Dissertations / Theses on the topic 'Commutation de classe des immunoglobulines'

Le processus de la commutation de classe ou commutation isotypique (CSR) des gènes d’immunoglobulines caractérise les cellules de la lignée B et implique principalement les régions switch précédant les gènes constants au sein du locus IgH. Des jonctions entre la région switch donneuse Sμ et celle acceptrice Sx sont crées pendant ce processus. Plusieurs études ont démontré que le destin des cellules de la lignée B était largement modulé en fonction de la classe de l’immunoglobuline qu’elles produisent et en particulier selon les signaux transmis par leur BCR (qui peuvent par exemple pour la classe IgE, comporter des signaux pro-apoptotiques). Nous avons utilisé plusieurs modèles visant à l’étude de la physiologie et de la mécanistique du switch vers différentes classes de BCR et d’immunoglobulines peu exprimées. Nous avons cherché à forcer l’expression de l’isotype IgA2 grâce à un modèle transgénique dédié, dans le but d’approfondir les spécificités du signal BCR transduit par cet isotype en comparaison avec le BCR IgA1. En outre, et d’une façon très intéressante, nous avons découvert l’existence (jusqu’ici ignorée et masquée par les 4 autres sous-classes plus abondantes) d’une cinquième sous-classe d’IgG humaine, l’IgG5 qui est codé par un gène jusqu’ici faussement classifié pseudo-gène. Ainsi nous avons étudié les modalités d’expression du gène correspondant après un switch non-canonique,le répertoire normal des IgG5, leur représentation parmi les IgG humaines monoclonales ainsi que leurs fonctions immunitaires grâce à un IgG5 fabriquée artificiellement portant une activité anti-CD20 humaine. Enfin, nous avons testé des produits pharmaceutiques (RHPS4 : stabilisant des structures G-quadruplex au niveau d’ADN et JQ1 : inhibiteur des facteurs de transcription à bromodomaines), montrant leur capacité à retarder ou inhiber la commutation de classe in vitro mais aussi in vivo dans des souris allergiques
The process of class switch recombination (CSR) or isotypic switching of immunoglobulin genes characterizes the B cell lineage and primarily involves switch regions preceding the constant genes within the IgH locus. Junctions between donor switch region Sμ and acceptor Sx are generated during this process. Several studies have shown that the fate of B cells is largely modulated according to the class of immunoglobulin they produce and in particular the signals transmitted by their BCR « for example for IgE, BCRs can combine proapoptotic signals. We used several relevant mouse models to study the physiological aspect and the B cell compartment after switching to IgA2 (a dedicated transgenic model expressing IgA2) since IgA2 conveys a membrane signal different from tht of IgA1. In addition, we tested two pharmaceuticals drugs(RHPS4: stabilizer of G-quadruplex structures at the DNA level and JQ1: inhibitor of bromodomain proteins) showed their ability to delay or inhibit class switching towards IgE in vitro but also in vivo in allergic mice. Interestingly, we also demonstrated the existence (till now ignored and maybe masked by the other 4 more abundant IgG subclasses) of a fifth subclass of human IgG, IgG5 which is encoded by a gene classified as a pseudo-gene. We studied the expression modalities of the corresponding gene after a non-canonical switch, the normal IgG5 repertoire, their representation among the monoclonal human IgGs as well as their immune functions through an artificially synthesited IgG5 with human anti-CD20 activity

La commutation isotypique au sein du locus des chaînes lourdes d'immunoglobulines (IgH) nécessite la transcription geffi1inale, l'intervention de AID (Activation-Induced cytidine Deaminase) et des éléments régulateurs en aval du locus (3 'RR). Pour analyser l'effet des interactions de longue distance sur la commutation isotypique, nous avons généré 3 modèles murins par recombinaison homologue. Dans le premier modèle, nous avons inséré un isolateur sauvage ou muté entre la 3'RR et le locus IgH. Dans le deuxième modèle, nous avons inséré un site de polyadénylation et de pause transcriptionnelle en aval des promoteurs germinaux Imu ou de Igamma3 pour un arrêt prématuré de la transcription germinale. Enfin dans le troisième modèle, nous avons remplacé le promoteur Igamma3 par Igamma1. Ces 3 approches nous ont permiis de mieux comprendre les interactions à longue distance au cours de la régulation de la transcription germinale, de la commutation isotypique et de l'élongation transcriptionnelle
Class switch recombination is a process in the immunoglobulin heavy chain locus (IgH) which requires germline transcription, Activated-Induced cytidine Deaminase (AID) and the 3' regulatory region (3'RR). In order to investigate the effect of long-range interactions on the class switch recombination, we generated three models in the mouse thanks to homologous recombination. In the first model, the entire or mutated core element of the chicken HS4 insulator was inserted between the 3'RR and the IgH locus. In the second, a polyadenylation and pause site was inserted downstream of germline promoters Imu or Igamma3 to attempt a premature termination of the germline transcription. In the last, the Igamma3 germline promoter was replaced by Igamma1. Thanks to these models, a better understanding is possible about the long-range interactions during the regulation of the germline transcription, the class switch recombination and the transcriptional elongation

