de que la línea celular acinar 266-6. La expresión combinada de genes clave implicados en el desarrollo pancreático en células ES es un prometedor abordaje que nos llevará a una comprensión de los sutiles procesos del desarrollo exocrino pancreático.
Despite known involvement of acinar cells in pancreatic exocrine pathologies (i.e pancreatitis and pancreatic cancer), the lack of normal cell-based models has limited the study of the alterations that occur in the acinar differentiation program. Our previous data showed that mES (murine embryonic stem) cells, which are pluripotent and have the ability to generate specialized cell types, can acquire an acinar phenotype in vitro. The aim of this work was to increase the digestive enzyme content of the generated cells as well as their functional properties based on stable overexpression of p48, RBPJL and Mist1 by lentiviral gene transduction. Thus, we engineered transgenic mES cell lines constitutively expressing RBPJL and/or Mist1 using a multi-step infection strategy. The superimposition of p48 expression by lentiviral infection of differentiating cells resulted in a strong expression of digestive enzymes, with a pattern of regulation similar to what occurs in vivo during pancreatic development. In this induction, both p48 and RPBJL are indispensable. On the other hand, we showed a high increase in the production of several components of the secretory machinery which was dependent of Mist1. Importantly, p48/RBPJL/Mist1 cells exhibited a regulated-secretory in response to acinar secretagogues and a better secretion activity than the 266-6 acinar cell line. Combined expression of key genes involved in pancreatic development in ES cells may be a promising approach to better understand subtle steps of pancreatic exocrine development.

Chromocenters are established after the 2-cell (2C) stage during mouse embryonic development, but the factors that mediate chromocenter formation remain largely unknown. To identify regulators of 2C heterochromatin establishment, we generated an inducible system to convert embryonic stem cells (ESCs) to 2C-like cells, thus modeling early embryogenesis in vitro. This conversion is marked by a global reorganization of H3K9me3-heterochromatin foci, which are then reversibly formed upon re-entry into pluripotency. Profiling the chromatin-bound proteome of ESCs transitioning to 2C-like cells, we uncover chromatin regulators involved in de novo heterochromatin formation and a relationship between cell cycle regulation and the establishment of the 2C-like state. We identified SMARCAD1, which associates with H3K9me3-heterochromatin in ESCs, but its nuclear localization is lost in 2C-like cells. SMARCAD1 depletion in mouse embryos leads to developmental arrest and loss of H3K9me3. Collectively, our findings contribute to comprehending the establishment of chromocenters during early development, a key step to instruct the embryonic totipotent program toward pluripotency.
Los cromocentros se forman después del estadio de 2 células (2C) durante el desarrollo embrionario de ratón, pero los factores que median su formación siguen siendo en gran medida desconocidos. Para identificar los reguladores del establecimiento de la heterocromatina 2C, generamos un sistema inducible capaz de convertir células madre embrionarias (ESCs) en células similares a embriones 2C (células 2C-like), modelando así el desarrollo temprano in vitro. Esta conversión está caracterizada por una reorganización global de las regiones heterocromáticas marcadas por H3K9me3, las cuales se forman de nuevo al volver a la pluripotencia. Describimos el proteoma unido a la cromatina de ESCs reprogramándose a células 2C-like donde descubrimos reguladores de la cromatina implicados en la formación de novo de heterocromatina así como una relación entre la regulación del ciclo celular y el establecimiento del estado 2C-like. Identificamos el factor SMARCAD1, el cual se asocia con la heterocromatina marcada por H3K9me3 en ESCs, pero su localización nuclear se pierde en las células 2C-like. Finalmente, eliminamos SMARCAD1 en embriones de ratón observando una detención en su desarrollo y una pérdida de H3K9me3. Estos hallazgos contribuyen a comprender el establecimiento de los cromocentros durante el desarrollo temprano, un paso crucial para instruir el programa totipotente embrionario hacia la pluripotencia.

Las células madre embrionarias (ESCs) derivan de la masa cellular interna de los blastocistos y son capaces de generar las tres capas germinales. Muchos factores controlan la pluripotencia incluyendo la ruta Wnt/β-catenina. La implicación de esta ruta en la renovación celular no ha sido aún esclarecida, mientras que su función es indispensable para la diferenciación de ESCs. En esta tesis investigamos como Wnt puede afectar la stabilidad epigenética de las ESCs. Interesantemente, observamos que la reducción de señal Wnt/β-catenina provoca desmetilación del ADN y perdida de represores de la cromatina en varias regiones de control de la impronta genética (ICR). Al contrario, el mantenimiento de Wnt/β-catenina no afectó el estado de los ICR. Además, mostramos que β-catenina puede interaccionar directamente con KAP1 y ZFP57, Finalmente, demostramos que una baja dosis de Wnt/β-catenina es necesaria durante los eventos tempranos de reprogramación cellular, pero la inhibición continua de Wnt perjudica este proceso.
