Academic literature on the topic 'Coagulación sanguínea'

La coagulación intravascular diseminada es un estado alterado de la coagulación secundario a cuadros inflamatorios locales o sistémicos. Se caracteriza por un aumento de la coagulación y una inadecuada fibrinólisis endógena que da como resultado la formación de fibrina intravascular, trombosis microvascular multiorgánica y un excesivo consumo de los factores de coagulación sanguínea, esto desencadena sangrados severos y trombosis, los cuales conducen a falla orgánica y circulatoria como principal manifestación clínica. Este artículo tiene como objetivo realizar una revisión del estado del arte describiendo su definición, etiología, fisiopatología, manifestaciones clínicas y actualidades en su diagnóstico y tratamiento. Para esto, se realizó una búsqueda bibliográfica en PubMed utilizando el término MeSH “Disseminated Intravascular Coagulation”, seleccionándose 63 artículos por la relevancia y pertinencia de su información al objetivo de la investigación. De esta manera, se espera brindar al clínico las herramientas necesarias para responder adecuadamente frente a esta patología. MÉD.UIS.2020;33(2):75-84

<p>Los venenos de serpientes inducen gran variedad de efectos sobre la coagulación sanguínea debido a sus componentes coagulantes y anticoagulantes. En este trabajo se estudió el efecto del veneno de Bothrops diporus de Argentina sobre el sistema hemostático en diferentes especies de mamíferos, determinándose las actividades coagulante, fibrinolítica y letal. Se pudo comprobar que el veneno de esta serpiente genera desórdenes de la coagulación sanguínea atribuibles a enzimas de tipo trombinas que inducen la transformación del fibrinógeno a fibrina, registrándose mayor susceptibilidad en las especies ovina y humana. La dosis coagulante mínima se comparó con venenos de víboras centroamericanas, surgiendo que las serpientes de zonas más cálidas poseen menor actividad coagulante.</p>

La hemorragia posparto corresponde a uno de los principales problemas de salud pública al ser una de las principales causas de mortalidad y morbilidad obstétrica a nivel mundial. Se define como la pérdida de volumen sanguíneo mayor a 500 mL para parto vaginal y mayor a 1000 mL en parto por cesárea. Las causas incluyen anomalías del tono uterino, trauma intraparto, retención de restos del producto de concepción, o bien, alteraciones en la coagulación sanguínea materna. Tras el diagnóstico, el manejo oportuno consiste en la utilización de medidas generales de soporte vital aunado a medidas de contención del sangrado con el fin de disminuir eventos adversos derivados de dicha patología.

El síndrome de Ectasia Vascular Antral Gástrica, también conocido como Estómago en Sandía es una causa significativa de pérdida sanguínea gastrointestinal ya sea aguda o crónica, así como la presentación con dolor abdominal epigástrico; y está caracterizada endoscópicamente por presencia “rayas de sandía” en la mucosa gástrica. Se reporta el caso de una paciente que presento esta entidad, acompañada de gastritis crónica y de infección con H. pylori positiva en la biopsia. Se procedió a realizar tratamiento para H. pylori , debido a la persistencia de síntomas, y al riesgo de sangrado que presenta, se decide realizar tratamiento endoscópico mediante coagulación con argón plasma, siendo este exitoso. Se describen además las diferentes formas de tratamientos existentes.

Tradicionalmente las hojas de Oenothera rosea “chupasangre” son usadas para reducir los hematomas, por lo que, esta investigación estuvo dirigida a la evaluación de los componentes capaces de retardar la coagulación sanguínea. Del extracto etanólico de O. rosea se separó por cromatografía de capa fina en celulosa, usando etanol: agua (1:5), dos fracciones F-2 y F-5, que luego fueron preincubadas por 10 minutos con trombina y el veneno de la serpiente Lachesis muta, rico en Enzima Semejante a Trombina (EST) y luego se midió la actividad coagulante sobre plasma humano citratado y fibrinógeno bovino (Fb), así como el sustrato cromogénico BApNA. Los resultados mostraron que F-2 alargó el tiempo de coagulación sobre Fb en 58,58 % y el F-5 en 67,78 %, mientras que usando veneno los retardos fueron para F-2 10,67 % y F-5 36,27 %. Usando plasma, los valores fueron para F-2 34,14 % y F-5 70,59 %. Asimismo, empleando trombina la actividad amidolítica se redujo en F-2 48,48 % y F-5 67,32 %, mientras que con la EST de L. muta la inhibición de F-2 50,20 % y F-5 69,10%. Mediante estos ensayos in vitro se concluye que F-2 y F-5 podrían ser flavonoides anticoagulantes, con probable acción antitrombolítica.