Chez les mammifères, les cassures double brin sont majoritairement réparées par la voie de jonction des extrémités non homologues (NHEJ). L'absence d'un des facteurs du NHEJ (Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Artémis, XRCC4, DMA ligase IV) entraîne, chez l'homme et chez la souris, une immunodéficience combinée sévère associée à une radiosensibilite��. Ce phénotype est provoqué par un défaut sévère de la recombinaison V(D)J. Bien que la voie NHEJ soit suspectée d'intervenir pendant la commutation de classe des immunoglobulines (CSR) aucune étude n'a réussi à le démontrer avec certitude. Afin de contourner le défaut de recombinaison V(D)J et analyser l'implication de XRCC4 et Artémis dans la CSR, nous avons développé un modèle d'invalidation conditionnelle dans les cellules B matures selon deux approches initiales: le système de transgenèse lentiviral pour XRCC4 et la technique classique de recombinaison homologue pour Artémis. Le défaut partiel de XRCC4 dans la CSR a définitivement conduit au rôle de la voie NHEJ dans ce processus mais a aussi révélé l'activité d'une voie de réparation NHEJ alternative. Les données obtenues pour Artémis ont permis de conclure que la protéine est nécessaire pour la réparation d'un groupe de CDB généré pendant la CSR. Quant à Cernunnos, le développement de la souris d'invalidation classique nous a permis de constater que, en tant que facteur du NHEJ, sa fonction n'est pas indispensable pour l'accomplissement de la recombinaison V(D)J mais est nécessaire pour la CSR. Indépendamment de la voie NHEJ, Cernunnos aurait probablement une fonction liée à la survie cellulaire. Son activité protectrice contre le développement de lymphomes B matures reste à établir
The non homologous end-joining (NHEJ) is a predominant pathway for double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. NHEJ repair factors (Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Artemis, XRCC4 and DNA ligase IV) defect causes a defective V(D)J recombination exhibiting a severe combined immune-deficiency and usually associated with a pronounced hypersensitivity towards ionizing radiation. Although DSB are essential intermediates in CSR, NHEJ intervention has not been established unequivocally yet. To bypass the V(D)J recombination defect and analyse XRCC4 and Artemis involvement in CSR, we developed a conditional knock-out mouse model. For the XRCC4 model we used a novel lentiviral transgenic technology to abolish its synthesis in mature B cells, whereas the classical homologous recombination was employed to achieve the Artemis conditional model. The partial CSR defect obtained in the absence of XRCC4 enabled us to conclude unambiguously the involvement of the NHEJ pathway during CSR, but also revealed a new alternative NHEJ repair pathway. For Artemis the results showed its function for repairing a subset of DSB induced during CSR. Finally, the Cernunnos KO mouse model exposed a "normal" immune System development associated with a partial CSR defect. These results suggest that as a NHEJ factor, Cernunnos is not essential for the V(D)J recombination but has a role during the repair of the CSR DSB. Furthermore, the hypocellularity of every lymphoid organ analysed brings to consideration a cell viability function in a NHEJ independent pathway

La commutation de classe (CSR) est une étape clef de la réponse immunitaire. Ce phénomène va permettre de changer le type d’immunoglobuline (Ig) produite en réponse à un antigène donné. Ces Ig seront ensuite produites par les plasmocytes, qui constituent le stade ultime de la différenciation de la lignée cellulaire B. Lors de dérèglements de la prolifération de ces cellules, certaines Ig monoclonales anormales peuvent être produites et conduire à des situations pathologiques. La première partie de ce travail s’inscrit dans une logique de compréhension des éléments minima requis pour l’établissement de ce phénomène de CSR. Grace à un modèle animal d’insertion dirigée dans le locus kappa murin, naturellement ciblé par l’enzyme AID responsable de ce phénomène, nous avons mis en évidence que la présence de deux régions « switch » transcrites et fortement mutées par AID, n’était pas suffisante pour permettre ce phénomène. Un modèle murin reproduisant une maladie due à une Ig anormale a aussi été établi. Ce modèle de HCDD (Heavy Chain Deposition Disease) nous a permis de mettre en évidence la nécessité de la délétion du CH1 des chaînes lourdes d’Ig pour la génération des dépôts et nous a également permis de montrer que l’efficacité des thérapies à base d’inhibiteur de protéasome observée chez les patients atteint de HCDD, était en partie due à l’Ig pathogène elle-même, qui induit une élévation du stress du réticulum endoplasmique (UPR) au sein des plasmocytes producteurs de ces Ig
Class Switch Recombination (CSR) is a key step during the immune response. CSR results in a switch to a more specific Ig isotype in response to a specific antigen. Plasma cells, the ultimate stage of B cell lineage differentiation, will synthesize this Ig. During plasma cell disorders, the production of an abnormal monoclonal Ig can lead to pathogenic situations. The aim of the first part of this study is to determine the minimal requirements for CSR induction with a mouse model in which we inserted a “switch cassette” composed of two transcribed S regions into a kappa locus which is naturally targeted by AID. However, despite efficient transcription and AID targeting of S regions, the “switch cassette” was not sufficient to induce effective CSR. We also developed a mouse model of HCDD (Heavy Chain Deposition Disease) which reproduced typical Randall-type renal lesions due to production of a pathogenic truncated heavy chain. This model demonstrated that the effective response to proteasome inhibitors observed in patients, is the consequence of the presence of a truncated HC that sensitizes plasma cells to this type of therapy through an elevated unfolded protein response (UPR)

La réparation des cassures double brin de l'ADN (CDB) est majoritairement prise en charge chez les mammifères par la machinerie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ). Un défaul d'expression d'une des protéines connues du NHEJ (tel qu'Artémis ou XRCC4) aboutit chez l'Homme ou la souris à un défaut de la recombinaison V(D)J associé à une sensibilité accrue aux agents induisant des CDB, entraînant un arrêt précoce du développement des cellules B et T. La voie NHEJ est supposée intervenir spécifiquement dans le mécanisme de commutation isotypique de la chaîne lourde des immunoglobulines (CSR), sans toutefois n'avoir jamais été indubitablement mise en cause. Afin de dépasser le défaut de recombinaison V(D)J, et ainsi d'évaluer finement le rôle des facteurs Artémis et XRCC4 dans la réaction de CSR, nous avons essayé de développer quatre différentes stratégies. Une des stratégies a servi à initier l'invalidation conditionnelle du gène murin Artémis dans les cellules B matures des centres germinatifs. Ces données n'ont pas permis d'impliquer Artémis dans le processus de réparation des extrémités non-homologues de l'ADN au cours du CSR. Pour définitivement statuer sur l'implication de la voie NHEJ durant le CSR, nous nous sommes efforcés de développer une stratégie d'invalidation conditionnelle du gène XRCC4 dans ces mêmes cellules B, en mettant en place un système de transgenèse lentivirale. Les résultats de ce modèle nous ont permis de définitivement impliquer XRCC4 et la voie NHEJ dans le processus de commutation isotypique. Son rôle n'est toutefois que partiel, suggérant que d'autres voies alternatives de réparation des CDB peuvent prendre le pas au cours du CSR
The immune System is the site of intense DNA damage. Indeed, DNA double-strand breaks (DSBs) are a constant threat to ail living cells. Mammalian cells tend to utilize mainly the non-homologous end-joining pathway (NHEJ) to repair DSBs. Lack of one of the NHEJ proteins (Artemis or XRCC4) leads to a severe combined immune deficiency with radiosensitivity in mammals. Mature B cells migrate to secondary lymphoid organs, where they undergo antigen-driven immunoglobulin-gene diversification through somatic hypermutation and class-switch recombination (CSR). So far, XRCC and DNA Ligase IV are the only proteins required for ail types of NHEJ reactions that have no reported roles outside NHEJ. Therefore, although most available evidence points to a role for NHEJ factors in CSR, elucidation of the role of XRCC4 would provide the most unequivocal proof. To bypass the embryonic lethality and the V(D)J recombination defect of knockout models, we tried to develop four differents strategies to identify the role of Artemis and XRCC4 in CSR. The purpose of one of these strategies was to bring about conditional inactivation of Artemis murine gene in mature germinal center B cells. We found that Artemis-deficient B cells undergo robust CSR, indicating that NHEJ pathway functions mostly in CSR via an Artemis-independent mechanism. To formally implicate NHEJ process in CSR, we built up a strategy of conditional invalidation of XRCC4 gene in mature B cells. Our results connect XRCC4 and NHEJ pathway to CSR while reflecting the use of an alternative pathway using microhomologies in the repair of CSR DSB in the absence of XRCC4