Mouse embryonic stem cells (ESCs) derive from the inner cell mass of the blastocyst and they are able to generate the three germ layers. Many factors control ESC pluripotency including Wnt/β-catenin signaling pathway. The implication of Wnt/β-catenin pathway in self-renewal remains still unclear, whereas its function is indispensable for ESC differentiation. In this study we investigate the effect of Wnt activity on ESC epigenetic stability. Indeed we observed that loss of Wnt/β-catenin signaling causes loss of DNA methylation and chromatin repressors recruitment, such as H3K9me3 and ZFP57, at several imprinted control region (ICR). On the contrary, sustained Wnt/β-catenin signaling protected the ICR status. Moreover, we showed that β-catenin could directly interact with KAP1 and ZFP57 proteins. Finally, we demonstrated that a low dosage of Wnt/β-catenin signaling is necessary during the early stages of somatic cell reprogramming process. However continuous inhibition of Wnt/β-catenin pathway is detrimental to this process.

Current therapy against colorectal cancer (CRC) is based on DNA-damaging agents that eradicate highly proliferative malignant cells. Whether sublethal chemotherapy affects tumour cell behaviour and impacts on patient outcome is primarily unstudied. We now show that sublethal chemotherapy imposes a non-senescent quiescent-like phenotype (TQL phenotype) to TP53 wildtype human CRC patient derived organoids (PDOs) and cell lines. CRC cells displaying this phenotype exhibit tumour-initiating activity comparable to untreated cells but superior metastatic capacity. Thus, re-entry of TQL cells into the cell cycle could be partially responsible of CRC patients’ relapse and metastasis. The TQL phenotype is linked to the acquisition of foetal traits downstream of YAP1, similar to that observed in intestinal regeneration after damage. Importantly, we have uncovered from TQL cells a foetal intestinal stem cell signature (feISC signature) that is also found in untreated human CRC tumours. Notably, nuclear YAP1 accumulation or detection of this signature predict poor prognosis in untreated CRC patients carrying TP53 wildtype tumours. Collectively, our results uncover a potential deleterious effect of chemotherapy and show that detection of nuclear YAP1 or foetal ISC signatures in tumours could be implemented in the clinical practice to inform about patient candidates for closer follow-up or specific pathway-based therapies, such as inhibition of YAP1.
La teràpia actual contra el càncer colorectal (CRC) està basada en l’ús d’agents que danyen el DNA, els quals eradiquen específicament les cèl·lules malignes molt proliferants. Actualment es disposa de molt poca informació sobre si el tractament amb quimioteràpia subletal afecta el comportament de les cèl·lules tumorals i si té un impacte en l’evolució del pacient. En el present estudi mostrem que la quimioteràpia subletal imposa un fenotip quiescent no senescent (fenotip TQL) en organoids derivats de pacients (PDOs) amb CRC i en línies cel·lulars amb p53 funcional. Les cèl·lules de CRC que mostren aquest fenotip presenten una capacitat d’iniciació de nous tumors comparable a la de les cèl·lules no tractades i una capacitat metastàtica superior. Per tant, la reentrada de les cèl·lules TQL al cicle cel·lular podria parcialment ser responsable de la recaiguda i la metàstasi dels pacients amb CRC. El fenotip TQL està associat amb l’adquisició de trets fetals depenent de YAP1, similar a l’observat en la regeneració de l’intestí danyat. És important destacar que hem descrit a partir de les cèl·lules TQL una signatura de cèl·lules mare intestinals fetals (signatura feISC) que també es troba en tumors CRC humans no tractats. A més, l’acumulació de YAP1 al nucli o la detecció d’aquesta signatura prediu mal pronòstic en tumors amb p53 funcional de pacients amb CRC no tractats. Col·lectivament, els nostres resultats revelen un nou potencial efecte perjudicial de la quimioteràpia i mostren que la detecció de YAP1 nuclear o de signatures feISC en tumors es podria implementar a la pràctica clínica per informar sobre els pacients candidats a un seguiment més proper o a teràpies dirigides específiques, com la inhibició de YAP1.
La terapia actual contra el cáncer colorectal (CRC) está basada en el uso de agentes que dañan el DNA, los cuales erradican específicamente las células malignas muy proliferantes. Actualmente se dispone de muy poca información sobre si el tratamiento con quimioterapia subletal afecta el comportamiento de las células tumorales y si tiene un impacto en la evolución del paciente. En el presente estudio mostramos que la quimioterapia subletal impone un fenotipo quiescente no senescente (fenotipo TQL) en organoides derivados de pacientes (PDOs) con CRC y en líneas celulares con p53 funcional. Las células de CRC que muestran este fenotipo presentan una capacidad de iniciación de nuevos tumores comparable a la de las células no tratadas y una capacidad metastática superior. Por lo tanto, la reentrada de las células TQL al ciclo celular podría parcialmente ser responsable de la recaída y la metástasis de los pacientes con CRC. El fenotipo TQL está asociado con la adquisición de rasgos fetales dependiente de YAP1, similar a lo observado en la regeneración del intestino dañado. Es importante destacar que hemos descrito a partir de las células TQL una signatura de células madre intestinales fetales (signatura feISC) que también se encuentra en tumores CRC humanos no tratados. Además, la acumulación de YAP1 al núcleo o la detección de esta signatura predice mal pronóstico en tumores con p53 funcional de pacientes con CRC no tratados. Colectivamente, nuestros resultados revelan un nuevo potencial efecto perjudicial de la quimioterapia y muestran que la detección de YAP1 nuclear o de signaturas feISC en tumores se podría implementar en la práctica clínica para informar sobre los pacientes candidatos a un seguimiento más cercano o a terapias dirigidas específicas, como la inhibición de YAP1.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias.
