Academic literature on the topic 'Ciona intestinalis – Génétique'

Au cours de mon travail de thèse, j'ai établi une procédure pour ordonner des motifs courts selon leur distribution dans le génome de C. Intestinalis autour d'un ensemble de gènes : plus une combinaison de motifs est regroupée autour des gènes exprimés spécifiquement dans un tissu, plus le score est élevé. Dans cette approche, j'ai intégré les résultats de la dissection d'un enhancer exprimé dans le neurectoderme antérieur qui indiquait une structure dupliquée. Ma procédure montre que les sites GATTA dupliqués sont une caractéristique générale des éléments cis-régulateurs du neurectoderme antérieur. Une recherche dans le génome entier pour ces séquences suivi par un test in-vivo montre une expression dans ce territoire pour la moitié des éléments. Par la suite, j'ai essayé d'améliorer l'annotation des séquences cis-régulatrices déjà publiées, par une extraction automatique à partir de la littérature. Grâce à l'augmentation du nombre de publications en accès libre et l'amélioration des procédures expérimentales de plus en plus de ce type de données est disponible. Finalement, j'ai montré que malgré l'absence d'alignements non-codants entre les génomes des vertébrés et C. Intestinalis, on peut cependant trouver quelques loci avec une conservation extrême de l'arrangement des gènes. Pour ces cas, la recherche des éléments cis-régulateurs peut être limitée aux introns du gène voisin, ce qui était confirmé dans la littérature pour certains. Ces trois approches montrent l'utilité de la bioinformatique pour une meilleure caractérisation des séquences cis-régulatrices et ouvrent la voie aux validations expérimentales supplémentaires
In this thesis, a procedure is presented to rank combinations of short sequence motifs by their distribution around a set of genes. The better a combination matches around genes expressed in a certain tissue, the higher is its score. I applied this to an already characterized enhancer of C. Intestinalis expressed in the anterior neurectoderm which had been found by systematic mutations to be composed of a duplicated structure. The results of my procedure indicated that duplicated GA TTA-sites are an essential feature of cis-regulatory elements active in the anterior neurectoderm. Searching the genome for matches to this signature resulted in putative enhancers that drive a reporter gene in 50% of the cases in the anterior neurectoderm. In addition, I tried to improve the curation of already published cis-regulatory elements by extracting them automatically from the full text of the biological research articles. Thanks to the thriving open access publishing model and the improvement in experimental assays, more and more of this data is becoming available. Finally, I showed that in the absence of non-coding sequence alignments between the genomes of vertebrate and C. Intestinalis, one can nevertheless find a handful of loci with a very unusually conserved gene order. In these cases, the cis-regulatory search space is reduced to a set of introns, some of which were recently shown to harbor enhancers. Many of these loci have not been analyzed yet. Together, these computational approaches should lead to a better characterization of cis-regulatory sequences and pave the way for further experimental validations

Ascidians (urochodates: Ciona intestinalis and Phallusia mammillata ) are considered the closest invertebrate ancestors of vertebrates. They develop into simple tadpoles made of 2600 cells harboring a notochord and a dorsal nerve chord. At the turn of the 20th century, the ascidians model contributed much to the idea that oocytes contained localized determinants of development. This led to the concept of mosaic development. Today we know that some of these determinants are maternal RNAs localized in the egg cortex. Ascidian determinant RNAs are part of a large family of maternal RNAs called postplasmic/PEM RNAs. They include about 40 transcrips classified as Type I (localized before fertilization) and Type II (localized after fertilization). Type I postplasmic/PEM RNAs are relocalized after fertilization in a stereotyped fashion such that they concentrate in the posterior region of the zygote and form a compact cortical zone in the 2 posterior vegetal blastomeres at the 8 cell stage called the CAB (Centrosome Attracting Body). The large numbers of postplasmic/PEM RNAs identified, the synchronicity and abundance of embryos, and the ability to isolate cortical fragments retaining the RNAs make the ascidian model particularly attractive for studying localization and cortical anchorage of polarized RNAs. It is possible to operate a first classification of postplasmic/PEM RNAs based on their localization in cells in the tail of the tadpole. The determinant Macho1 and PEM1 segregate in 2 B8. 