La commutation isotypique (CI) des immunoglobulines (Ig) a lieu au locus constant de la chaîne lourde (IgH) de l'immunoglobuline lors de l'activation des cellules B et entraîne un changement de l'isotype exprimé. La CSR est déclenchée par l’enzyme AID et dépend des boucles à longue portée entre enhancers et promoteurs et de la transcription non-codante, qui sont contrôlés par l’enhancer Eμ et le super-enhancer de la région régulatrice 3' (3'RR). Ici, nous caractérisons le rôle sur la transcription non-codante et la CI de g1E, une région située en aval du gène Cg1 qui porte de marques d'enhancers actifs et qui interagit dynamiquement avec les deux enhancers du locus lors de l'activation des cellulesB. Nous montrons que la suppression de g1E réduit l'efficacité de la CI vers IgA dans les cellules CH12 et affecte la transcription non-codante et la CI d'une manière spécifique à l'isotype chez la souris. D'autre part, si la transcription précède ou suit la formation de la boucle pour induire la CI est encore inconnue. Pour répondre à cette question, nous avons ciblé un système d'induction transcriptionnelle basé sur la technologie CRISPR/Cas9 au promoteur Cg1 dans un contexte dépourvu de transcription et boucle pour étudier si la CI pouvait être restaurée
Immunoglobulin (Ig) class switch recombination (CSR) takes place at the immunoglobulin heavy chain (IgH) constant locus upon B cell activation and results in a change of the isotype expressed. CSR is triggered by activation-induced cytidine deaminase (AID) and is dependent on inducible long-rangeenhancer/promoter looping and on germline transcription, which are controlled by the Eμ enhancer and the 3' regulatory region (3'RR) super-enhancer. Here, we characterize the role on switch transcription and recombination of g1E, a region located downstream of the Cg1 gene that bears marksof active enhancers and that interacts dynamically with both IgH enhancers upon B cell activation. We show that g1E deletion reduces CSR efficiency to IgA in CH12 cells and affects germline transcription and CSR in an isotype-specific manner in mice. On the other hand, whether transcription precedes orfollows looping to induce CSR is still unknown. To address this question, we targeted a transcriptional induction system based on the CRISPR/Cas9 technology to the Cg1 promoter in a background deficient for transcription and looping to study whether CSR could be restored

Le gène néo(R) est couramment utilisé comme marqueur de sélection dans les expériences de recombinaison homologue. Mais il est également utilisé comme révélateur des mécanismes sous-jacents aux interactions de longue distance dans les loci complexes comme le locus IgH. Dans ce contexte, mon travail de thèse a porté sur les perturbations générées par le remplacement de séquences du locus IgH par le marqueur néoR. Le premier modèle correspond à des souris mutantes dans lesquelles la quasi-totalité de l'intron Iµ-Cµ (mais laissant intactes les séquences nécessaires à un épissage correct des pré-messagers µ) a été remplacé par néo(R). Nous avons trouvé que le compartiment B était profondément altéré avec un blocage dès les stades précoces du développement. En conséquence, une faible proportion de cellules B atteint les organes lymphoïdes secondaires. La transcription germinale initiée à partir du promoteur Iµ est bloquée. Dans le second modèle, nous avons généré des souris dans lesquelles le gène néoR a été inséré en aval de l'exon Iγ3 en laissant intacts tous les éléments nécessaires pour la transcription germinale et l'épissage normal des transcrits γ. L'expression du gène néoR interfère avec la transcription initiée à partir de Iγ3 et provoque une diminution de la commutation de classe vers IgG3. De plus, cette étude montre que le gène néoR apporte tous les éléments nécessaires à l'épissage des transcrits germinaux par l'activation de deux nouveaux sites cryptiques d'épissage, l'un dans la région codante du gène néoR et l'autre dans l'intron Iγ3-Cγ3. Une autre partie de mon travail a porté sur la mise en évidence d'une recombinaison interchromosomique au cours de la commutation de classe chez la souris. La première étude a été réalisée sur la lignée murine fr-Vκ pour laquelle un allèle de chaîne lourde a été rendu non fonctionnel par l'insertion d'un exon de chaîne légère entre JH4 et Eµ. Ce modèle nous a permis de montrer que le phénomène de trans-recombinaison participe activement à la commutation de classe vers IgA et IgG3. Dans une seconde étude, nous avons montré que le phénomène de trans-recombinaison participe à la commutation de classe vers tous les isotypes d'anticorps et permet la ré-expression d'un allèle exclu (au cours des réarrangements VDJ) lors du développement précoce B

Lors des réponses immunitaires, les lymphocytes B diversifient leur répertoire par l’hypermutation somatique (HMS) et la commutation isotypique (CI). Ces deux mécanismes sont dépendant de l’activité de « activation-induced cytidine deaminase » (AID), une enzyme qui déamine les cytosines de l’ADN en uraciles générant des mésappariements qui sont processés différemment dans le cas de l’HMS et de la CI. Au cours de la CI, le locus de la chaîne lourde des immunoglobulines subit un changement de conformation qui rapproche les promoteurs, les enhancers et les régions de switch afin de permettre la recombinaison des régions de switch. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents n’ont pas encore été identifié. Dans le but de comprendre les mécanismes de régulation d’AID, nous avons réalisé un criblage protéomique et identifié CTCF ainsi que les complexes médiateur et cohésine qui constituent des facteurs préalablement impliqués dans les interactions longues distances. Au cours de ce travail de thèse, nous avons montré que le complexe médiateur est requis pour la transcription de la région de switch acceptrice, pour l’interaction de cette dernière avec l’enhancer Eµ et pour le recrutement d’AID au locus des IgH. D’un autre côté, nous avons montré que le complexe cohésine est impliqué dans la réparation des cassures induites par AID et qu’il pourrait être impliqué dans la recombinaison des régions de switch
During immune responses, B cells diversify their repertoire through somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR). Both of these mechanisms are dependent on the activity of activation-induced cytidine deaminase (AID), an enzyme that deaminates cytosines into uracils generating mismatches that are differentially processed to result in SHM and CSR. During CSR, the Ig heavy chain (IgH) locus undergoes dynamic three-dimensional structural changes in which promoters, enhancers and switch regions are brought into close proximity. Nevertheless, little is known about the underlying mechanisms. To gain insight into the molecular mechanism responsible for AID regulation during CSR, we performed a proteomic screen for AID partners and identified CTCF, cohesin and mediator complexes, which are factors previously implicated in long-range interactions. We showed that during CSR, the mediator complex is required for acceptor switch region transcription, long-range interaction between the enhancer and the acceptor switch region and AID recruitment to the IgH locus whereas the cohesin complex is required for proper AID-induced breaks repair and might favor switch regions synapsis