Las células madre mesenquimáticas (MSC, del inglés, Mesenchymal Stem Cells) son células progenitoras adultas capaces de diferenciarse hacia células de tejidos mesodérmicos y que además poseen potencial de auto-renovación y morfología fibroblastoide. Como parte de su capacidad de diferenciación multilinaje, estudios recientes han demostrado que las MSC cuentan con la capacidad de diferenciarse in vitro hacia linaje celular germinal. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial de diferenciación germinal de MSC derivadas de médula ósea fetales bovinas (MSC-MO) mediante exposición in vitro a los biofactores proteína morfogénica ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) y ácido retinoico (AR). Las MSC-MO fueron aisladas mediante adherencia a placas de cultivo de plástico desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=14). El efecto dosis-respuesta fue analizado luego de 21 días de cultivo utilizando tres concentraciones de BMP4 (10, 50, 100 ng/mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng/mL) y AR (0,01; 0,1 y 1 μM). El efecto temporal fue analizado en los días 0, 7, 14 y 21 de cultivo utilizando 100 ng/mL de BMP4, 100 ng/mL de TGFβ1 o 0,1 μM de AR. Se analizaron los genes de pluripotencia OCT4, NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, PIWIL2, STRA8 y el marcador de meiosis SCP3 mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La expresión de Dazl, Nanog y Oct4 fue analizada mediante citometría de flujo. El tratamiento con AR y BMP4 aumentó la expresión génica de DAZL (P<0,05) a partir del día 7. Sin embargo, el aumento bajo el efecto de BMP4 fue transitorio. TGFβ1 no modificó la expresión de mRNA de DAZL. La suplementación con AR activó la expresión de mRNA de NANOG a partir del día 7 hasta el día 21 de exposición, pero no se observaron cambios de expresión bajo el efecto de BMP4 durante el período de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 y de SCP3 no fueron modificados bajo el efecto de ninguno de los factores utilizados. En conclusión, AR fue el biofactor más efectivo en la diferenciación germinal de MSC-MO logrando el aumento de la expresión del gen germinal DAZL
Mesenchymal Stem Cells (MSC) are adult progenitor cells that possess self-renewal capacity and fibroblastoid morphology and are also capable of differentiating into cells of mesodermal tissues. In addition to the multilineage differentiation potential, recent studies have shown that MSCs can differentiate in vitro into germ cell lineage. The objective of the present study was to evaluate the potential for germ cell differentiation of MSCs derived from fetal bovine bone marrow (BM-MSC) by in vitro exposure to bioactive factors bone morhogenetic 4 (BMP4), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and retinoic acid (RA). BM-MSC were isolated by adherence to plastic culture plates from bone marrow of bovine fetuses (7-9 months gestation, n = 14). The dose-response effect of each factor was analyzed using three concentrations of BMP4 (10, 50, 100 ng / mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng / mL) and RA (0.01, 0.1 and 1 μM), after 21 days of culture. The temporal effect was analyzed on days 0, 7, 14 and 21 of culture using 100 ng/mL of BMP4, 100 ng/mL of TGFβ1 o 0,1 μM of RA. The pluripotency genes OCT4, NANOG, germ cell genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germ cell genes DAZL, PIWIL2, STRA8 and the meiosis marker SCP3 were analyzed by quantitative PCR (Q-PCR). The expression of Dazl, Nanog and Oct4 was analyzed by flow cytometry. Treatment with AR and BMP4 increased DAZL gene expression (P <0.05) from day 7, however the increase under the effect of BMP4 was transient. TGFβ1 did not modify the expression of DAZL mRNA. Supplementation with RA activated NANOG mRNA expression from day 7 to day 21 of exposure, but no expression changes were observed under the effect of BMP4 during the culture period. OCT4 mRNA levels are not modified under the effect of any of the factors as well as the SCP3 meiosis marker. In conclusion, AR was the most effective biofactor in the germ differentiation of BM-MSC achieving increased expression of the DAZL germline gene
Financiamiento: Proyecto Fondecyt N° 1161251 y Programa de becas “Convocatoria Abierta 2013” – SENESCYT, Ecuador