OBJETIVO: describir el estado de hipercoagulabilidad y complicaciones tromboembólicas que se presentan en el paciente con infección por SARS-CoV-2. MÉTODO: se recopiló información de Pubmed, Asociación Americana del Corazón, Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia, libros y revistas médicas mundiales donde se encontraron metaanálisis, artículos y guías sobre el estado de hipercoagulabilidad y complicaciones tromboembólicas que han sido documentadas en el paciente con infección por SARS-CoV-2. RESULTADOS: la coagulopatía asociada a COVID-19 es consecuencia de la tormenta de citocinas desencadenada por la respuesta inmune ante el SARS-CoV-2, la cual provoca lesión endotelial e hiperactivación de la cascada de la coagulación que culmina con generación de fibrina a nivel vascular, favoreciendo así, la estasis sanguínea. CONCLUSIÓN: las principales complicaciones tromboembólicas en el paciente con SARS-CoV-2 han sido la trombosis venosa profunda, tromboembolia pulmonar, síndrome coronario agudo, evento cerebrovascular isquémico agudo, coagulopatía intravascular diseminada, trombosis aórtica abdominal y torácica, siendo el 80% tromboembolia pulmonar y 31% trombosis venosa profunda las más frecuentes y aumentando la mortalidad global hasta en 7% debido al estado hipercoagulable.

Objetivo: Determinar preliminarmente 10 plantas medicinales del Valle del Mantaro mediante el método cualitativo (fitoquímico) para uso farmacéutico. Material y Métodos: Cualitativo (fitoquímico) para uso farmacéutico. Resultados: La actividad farmacognósicas de las plantas medicinales son utilizadas en el Valle del Mantaro: Xanthium spinosum (Juan alonso) como antitumoral y anticancerígena, Equisetum arvense (Cola de caballo) como osteoporosis, coagulación sanguínea Mentha sativa L (Hierba buena) para el nerviosismo, Rumex crispus L. (Cuturrumasa) como antiinflamatorio, Piper aduncum (Matico) como antiviral, Centauriun erythraea Rafn. (Canchalagua) como antitumorales, antidiabéticas, Schinus molle (Molle) como antirreumático, Psoralea glandulosaxonomía (Culen) como hipoglucemiente, Minthostachys mollis (Inca muña) como antireumático y acción carminativa, Taraxacum officinale (Diente de león) como hipoglucemiante. Conclusiones: De acuerdo al análisis fitoquímico de las plantas, confirman la actividad farmacológica para el uso medicinal: Xanthium spinosum (Juan Alonso), Equisetum arvense (Cola de caballo), Mentha sativa L. (Hierba buena), Rumex crispus L. (Cuturrumasa), Piper aduncum (Matico), Centauriun erythraea Rafn (Canchalagua), Schinus molle (Molle), Psoralea glandulosaxonomía (Culen), Minthostachys mollis (Inca Muña) y Taraxacum officinale (Diente de León). El uso de las plantas medicinales en el Valle del Mantaro por sus metabolitos secundarios pueden asociarse a prometedoras actividades medicinales como: antitumorales, anticancerígenos, osteoporosis, antiviral, antidiabéticas, antirreumático; siendo candidatos para estudios con mayor profundidad fitoquímica y farmacobiólogica.

El autor analiza el criterio con que se ha encarado en su Clínica el síndrome de fibrinogenopenia aguda consecutiva al cuadro de "abruptio placentae". Considera que atendidas las causas que originan el descenso de los niveles del fibrinógeno, se justifica hoy más que antes proceder a la rotura artificial precoz de las membranas (parto médico de Kreis), a fin de desencadenar el trabajo y a la vez interferir en la liberación de sustancias tromboplásticas o fibrinolíticas, observando simultáneamente y muy de cerca las variaciones que se operan en la prueba del coágulo y curva de fibrinogenemia. Cuando el tratamiento obstétrico no surte resultados o el síndrome de incoagulabilidad sanguínea se perfila desde, un comienzo con caracteres severos, estimo que debe recurrirse sin demora a la evacuación del útero mediante la operación cesárea. El tratamiento específico de la hipo y afibrinogenemia debería contemplar la administración oportuna - usando la vía endovenosa - de fibrinógeno humano. Conforme a la experiencia del Servicio, las dosis no necesitan ser tan altas como las que han sido preconizadas por los autores norteamericanos. Bastan en general 2 o 3 gramos para alcanzar los niveles críticos (100 mgrs. 0/100) y asegurar la coagulación. Además se utilizarán con generosidad transfusiones de sangre y plasma, particularmente cuando no se disponga de droga, como ha sucedido en algunos de los casos que el autor comenta. En atención al alto costo de tratamiento, recomienda administrar la droga en los casos de operación cesárea sólo una vez que ha sido evacuado el útero, momento propicio para obtener los mejores resultados, suprimidos ya las causas aparentes que originan el cuadro de incoagulabilidad sanguínea. Se infiere de lo anterior que la histerectomía representa una alternativa poco común (1 caso en esta serie); cuando se la practica, su indicación dimana más bien de la insuficiencia contráctil de la fibra muscular uterina. El autor recalca que los resultados obtenidos en el curso de los últimos 5 años en las 11 pacientes que presentaron el síndrome de fibrinogenopenia aguda y "abruptio placentae” - habiéndose resuelto en 8 el problema mediante lo operación cesárea - sobre un total de 138 casos, lo que representa una frecuencia de 7.97%, han sido buenos, si se piensa que la mortalidad especial que se registró fue de 9.09%, siendo que la mortalidad en el conjunto de las hemorragias retroplacentarias (1381 alcanzó en el mismo período a 3.17%. La mortinatalidad fetal fue muy alta, llegando a 90.9%, mientras que en la casuística global la tasa que se consignó fue tan sólo de 63.4 %.

