Academic literature on the topic 'Chromatographie liquide à haute performance couplée à la masse (LC-MS)'

Les médicaments à usage humain ou vétérinaire se retrouvent, par différents moyens, dans les milieux aquatiques et notamment dans les filières de potabilisation des eaux. Les médicaments sont en partie métabolisés après ingestion (le pourcentage dépend du principe actif et est compris entre 1 et 99 %). Des médicaments se retrouvent alors dans les eaux destinées à la consommation humaine avec des concentrations allant du ng/L à la centaine de ng/L. Différents types de métabolites existent, et parmi eux les dérivés conjugués. Ils peuvent représenter 90 % des métabolites d’un principe actif. Le travail présenté ici décrit le développement d’une méthode analytique par « Solid Phase Extraction » (SPE) en ligne – chromatographie liquide haute performance – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour la détermination et la quantification de principes actifs et leurs dérivés conjugués dans les eaux de surface et en cours de potabilisation. Ces dérivés conjugués sont susceptibles de subir une déconjugaison lors des traitements de potabilisation conduisant au relargage du principe actif. C’est pourquoi il est nécessaire de s’intéresser à ces molécules et en particulier les conjugués glucuronides. Comme tous les standards ne se sont pas disponibles dans le commerce, une nouvelle voie de synthèse en milieu aqueux a été explorée. Des analyses sont effectuées en entrée et sortie de filière de potabilisation d’eau afin de déterminer les concentrations présentes en principes actifs et leurs dérivés conjugués. Les limites de détection et de quantification obtenues sont de l’ordre du ng/L ou la dizaine de ng/L.

En raison de la diffusion incontrôlée sur le e-commerce, la sécurité et l’alternative légale aux stupéfiants habituels, les nouvelles substances psychoactives (NPS), d’apparition récente (2008), sont au cœur des phénomènes récents d’addiction et de décès mal expliqués. Au-delà des différents défis dans nos sociétés (prévention, législation), la capacité d’identifier les NPS dans des échantillons biologiques pour caractériser leur utilisation, présente de nombreux challenges analytiques. L’objectif principal de cette thèse a été de collecter des échantillons biologiques (sang, urine, cheveux) provenant de cas d’exposition à des NPS et d’y caractériser les substances présentes à l’aide de méthodes analytiques originales, dans le but d’enrichir les librairies de spectres de masse et d’améliorer, en conséquence, la détection de la consommation de NPS. En particulier, il s’agissait d’augmenter la fenêtre de détection de la prise de NPS en se focalisant sur les métabolites qui sont, le plus souvent, les produits majeurs d’élimination. Le développement analytique, par chromatographie liquide ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UHPLC-MS/MS), a demandé plusieurs mois d’optimisation afin d’obtenir une méthode robuste, exhaustive et sensible. Actuellement, la librairie de spectres MS comporte 114 NPS et est mise à jour régulièrement. A la suite de ce développement, ma thèse a porté sur l’étude de cas d’intoxication vus au service des urgences du CHU de Strasbourg, mais aussi en médecine légale, avec des situations de décès et d’identification de produits inconnus provenant de saisies (poudres et cristaux). Il a également été nécessaire de développer des outils analytiques complémentaires, tels que la caractérisation de métabolite(s) par étude sur microsomes hépatiques humains (HLMs), et l’utilisation de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) afin d’identifier avec certitude certains composés et de déterminer leur degré de pureté. Les outils analytiques développés et la stratégie mise en place ont permis la rédaction de 18 publications, ainsi que l’agencement de nombreuses collaborations
Due to the uncontrolled spread on the Internet and their legal alternative to usual drugs, the new psychoactive substances (NPS), recently appeared (2008), are at the center of recent phenomena of addiction and badly explained deaths. Beyond different challenges in our societies (prevention, legislation), the ability to identify NPS in biological samples, in order to characterize their use, presents many analytical challenges. The main objective of this thesis was to collect biological samples (blood, urine, hair) from cases of exposure to NPS and to characterize the substances present using original analytical methods, in order to enlarge the libraries of mass spectra and improve, as a result, the detection of NPS consumption. In particular, it was intended to increase the detection sensitivity of NPS intake by focusing on the metabolites that are often the major products of elimination. This analytical development, by ultra-high liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), required several months of optimization in order to obtain a robust, exhaustive and sensitive method. At present, the mass spectra database has 114 NPS and is regularly updated. Thereafter, ma thesis focused on the study of cases of intoxication observed in the emergency department of Strasbourg, but also in legal medicine with situations of deaths and identification of unknown products collected from seizures (powders and crystals). It has also been necessary to implement complementary analytical tools, such as the characterization of metabolites by human liver microsomes (HLMs), and the use of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accurately identify the compounds and establish their purity degrees. The analytical tools developed, and the strategy adopted, allowed the writing of 18 publications, as well as the setting up of numerous collaborations