L’enzyme Activation-induced cytidine deaminase (AID) initie la diversification des immunoglobulines (Ig) par l’induction de dommages à l’ADN. Alors que les lésions induites aux gènes des Ig sont cruciales pour l’établissement de réponses immunes hautement spécifiques et adaptées, ce même type de lésions provoquées ailleurs dans le génome contribue à la transformation cellulaire et à l’apparition de cancer. Les mécanismes impliqués dans la protection de l’intégrité génomique des cellules B restent à définir. D’une part, nous avons développé une approche de protéomique locus-unique en couplant une technique d’identification de protéine par biotinylation de proximité avec l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9. Cette technique innovante, dont nous avons fait la preuve de principe pour des loci abondants, pourra être utilisée pour identifier le protéome des différentes cibles génomiques d’AID. D’autre part, nous avons caractérisé le rôle de Parp3, Parp9 et Med1, identifiées comme partenaires d’AID, éclairant ainsi les mécanismes qui contrôlent l’activité d’AID et la réparation des lésions induites par AID lors de la diversification des Ig
Activation-induced cytidine deaminase (AID) initiates immunoglobulin (Ig) diversification by inducing DNA damage. While on-target lesions are crucial for mounting highly specific and adaptive immune responses, off-target lesions contribute to malignant cell transformation. Despite its implications, the events following AID recruitment that enforce genome integrity in B cells remain poorly defined. It is not understood why multiple non-Ig loci bound by AID are not mutated or why AID-induced DNA lesions may lead to mutations or DNA breaks. To address this question, we developed a single-locus proteomic approach coupling proximity-dependent protein identification and genome editing (CRISPR/Cas9) to identify and compare the proteins recruited at individual genomic loci bound by AID. We performed the proof of principle of this innovative tool by identifying the proteome of abundant genomic loci. On the other hand, we functionally characterized Parp3, Parp9 and Med1, identified as AID partners, revealing novel mechanisms that tightly control AID activity and DNA repair during Ig diversification

Lors des réponses immunitaires, le répertoire des lymphocytes B est diversifié par l’hypermutation somatique (HMS) et la commutation isotypique (CI), dépendant d’«activation-induced cytidine deaminase» (AID), qui introduit des lésions dans les gènes Ig. Une déficience d’AID cause un défaut d’HMS et de CI; par contre, une délétion du domaine C-terminal d’AID cause un défaut spécifique de la CI, suggérant que ce domaine interagit avec des facteurs spécifiques de la CI. Pour identifier ces facteurs, nous avons étudié une immunodéficience présentant un défaut de la CI non lié à la carence d’AID ni à un défaut d’HMS. De plus, les cassures de l’ADN ne sont pas détectées au niveau des gènes Ig suggérant qu’AID n’est pas correctement ciblée dans ces loci. Nous avons identifié et analysé des candidats : Spt6, les cohésines et le complexe Smc5/6. Dans les cellules B activées, AID interagit avec Spt6, Spt5, l’ARN polymérase II et le complexe PAF. Par contre, les cohésines pourraient réguler la structure du locus IgH lors de la CI et la voie de réparation des cassures de l’ADN générées pendant la CI. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des étapes de la CI
During immune responses, B cell repertoire is diversified through somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR). SHM and CSR require activation-induced cytidine deaminase (AID), which induces DNA damage. While AID deficiency abrogates SHM and CSR, C-terminal truncations impair CSR without affecting SHM and it has been proposed that AID C-terminal domain associates with CSR-specific factor(s). In order to identify these factors, we studied a human CSR-specific immunodeficiency, characterized by normal SHM and AID expression. B cells from these patients do not display DSBs at switch (S) regions, suggesting that they might lack an AID-binding factor(s) required to target AID to S regions during CSR. Through a multi- approach strategy, we identified and analyzed candidate factors, including Spt6, the cohesin complex and the Smc5/6 complex. We show that, in B cells poised to undergo CSR, AID is in a complex with Spt6, Spt5, the RNA polymerase II and the PAF complex while cohesins might regulate the 3D structure of the IgH locus and the pathway of DSBs repair at the Ig S regions. Our work thus contributes to a better understanding of the CSR reaction

Jusqu'en 1993, le recepteur cellulaire humain du virus de la poliomyelite (hpvr) apparaissait comme un membre orphelin de la superfamille des immunoglobulines (sfig) sans fonction physiologique connue et le gene mph etait considere comme l'homologue murin du gene hpvr. Deux nouveaux genes humains (prr1 et prr2) analogues au gene hpvr ont ete identifies au laboratoire: prr2 s'avere en realite etre l'homologue de mph. Nos donnees d'expression et la revelation recente de mph comme molecule d'adhesion homophilique orientent les travaux dans la recherche d'une fonction d'adhesion des molecules de cette nouvelle famille individualisee au sein de la sfig. Que cette famille contienne une quatrieme molecule et que prr1 et prr2 puissent etre des recepteurs viraux a l'instar de hpvr sont deux autres hypotheses privilegiees. Nous presentons par ailleurs le rationnel et les bases techniques d'une nouvelle methode qui vise a cloner des genes induits par des facteurs de croissance hematopoietiques, le gene trap