La coagulación es el resultado de una interacción coordinada de las proteínas sanguíneas, las células circulantes, células de la vasculatura y las proteínas de la matriz extracelular en la pared de los vasos. Este complejo mecanismo hace difícil su evaluación en el laboratorio, que sólo se limita a medir las proteínas de la coagulación circulantes y células circulantes, mientras que los elementos vasculares no son medibles.

El propósito de este estudio fue detectar la falla de la transferencia pasiva (FTP) en potrillos de un hospital veterinario del Perú, usando las pruebas de coagulación por glutaraldehído y la medición de la concentración de las proteínas séricas totales por refractometría, y evaluar la concordancia entre ambas pruebas. Treinta y un potrillos con 24 horas de vida fueron seleccionados para este estudio. De cada potrillo se extrajo 3 ml de sangre por venopunción yugular, de donde se obtuvo 1 a 1,5 ml de suero. Para la prueba de coagulación por glutaraldehído se utilizó 0,5 ml de suero sanguíneo y una gota de glutaraldehído al 10%, y para la prueba de refractometría fueron necesarias 2 gotas del suero sanguíneo. De los 31 potrillos evaluados, 8 (25,81%) y 9 (29,03%) potrillos fueron detectados con la FTP mediante las pruebas de coagulación por glutaraldehído y refractometría, respectivamente. Por lo tanto, el índice kappa fue de 0.93. Ambas pruebas pueden ser usadas para el diagnóstico de FTP dada su sencillez, bajo costo y resultados inmediatos.

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS El uso de injertos provenientes de donantes en asistolia (DA) como estrategia para reducir la mortalidad en lista de espera presenta como menoscabo una mayor incidencia de estenosis biliares no anastomóticas. Esto se debe a la mayor susceptibilidad del epitelio biliar a la isquemia caliente que se da durante la fase de asistolia. La activación del endotelio del plexo peribiliar y la consecuente formación de microtrombos exacerbaría la hipoxia colangiocelular. Ante dicha hipótesis, el uso de fibrinolíticos se postuló como una prometedora estrategia para mejorar la viabilidad de los órganos, al lisar los trombos y permitir el paso de sangre. Sin embargo, estudios realizados en pacientes que han sufrido una parada cardiorespiratoria recuperada muestran un estado de hiperfibrinolisis mediante tromboelastometría. Para valorar la efectividad del tratamiento con fibrinolíticos en los DA no controlados, por un lado analizamos el patrón de coagulación de éstos a su llegada a nuestro hospital; y paralelamente, mediante un estudio experimental, analizamos la efectividad del uso de fibrinolíticos sobre los injertos hepáticos. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS En el estudio clínico se describen las alteraciones en la coagulación de los DA tipo 2 de la clasificación de Maastricht. De los 33 potenciales donantes llegados al hospital durante 18 meses, se trasplantaron 22 riñones y 5 hígados. El análisis tromboelastométrico muestra un patrón de hipocoagulabilidad e hiperfibrinolisis en todos ellos. Se vio una correlación inversa entre el grado de lisis a los 30 minutos y el pico de transaminasas. En el estudio experimental porcino, se reproduce la situación clínica del DA. Se analizó el efecto de la heparina pre-PCR, de 60 minutos de duración; o fibrinolítico (tPA) tras PCR y durante la perfusión regional abdominal normotérmica (PRAN), que se mantuvo 60 minutos. El injerto hepático se implantó en un receptor, seguido durante 5 días. Se observó una mejoría en los flujos durante la PRAN en aquellos animales que recibieron heparina pre-parada frente a aquellos animales que no la recibieron. Así mismo, la supervivencia fue superior en este grupo, con un menor pico de transaminasas y mayor recuperación de la función hepática medida por el tiempo de protrombina. No se observaron diferencias en el grupo en el que se administró tPA en comparación con el grupo control. En cuanto al análisis histológico, en ninguno de los grupos se observaron depósitos de fibrina significativos. La lesión por isquemia-reperfusión y la expresión de los marcadores de activación endotelial e inflamación fue menor en aquellos animales pre-tratados con heparina. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES En el estudio clínico, el patrón de hiperfibrinolisis en todos los potenciales DA es similar a los resultados de los estudios en pacientes que sufrieron PCR recuperadas. Dicha hiperfibrinolisis podría atribuirse a un mecanismo de protección mediado por la vía de la proteína C. En el estudio experimental, el hecho de que no hubiera diferencias en cuanto a la calidad del injerto hepático y la viabilidad del mismo en aquellos animales que habían recibido tPA en comparación con los controles; así como la ausencia de depósitos significativos de fibrina tras 60 minutos de parada cardíaca, no justifica la administración de fibrinolítico. Por otro lado, la heparina administrada pre-PCR la viabilidad del injerto. En conclusión, el patrón de hiperfibrinolisis en los DA tipo 2 de la clasificación de Maastricht, la ausencia de depósitos de fibrina en el tejido hepático después de la PRC en el modelo animal, y el hecho de que el tratamiento con un agente fibrinolítico fuera inefectivo para mejorar la viabilidad del injerto hepático, ponen en entredicho la utilidad de este tratamiento. Por otro lado, la administración de heparina pre-PCR ha demostrado su utilidad para mejorar tanto la calidad del injerto durante la PRAN como su viabilidad postoperatoria.
INTRODUCTION AND GOAL The use of organs obtained from donation after cardiocirculatory death (DCD) is limited by the appearance of ischemic-type biliary strictures. These are due to a greater susceptibility of the biliary epithelium to warm ischemia. Some studies suggest the use of fibrinolytics to dissolve microthrombi formed during this period to improve graft function; however, other studies describe a hiperfibrinolytic thromboelastometry pattern in patients who suffer cardiac arrest (CA). To evaluate the adequacy of fibrinolytic treatment in the Maastricht type II donor, we performed a clinical and an experimental study. MATERIAL AND METHODS In the clinical study, lab analysis and viscoelastic assays were performed in all potential DCD type II donors arriving at our hospital during an 18-month period. In the experimental study performed in a previously validated porcine model, we analyzed the usefulness of fibrinolysis in liver outcomes by either administering tPA after a 60 minute CA and during normothermic abdominal perfusion, or the use of heparin prior to CA. RESULTS 33 potential donors arrived in our hospital during the period of study, from which 22 kidneys and 5 livers were transplanted. Viscoelastic assays in all cases found a pattern of hyperfibrinolysis. There was an inverse correlation between clot stability as measured by Ly30 and transaminase levels. In the experimental study, there were no differences in pump flows, liver graft function or histologic parameters in those animals treated with tPA as compared to the control group. Moreover, fibrin deposition was not detected in any group after one hour of cardiac arrest. On the other hand, the use of pre-arrest heparin did improve pump flow and liver graft quality. CONCLUSIONS Both results in the clinical and experimental studies indicate no additional role for fibrinolytic therapy in the Maastricht type II setting. Heparin does offer anti-inflammatory and other cytoprotective effects that help improve DCD liver graft quality.