La levure enrichie en sélénium (Saccharomyces cerevisiae) est l’une des formes de supplémentation alimentaire les plus appréciée chez l’homme et l’animal, notamment pour ses propriétés anti-cancérigènes potentielles. Les travaux de cette thèse ont contribué principalement à la caractérisation globale du selenométabolome (l’ensemble des métabolites de faibles poids moléculaires contenant du sélénium). C’est grâce aux développements et à l’utilisation de chromatographies liquides multidimensionnelles orthogonales couplées à l’ICP MS et à l’ESI MSn à haute résolution que ce travail de recherche a été rendu possible. L’approche méthodologique ainsi mise au point a permis de réaliser des empreintes moléculaires du sélénométabolome et de compléter la liste des composés identifiés (plus de 50, représentant la liste la plus complète à ce jour). Ces résultats ont également permis d’améliorer la compréhension des voies métaboliques utilisées lors de l’utilisation du sélénium par la levure. De plus, l’utilisation de la signature isotopique du sélénium déterminée par ICP MS multicollecteur en association avec les empreintes moléculaires du sélénométabolome représente ici un outil original et de choix permettant la discrimination des levures enrichies en fonction de leurs origines
Selenium-rich yeast (Saccharomyces cerevisiae) is the most popular form of supplemented selenium because of its putative anticancer properties. This thesis offers a contribution to the characterization of selenometabolome (the entirety of the low molecular weight selenium-containing metabolites) owing to the development of multidimensional liquid chromatography with parallel detection by ICP MS and electrospray high-resolution MSn. The developed methods permitted to obtain a selenometabolome’s fingerprint including the identity of over 50 selenium metabolites, the most exhaustive list so far, and to obtain a deeper insight into the Se metabolic pathways in yeast. Besides, isotopic signatures obtained by multicollector ICP MS associated with the selenometabolome fingerprint allowed the discrimination of Se-rich yeast samples according to their origin

Des millions d’années d’évolution ont débouchées sur des biomolécules spécifiques capables de complexer ou d’intégrer dans leur structure des hétéroatomes ou des métaux. Leur présence est indispensable pour le bon déroulement de certains processus biochimiques fondamentaux et leur absence peut être à l’origine de maladies ou de dysfonctionnements. L’architecture moléculaire déployée est souvent très complexe et l’étude des biomolécules a énormément progressé depuis le développement des sources d’ionisation electrospray et MALDI en complément des techniques de résonances magnétiques nucléaire (RMN). Cependant ces techniques ne permettent pas toujours d’analyser les composés minoritaires que sont les metallobiomolécules, ou celles dont l’hétéroatome qu’elles contiennent jouent un rôle biochimique clé. Le travail de recherche présenté a pour objet l’identification de ces biomolécules et surtout leur quantification par le biais de l’hétéroatome ou du métal qu’elles contiennent. Outre le grand nombre de molécules qu’ils comportent, les échantillons d’origine biologique ont la particularité d’être souvent réduits à des volumes inférieurs au microlitre. L’utilisation de techniques séparatives miniaturisées telles que les systèmes nanoHPLC furent donc requises. Le développement du couplage nanoHPLC - ICP MS, point focal de cette thèse, a nécessité la mise au point d’une nouvelle interface brevetée, et a permis la détection et la quantification des hétéroatomes contenus dans les biomolécules ciblées. L’utilisation du couplage parallèle utilisant cette fois un spectromètre de masse moléculaire permis ensuite de déterminer leur structure