La generation du repertoire des anticorps s'effectue en deux etapes: la generation du repertoire primaire dans la moelle osseuse et celle du repertoire secondaire dans les organes lymphoïdes secondaires. Dans les organes lymphoïdes secondaires, l'activation des lymphocytes b par l'antigene (ag) sous la dependance des lymphocytes t aboutit a la generation des centres germinatifs dans lesquels les deux evenements majeurs de la maturation terminale des anticorps interviennent: la commutation isotypique (csr) permettant la production d'immunoglobulines (ig) d'isotypes diversifies, et la generation des mutations somatiques des regions variables (v) des ig (shm). Des anomalies de la voie de maturation terminale des lymphocytes b resultent en des deficits immunitaires primitifs rares caracterises par un defaut de csr associe ou non a un defaut des shm. Parmi les defauts de csr dus a un defaut intrinseque du lymphocyte b, les defauts en activation-induced cytidine deaminase (aid) et en uracil-n glycosylase (ung) ont mis en evidence le role majeur de aid dans la maturation des anticorps. Cependant, la plupart des defauts de csr dus a un defaut intrinseque du lymphocyte b restent de cause moleculaire inconnue et ont fait l'objet de notre etude pendant cette these. Nous avons caracterise deux nouveaux defauts de csr : l'un lie a un defaut en pms2, l'autre associe a une anomalie de la reparation de l'adn. La definition moleculaire des differents defauts de csr presente un interet en clinique humaine et permet une meilleure comprehension des mecanismes complexes de la maturation des anticorps chez l'homme
Antibody diversity generation occurs in two steps: the primary antibody repertoire is generated in the fetal liver and in the bone marrow by means of the v(d)j recombination process and the secondary antibody repertoire is shaped in secondary lymphoid organs. The terminal maturation of b lymphocytes occurs in the germinal centers of the secondary lymphoid organs following antigen (ag) and t-cell-driven activation. Two major events take place: class switch recombination (csr) resulting in the production of immunoglobulin (ig) of different isotypes and somatic hypermutations (shm). Defects in the terminal maturation of b cells result in ig-csr deficiencies. Ig-csr deficiencies are rare primary immunodeficiencies characterized by a defective ig-csr variably associated with defective shm. Activation-induced cytidine deaminase (aid) and uracil-n glycosylase (ung) deficiencies have established the major role of aid in antibody maturation. Meanwhile, most cases of intrinsic b-cell defects responsible for ig-csr deficiencies are not due to aid or ung deficiencies and are related to unknown molecular basis. The major aim of my thesis was to contribute to the molecular characterization of these immunodeficiencies. We have characterized two new ig-csr deficiencies: the first one is due to pms2 deficiency, the second is assosiated with defective dna repair. The ongoing delineation of inherited ig-csr deficiencies is essential from a medical point of view and contributes to a better understanding of the complex mechanisms underlying antibody maturation in humans

Les axones possèdent un cône de croissance qui intègre les effets répulsifs et attractifs de signaux environnementaux pour se diriger vers leurs tissus cibles. La Semaphorine3A repousse les cônes de croissance par l’activation d’un complexe récepteur formé de la Neuropiline-1 qui lie le ligand, et d’une Plexin-A, qui contrôle le remodelage du cytosquelette d’actine. Un troisième partenaire a été identifié, la molécule d’adhérence (IgCAM) L1, dont la fonction reste inconnue. Nous avons démontré la participation d’une nouvelle IgCAM au complexe récepteur de deux autres Sémaphorines. Puis, nous avons montré que la sous-unité IgCAM contrôle un processus nécessaire à la réponse répulsive aux Sémaphorines, qui est le désassemblage des contacts adhérents entre les cônes de croissance et leur substrat
Axons elaborate growth cones, which integrate repulsive and attractive effects of environmental guidance cues to reach their target tissue. The Semaphorin3A repels the growth cones by activating a receptor complex composed of Neuropilin-1, the ligand binding sub-unit, and Plexin-A controlling the cytoskeleton remodeling. The cell adhesion molecule (IgCAM) L1 was found as a third partner of this complex, but its function remains unknown. We identified an IgCAM partner in the receptor complex of two other Semaphorins and demonstrated its implication in their guidance function. We investigated the role of L1 in the Sema3A receptor and found that it controls a crucial process of the repulsive behavior, which is the disassembly of adherent contacts between growth cones and their substrate

TRRAP est un composant de différents complexes histone-acetyltransférases (HAT). Elle peut également s'associer au complexe MRN dépourvu d'activité HAT. TRRAP est impliquée dans différents processus nécessitant une accessibilité accrue de l'ADN tels que la transcription et la réparation de l'ADN. La délétion du gene Trrap chez la souris est létale aux stades précoces du développement embryonnaire. Nous avons donc recouru a une inactivation conditionnelle, restreinte aux lymphocytes B, en utilisant le système Cre-loxP, ou Cre se trouve sous le contrôle des éléments transcriptionnels de CD19, un marqueur spécifique de la lignée B. L'analyse phénotypique et moléculaire de populations cellulaires B des souris Trrap-/-/CD19Cre/Cre m'a permis de montrer que TRRAP jouait un rôle important dans le développement B et dans la CSR. Une analyse plus poussée au niveau de la cellule unique par" single-cell PCR " à différents stades de développement, a révélé que TRRAP était absolument requise pour la prolifération des cellules B, et que les effets de sa déficience sont plus prononcés dans les cellules proliférantes que quiescentes. Mes résultats suggèrent fortement que TRRAP possède un rôle central et général dans la régulation du cycle cellulaire. La protéine MSH2 est impliquée dans le mécanisme de réparation des mésappariements(mismatch repair). Son rôle précis dans la CSR est encore inconnu, sa déficience provoque une faible diminution de la CSR. Le modèle en vogue stipule qu'elle jouerait un rôle crucial dans les cassures double brin générées en dehors des motifs répétés des régions S. Pour tester ce modèle, j'ai analyse la CSR dans des souris déficientes en MSH2 et en motifs répétés de la region Sµ. L'analyse des souris mutantes a montre que la double déficience abolissait complètement la CSR. Ce blocage n'est pas du a une inhibition de la transcription des régions S ni a un défaut de prolifération (deux pré-requis a la CSR) mais plutôt a l'absence de cassures au niveau de l'ADN malgré la présence de "points chaud" pour AID. Par ailleurs, mes résultats montrent que le domaine d'action de MSH2 dans la region Sµ s'étend bien au-delà des domaines delimités par les boucles R
TRRAP is a common component of histone-acetyltransferase (HAT) complexes. TRRAPalso takes part in MRN complexe, without any HAT activity. TRRAP is implicated in severalprocesses where DNA accessibility is required, such as transcription and DNA repair. Trrapdeletion in mouse results in embryonic lethality. To avoid this lethality, we took advantage ofthe Cre-LoxP system with Cre under the control of CD19 transcriptional regulatory elements;CD19 being only expressed in B cells. Phenotypic and molecular analyses of Trrap-/-/CD19Cre/Cre mice B cells demonstrated thatTRRAP is strongly implicated in B cell development and CSR. Analyses by single cell PCR at eachdevelopmental stage revealed that TRRAP is absolutely required for proliferation; Effects ofTRRAP deletion are more pronounced in proliferating cells than in quiescent cells. My resultsalso suggest that TRRAP plays a central role in cell cycle regulationMSH2 takes part in mismatch repair. Its precise role in CSR is still unknown althoughMSH2 deficiency results in slight reduction of CSR. Currently MSH2 is thought to be implicated indouble strand breaks (DSB) generated outside S regions tandem repeats during CSR. To test this model, I analyzed CSR in MSH2 and Sµ tandem repeats deficient mice. Analysis of those mutants shows a complete CSR abolishment. Neither S region transcription norcell proliferation (both required for CSR) are implicated. It seems likely that a lack of DSB isresponsible for the absence of CSR, despite AID hotspots presence. Besides, my resultsdemonstrate that MSH2 affects Sµ region but also domains outside R-loops