11 cells with somatic destinies while RNAs such as the germ plasm marker Vasa is in addition localized in 2 B. 12 cells precursors of the germ line. The 3’ UTR regions of postplasmic/PEM RNA are considered to contain part of the code for localization and anchorage. In Ascidians as in the amphibian Xenopus these regions are characterized by frequent xCACx repeats. Using this criteria to screen 3’UTRs of all Ciona intestinalis genes, we confirmed that frequent xCACx repeats constituted a predictive signature for postplasmic/PEM RNAs and found 2 new members (MnK et PSD). We have also identified subcellular anchorage sites of postplasmic/PEM RNAs using high resolution immuno-in situ localization techniques in oocytes and embryos as well as in cortical fragments isolated from them. The RNA determinants Macho1 and PEM1 are associated with a sub-domain of cortical Endoplasmic Reticulum (cER) while Vasa, PEM3, POPK RNAs are localized in granules (putative germ granules). This demonstrates that although at low resolution these RNAs appear co-localized in the cortex they have in fact different structures of anchorage. This allows to propose that postplasmic/PEM RNAs belong to 2 categories: a category (“Vasa-Type” ) associated with granules and segregating in both 8. 11 and 8. 12 cells and a category (“Macho1-Type”) associated to cER which segregates only into B8. 11 cells. We also investigated whether, as in nerve terminals, the translation machinery was also polarized in oocytes and embryos. Indeed we found that some factors (PAPB) and regulators (phosporylated forms of MnK, 4EBP et S6Kinase…) of translation initiation were co-localized with postplasmic/PEM RNAs associated with the cER (Macho1 and PEM1 RNAs). The fact that regulators such as MnK and S6Kinase change phosphorylation status after fertilization suggests that they control translation initiation of determinants RNAs in the cortex following egg activation
Les ascidies (urochordés, espèces Ciona intestinalis et Phallusia mammillata) sont les invertébrés marins les plus proches des vertébrés. Ces organismes se développent en un têtard simplifié (env. 2600 cellules) possédant une notochorde et un système nerveux dorsal. Le modèle ascidie a contribué au début du 20ème siècle à l’émergence de l’idée que l’ovocyte contenait des facteurs localisés déterminant le développement embryonnaire, l’ascidie étant ainsi l’archétype du développement de type mosaïque. Aujourd’hui, nous savons que certains de ces déterminants sont des ARNs maternels corticaux. Ces ARNs font partis d’une grande famille- les ARNs postplasmic/PEM - constituée d’une quarantaine de transcrits classés en Type I (localisés avant fécondation) et Type II (localisés après fécondation). Les ARNs postplasmic/PEM présentent un profil de localisation et de relocalisation corticale très stéréotypé les concentrant dans la région postérieure du zygote et de l’embryon (région du Centrosome Attracting Body : CAB). Le grand nombre d’ARNs corticaux polarisés, la possibilité d’obtenir des embryons synchrones en abondance, d’isoler des fragments corticaux contenant de nombreux ARNs postplasmic/PEM, font du modèle ascidie un modèle de choix pour l’étude de la localisation, de l’ancrage et de la traduction d’ARNs corticaux polarisés. Il était en particulier intéressant d’examiner rigoureusement la classification des ARNs postplasmic/PEM. La différence la plus notable entre ces ARNs corticaux qui se sont tous révélés être localisés avant fécondation (Type I) est leur redistribution dans la partie caudale du têtard. Certains (tel les déterminants Macho1 et PEM1) sont ségrégés uniquement dans 2 petites cellules (B8. 11) à destinée somatique, alors que d’autres (tels le marqueur du plasme germinal Vasa) sont également localisés dans 2 autres petites cellules à destinée germinale (B8. 12). La région 3’UTR est généralement considérée comme responsable de la localisation et de l’ancrage des ARNs corticaux. Les régions 3’UTR des ARNs postplasmic/PEM comme celles des ARNs localisés de l’amphibien Xenopus étaient connues pour partager de fréquentes répétitions de type xCACx. En recherchant dans l’ensemble des transcrits chez Ciona tous les gènes contenant de telles répétitions à haute fréquence, nous avons confirmé la surreprésentation des ARN postplasmic/PEM dans la catégorie xCACx-riche et avons identifié 2 nouveaux ARNs postplasmic/PEM (MnK et PSD). Nous avons également déterminé les structures d’ancrage corticales des ARNs grâce à des techniques de localisation à très haute résolution (immuno / in situ et microscopie confocale sur œufs et cortex isolés). Ainsi, les ARNs déterminants Macho1 et PEM1 à destinée somatique sont associés à un sous domaine de Réticulum Endoplasmique cortical (REc), alors que les ARNs Vasa, PEM3, POPK à destinée germinale sont associés à des structures granulaires (granules germinaux). Ceci démontre que bien qu’à basse résolution tous ces ARNs semblent partager la même localisation (une fine couche d’un micron sous la membrane plasmique), ils sont en fait associés à différentes structures d’ancrage. Cela nous permet de proposer une nouvelle classification en 2 catégories - le « Type Vasa » associé a des granules et aboutissant dans les cellules B8. 