As a result of millions of years of evolution, biomolecules and biological complexes have incorporated heteroelements or metals in their chemical structure. Their presence can be essential to the functioning of fundamental biochemical processes or alternatively their absence can be responsible for causing illnesses and dysfunctions. The molecular structure of these biomolecules is often very complex and their characterization has progressed substantially with the development of NMR, MALDI and electrospray techniques. Nevertheless, these techniques show limitations for the analysis of minor compounds, which are often the target hetero- or metallo- containing molecules, key to the biochemical role under investigation. The researches presented here aim at identifying and quantifying these biomolecules through the heteroatom or metal present in the structure. In addition to the large number of molecules that biological sample can contain, the sample volume is often limited to the microlitre range. The use of miniaturized separation techniques, such as nanoHPLC systems was therefore required. The instrumental development of a patented nanoHPLC - ICP MS interface, principal objective of this thesis, has enabled a series of advances in the identification and quantification of the heteroatoms contained in the targeted biomolecules. The parallel coupling using a molecular mass spectrometer was then used to determine the biomolecule structure

La peau est l’organe le plus étendu du corps humain. Doté d’une membrane biologique fine appelée la couche cornée, celle-ci le protège du desséchement et des agressions extérieures chimiques ou mécaniques auxquelles le corps humain doit faire face. Ce travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à décrire via la littérature existante les effets de l’âge,dûs au vieillissement intrinsèque et extrinsèque,sur la physiologie cutanée du Stratum Corneum (SC).La partie expérimentale basée sur la microscopie vibrationnelle traitera des variations de la fonction barrière et de l’hydratation du SC lors du vieillissement chronologique et photo-vieillissement. D’autres méthodes ont également été utilisées comme la chromatographie liquide en phase normale couplée à la spectrométrie de masse haute résolution dotée d’une source APCI et d’un détecteur Orbitrap pour l’étude de la composition détaillée des lipides du SC ainsi que des méthodes plus globales comme la PIE ou la cornéométrie. Le caractère non invasif de toutes ces méthodes a permis de réaliser ces études in vivo. L’évolution de la fonction barrière a été étudiée aux niveaux tissulaire, moléculaire et supramoléculaire par micro-spectroscopie confocale Raman et spectroscopie Infrarouge. Puis le lien moléculaire a été fait entre le vieillissement intrinsèque et les céramides de la matrice lipidique intercornéocytaires par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Les molécules discriminantes entre population jeune et âgée ont été déterminées par analyse chimiométrique. L’évolution de l’hydratation cutanée aux niveaux tissulaire, moléculaire et supramoléculaire a également été l’objet d’une investigation approfondie. Les variations de la composition des NMF et la teneur en eau dans le SC lors du vieillissement cutané ont été mises en lumière en utilisant des descripteurs spectraux Raman. Les variations structurelles des molécules d’eau impactant l’organisation supramoléculaire des édifices lipidiques ont également été évaluées. Au cours du vieillissement, la fonction barrière cutanée et hydratation sont conservées
Skin is the external surface defining the human body in space. Its outer-most layer is a thin biological membrane, called Stratum Corneum(SC), that protects the internal organs from desiccation as well as chemical or mechanical external aggressions. The present thesis aimsin a first step, to summarize the current knowledge regarding the effects of intrinsic and extrinsic aging on SCphysiology,based on available literature. The experimental part addresses the gaps in our understanding of the effects of chronological aging and photoaging on the SC barrier function and hydration, using traditional methods (such as trans epidermal water loss and skin conductance) as well as more advanced ones (vibrational spectroscopies, liquid chromatography in normal phase tandem mass spectrometry high resolution with an APCI source and an Orbitrap detector. As these methods are non-invasive, all studies have been carried out in vivo. The evolution of the barrier function has been studied at the tissular, molecular and supramolecular levels using confocal Raman micro-spectroscopy and infrared spectroscopy. Then the link between the intrinsic aging and the ceramides of the intercorneocytary lipid matrix has been studied by liquid chromatography tandem mass spectrometry. The discriminant molecules between young and old population have been identified by a chemometric analysis. The evolution of cutaneous hydration at the tissular, molecular and supramolecular level has also been investigated. The variations in the NMF composition and the SC water content have been studied by Raman spectral descriptors. Moreover, the structural variations of water molecules impacting the supramolecular organization of the lipid structures have been evaluated. Chronological aging and chronic exposure to environmental factors mildly affect SC barrier function and hydration levels. However, the processes controlling these properties are affected by aging in a site-dependent fashion