Les lymphocytes B expriment une immunoglobuline (Ig) membranaire, qui s’associe à l’hétérodimère Igα/Igβ pour former le récepteur à l’antigène des cellules B (BCR). Ce récepteur peut ensuite être sécrété sous la forme d’une Ig soluble pour assurer la réponse humorale adaptative. L’enzyme AID, spécifiquement exprimée dans les lymphocytes B, permet de moduler le répertoire B, en modifiant le site de reconnaissance des antigènes par hypermutation somatique des domaines variables, et en changeant le domaine constant des Ig par le phénomène de recombinaison de classe (CSR) du locus de chaine lourde d’Ig (IgH). Nous avons ainsi suivi le destin cellulaire B après différents évènements de recombinaison médiés par AID, en particulier après le CSR vers l’IgE. Les IgE sont impliquées dans les défenses antiparasitaire et anti-tumorale mais sont également responsables de réactions allergiques, pouvant aller jusqu’au choc anaphylactique, potentiellement mortel. De cette dangerosité potentielle des IgE résulte sans doute qu’aient été sélectionnés des mécanismes puissants et multiples pour réguler finement et maintenir à des taux très faible la production des IgE, notamment sans doute pour prévenir leurs effets délétères. Alors que différents niveaux de contrôle de la production d’IgE sont déjà bien établis, nous mettons en évidence un phénomène d’autorégulation négative des cellules B IgE+ assuré par le BCR IgE lui-même, permettant de limiter fortement la mémoire cellulaire IgE. Nous avons également étudié des évènements de recombinaison non-classiques AID-dépendants. Il s’avère que le changement de classe, qui se fait classiquement entre deux régions switch d’un même chromosome IgH, peut également se faire de manière inter-chromosomique (trans-CSR), et nous montrons son existence chez l’homme ainsi que sa fréquence élevée. Nous pensons que cette fréquence élevée doit être prise en compte dans les modèles qui tentent de comprendre comment la cellule B privilégie les jonctions d’ADN légitimes tout en étant à l’évidence impliquée fréquemment dans des recombinaisons inter-chromosomiques. Nous démontrons également la présence et le ciblage par AID de régions répétitives autres que les régions « switch », les régions « LS », situées à la fin du locus IgH et intégrées à sa région régulatrice 3’, qui peuvent être recombinées avec la région Sμ. Un tel évènement de recombinaison entraine la délétion des gènes constants, la perte du BCR et la mort de la cellule B, et donc le « Locus Suicide Recombination »
B lymphocytes express a membrane immunoglobulin (Ig), which is associated with the heterodimer Igα/Igβ to form the B cell antigen receptor (BCR). This receptor can be secreted later as soluble Ig to ensure humoral immune responses. AID enzyme, specifically expressed in B lymphocytes, modulates the B repertoire, by modifying antigen binding sites via somatic hypermutation of variable domains, and by changing constant domains of Ig by class switch recombination (CSR) of the Ig heavy chain locus (IgH). We followed B cell fate after different recombination events mediated by AID, in particular after IgE CSR. IgE is implicated in antiparasitic and antitumoral defenses but also in allergic responses, including anaphylactic shock, which is potentially lethal. Resulting from this potential danger, multiple and strong mechanisms have probably been selected to tightly regulate and maintain very low levels of IgE production, especially to avoid these deleterious effects. Different IgE production control levels are well established, but we now show an auto-regulatory negative control of IgE class-switched B cell fate, mediated by IgE BCR itself, which strongly limits IgE cell memory. We also studied unconventional AID-dependent recombination events. CSR, which occurs classically between two switch regions on the same IgH chromosome, could occur through an inter-chromosomal pathway (trans-CSR), and we demonstrated this very frequent phenomenon in humans. We think this high frequency should be considered in models that try to understand how B cells privilege legitimate DNA junctions while undergoing frequent inter-chromosomal recombinations. We also demonstrated the presence and AID targeting of repetitive regions other than “switch” regions, “LS” regions, located at the end of the IgH locus and integrated into its 3’ regulatory region, which can be recombined with Sμ regions. This recombination event induces deletion of all constant genes, BCR loss and B cell death, and is called “Locus Suicide Recombination”

Cette thèse s'intéresse à la commande et l'observation d'une classe de systèmes linéaires à commutations (SLC). La classe considérée regroupe les systèmes pouvant être représentés par un modèle Hamiltonien à ports. Récemment, plusieurs travaux ont utilisé la théorie des systèmes dynamiques hybrides pour traiter les problèmes de stabilité, de commandabilité et d'observabilité des systèmes linéaires à commutations. Cependant, certains verrous scientifiques demeurent et nécessitent d'être levés tels que la synthèse d'observateurs pour des SLC présentant des modes de fonctionnement inobservables ou la commande hybride de systèmes possédant un nombre réduit d'entrées de commutations et un nombre élevé de variables d'état à contrôler. Dans ce travail, nous nous intéressons à la synthèse d'observateurs s'appuyant sur la modélisation moyenne et la modélisation hybride de SLC ayant une topologie Hamiltonienne à ports particulière. Ce formalisme possède les outils nécessaires pour établir des preuves de stabilité des erreurs d'observation. Dans un premier temps, nous proposons un observateur non linéaire reposant sur le modèle moyen de la classe des SLC considérée. Ensuite, nous traitons le problème de synthèse d'un observateur hybride où nous proposons un observateur commuté prenant en compte les modes de fonctionnement inobservables. Le problème de la commande des SLC est abordé par la suite. Au départ, la théorie de Lyapunov est utilisée pour proposer deux lois de commandes : La première est synthétisée à partir du modèle moyen et la deuxième exploite le modèle hybride. Une commande optimale hybride est élaborée en utilisant le principe du maximum de Pontryagin et une approche utilisant la recherche d'arcs singuliers. Finalement, une commande prédictive hybride est établie à partir d'un modèle discrétisé du système. Des résultats de simulation et une mise en œuvre expérimentale sur un convertisseur DC-DC SEPIC sont donnés pour montrer l'efficacité des méthodes proposées. L'étude d'un tel circuit est motivée par sa topologie particulière qui contient à la fois un mode de fonctionnement observable et un mode de fonctionnement inobservable. En outre, il possède une seule entrée de commutations et quatre variables d'état ce qui lui vaut la réputation être difficile à commander.