11 et B8. 12, – « le Type Macho1 » associé au REc dans les B8. 11 seulement. Nous avons enfin voulu savoir si, comme dans les terminaisons nerveuses, la machinerie de traduction était aussi polarisée au niveau du cortex des œufs et embryons d’ascidie. Nous montrons que plusieurs facteurs et régulateurs de la machinerie d’initiation de la traduction sont co-localisés avec les ARNs postplasmic/PEM (la PABP, formes phosphorylées de MnK, 4EBP et S6Kinase…) et que certains sont associés sur le REc comme les ARNs Macho1 et PEM1. Le fait que certains des régulateurs de la machinerie d’initiation de la traduction (MnK, S6Kinase…) changent leur statut de phosphorylation après fécondation ouvre de nouvelles perspectives pour comprendre les étapes qui mènent de l’activation de l’œuf à l’initiation de la synthèse localisée des ARNs déterminants

Implications des complexes Polycomb et Trithorax au cours du développement précoce chez Ciona intestinalisLes protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) ont été initialement découvertes chez Drosophila melanogaster. Ces deux groupes sont classiquement connus pour leurs rôles respectifs de répresseurs et d'activateurs épigénétiques qui contrôlent et maintiennent les états chromatiniens au cours du temps. Ces facteurs régulent de nombreux gènes cibles dont les gènes homéotiques. Au cours de ma thèse, j'ai étudié trois composants de ces deux groupes : Enhancer of zeste (E(z)), appartenant au complexe PRC2 du PcG et responsable du dépôt de la marque de répression génique H3K27me3, Polyhomeotic (Ph), appartenant au complexe PRC1 du PcG et dont le rôle exact reste à déterminer, et Trithorax (Trx), appartenant au complexe TAC1 du TrxG et responsable du dépôt de la marque d'activation génique H3K4me3. Jusqu'à présent, aucune étude n'a abordé la régulation épigénétique via les PcG et TrxG chez l'ascidie solitaire Ciona intestinalis. Cette espèce présente un cluster des gènes Hox désorganisé et ne possède pas la protéine Polycomb (Pc) du PRC1, responsable de la reconnaissance de la marque de répression H3K27me3 déposée par la protéine E(z).Nos travaux montrent que la protéine E(z) est fonctionnelle et conserve son activité méthyltransférase sur le résidu H3K27 chez Ciona intestinalis. Nous avons ensuite observé, par des expériences de knockdown par micro-injection de morpholinos, que les inhibitions protéiques d'E(z), Ph et Trx ont des conséquences dramatiques sur la différenciation et la mise en place des différents tissus au cours du développement larvaire, notamment sur la mise en place de la notochorde puisque celle-ci est totalement absente chez les morphants E(z) et Ph. Les défauts de phénotype du morphant E(z) sont corrélés à la perte du dépôt d'H3K27me3 et nous avons mis en évidence, lors de l'inhibition d'E(z), une dérépression des gènes tissu-spécifiques impliqués dans le développement embryonnaire précoce alors que les gènes tardivement exprimés sont réprimés. De plus, l'expression des gènes Hox n'est pas significativement modifiée au cours du développement embryonnaire lorsque la protéine E(z) est inhibée, à l'exception du gène Hox12 qui est déréprimé, comme attendu.L'ensemble de ces résultats permet d'émettre l'idée innovante selon laquelle les protéines des PcG et TrxG jouent un rôle déterminant dans la régulation de l'expression génique lors de l'embryogénèse de Ciona intestinalis tout en ayant une implication mineure dans la régulation de l'expression des gènes Hox à ce stade du développement
Implications of Polycomb and Trithorax complexes in the early development of Ciona intestinalisPolycomb and Trithorax group (PcG and TrxG) proteins were discovered originally in Drosophila melanogaster. Both groups are classically known for their roles in the maintenance of silenced and active chromatin states over time, respectively. These factors regulate many target genes including the homeotic genes. During my PhD, I studied three components of these two groups: Enhancer of zest (E(z)), belonging to the PRC2 complex of PcG and responsible for H3K27me3 mark deposit for gene repression, Polyhomeotic (Ph), belonging to the PRC1 complex of PcG whose role remains to be determined, and Trithorax (Trx), belonging to the TAC1 complex of TrxG and