Certains acides aminés et peptides sont des neurotransmetteurs impliqués dans les maladies neurologiques. Présents en très faible quantité dans les échantillons biologiques, une HPLC couplée à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse est utilisée pour identifier et doser ces molécules. Les acides aminés sont marqués avec un agent fluorogène : le naphtalène-2, 3-dicarboxaldéhyde (NDA) et un nucléophile (CN-). Pour l'analyse des peptides enképhalines, le marquage est modifié afin de faciliter l'analyse en spectrométrie de masse : le nucléophile CN- est remplacé par un aminothiol facilement ionisable en mode positif, le N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT). Des études théoriques en modélisation moléculaire, spectrométrie de masse haute résolution et sur l'échange H/D ont été réalisées pour interpréter les résultats obtenus avec chaque marquage
Some amino acids and peptides are neurotransmitters involved in neurological diseases. As they are very low concentration in biological samples, HPLC coupled with a fluorescence detector and a mass spectrometer is performed for the identification and the quantification of these molecules. As amino acids are not fluorescent natively, they are labelled with a fluorogenic dye: the naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA) and a nucleophile (CN-). The labelling for the peptides (enkephalins) is slightly modified in order to facilitate the ionisation in positive mode in mass spectrometry: the nucleophile CN- is substituted by an aminothiol easily ionisable, the N,N-dimethylaminoethanethiol (MeAT). Some theoretical studies are investigated in molecular modelling, high resolution mass spectrometry and H/D exchange studies in order to explain the results obtained on each labelling

Chez l’homme, les erreurs innées du métabolisme des lipides sont dues à des déficits enzymatiques, entraînant une accumulation intracellulaire de substrats lipidiques. Il en résulte un large éventail de symptômes tels que des atteintes viscérales, osseuses et dans certains cas neurologiques. En outre, de nombreux patients atteints de ce type de maladie présentent des anomalies hématologiques et vasculaires attribuées à des anomalies rhéologiques du globule rouge (GR). Ces observations ont conduit à l’hypothèse de l’existence d’un lien entre les propriétés anormales du GR et sa composition lipidique. Or actuellement, le profil lipidique du GR normal reste méconnu. Cependant, le diagnostic précoce de ces troubles est d’une importance capitale pour la prise en charge des patients, notamment dans les cas où un traitement correctif est disponible. La maladie de Gaucher (MG) de type 1, qui est une maladie lysosomale caractérisée par un déficit en β-glucocérébrosidase et pour laquelle un traitement enzymatique substitutif (ERT) est proposé, en est le meilleur exemple. D’où l’intérêt de disposer d’un outil simple et rapide de diagnostic de ce type de maladie.Dans le cas de la MG, le diagnostic repose encore sur la mise en évidence, laborieuse, du déficit enzymatique. Néanmoins, des travaux récents suggèrent que les anomalies rhéologiques du GR pourraient être dues à l’accumulation de quatre sphingolipides, le glucosylcéramide, la glucosylsphingosine, la sphingosine et la sphingosine-1-phosphate, qui seraient de bons candidats biomarqueurs. Or, les méthodes actuelles de dosage de ces sphingolipides nécessitent au moins deux étapes chromatographiques, avec pour chacune une étape longue et fastidieuse de préparation de l’échantillon, ce qui ne facilite guère une approche lipidomique de ce sujet. En outre, seul le glucosylcéramide a été dosé dans le GR tandis que les trois autres sphingolipides n’ont été dosés que dans le plasma. Ces candidats biomarqueurs restent donc à valider.Dans cette thèse, nous avons développé et validé une méthode simple et rapide, par UHPLC-MS/MS, de dosage simultané des 4 sphingolipides impliqués dans la MG. L’application de cette méthode à des GR provenant de patients atteints de la MG, en collaboration avec l’Institut National de Transfusion Sanguine et la société Shire, nous a permis de : 1- valider un biomarqueur parmi les quatre proposés et de montrer que les trois autres n’étaient pas suffisamment spécifiques ; 2- vérifier l’efficacité du traitement ERT actuellement proposé et 3- confirmer l’hypothèse de départ reliant les anomalies rhéologiques du GR à sa composition lipidique.De même, une étude systématique des conditions opératoires nous a permis de généraliser la méthode proposée à l’identification et au dosage de l’ensemble des sphingolipides présents dans un GR ainsi que des phospholipides, constituants majoritaires de sa membrane. Appliquée à la quantification simultanée d’une trentaine de sphingolipides et de phospholipides dans le GR normal et celui de la MG, cette méthode nous a permis de mettre en évidence l’implication d’autres lipides polaires dans la maladie de Gaucher, outre les 4 sphingolipides jusqu’alors proposés. De même, il est prévu de l’adapter à moyen terme pour le profilage total, par classe, de tous les lipides présents dans le GR.Enfin, nous avons évalué d’autres techniques de SM telles que la haute résolution et la mobilité ionique (TWIMS et DIMS) dans le but d’affiner la recherche de nouveaux biomarqueurs, notamment par l’identification des lipides isomères non discriminables par les techniques de MS conventionnelles. Grâce à une collaboration avec le Laboratoire de Chimie Physique (LCP, CNRS UMR 8000) nous avons montré la faisabilité de cette approche en séparant en DIMS deux isomères : la galactosylsphingosine 18:1 et la glucosylsphingosine 18:1 et nous poursuivons actuellement cette étude pour séparer d’autres couples d’isomères