Cette thèse s’intéresse à la commande et l’observation d’une classe de systèmes linéaires à commutations (SLC). La classe considérée regroupe les systèmes pouvant être représentés par un modèle Hamiltonien à ports. Récemment, plusieurs travaux ont utilisé la théorie des systèmes dynamiques hybrides pour traiter les problèmes de stabilité, de commandabilité et d’observabilité des systèmes linéaires à commutations. Cependant, certains verrous scientifiques demeurent et nécessitent d’être levés tels que la synthèse d’observateurs pour des SLC présentant des modes de fonctionnement inobservables ou la commande hybride de systèmes possédant un nombre réduit d’entrées de commutations et un nombre élevé de variables d’état à contrôler. Dans ce travail, nous nous intéressons à la synthèse d’observateurs s’appuyant sur la modélisation moyenne et la modélisation hybride de SLC ayant une topologie Hamiltonienne à ports particulière. Ce formalisme possède les outils nécessaires pour établir des preuves de stabilité des erreurs d’observation. Dans un premier temps, nous proposons un observateur non linéaire reposant sur le modèle moyen de la classe des SLC considérée. Ensuite, nous traitons le problème de synthèse d’un observateur hybride où nous proposons un observateur commuté prenant en compte les modes de fonctionnement inobservables. Le problème de la commande des SLC est abordé par la suite. Au départ, la théorie de Lyapunov est utilisée pour proposer deux lois de commandes : La première est synthétisée à partir du modèle moyen et la deuxième exploite le modèle hybride. Une commande optimale hybride est élaborée en utilisant le principe du maximum de Pontryagin et une approche utilisant la recherche d’arcs singuliers. Finalement, une commande prédictive hybride est établie à partir d’un modèle discrétisé du système. Des résultats de simulation et une mise en œuvre expérimentale sur un convertisseur DC-DC SEPIC sont donnés pour montrer l’efficacité des méthodes proposées. L’étude d’un tel circuit est motivée par sa topologie particulière qui contient à la fois un mode de fonctionnement observable et un mode de fonctionnement inobservable. En outre, il possède une seule entrée de commutations et quatre variables d’état ce qui lui vaut la réputation être difficile à commander
This thesis is dedicated to the control and the observation of a class of switched linear systems (SLS). This class contains the systems that can be represented by a port-Hamiltonian model. A lot of works have been studied SLS for several years using an average modeling approach. Recently, various works have shown that hybrid system theory allows to cope with stabilization, controllability, and observability problems of switched linear systems. However, several problems are still open and need more development such as the design of hybrid observers for SLS that have unobservable modes or the control of systems with reduced number of switching inputs and numerous variable states to control. In this work, we are interested in the design of state observers for a particular class of SLS using both the average and the hybrid port-Hamiltonian models. This formalism has the necessary tools to study and establish the stability of the observation errors. At the beginning, a nonlinear observer based on the average modeling is proposed. Next, a hybrid observer is designed for switched linear systems. This observer takes into account the unobservable operating modes of the system. The second point of our work concerns the design of control laws for the considered class of SLS. At first, two Lyapunov-based control laws have been established using either an average model or a hybrid model of the system. A hybrid optimal control based on the maximum principle of Pontryagin and the computation of singular arcs has been also proposed. Finally, a hybrid predictive control based on a discrete model of the system is synthesized. Simulation results and an experimental implementation on a SEPIC converter are given to show the efficiency of the proposed methods. Our motivation to study such a converter is mainly due to its particular topology that includes observable and unobservable subsystems. It is also known to be difficult to be controlled because only one switching input is used to control four state variables

Les travaux présentés dans cette thèse concernent le problème d'identification des systèmes à retards et d'une certaine classe de systèmes hybrides appelés systèmes "impulsifs".Dans la première partie, un algorithme d'identification rapide a été proposé pour les systèmes à entrée retardée. Il est basé sur une méthode d'estimation distributionnelle non asymptotique initiée pour les systèmes sans retard. Une telle technique mène à des schémas de réalisation simples, impliquant des intégrateurs, des multiplicateurs et des fonctions continues par morceaux polynomiales ou exponentielles. Dans le but de généraliser cette approche pour les systèmes à retard, trois exemples d'applications ont été étudiées. La deuxième partie a été consacrée à l'identification des systèmes impulsifs. En se basant sur le formalisme des distributions, une procédure d'identification a été élaborée afin d'annihiler les termes singuliers des équations différentielles représentant ces systèmes. Par conséquent, une estimation en ligne des instants de commutations et des paramètres inconnus est prévue indépendamment des lois de commutations. Des simulations numériques d'un pendule simple soumis à des frottements secs illustrent notre méthodologie

Cette thèse s'intéresse au diagnostic et à l'observation de systèmes linéaires à commutations et à l'application au convertisseur multicellulaire série. L'objectif est de proposer des solutions pour des sous-systèmes non-observables au sens classique et dont des fautes continues ou discrètes peuvent être présentes. Après la présentation d'un état de l'art sur les techniques d'observation et de diagnostic pourles systèmes à commutations, le mémoire est scindé en deux parties. La première partie propose, d'une part, une stratégie d'estimation des états discret et continu d'un système linéaire à commutation soumis à une entrée inconnue. Un observateur hybride basé sur la théorie des modes glissants d'ordre supérieur est développé. D'autre part, deux procédures de diagnostic sont présentées. La première combine un observateur hybride et un diagnostiqueur pour détecter une faute continue. Pour la seconde, un diagnostic actif est défini sur la base de la théorie du test afin de détecter et d'isoler une faute discrète. Dans la seconde partie de ce mémoire, les étapes de la réalisation d'un convertisseur multicellulaire sont détaillées. Ensuite, un chapitre est dédié à la validation des approches théoriques d'observation et de diagnostic sur le convertisseur à trois cellules. Un observateur est synthétisé afin d'estimer les tensions des capacités. Les deux procédures de diagnostic sont appliquées pour la détection d'une variation des valeurs des capacités et le diagnostic de cellules bloquées. Enfin, une commande binaire pour le convertisseur est proposée. L'application de cette stratégie permettra, par la suite, la commande tolérante aux fautes du convertisseur.