responsible for H3K4me3 mark deposit for gene activation. Until now, no study addresses the epigenetic regulation mediated by PcG and TrxG in the solitary ascidian Ciona intestinalis. This specie has a disorganized Hox cluster and in which the Polycomb (Pc) protein of PRC1, responsible for the recognition of the repressive H3K27me3 mark, is absent.Our work shows that the E(z) protein is functional and retains its methyltransferase activity on H3K27 residue in Ciona intestinalis. Then, we demonstrated, by knockdown experiments with morpholino microinjection, that the inhibition of E(z), Ph and Trx has dramatic consequences on differentiation and on the establishment of different tissues during larval development, particularly on the notochord establishment since it is totally absent in E(z) and Ph morphants. E(z) morphant phenotypic defects are correlated with lack of H3K27me3 mark deposit and we highlighted that, during the E(z) inhibition, tissue-specific genes implied in early development are de-repressed while late-expressed genes are down-regulated. In addition among Hox genes, only Hox12 expression is significantly modified and found to be de-repressed in E(z) morphant context, as expected.Altogether, our results present the innovative idea that the PcG and TrxG proteins play a major role in the gene expression regulation during embryogenesis of Ciona intestinalis while having a minor involvement in the regulation of Hox genes expression at this stage of development

La biologie comparée du développement a mis en évidence la conservation de l'expression de certains gènes même entre des groupes évolutivement éloignés. Les séquences régulant des expressions similaire sont souvent, elles, trop divergentes pour être comparées facilement. Mon travail a été réalisé principalement chez l'ascidie Ciona intestinalis, un chordé invertébré qui occupe la position de groupe frère des vertébrés. L'analyse de la région cis-régulatrice du gène pitx, exprimé à la frontière antérieure neurale a permis de mettre en évidence un élément régulateur D1. Son analyse a montré qu'il contenait des sites de liaison pour des facteurs de transcription, conservés évolutivement, essentiels à son activité et présents en deux exemplaires. Un de ces sites lie l'homéoprotéine OTX qui joue un rôle majeur dans la formation du système nerveux central (SNC) antérieur. Une analyse bioinformatique basée sur la recherche de sites conservés et dupliqués dans le génome a permis de montrer que le motifliant OTX (GATTA) était surreprésenté dans les éléments conservés flanquant les gènes du système nerveux antérieur. Ces éléments ont été testés par transgénèse pour confirmer que la grammaire de sites GATTA dupliqués permettait de prédire des séquences régulatrices actives dans le SNC antérieur. Nous avons montré que les éléments non-codants conservés contenant la grammaire 2xGATTA présents autour des gènes pitx chez le médaka, un poisson téléostéen, conduisaient l'expression dans les régions antérieures du SNC. Cette logique cis-régulatrice est donc conservée à longue distance évolutive, entre des gènes à l'expression conservés dont les séquences régulatrices sont très différentes
Comparative Developmental Biology has shown that gene expression is conserved among evolutionary distant species. However cis-regulatory regions that drive the expression of those genes are often not conserved. My work was done on an ascidian, Ciona intestinalis, an invertebrate marine animal closely related to vertebrates. An analysis of the promoter region of pitx, a gene expressed at the anterior neural boundary, reveals the presence of a regulatory element named D1. We show that D1 likely contains binding sites for transcription factors that are evolutionarily conserved and essential for its activity. Furthermore we show that these motifs need to be duplicated to be functional. One of these motifs is a binding site for Otx, a transcription factor involved in the formation of the anterior central nervous system (CNS). A bioinformatics analysis was performed on the genome sequence of C. Intestinalis and showed that the OTX binding motifs (GATTA) are overrepresented in conserved elements flanking genes that are specificaIly expressed in the anterior CNS. A number of such conserved elements were tested through transient transgenesis and confirm that the duplicated GATTA sites grammar was sufficient to identify regulatory elements active in the anterior CNS. We also show that conserved non-coding elements containing the 2xGATTA grammar are found around pitx genes in the teleost fish Orizias latipes and drive the expression in anterior regions of the CNS. The cis-regulatory logic, predictive in ascidians for anterior CNS enhancers can also be found in some vertebrates genes