In humans, hereditary disorders of lipid metabolism are due to enzyme deficiencies, resulting in intracellular accumulation of lipid substrates. This results in a wide range of symptoms such as visceral, bone and in some cases neurological disorders. Furthermore, many patients suffering such diseases have hematologic and vascular symptoms attributed to red blood cell (RBC) rheological abnormalities. These observations led to a hypothesis linking RBC abnormal properties to its lipid composition. However, the lipid profile of normal RBC remains unknown to date. Early diagnosis of these conditions is of importance notably when a therapy is available. This is the case for Gaucher disease (GD) type 1, a lysosomal disorder characterized by β-glucocerebrosidase deficiency, where an enzyme replacement therapy (ERT) is proposed. Hence, the availability of a simple and rapid tool of diagnosis of such a disorder is of great importance, notably for a better patient care and monitoring.To the best of our knowledge, standard diagnosis procedures and monitoring of GD patients are still based on the tedious evaluation of enzyme deficiency. Nevertheless, recent works suggest that these rheological disorders may be due to the accumulation of four sphingolipids, glucosylceramide, glucosylsphingosine, sphingosine and sphingosine-1-phosphate, which could be considered as relevant biomarkers. However, most of current determination methods of these sphingolipids require at least two liquid chromatographic runs, each with a time-consuming sample preparation step that does not facilitate a lipidomic approach. In addition, only glucosylceramide was quantified in RBC while the other three sphingolipids were quantified only in plasma. Thus, these biomarker candidates remain to be validated.In this PhD, we describe a simple and rapid UHPLC-MS/MS method of simultaneous determination of the 4 sphingolipids involved in GD in both plasma and RBC. The application of this method to RBC from GD patients, in collaboration with the Institut National de Transfusion Sanguine and Shire (USA), allowed us: 1- to validate one biomarker among the four proposed candidates and to show that the other three candidates are not specific; 2- to check the efficiency of the proposed ERT and 3- to confirm the initial hypothesis linking the RBC rheological abnormalities to its lipid composition.Also, a systematic study of the operating conditions allowed us to generalize the proposed method to the determination of not only all the sphingolipids present in RBC but also all phospholipids, which are the major constituents of its membrane. The application of the later method to the simultaneous quantification of thirty sphingolipids and phospholipids in normal and GD RBCs, allowed us to validate it and to unravel the involvement of other candidate biomarkers of GD, different from the 4 previous sphingolipids. Providing appropriate modifications, this method is intended to be used for the profiling of all lipid classes in plasma and RBC. This is our main objective in the medium-term.Finally, we evaluated other modern MS techniques such as high resolution (HRMS) and ion mobility (TWIMS and DIMS) in order to refine the investigation of new biomarker candidates, including the separation of lipid isomers that cannot be discriminated by conventional MS techniques. Indeed, in collaboration with the Laboratoire de Chimie Physique (LCP, CNRS UMR 8000), we here show the feasibility of this approach by achieving the separation of two isomers, by the DIMS technique: galactosylsphingosine 18:1 and glucosylsphingosine 18:1, which cannot be separated by conventional methods. We are currently pursuing these investigations in order to separate other isomers