Dans le but de reconnaitre et répondre de manière efficace à une très grande variétés d’agents pathogènes, les cellules B ont développé au cours des mécanismes de diversifications des immunoglobulines contrôlés par des processus génétiques complexes comme la recombinaison V(D)J, l’hypermutation somatiques (SHM), et le changement de classe par recombinaison (CSR). L’ensemble de ces processus est contrôlé par différentes voies de réparations de l’ADN. L’anémie de Fanconi est une maladie génétique rare caractérisée par une défaillance progressive de la moelle osseuse, des anomalies de développement et un risque accru de développer des leucémies et des cancers oesopharyngés. La voie FANC est impliquée dans la réparation des pontages de l’ADN et dans le maintien de la fourche de réplication en cas de stress génotoxique. Il est également bien décrit que la voie FANC joue un rôle important dans la coordination des voies de réponses aux dommages à l’ADN. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés au rôle de la voie FANC dans les processus de diversifications des immunoglobulines.En utilisant des souris déficientes pour le gène Fanca, nous montrons que la voie FANC (ou FANCA) participe à la recombinaison V(D)J en contrôlant, dans la moelle osseuse, la transition des cellules B, du stade pre-B au stade de cellules B immatures. Ceci se ferait probablement par le contrôle de la transcription des gènes codant les chaines légères κ des immunoglobulines. Nous montrons également que Fanca pourrait avoir un rôle dans l’addition de nucleotides aux extrémités codantes, en régulant d’une manière indéterminée l’activité et/ou l’activation de l’enzyme TdT ou de la polymérase Polµ. Par ailleurs, nous avons montré que Fanca est nécessaire pour l’induction des mutations de type transitions A/T pendant le processus de SHM en régulant l’expression ou la stabilisation de Polη. Enfin, Fanca (ou la voie FANC) participe à l’inhibition de la recombinaison non homologue (NHEJ) et est requis durant le CSR pour stabiliser les duplexes entre 2 régions de microhomologies qui facilitent le recrutement d’endonucléases et réguler l’accès des DNA polymérases aux cassures de l’ADN
To recognize and respond dynamically to an enormous variety of different pathogens, B lymphocytes of the immune system have evolved controlled genetic processes at their immunoglobulin (Ig) loci that are known as Ig diversification including V(D)J recombination, somatic hypermutation (SHM), and class switch recombination (CSR). These complex and vulnerable processes are orchestrated by multiple DNA repair pathways. Fanconi anemia (FA) is a rare genetic disorder that can lead to bone marrow failure, congenital abnormalities, and an increased risk of leukemia and cancer. FANC pathway has been implicated in DNA interstrands crosslinks (ICL) repair and in the rescue of stalled replication forks. The FANC pathway also plays a fundamental role in coordinating the DNA repair pathways. Several lines of evidence suggest a possible involvement of the FANC pathway in Ig diversification processes, thus we are particularly interested in revealing function of FANC pathway during these processes. By using Fanca-/- mice, our results first show that during V(D)J recombination, Fanca (or FANC pathway) participates to the control of the transition from pre-B to immature B cells in bone marrow (BM), probably through transcriptional activation of post-rearranged κ light chain. In addition, Fanca might play a role in nucleotide addition at coding end, possibly by regulating either TdT or Polµ activity/activation. Secondly, we found that Fanca is required for the induction of transition mutations at A/T during SHM via regulation of Polη expression/stabilization. Finally, Fanca (or FANC pathway) inhibits short-range recombination and is required during CSR to stabilize duplexes between 2 short microhomology regions that facilitate the recruitment of endonucleases to trim overhangs and avoid unscheduled access of polymerases to DNA ends

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.
Activation induced deaminase (AID) plays a central role in adaptive immunity. AID deaminates deoxycytidine to deoxyuridine in defined regions of the immunoglobulin (Ig) genes and initiates somatic hypermutation (SHM), gene conversion (iGC) and class switch recombination (CSR). While being essential for an effective immune response by underpinning antibody affinity maturation and isotype switching, the mutagenic activity of AID can also be oncogenic and causes genomic instability leading to the development of cancer, or exacerbate autoimmune diseases. Therefore, AID regulation, including the control of its protein level, is central to balancing effective immunity with cancer/autoimmunity. Notably, AID shuttles between the cytoplasm and the nucleus but is predominantly cytoplasmic at steady-state, with cytoplasmic AID being much more stable than nuclear AID. These regulatory steps contribute to limit the exposure of the genome to AID but their mechanisms are unknown. This thesis aimed at identifying AID partners and intrinsic determinants regulating its stability and modulating its biological functions. Firstly, we identified AID as a novel HSP90 client protein. We demonstrated that HSP90 interacts with AID in the cytoplasm and prevents its polyubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Consequently, HSP90 inhibition results in a significant reduction of endogenous AID levels and correlates with a proportional reduction in both AID-mediated antibody diversification and off-target mutations. Secondly, we showed that the first step in the HSP90 molecular chaperoning pathway and stabilization is the interaction of AID with the HSP40 and HSP70 system. In fact, a specific HSP40 protein, DnaJa1, is the limiting step in cytoplasmic AID stabilization. DnaJa1 farnesylation is required for DnaJa1-AID interaction and modulation of DnaJa1 levels or its farnesylation impacts endogenous AID levels and antibody diversification. In vivo, DnaJa1- deficient mice display compromized response to immunization, resulting from reduced AID protein levels and isotype switching. Thirdly, we found that AID is intrinsically less stable than its APOBEC paralogs. We identified the AID N-terminal aspartic acid residue at position two and an internal PEST-like motif as destabilizing modulators of AID protein turnover. Disruption of these motifs increases AID protein stability and antibody diversification.We conclude that AID’s intrinsic instability directly contributes to regulating antibody diversification. This intrinsic instability is at least partially compensated for in the cytoplasm by the protective action of the DnaJa1-HSP90 molecular chaperoning pathway. Pharmacologically targeting AID in an indirect way, by using HSP90 or farnesyltransferase inhibitors, could be relevant for treating some AID-associated lymphomas/leukemias and/or autoimmune diseases.