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Como el hígado es el sitio donde se sintetizan la mayoría de las proteínas de la cascada de la coagulación, una hemostasis anormal puede ser consecuencia de una insuficiencia hepática, convirtiéndose así, los factores de coagulación en una buena herramienta para la evaluación de funcionalidad hepática en equinos. El propósito de este estudio fue determinar valores de referencia para Fibrinógeno (Fb), Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado (TTPA) y Tiempo de Protrombina (TP) en caballos Fina Sangre de Carrera (FSC), y establecer si factores como sexo y edad influyen en la cuantificación de dichas pruebas. Para ello se seleccionaron equinos clínicamente sanos (n=80) de 1 a 5 años de edad provenientes de haras e hipódromos de la Región Metropolitana, sometidos a normas de manejo, alimentación y entrenamiento habituales para la especie. Las pruebas de coagulación se realizaron en un coagulómetro semiautomático, para Fb se utilizó método de Clauss, para TTPA el método de tiempo de cefalina más activador y para TP el método de Quick. Se determinó la distribución de los datos y se calculó los valores de referencia con un intervalo de confianza de 95%. Para Fb se encontraron diferencias significativas entre edades, por esta razón se determinó realizar valores de referencia para equinos de 1 a 2 años y otro intervalo para equinos mayores de 3 años. Para TTPA y TP se determinó valores de referencia para la muestra completa. Los valores de referencia obtenidos de este estudio proveen valiosa información para la evaluación de parámetros de coagulación, evaluación de funcionalidad hepática y para comparaciones interlaboratorios.