En raison de leur diffusion sauvage sur le e-commerce, leur soi-disant sécurité d’usage et l’alternative légale aux stupéfiants habituels qu’ils constituent, les nouvelles substances psychoactives (NPS) sont un phénomène mondial émergeant. Au-delà de différents défis dans nos sociétés (législation, prévention,... ), la capacité d'identifier les NPS dans des échantillons biologiques présente de nombreux challenges analytiques : ces nouvelles substances ne sont pas référencées dans les bibliothèques habituelles de spectrométrie de masse commerciales, leur métabolisme est inconnu (avec parfois des métabolites actifs), les doses actives sont parfois très faibles et par conséquent, les concentrations dans le sang ou l'urine sont également faibles. Dans ce contexte, notre laboratoire effectue régulièrement des analyses toxicologiques dans un contexte clinique, et pour les forces de l’ordre, dans des échantillons biologiques à l'aide de deux principaux types d’analyseurs : la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (CL-SM/SM) pour le criblage ciblé et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (CL-SMHR) pour le criblage non ciblé. Cette dernière technique est basée sur la masse exacte (mais également, le profil isotopique et le temps de rétention) des composés de l’échantillon à partir de laquelle la formule chimique est déterminée et recherchée dans une base de données spectrales en utilisant un logiciel dédié. L’objectif de ma thèse est de caractériser des NPS et leurs métabolites (afin d’alimenter cette base de données) en utilisant une stratégie combinant des approches in vitro, in silico et in vivo. Il s’agit, en particulier, d’augmenter la sensibilité de détection de la prise de NPS en se focalisant sur les métabolites qui sont le plus souvent les produits majeurs d’élimination des NPS.A cet effet, une méthode in vitro destinée à produire les métabolites des NPS et utilisant des microsomes hépatiques humains a été mise en oeuvre. Les métabolites obtenus, comparés aux prédictions in silico, ont été enregistrés dans la base de données. Cette approche a été confrontée à l’analyses de comprimés et d’autres produits non biologiques contenant des NPS, mais également, à des données in vivo d’exposition aux NPS : cas d’intoxications, études expérimentales et études épidémiologiques prospectives et rétrospectives dans des populations ciblées, ou non…Au total, ce travail basé sur cette stratégie in vitro, in silico, in vivo m’a permis d’enrichir notre base de données de spectres de masse haute résolution (SMHR) pour le criblage non ciblé et également notre base de données de criblage ciblé (SM/SM). Notre méthode en haute résolution, qui s’est enrichie au cours de ces 3 années de thèse de 83 nouveaux NPS et 281 métabolites, constitue aujourd’hui un outil analytique efficient pour la détection d’une exposition aux NPS
Owing to wild e-commerce diffusion, alleging safety and legal alternative to usual drugs of abuse arguments, the new psychoactive substances (NPS) are emerging phenomenon in the world. In our societies, through various consecutive challenges (legislation, prevention, …), the ability to identify NPS in biological samples exhibits numerous analytical pitfalls: new substances which are not referenced in the usual commercial mass spectrometric libraries, unknown metabolism (with sometimes active metabolites), sometimes very low active dosages and consecutively low concentrations in blood or urine. In this context, clinical and forensic toxicological analyses in biological samples are routinely performed in our laboratory using two main analytical devices: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for targeted screening and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) for non-targeted screening. This last technique is based on the accurate mass (together with isotopic pattern and retention time) of sample components, from which the chemical formula is calculated and searched against a database of mass spectra using dedicated software. The aim of my thesis is to characterize NPS and metabolites (in order to increase the spectral database) using a strategy combining in vitro, in silico, and in vivo approaches. Therefore, the main goal is to increase the detection sensitivity of the NPS use by focusing on the metabolites that are most often the major products of NPS elimination. For this purpose, an in vitro method designed to produce NPS metabolites using human liver microsomes incubations was applied. Obtained metabolites, after confrontation with metabolites in silico predicted, were saved in database. This approach was subsequently confronted with analysis of tablets or other non-biological product containing NPS, but also, with in vivo observed data from NPS exposure: intoxication cases, experimental studies and prospective and retrospective epidemiological studies in targeted population or not … All in all, this work based on this in vitro, in silico and in vivo strategy allowed me to enhance our high resolution spectra database (HRMS) for non-targeted screening and also our spectra database for targeted screening (MS/MS). Today, our HRMS device, with a database that was increased with 83 new NPS and 281 metabolites for the duration of my thesis, is an efficient analytical tool for NPS use detection

Cette thèse est le résultat d’une cotutelle entre l'Université de Pau et des Pays de l'Adour (UPPA) à Pau, en France et l'Université Christian Albrecht (CAU) à Kiel, en Allemagne. Dans le cadre de cette collaboration internationale, des méthodes bio-analytiques sont développées pour analyser quantitativement et qualitativement des peptides et protéines marquées par le couplage de la chromatographie avec la spectrométrie de masse. Les peptides et les digestats des protéines sont marquées selon un protocole optimisé par des lanthanides en utilisant des composés à base de DOTA. La séparation des peptides est réalisée par IP-RP-nanoHPLC. Des données complémentaires sont acquises par MALDI-MS pour l'identification et par ICP-MS pour la quantification. Dans ce contexte, une étape de pré-nettoyage en ligne est développée et mise en œuvre dans le protocole de séparation par nanoHPLC. Cette étape permet l'élimination efficace des réactifs appliqués en excès et ainsi la diminution du bruit de fond lié à la présence de métaux lors des analyses par ICP-MS. Les données obtenues sont alors plus facile à interpréter, la sensibilité des signaux des peptides n’étant par ailleurs pas modifié. L'extraction en phase solide (SPE) appliquée comme alternative entraîne des pertes importantes de peptides et peut être considérée comme inadaptée pour l'analyse quantitative. Des additifs pour éluants de nanoHPLC, tels que l'EDTA et le HFBA sont testés et jugés non bénéfiques pour l'analyse des échantillons peptidiques normaux. HFBA peut être reconsidéré pour une application spéciale sur des peptides très hydrophiles. Des peptides marqués sont développés. Leur utilisation en quantité connue pourrait permettre la quantification rapide et simple d'un échantillon de digestat à faible complexité. De plus, cet ensemble de peptides permet la superposition fiable des chromatogrammes, et ainsi de comparer des données complémentaires obtenues par l’analyse d’échantillon par ICP-MS et MALDI-MS. Expériences d'application avec le couplage laser femtoseconde avec ICP-MS sont effectuées sur des plaques métalliques de MALDI MS et montrent des résultats très prometteurs. Pour cela, les échantillons préalablement identifiés par MALDI-MS sont analysés par fsLA-ICP-MS. Les premières tentatives de quantification sur la plaque en acier modifiée sont satisfaisantes et donnent des résultats répondant aux attentes. L’optimisation des paramètres de MALDI-MS facilite l’identification des peptides
This PhD thesis was a Cotutelle between the Université de Pau et des Pays de l’Adour (UPPA) in Pau, France and the Christian-Albrechts University (CAU) in Kiel, Germany. In the course of this international collaboration, bio-analytical methods for the quantitative and qualitative analysis of labelled peptides and proteins were developed, which were based on the hyphenation of chromatography with mass spectrometry. Peptides and protein digests were lanthanide labelled using DOTA-based compounds according to an optimised protocol. Separation on the peptide level was performed using IP-RP-nanoHPLC. Complementary data sets were acquired using MALDI-MS for identification and ICP-MS for quantification. In this context, an online precleaning step was developed and implemented in the nanoHPLC separation routine, which allowed for effective removal of excess reagents. This lead to lowered metal backgrounds during ICP-MS measurements and thus better data interpretability, while guarding peptide recovery at a maximum level. An alternative offline purification using solid phase extraction (SPE) resulted in important peptide losses and can be considered unsuitable for quantitative analysis. Additives to the nanoHPLC eluents, such as HFBA and EDTA were tested and not deemed beneficial for the analysis of normal peptide samples. HFBA can be reconsidered for special application on very hydrophilic peptide species. A set of labelled peptides was developed, which due to application of known quantities could be employed for quick and simple quantification of a low complexity digest sample. In addition this peptide set allowed for the reliable superposition of chromatograms, enabling sample comparability especially for complementary ICP-MS and MALDI-MS data. Experiments for application of fsLA-ICP-MS on MALDI-MS target plates were conducted and showed very promising results. For this purpose, samples that were already identified using MALDI-MS were supposed to be remeasured using fsLA-ICP-MS. First quantification attempts on the modified steel target plate were successful and in the range of expectance. Adjusted parameters for MALDI-MS allowed for proper peptide identifications

La phosphorylation des protéines constitue l’une des plus importantes modifications post-traductionnelles (PTMs) et intervient dans de multiples processus physiologiques tels, la croissance, la différenciation cellulaire, l’apoptose, etc. En dépit de son importance, l’analyse des phosphoprotéines demeure une tâche difficile en raison de leur nature dynamique (car la phosphorylation des protéines est un processus réversible) et de leur faible abondance relative. En effet, la détermination des sites de phosphorylation est souvent difficile car les phosphopeptides sont souvent difficiles à détecter par des méthodes d’analyse chromatographique classique et par spectrométrie de masse (MS). De récentes études ont démontré que les nombreuses méthodes d’enrichissement de phosphopeptides