La depressió s’associa a múltiples alteracions biològiques. En aquesta tesi s’analitza les alteracions que es presenten en els pacients depressius respecte als subjectes controls i els canvis que s’observen durant el tractament amb un inhibidor de la recaptació de la serotonina (ISRS). S’ha proposat que els pacients amb depressió presentarien uns nivells de neurotrofines perifèriques inferiors als subjectes sans el que indicaria una disminució de la neuroplasticitat cerebral que es corregiria amb el tractament antidepressiu. Una altra alteració observada en els pacients depressius és la major activació plaquetària i les alteracions en els paràmetres hemostàtics. Aquestes alteracions podrien explicar la predisposició als esdeveniments cardiovasculars en pacients depressius. Els estudis avaluen els nivells de BDNF en plasma i en plaquetes en pacients amb depressió sense tractament respecte al controls sans i valorar els canvis observat en els nivells de BDNF en les diferents fases (8 i 24 setmanes) del tractament amb escitalopram. També es avaluar la funcions adhesives, cohesives i procoagulants plaquetàries en els pacients amb trastorn depressiu major i en les diferents fases del tractament amb ISRSs i comparat amb subjectes sans. Els resultats dels estudis presentats a la tesi mostren que els pacients amb depressió major abans del tractament presenten nivells de BDNF en plaquetes inferiors i nivells en plasma pobre en plaquetes superiors als controls sans. El tractament amb un ISRS (escitalopram) modifica els nivells de BDNF tendint als paràmetres similars als controls, però a les 8 setmanes de tractament solament s’observa un increment significatiu del BDNF plaquetari, aconseguint-se nivells similars als controls, pel que s’ha suposat que el BDNF plaquetari podria ser un marcador de resposta al tractament en fases inicials. A les 24 setmanes de tractament els nivells de BDNF plaquetari i plasmàtic no mostren diferències respecte als controls. També es va observar una correlació negativa entre les nivells de BDNF plaquetari i plasmàtic. Respecte als paràmetres de l’hemostàsia s’observa que els pacients depressius sense tractament presenten un endofenotip protrombòtic amb un increment significatiu del volum de les plaquetes, un increment dels paràmetres d’activació plaquetària, un increment de la fermesa del coàgul, un increment de l’activitat del factor tissular associat a plaquetes, un increment de la formació fibrina i trombina quan s’exposa a una superfície trombogènica en condicions de flux i un increment de l’agregació de les plaquetes en resposta a àcid araquidònic. El tractament amb ISRS normalitza de forma ràpida i eficaç aquests paràmetres, excepte que s’observa un increment de GPIIbIIIa i no es modifiquen les propietats viscoelàstiques dels trombes formats en condicions de cisalla reduïda. Els resultats observats sobre la coagulació amb el tractament amb ISRS podria explicar el major risc de sagnat en els pacients que reben tractament amb aquest grup d’antidepressius. En la discussió es valoren els resultats respecte a estudis previs, alhora que s’analitza la utilitat actual del BDNF com a marcador biològic de depressió a nivell perifèric, la relació entre el BDNF plaquetari i l’activació plaquetària i la possible relació entre BDNF i malaltia cardiovascular. També s’analitza la relació entre depressió i malaltia cardiovascular i els canvis observats amb el tractament amb ISRSs.
Depression is associated with multiple biological alterations. It has been proposed that patients with depression show lower levels of peripheral neurotrophin than healthy subjects, indicating a decrease in brain neuroplasticity and these levels are corrected with antidepressant treatment. Another alteration observed in depressive patients is increased platelet activation and alterations in the hemostatic parameters. These alterations could explain the predisposition to cardiovascular events in depressive patients. These studies evaluate the levels of BDNF in plasma and platelets in patients with untreated depression compared to healthy controls and assess the changes observed in the levels of BDNF in the different stages of treatment with escitalopram (8 to 24 weeks). Also evaluate adhesive, cohesive and procoagulant platelet functions in patients with major depressive disorder and at different stages of treatment with SSRIs and compared with healthy subjects. The study results show that patients with depression before treatment have lower levels of BDNF in platelets and higher plasma levels compared to healthy controls. Treatment with SSRIs (escitalopram) modifies BDNF levels tending to parameters similar to controls, but at 8 weeks of treatment, platelet BDNF achieving levels similar to controls. So, platelet BDNF could be a marker of response to treatment in early stages. At 24 weeks of treatment the levels of platelet and plasma BDNF showed no differences from controls. Also it has been observed a negative correlation between the levels of platelet and plasma BDNF. Regarding the parameters of hemostasis is observed that untreated depressed patients exhibit a prothrombotic endophenotypes with a significant increase platelet volume, platelet activation parameters, clot firmness, tissue factor activity associated with platelets, an increase in thrombin and fibrin formation when exposed to a thrombogenic surface under flow conditions and increased platelet aggregation in response to arachidonic acid. SSRI treatment normalizes quickly and effectively these parameters, but persist an increase in GPIIbIIIa and alterations in thromboelastometric parameters. The results observed on coagulation treatment with SSRIs could explain the increased risk of bleeding in these patients. In discussing, the results are compared with previous studies. The usefulness of current BDNF in peripheral levels as a biological marker of depression, the relationship between platelet activation and BDNF and the possible relationship between BDNF and cardiovascular disease are discussed. We also analyze the relationship between depression and cardiovascular disease and the changes observed with SSRI treatment.

A pesar de las investigaciones y los importantes avances clínicos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En este sentido, el incompleto conocimiento estructural y funcional de los procesos que en última instancia conducen a la formación del coágulo sanguíneo limita el desarrollo de nuevos antitrombóticos. La proteasa serínica trombina-α cumple un rol clave en el proceso de coagulación sanguínea debido a que activa diversas moléculas que son críticas para la formación del coágulo, entre estas se encuentran el fibrinógeno, el factor XIII, los receptores activados por proteasa en la superficie de las plaquetas (PAR1) y los factores V y VIII. Por estas razones, es imperativo comprender el dinamismo molecular de la trombina y sus interacciones con sustratos fisiológicos. En este sentido, en esta tesis se evaluó el efecto de diferentes ligandos sobre la estabilización de esta proteasa mediante calorimetría, fluorimetría y proteólisis limitada. Nuestros resultados demostraron que los ligandos FPR y el péptido C-terminal de la hirudina actúan sinérgicamente incrementando la termoestabilidad de la trombina. Además, determinamos que la resistencia a proteólisis en el exositio I de la proteasa se ve incrementada en presencia de benzamidina y FPR. Adicionalmente, en este trabajo de tesis doctoral, se analizaron dos de los sustratos más importantes de la trombina, el receptor PAR1 y el factor VIII. En este caso, nuestro objetivo principal fue caracterizar los mecanismos de las interacciones de estas proteínas con su proteasa activadora, la trombina. Para lograr este objetivo el ectodominio del receptor PAR1 y tres fragmentos de FVIII (FVIIIa1 a FVIIIa3; interconectores ácidos que preceden a los sitios de corte de activación) se clonaron, sobreexpresaron, purificaron para realizar ensayos de RMN y de cristalografía de rayos X. En este trabajo se cristalizó y resolvió la estructura 3D del complejo trombina•PAR1(R41S) (refinado a 3.0 Å), lo que nos permitió identificar que los residuos Lys51-Glu57 de PAR1 desempeñan una función esencial en las interacciones con el exositio I de la trombina. Finalmente, mediante ensayos de triple resonancia utilizando el fragmento recombinante FVIIIa1, marcado uniformemente con 13C y 15N, en presencia o ausencia de trombina permitió asignar las resonancias al esqueleto de carbonos α y β del interconector ácido a1. El análisis de las interacciones intermoleculares del FVIIIa1 con su proteasa activadora demostró que un subgrupo de residuos de este interconector son críticos para el reconocimiento del exositio I de la trombina. Estos resultados son un importante paso hacia la comprensión del mecanismo de activación del PAR1 y del FVIII catalizado por trombina.
Decade-long investigations have been result in important clinical advances for cardiovascular diseases; however these pathologies are still the main worldwide cause of morbidity and mortality. To develop novel and better antithrombotics is necessary refine the structural and functional knowledge of the thrombotic process. The serine proteinase alpha-thrombin plays a key role in the blood coagulation process by activating several molecules that are critical for clot formation, most notably fibrinogen, FXIII, protease-activated receptors on the platelet surface (PAR1) and two upstream coagulation factors, FV and FVIII. To understand the molecular dynamisms of thrombin and its interactions with physiological substrates, this thesis work evaluated the effect of ligands on thrombin-stability molecule using calorimetry, fluorimetry and limited proteolysis. Our results demonstrated that the ligands FPR and the C-terminal hirudin peptide, acts synergistically to increase the thermostability of thrombin. Moreover, we showed that the resistance to limited proteolysis of thrombin-exosite I is enhanced by the ligands benzamidine and FPR. On the other hand, the present work characterized the interactions mechanisms between thrombin and two of its most important substrates, PAR1 receptor and factor VIII. To achieve these aims, the ectodomain of PAR1 receptor and three FVIII fragments (FVIIIa1 to FVIIIa3; acidic polypeptides preceding the activation cleavage sites), were cloned, overexpressed, purified, and used for NMR and X-ray crystallization assays. In this thesis work has been crystallized and solved (3.0 Å) the 3D structure of the complex thrombin•PAR1(R41S), which allowed us to identify the residues Lys51-Glu57 of PAR1 as critical in the recognition of thrombin’s exosite I. Furthermore, standard triple-resonance experiments using the uniformly 13C, 15N-labeled recombinant peptide in presence or absence of thrombin showed FVIIIa1 backbone resonances variations corresponding to the intermolecular interactions with the activated thrombin. These variations allowed us to determinate a subset of FVIIIa1 residues that are critical for thrombin recognition. Altogether, our results represent an important advance towards understanding the mechanism of thrombin-catalyzed PAR1 and FVIII activation.

The present thesis has established a new and state of the art mammalian protein expression system at the laboratory which has then contributed with high-yield expression for the purification and crystallization of three glycoproteins, namely TGFβ2, ADAMTS13 and Neprosin, which adopt important biomedical roles in human physiology, cardiovascular disorders, and celiac disease treatment, respectively. Proteases are major players in the physiology and pathology of all living organisms. Their often highly sophisticated regulation mechanisms are therefore essential for proper function, and to prevent misdirected spatial and/or temporal proteolytic activity, which in turn may trigger disease. This regulation is achieved through a wide variety of mechanisms including protein-protein interaction, substrate allosteric activation, or their biosynthesis as inactive precursor, so called zymogens. In the present thesis a variety of regulatory mechanisms of proteases and inhibitors were studied by using a combination of biochemical, biophysical and structural techniques. In the first project we comprehensively illuminate the biochemistry of the VWF:ADAMTS-13 axis. ADAMTS13 regulates the multimeric form of Von Willebrand Factor (VWF) in blood circulation by specific, shear-dependent proteolysis. Despite circulating in a seemingly latent form with a very long active plasma half-life, ADAMTS13 is resistant to plasma inhibitors and VWF is the only known substrate, and which involves an allosteric activation of ADAMTS13 by substrate binding. This unprecedented specificity has been attributed to extensive exosite interactions between the AD13-MDTCS domains, where the Disintegrin-like domain (D) approaches to Metalloprotease (M), Cysteine-rich (C), and Spacer (S) domain once the VWF is bound achieving a “tight” conformation. Structural analysis in solution revealed that the enzyme adopts a highly flexible unbound, latent structures and VWF peptide-bound, active structures that significantly differes from the AD13-MDTCS crystal structure. We integrate the experimental results with computational approaches. Thus, we hypothesize that the interaction culminates in a ‘fuzzy complex’ that follows a ‘dynamic zipper’ mechanism involving numerous reversible, weak but additive interactions that result in strong binding and ultimately in cleavage. In the second project a novel family of glutamate peptidases was studied and the crystal structure determined of both the active and zymogen form, establishing the active site, catalytic mechanism and protease class annotation, and describing a unique catalytic dyad composed by two glutamates while showing a close structural homology with eqolisins. Neprosin was recently discovered in the fluid of the carnivorous pitcher plant Nepenthes ventrata. Given its high activity at low pH, thermic stability and great specificity, neprosin is especially useful in detoxifying gluten proteins including wheat gliadin and the 33-mer immunogenic fragment into non-toxic peptides in a human stomach environment. Additionally, we determined its inhibitory profile against a cohort of peptidase inhibitors. Future approaches will study the effect of neprosin processing of the 33-mer on inflammatory responses in cells and tissue explants to elucidate if neprosin indeed presents an effective and harmless supplementation approach for gluten intolerant patients. In the third project the main protease inhibitor of the blood plasma has been studied; human α2 Macroglobulin (hα2Ms) has a great role on the human physiology by modulating the activity of cytokines such as TGFβ2. We characterised the interaction by a variety of biochemical, biophysical, and binding techniques. Intriguingly, during our crystallographic studies of the complex, we obtained a crystal structure of a TGFβ2 dimer in a novel dimeric assembly of biological unknown function. Overall, the present thesis contributes substantially to the field of structural biochemistry, expanding previous knowledge at the molecular level and adding new regulatory mechanisms, which will hopefully pave the way for the design of specific drugs for therapeutic interventions as well as lead to new approaches for treating coeliac disease through an enzyme supplementation strategy.

En esta tesis, se estudiaron tres aspectos relacionados con el campo de la hemostasia y se presentan en tres capítulos independientes con un nexo común; el papel de los miRNA como nuevos reguladores del sistema hemostático. Objetivos: 1) Evaluar la regulación de FXI por miRNA en hígado humano. 2) Identificar SNP en el 3'UTR de factores de coagulación que desestabilicen la unión de miRNA con consecuencias en los niveles plasmáticos y riesgo de sufrir trombosis. 3) Estudiar el papel indirecto de miRNA sobre la regulación de las proteínas hemostáticas a través de HNF4α. Métodos: Se realizaron microarrays y búsquedas in silico de miRNAs. Líneas celulares humanas, cultivo primario de hepatocitos murinos se emplearon para transfecciones y ensayos de luciferasa. Correlaciones entre los niveles de expresión de miRNAs y mRNAs se realizaron en muestras de hígados. Se incluyeron sujetos de los estudios MEGA y LETS. Para la identificación de variantes en el 3'UTR, se seleccionaron los sujetos con niveles extremos para su secuenciación y genotipado. Resultados: 1. MiR-181a-5p regula la expresión de FXI Predicciones in silico identifican cuatro miRNA como potenciales candidatos a regular la expresión de FXI. Sólo miR-181a-5p redujo los niveles de mRNA y proteína de FXI, y el anti-miR-181-5p aumentó los niveles de mRNA y proteína de FXI en células hepáticas. Los ensayos de luciferasa demostraron una interacción directa entre miR-181-5p y el 3’UTR de F11. En hígados humanos sanos se mostró una correlación inversa y significativa entre los niveles de mRNA de F11 y de miR-181a-5p. 2. Identificación de una variante en el 3’UTR del F11 potencialmente regulada por miRNA En dos estudios caso-control, se secuenciaron los 3'UTR de 9 genes hemostáticos en sujetos con niveles plasmáticos extremos. Se identificaron 26 variantes, 4 de ellas con diferencias significativas entre los grupos de los extremos [F2: rs1799963 (previamente descrita) y F11: rs4253429, rs4253430 y rs1062547]. Los SNP de F11 mostraron un alto desequilibrio de ligamiento con las variantes funcionales descritas rs2289252 y rs2036914. El análisis en controles con el alelo silvestre para estas variantes conocidas de F11 mostró que rs1062547 y rs4253430 se asociaban con un aumento significativo de la actividad FXI. Se evaluaron aquellos SNP que pudieran perturbar la unión de miRNA in silico e in vitro. La predicción in silico reveló que la presencia de estos SNP podrían interferir en la unión de 2 miRNA (rs1062547 con miR-513a-5p y rs4253430 con miR-544). Los ensayos de luciferasa mostraron que sólo miR-544 disminuía significativamente su actividad. Dicha inhibición no se observó cuando se utilizó un vector mutado con rs4253430. 3. MiR-24 y miR-34a regulan la expresión de proteínas hemostáticas a través de HNF4α Se encontraron correlaciones positivas y muy significativas entre los niveles de expresión de HNF4A y dianas hepáticas de la coagulación. Los hígados con niveles extremos de miRNA mostraron asociaciones inversas con los niveles de expresión de factores de coagulación. Estos resultados sugieren que las diferencias en la expresión de mRNA de HNF4A pueden explicar, en parte, las variaciones individuales observadas en la expresión de factores de coagulación en el hígado humano. MiR-24 y miR-34a se unen a varios sitios en HNF4A humano. MiR-24 y miR-34a redujo los niveles diferentes proteínas hemostaticas en HepG2. En tejido hepático sano se observaron correlaciones negativas entre los niveles de HNF4A, miR-24 y miR-34a. Además, miR-24 y miR-34a redujeron los niveles del HNF4α y los niveles de expresión de diferentes proteínas hemostáticas en hepatocitos murinos. Conclusiones: Aproximaciones in silico, in vitro y ex vivo, han mostrado que ciertos miRNA funcionan como reguladores de la expresión de diversos factores hemostáticos. Las consecuencias patológicas de estas regulaciones quedan por ser exploradas.
In the present Thesis, I have addressed three points of investigation in the thrombosis field that have been reported as independent Chapters with a common nexus, the role of miRNAs as new regulators of the hemostatic system. Aims: 1) To investigate the potential relevance of miRNAs as new elements that may modulate FXI in human liver. 2) To identify 3’UTR variants in coagulation genes that influence coagulation factor levels and deep vein thrombosis risk through miRNA modulation. 3) To gain a deeper insight into the physiological modulator role of miRNAs in the expression of coagulation factors regulated by HNF4α. Methods: Microarray and in silico search of miRNAs were performed. Human cell lines and Murine hepatocyte primary culture were used for transfections (in vitro validation). Luciferase assays were used. Ex vivo correlations between miRNAs and mRNAs expression levels were performed in liver samples. Study subjects from MEGA and LETS studies were included. For the identification of 3’UTR variants, we selected subjects with extreme levels. Sequencing and genotyping were performed in 3’UTR of hemostatic factors genes. Results: 1. MiR-181a-5p regulates FXI expression in human liver In silico predictions suggest that 4 miRNAs may bind to F11 mRNA. However, only miR-181a-5p inhibits FXI by decreasing levels of both F11 mRNA and protein expression, anti-miR-181-5p increased both mRNA and protein levels of FXI in human. The expression of F11 mRNA in human liver is inversely correlated with the expression of miR-181a-5p, demonstrating for the first time that F11 expression may be regulated by miRNAs. This new regulatory mechanism of F11 expression could partially explain the interindividual variability of plasma FXI found in population. 2. Identification of a variant in the F11 3'UTR potentially regulated by miRNA In two case-control studies, 3’ UTRs of selected coagulation factor genes were sequenced. Four (in F2 and F11) of the 28 variants identified, were clearly more prevalent in low than high levels. F11 SNPs were in partial, inverse linkage (0.4 ≤r2<0.5) with functional variants rs2289252 & rs2036914 previously described. In wildtype carriers of the known variants, rs1062547 and rs4253430 were associated with plasma F11 activity, but none of the variants were associated with venous thrombosis risk. In silico prediction revealed that certain SNPs might disturb the binding sites of miRNAs. In vitro data, confirmed that only miR-544 showed a significant decrease of the luciferase activity in comparison with a scrambled control. This inhibition was not observed when using a mutated vector with rs4253430. 3. MiR-24 and miR-34a regulate several hemostatic proteins expression through HNF4α modulation In human healthy livers we observed significant and positive correlations between expression levels of both HNF4A and several hemostatic proteins. In samples with extreme levels of miR-24 and miR34a, we observed that HNF4A and hemostatic factors transcript levels were inversely correlated. Variations in the expression of these miRNAs could partly explain differences of HNF4A expression levels and therefore levels of several hemostatic factors in healthy subjects. MiR-24 and miR-34a bind to several sites on human HNF4A. In HepG2 cells, miR-24 transfections reduced expression levels of F10, F12, PROC, and PROS1, these latter were also reduced with miR-34a as well asSERPINC1 and PROZ transcript levels. HNF4A transcripts levels were negatively correlated with miR-24 and miR-34a levels in human healthy livers. In murine hepatocytes, miR-24 and miR-34a transfections reduced HNF4α levels and the expression levels of various hemostatic proteins. Conclusions: The present thesis identifies diverse mechanisms implicating miRNAs in the control of hemostasis. Further studies will help in linking these gene-silencing processes with pathologic processes as well as translating them into practical application.