existantes ne sont pas complètes, et que le nombre total de phosphopeptides détectés ne chevauchent pas complètement ces méthodes. C’est pour cela qu’il existe une nécessité de combler les lacunes des méthodes d’enrichissement existantes afin d’avoir des analyses phosphoprotéomiques plus complètes. Dans cette étude, nous avons utilisé les liquides ioniques (LI), plus particulièrement les sels d’imidazolium, comme une technique d’enrichissement alternative, dans le but de favoriser une extraction sélective de phosphopeptides présents en solution. Les sels d’imidazolium ont donc été utilisés en raison de leurs propriétés physico-chimiques "facilement" ajustables selon la nature des substituants sur le noyau imidazolium et la nature de l’anion. Les sels de monoimidazolium et de bis-imidazolium possédant respectivement des chaînes linéaires à 4, 12 et 16 atomes de carbone et ayant différents anions ont été synthétisés et utilisés pour effectuer des extractions liquide-liquide et solide-liquide des phosphopeptides en solution. Dans un premier temps, des extractions liquide-liquide ont été réalisées en utilisant un liquide ionique (LI) ayant une chaine linéaire de 4 atomes de carbone. Ces extractions réalisées avec le bis(trifluoromethanesulfonyl) amide de 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-NTf2) et l’hexafluorophosphate de 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-PF6) n’ont pas montré une extraction notable du PPS comparativement au PN. Dans un deuxième temps, des extractions solide-liquide ont été réalisées en fonctionnalisant des particules solides avec des sels d’imidazolium possédant des chaines linéaires de 12 ou 16 atomes de carbone. Ces extractions ont été faites en utilisant un phosphopentapeptide Ac-Ile-pTyr-Gly-Glu-Phe-NH2 (PPS) en présence de 2 analogues acides non-phosphorylés. Il a été démontré que les sels d’imidazolium à chaine C12 étaient meilleurs pour extraire le PPS que les deux autres peptides PN (Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) et PE (Ac-Glu-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) L’électrophorèse capillaire (CE) et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ont été utilisées pour quantifier le mélange des trois peptides avant et après extraction ; dans le but de mesurer la sélectivité et l’efficacité d’extraction de ces peptides par rapport à la composition chimique du liquide ionique utilisé.
Protein phosphorylation is one of the most important post-translational modifications because it is involved in multiple physiological processes such as growth, differentiation, apoptosis, etc. Despite its importance, the analysis of phosphoproteins remains a difficult task due to their dynamic nature (phosphorylation of proteins is a reversible process) and their low abundance. Indeed, the determination of phosphorylation sites is difficult because phosphopeptides are often difficult to detect by conventional chromatographic analysis and by mass spectrometric (MS) methods. Recent studies have shown that the existing methods of enrichment of phosphopeptides are not complete, and the total number of phosphopeptides detected does not overlap completely with those detected by these methods. The gaps in existing enrichment methods need to be filled in order to have more complete phosphoproteomic analyses. In the current study, ionic liquids (IL), specifically imidazolium salts, have been used in an alternative enrichment technique with potential for selective extraction of phosphopeptides from solution. Imidazolium salts were chosen because their physicochemical properties are readily adjustable depending on the nature of the substituent attached to the imidazolium core and the counter-anion. Monoimidazolium and bis-imidazolium salts with linear chains having respectively 4, 12, and 16 carbon atoms and with different anions were synthesized and used to carry out liquid-liquid and solid-liquid extractions of a phosphorylated peptide from a solution. At first, liquid-liquid extractions were carried out using an ionic liquid (IL) with a linear chain of 4 carbon atoms. These extractions performed with bis (trifluoromethanesulfonyl) amide 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-NTf2) and hexafluorophosphate 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-PF6) did not show a considerable extraction of PPS comparatively to the PN. Secondly, solid-liquid extractions were done by first functionalizing solid-phase particles with the imidazolium salts. The extractions were carried out using the phosphopentapeptide Ac-pTyr-Ile-Gly-Glu-Phe-NH2 (PPS) and its acidic non-phosphorylated analogues. It has been shown that the C12 chain imidazolium salts were better to extract PPS than the other two peptides PN (Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) and PE (Ac-Glu-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2). The extraction efficiency of these peptides was estimated by capillary electrophoresis (CE) and high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS).